Post on 21-Feb-2021
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS E NUTRICcedilAtildeO
EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA NA β-LACTOGLOBULINA MODIFICACcedilOtildeES ESTRUTURAIS E
AGREGACcedilAtildeO
Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola Doutoranda
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto Orientadora
Tese apresentada agrave Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de
Campinas para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo
Campinas-SP
2006
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FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FEA ndash UNICAMP
Titulo em inglecircs Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation Palavras-chave em inglecircs (Keywords) Circular dichroism Proteins ndash Aggregation X-ray ndash Small-angle scattering Whey ndash Proteins Aacuterea de concentraccedilatildeo Nutriccedilatildeo Experimental Aplicada agrave Tecnologia de Alimentos Titulaccedilatildeo Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo Banca examinadora Flaacutevia Maria Netto Valdemiro Carlos Sgarbieri Iacuteris Torriani Francisco Teixeira Pessine Maria Teresa Bertoldo Pacheco Susy Frei Sabato Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo Programa em Alimentos e Nutriccedilatildeo
Hoz Urrejola Luciacutea del Carmen de la H856e Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees
estruturais e agregaccedilatildeo Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola -- Campinas SP [sn] 2006
Orientador Flaacutevia Maria Netto Tese (doutorado) ndash Universidade Estadual de CampinasFaculdade
de Engenharia de Alimentos 1 Dicroiacutesmo circular 2 Proteiacutenas ndash Agregaccedilatildeo 3 Raios X ndash
Espalhamento a baixo acircngulo 4 Soro do leite ndash Proteiacutenas I Netto Flaacutevia Maria II Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Engenharia de Alimentos III Tiacutetulo
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Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola
EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA NA β-LACTOGLOBULINA MODIFICACcedilOtildeES ESTRUTURAIS E
AGREGACcedilAtildeO
Tese apresentada agrave Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
Orientadora
Campinas -SP 2006
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BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
(ORIENTADORA) ndash DEPANFEAUNICAMP
Prof Dr Valdemiro Carlos Sgarbieri (MEMBRO) ndash DEPANFEAUNICAMP
Profa Dra Iacuteris Torriani (MEMBRO) ndash IFGWUNICAMP
Prof Dr Francisco Teixeira Pessine (MEMBRO) ndash IQMUNICAMP
Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco MEMBRO) ndash ITAL
Dra Susy Frey Sabato (MEMBRO) ndash IPEN
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Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
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AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
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xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
ii
FICHA CATALOGRAacuteFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FEA ndash UNICAMP
Titulo em inglecircs Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation Palavras-chave em inglecircs (Keywords) Circular dichroism Proteins ndash Aggregation X-ray ndash Small-angle scattering Whey ndash Proteins Aacuterea de concentraccedilatildeo Nutriccedilatildeo Experimental Aplicada agrave Tecnologia de Alimentos Titulaccedilatildeo Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo Banca examinadora Flaacutevia Maria Netto Valdemiro Carlos Sgarbieri Iacuteris Torriani Francisco Teixeira Pessine Maria Teresa Bertoldo Pacheco Susy Frei Sabato Programa de Poacutes Graduaccedilatildeo Programa em Alimentos e Nutriccedilatildeo
Hoz Urrejola Luciacutea del Carmen de la H856e Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees
estruturais e agregaccedilatildeo Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola -- Campinas SP [sn] 2006
Orientador Flaacutevia Maria Netto Tese (doutorado) ndash Universidade Estadual de CampinasFaculdade
de Engenharia de Alimentos 1 Dicroiacutesmo circular 2 Proteiacutenas ndash Agregaccedilatildeo 3 Raios X ndash
Espalhamento a baixo acircngulo 4 Soro do leite ndash Proteiacutenas I Netto Flaacutevia Maria II Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Engenharia de Alimentos III Tiacutetulo
iii
Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola
EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA NA β-LACTOGLOBULINA MODIFICACcedilOtildeES ESTRUTURAIS E
AGREGACcedilAtildeO
Tese apresentada agrave Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
Orientadora
Campinas -SP 2006
iv
v
BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
(ORIENTADORA) ndash DEPANFEAUNICAMP
Prof Dr Valdemiro Carlos Sgarbieri (MEMBRO) ndash DEPANFEAUNICAMP
Profa Dra Iacuteris Torriani (MEMBRO) ndash IFGWUNICAMP
Prof Dr Francisco Teixeira Pessine (MEMBRO) ndash IQMUNICAMP
Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco MEMBRO) ndash ITAL
Dra Susy Frey Sabato (MEMBRO) ndash IPEN
