UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJAUNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJALa Universidad Católica de LojaLa Universidad Católica de Loja

Proliferación Muerte

• Muerte Celular Programada.• “Suicidio” para beneficio del

organismo.• No afecta a células vecinas, no

produce inflamación.

• Etapas– Inicio– Decisión– Ejecución– Ablución

• Etapas– Inicio– Decisión– Ejecución– Ablución

E

• Fisiológicamente– Remodelamiento – Liberar espacio– Formar un nuevo tejido– Eliminar células sobrantes

• Patológicamente– Agentes Externos: bacterias,

virus, radiación, etc.– Agentes Internos: mutaciones

• Activación de la maquinaria de reparación.

• Activación de las vías de la Apoptosis

APOPTOSIS

Caspasa 8

p53

Citocromo c

Bcl-2

Bax

Apoptosoma

TNF, etc.Radiación

Quimioterapia, etc.

Vía Extrínseca Vía Intrínseca

Caspasa 3

• Debilitamiento del citoesqueleto y membrana citoplasmática

• Degradación del núcleo y condensación del material genético.

• Degradación de Organelas.• Formación de Cuerpos Apoptóticos.

Célula Normal Proceso Apoptótico

Cuerpos Apoptóticos

• Receptores de reconocimiento: – Fosfatidil Serina (FS)

• Membrana citoplasmática es dependiente de ATP.• Liberación de citocromo c implica una disminución de la reserva

energética y perdida de la estabilidad de la membrana citoplasmática.

Macrófagos

Cuerpos Apoptóticos

= FS

Célula Normal

Matriz Extracelular

Citoplasma

Macrófago

Receptor de FS

ATPATP

Célula Apoptótica

ATPATP

• Principal causa de mortalidad a nivel mundial.

• Proliferación incontrolada de células anormales.

• Las células evaden la Apoptosis y adoptan un nivel de proliferación ilimitado originando una carcinogénesis.

Proliferación

Muerte

CARCINOGÉNESISCARCINOGÉNESIS

Célula Afectada

Célula Normal

• Activación de Apoptosis sobre células tumorales resulta ser una de las mejores estrategias para el tratamiento del cáncer.

• Quimioterapia:– No es específica– Afecta a las células normales– Efectos adversos

• Compuestos capaces de Inducir apoptosis e inhibir la proliferación celular descontrolada.

• Necrosis:

• Senescencia: Perdida de la capacidad de replicación.• Autofagia: Autofagocitosis.• Oncosis: Perdida de Reserva Energética.• Piroptosis: Caspasa 1.

Célula Normal

Proceso Necrótico

Respuesta Autoinmun

e

linfocitos

• Los eventos bioquímicos durante la apoptosis pueden ser detectados a través biomarcadores.

• Indicadores de uno o varios procesos, pueden ser medidos y analizados.

Ac-Ac-DEVDDEVD

pNA

Caspasa 3

+

Ac-Ac-DEVDDEVD

pNA

Anexina VAnexina VFLUOSFLUOS

Ca2+

= FSCélula Apoptótica

Radiación

Fluorescencia en campo oscuro

Célula Apoptótica

Célula Necrótica

• General:

– Implementar dos diferentes ensayos que permitan la determinación de muerte celular por apoptosis en la línea celular RKO, expuestas durante 24 h a diferentes dosis de Doxorrubicina.

• Específicos:

– Desarrollar curvas Dosis/Respuesta para establecer las dosis a probar de Doxorrubicina mediante el ensayo de viabilidad por captación de: FDA-BrEt.

– Determinar la actividad de caspasa 3 mediante el ensayo “CaspACE™ Assay System, Colorimetric” en respuesta a las dosis de Doxorrubicina establecidas.

– Mediante el ensayo de Anexina V, determinar el índice de células en apoptosis en respuesta a las dosis de Doxorrubicina establecidas.