vi
vii
Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
iii
Luciacutea del Carmen de la Hoz Urrejola
EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA NA β-LACTOGLOBULINA MODIFICACcedilOtildeES ESTRUTURAIS E
AGREGACcedilAtildeO
Tese apresentada agrave Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
Orientadora
Campinas -SP 2006
iv
v
BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
(ORIENTADORA) ndash DEPANFEAUNICAMP
Prof Dr Valdemiro Carlos Sgarbieri (MEMBRO) ndash DEPANFEAUNICAMP
Profa Dra Iacuteris Torriani (MEMBRO) ndash IFGWUNICAMP
Prof Dr Francisco Teixeira Pessine (MEMBRO) ndash IQMUNICAMP
Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco MEMBRO) ndash ITAL
Dra Susy Frey Sabato (MEMBRO) ndash IPEN
vi
vii
Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
iv
v
BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
(ORIENTADORA) ndash DEPANFEAUNICAMP
Prof Dr Valdemiro Carlos Sgarbieri (MEMBRO) ndash DEPANFEAUNICAMP
Profa Dra Iacuteris Torriani (MEMBRO) ndash IFGWUNICAMP
Prof Dr Francisco Teixeira Pessine (MEMBRO) ndash IQMUNICAMP
Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco MEMBRO) ndash ITAL
Dra Susy Frey Sabato (MEMBRO) ndash IPEN
vi
vii
Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
v
BANCA EXAMINADORA
Profa Dra Flaacutevia Maria Netto
(ORIENTADORA) ndash DEPANFEAUNICAMP
Prof Dr Valdemiro Carlos Sgarbieri (MEMBRO) ndash DEPANFEAUNICAMP
Profa Dra Iacuteris Torriani (MEMBRO) ndash IFGWUNICAMP
Prof Dr Francisco Teixeira Pessine (MEMBRO) ndash IQMUNICAMP
Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco MEMBRO) ndash ITAL
Dra Susy Frey Sabato (MEMBRO) ndash IPEN
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vii
Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
vi
vii
Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
vii
Em especial dedico
As minhas filhas como siacutembolo de um novo
recomeccedilo na minha vida
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Aos professores e funcionaacuterios da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela
oportunidade de aprendizado e apoio na realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Profa Flavia Maria Netto pela orientaccedilatildeo pelo apoio constante e pela confianccedila e
oportunidade de desenvolver a minha tese
Agrave Profa Dra Iacuteris Torriani pela sua paciecircncia atenccedilatildeo e ajuda no propoacutesito da utilizaccedilatildeo
do Laboratoacuterio de luz Siacutencrotron pela sua colaboraccedilatildeo no projeto e pelos ensinamentos
sobre a teacutecnica de SAXS
Agrave Cristiano de Oliveira pela sua valiosa colaboraccedilatildeo nas anaacutelises de SAXS e pelas
discussotildees esclarecedoras
Ao Prof Dr Francisco Pessine pela sua pronta disposiccedilatildeo para esclarecer duacutevidas e pela
ajuda indispensaacutevel na correccedilatildeo da tese
Agrave Dra Maria Teresa Bertoldo Pacheco pela sua cooperaccedilatildeo na preparaccedilatildeo e discussatildeo
do projeto de tese
Ao Prof Dr Valdemiro Sgarbieri pelos ensinamentos e por partilhar comigo suas ideacuteias e
opiniotildees
A todos os membros da banca examinadora pelas valiosas correccedilotildees e sugestotildees que
permitiram aperfeiccediloar este trabalho
Agrave Profa Deacutebora Tavares pela amizade confianccedila e pelos seus conselhos e constante
apoio durante o tempo da realizaccedilatildeo de meu trabalho Obrigada pelas jornadas musicais
disfrutadas juntas
Ao Prof Carlos Grosso pelo estiacutemulo e pela atenccedilatildeo dispensada em todo momento que
precisei de sua experiecircncia e conhecimentos
x
xi
Ao IPEN na pessoa de Elizabeth Somessari e Carlos Gaia pela atenccedilatildeo e
responsabilidade em atender ao nosso pedido de realizar a irradiaccedilatildeo de nossas
amostras
Ao CENA-USP ESALQ na pessoa do Prof Dr Julio Walder que disponibilizou os
equipamentos para a irradiaccedilatildeo e agrave Gilberto Furlan pela sua pronta colaboraccedilatildeo na
irradiaccedilatildeo de nossas amostras
Agrave Profa Dra Eneida de Paula do Instituto de Biologia- Unicamp por disponibilizar o seu
laboratoacuterio para as determinaccedilotildees de fluorescecircncia
Agrave Daniel Rezza pela sua disposiccedilatildeo e ajuda na realizaccedilatildeo das anaacutelises de dicroiacutesmo
circular e discussotildees afins
Agraves colegas do laboratoacuterio de Bioquiacutemica Eliana Beth Duda Soninha Liz Andreacuteia
Mariza Bete pelos bons momentos partilhados pelo apoio amizade e carinho que me
permitiram uma estadia inesqueciacutevel e proveitosa enquanto a realizaccedilatildeo de meu trabalho
Agrave Suzi pela amizade bons momentos partilhados e pela ajuda nas anaacutelises estatiacutesticas
Ao Chico pelo apoio nas anaacutelises no laboratoacuterio central de instrumentaccedilatildeo e pelas
discussotildees esclarecedoras
Aacute Florencia Bia Maria Ineacutes Nonoacute mis queridas amigas gracias por la amistad incentivo
y lindos momentos compartidos
Agrave meu amigo Guillermo pelo incentivo e constante apoio obrigada pelos ensinamentos e
pelos cafezinhos disfrutados e ldquodiscutidosrdquo juntos
Agraveo CNPq pela bolsa de doutorado concedida
Agrave Davisco por ternos proporcionado a mateacuteria prima para nosso trabalho
A todos os que de alguma forma contribuiacuteram direta ou indiretamente para a realizaccedilatildeo
desta tese
Agrave minhas filhas que me compreenderam e apoiaram nesta nova empreitada
xii
xiii
IacuteNDICE
LISTA DE TABELAS xix
LISTA DE FIGURAS xxi
RESUMO xxix
ABSTRACT xxxiii
1 INTRODUCcedilAtildeO 1
2 OBJETIVOS 5
21 Geral 6
22 Especiacuteficos 6
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA 7
31 Proteiacutenas de soro de leite 8
32 β-lactoglobulinahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
321 Caracteriacutesticas estruturais 9
3211 Estrutura primaacuteria e secundaacuteria 9
3212 Estrutura terciaacuteria 9
322 Relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo 10
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas 10
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas 13
323 Digestibilidade da β-LG 14
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas 14
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG 15
331 Influecircncia do pH 17
332 Efeito do aquecimento 18
333 Influecircncia da alta pressatildeo hidrostaacutetica 19
334 Efeitos da irradiaccedilatildeo gama 20
xiv
xv
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo 22
341 Dicroiacutesmo Circular (CD) 23
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD 24
Espectro de CD no UV-longiacutenquo 25
Espectro de CD no UV-proacuteximo 26
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 27
343 Fluorescecircncia 29
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos 30
4 MATERIAL E MEacuteTODOS 33
41 Material e reagentes 34
42 Meacutetodos 35
421 Delineamento experimental 35
422 Irradiaccedilatildeo 35
423 Proteoacutelise enzimaacutetica 36
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos 36
Dicroiacutesmo Circular (CD) 36
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) 37
Grupos tiol (-SH) livres totais 37
Fluorescecircncia 37
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel 38
425 Meacutetodos cromatograacuteficos 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de fase reversa 39
Cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular 39
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida 40
427 Isotermas de sorccedilatildeo 40
428 Anaacutelises estatiacutesticas 40
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 41
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LGhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
xvi
xvii
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG 44
521 Mudanccedilas estruturais 44
Fluorescecircncia intriacutenseca 44
Dicroiacutesmo circular 48
Grupos sulfidrila livre 59
522 Agregaccedilatildeo 61
Turbidez medida pela transmitacircncia a 550 nm 61
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 62
Cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) 64
SAXS 67
523 Mecanismos de agregaccedilatildeo 83
Eletroforese em gel (SDS-PAGE) 84
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil 85
524 Mudanccedilas na funcionalidade 87
Poder ligante do retinol 87
Susceptibilidade agraves proteases 88
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 93
7 CONCLUSOtildeES 99
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 101
xviii
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
35
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
35
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do seu espectro de UV-longiacutenquo
49
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na literatura
49
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida 52 Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e 10mgmL)
56
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de radiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
60
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida (aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL) lida nestas mesmas concentraccedilotildees
62
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama na forma soacutelida
71
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos nas medidas experimentais de espalhamento de raios-X da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama em soluccedilatildeo
78
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas isoformas A e B
10
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemero 24 Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas
25
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente
29
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 125 Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG-022
42
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05 mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40degC A eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mLmin em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
43
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC 44 Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras (aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) (aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw 074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