Tratamiento

24 h Incubación

Cosecha

EXTRACTO CELULAR

RKO(Carcinoma de Colon)

0,5 µM

1 µM

2,5 µM

5 µM

37ºC5% CO2

24 h Incubación

37 ºC, 5% CO2

Microscopio de Fluorescencia

Vivas

Muertas

Agonizantes

EXTRACTO CELULAR

FDA

BrEt

Tinción con Solución de Trabajo

Lavados

ConteoConteo

BRADFORD

µg/mL ProteínaCurva Estándar: ASB

Incubación a Temperatura Ambiente: 30min

Incubación a 37 ºC, 4 h

Lisis Celular

Extracto Proteico

Ac-DEVD p-NA

Espectrofotómetro620 nm620 nm405 nm405 nm

EXTRACTO CELULAR

Microscopio de Fluorescencia

LavadosBrEtBrEt

Tinción con Solución de Trabajo

Anexina VAnexina VFLUOSFLUOS

Ca2+

ConteoConteo

Vivas

MuertasAPOPTÓTICAS

• Cada ensayo fue realizado por duplicado en tres experimentos independientes

• Analizados mediante es Software estadístico “GraphPad”, a través del test de Dunnet y Tukey

• La activación de apoptosis en células tumorales resulta ser una de las mejores estrategias para el tratamiento del cáncer.

• La Dxo permitió implementar dos biomarcadores para la detección de apoptosis.

ControlControl 0,5 0,5 μμM DxoM Dxo 1 1 μμM DxoM Dxo 2,5 2,5 μμM DxoM Dxo 5 5 μμM DxoM Dxo

Smukste, et al. 2006

MTT:

C-26 (Cáncer de Colon)

1 µM Dxo – 24 h40 % Viabilidad

Smukste, et al. 2006

MTT:

C-26 (Cáncer de Colon)

1 µM Dxo – 24 h40 % Viabilidad

Han, et al. 1997

Eficiencia en Placa:

Rat-1 (Fibroblastos de Rata)

0,1 µM Dxo – 24 h- 90 % Viabilidad

Han, et al. 1997

Eficiencia en Placa:

Rat-1 (Fibroblastos de Rata)

0,1 µM Dxo – 24 h- 90 % Viabilidad

El sustrato Ac-DEVD-pNA tambien puede ser clivado

por las caspasas: 7, 1, 4 y 6.

El sustrato Ac-DEVD-pNA tambien puede ser clivado

por las caspasas: 7, 1, 4 y 6.

Tong, et al. 2000

U-937 (Cáncer leucémico)

20 Gy/min de radiación0,250 nm aproximadamente

Tong, et al. 2000

U-937 (Cáncer leucémico)

20 Gy/min de radiación0,250 nm aproximadamente

La línea celular MCF-7 no expresa caspasa 3.

La línea celular MCF-7 no expresa caspasa 3.

Thompson, et al. 2004

RKO, 0,5 µM Dxo – 48 h90 % de células apoptóticas

Thompson, et al. 2004

RKO, 0,5 µM Dxo – 48 h90 % de células apoptóticas

La vía de muerte apoptótica no es estática.

Ambos biomarcadores se activan en tiempos diferentes.

A pesar de que las células entren en apoptosis tardía, la actividad de la caspasa 3 todavía no decrece y dependiendo de las condiciones, puede seguir clivando a sus sustratos.

La vía de muerte apoptótica no es estática.

Ambos biomarcadores se activan en tiempos diferentes.

A pesar de que las células entren en apoptosis tardía, la actividad de la caspasa 3 todavía no decrece y dependiendo de las condiciones, puede seguir clivando a sus sustratos.

• 1 µM de Dxo, es una adecuada concentración para ser aplicada en ensayos de viabilidad y de inducción de apoptosis.

• Para determinar el tipo de muerte que induce un compuesto citotóxico es importante escoger adecuadamente el modelo biológico, el biomarcador y el tiempo en cual se hace la cuantificación.

• La Caspasa 3 y Anexina-V, son biomarcadores para la determinación de apoptosis.

• Ambos miden distintos proceso, y son igual de útiles y Ambos miden distintos proceso, y son igual de útiles y complementarios entre sí.complementarios entre sí.