45
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A) (10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3 C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
46
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
51
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
51
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
52
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1))
53
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
53
xxii
xxiii
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
54
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
54
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
55
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevelable (3) oligocircmeros (4) agregados Ref Carrota et al (2001)
57
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
58
Figura 20Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
58
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves amostras de β-LG irradiadas com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2 corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
63
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses de 10 5 25 1 e 0 kGy
64
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
65
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy (C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
66
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3) 10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
67
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva de ajuste com dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e C0A3
69
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
70
xxiv
xxv
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
72
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as amostras foram submetidas a 250 kGy
73
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
74
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias C graacutefico de Kratky e D curva de ajuste com dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo irradiada
75
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 5 kGy
76
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 26 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
77
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 80 Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10 80 Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10 81 Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10 81 Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy 82 Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG-L3 irradiada com 5 kGy 83 Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e (B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
84
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
85
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondentes a uma mesma dose de radiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
86
xxvi
xxvii
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
88
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
89
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
90
Figura 46 Aacutereas dos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes dose (0 10 25 e 50 kGy) Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (corre spondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Numa mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor (correspondente a uma mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
91
xxviii
xxix
Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-lactoglobulina modificaccedilotildees estruturais e agregaccedilatildeo
RESUMO
Amostras de β-lactoglobulina (β-LG) no estado soacutelido com diferentes atividades de
aacutegua (aw) (022 053 074) ou em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 e 10
mgmL foram irradiadas (1-50 kGy) utilizando uma fonte de Cobalto-60 Espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos (SAXS) dicroiacutesmo circular (CD) e fluorescecircncia foram as
teacutecnicas utilizadas para estudar as mudanccedilas conformacionais da β-LG por efeito da
irradiaccedilatildeo A proteiacutena irradiada foi tambeacutem examinada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) e desnaturante (SDS-PAGE) sob condiccedilotildees redutoras e natildeo
redutoras cromatografia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC) e ndashSH livre A β-LG no estado
soacutelido nas diferentes aw estudadas natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo As amostras natildeo
apresentaram diminuiccedilatildeo na digestibilidade sob accedilatildeo da pepsina e tripsina e natildeo
mudaram seu poder ligante de retinol quando irradiadas com doses ateacute 10 kGy Nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo houve modificaccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura
terciaacuteria enquanto a estrutura secundaacuteria parece ter sido preservada como indicado pela
quantificaccedilatildeo das estruturas obtidas a partir da deconvoluccedilatildeo dos espectros de CD no
UV-longiacutenquo Os dados de SE-HPLC e espalhamento de raios-X mostraram que a
irradiaccedilatildeo promoveu a formaccedilatildeo de oligocircmeros e agregados que resultaram ser
altamente soluacuteveis como mostrado pelas medidas de turbidez Da anaacutelise dos dados de
SAXS e a construccedilatildeo de modelos pode ser mostrado que os oligocircmeros eram muacuteltiplos
de diacutemeros de β-LG (tetracircmeros e hexacircmeros etc) linearmente ordenados Ligaccedilotildees
cruzadas intermoleculares entre radicais tirosil teriam participaccedilatildeo na agregaccedilatildeo e as
ligaccedilotildees dissulfeto pelo contraacuterio natildeo teriam sido relevantes para a formaccedilatildeo dos
agregados O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG mediante ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil
contraacuterio ao que acontece em outros tratamentos fiacutesicos como o teacutermico ou de alta
pressatildeo hidrostaacutetica poderia estar gerando agregados com caracteriacutesticas e propriedades
diferentes O efeito da irradiaccedilatildeo na proteiacutena foi maior nas amostras mais diluiacutedas e com
maior dose de radiaccedilatildeo indicaccedilatildeo da ocorrecircncia do chamado ldquoefeito indiretordquo da
irradiaccedilatildeo Considerando que natildeo houve alteraccedilotildees estruturais nem perda de
funcionalidade ou de digestibilidade da β-LG irradiada no estado soacutelido ateacute com 10 kGy
em diferentes aw o tratamento com radiaccedilatildeo gama poderia ser usado para melhorar a
xxx
xxxi
qualidade microbioloacutegica da proteiacutena e aumentar as condiccedilotildees de seguranccedila se for
aplicada uma radiaccedilatildeo na faixa geralmente utilizada no processamento de alimentos (lt10
kGy)
Palavras chave Dicroiacutesmo circular complexo β-lactoglobulina-retinol agregaccedilatildeo de
proteiacutena espalhamento de raios-X a baixos acircngulos proteiacutenas do soro de leite
xxxii
xxxiii
Gamma radiation effects on β-lactoglobulin structural modifications and aggregation
ABSTRACT
β-lactoglobulin (β-LG) in solution at different protein concentrations (3 and 10 mgmL)
and in solid state with different water activity (aw) (022 053 074) was irradiated using a
Cobalt-60 radiation source at a dose level of 1-50 kGy Small-angle X-ray scattering
(SAXS) Circular Dichroism (CD) and Fluorescence spectroscopy were used to study the
conformational changes of β-LG due the irradiation treatment The irradiated protein was
also examined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate
(SDS) PAGE under reducing and nonreducing conditions size exclusion chromatography
(SE-HPLC) and free SH β-LG in the solid state at different aw was not significantly
affected by gamma radiation The digestibility of these samples under pepsin or trypsin
action was not diminished and the retinol binding property was not changed by irradiation
up to 10 kGy The irradiation of β-LG in solution promoted structural changes at the tertiary
structure level but the secondary structure seemed to be maintained as indicated by the
quantification of structures from the deconvolution of the far-UV CD spectra The SE-
HPLC and X-rays scattering data showed that irradiation of β-LG solutions promoted
oligomers and aggregates formation which proved to be highly soluble as shown by
turbidity measurements From the SAXS data analyses and the model building it could be
shown that the formed oligomers were linear molecules built by linear combinations of β-
LG dimers (tetramers hexamers etc) Formation of intermolecular cross-linking between
tyrosil radicals are proposed to be at least partially responsible by this occurrence and the
disulphide bonds in contrast do not appear to be relevant to the formation of these
aggregates The mechanism of aggregation of β-LG through bityrosil cross-links
differently from the mechanism occurring in other physical treatments as heating or high
pressure could form aggregates with special and different characteristics The radiation
effect was more significant at low protein concentration and higher irradiation dose being
consistent with the occurrence of the ldquoindirect effectrdquo when proteins are irradiated in
solution Considering that neither structural changes or loss of functionality and digestibility
of β-LG irradiated in the solid state at different aw with dose up to 10 kGy was detected
the gamma radiation treatment could be used for improving the microbiological quality of
xxxiv
xxxv
the protein enhancing the safety conditions when applying the radiation range generally
used in food processing (lt10kGy)
Keywords Circular dichroism retinol-β-lactoglobulin complex aggregation of protein
small-angle X-ray scattering protein digestibility whey
xxxvi
1 Introduccedilatildeo 1
1 INTRODUCcedilAtildeO
1 Introduccedilatildeo 2
1 INTRODUCcedilAtildeO
O soro de leite bovino foi considerado em deacutecadas passadas como resiacuteduo
industrial altamente poluente proveniente da fabricaccedilatildeo do queijo Atualmente eacute uma
fonte proteica de grande importacircncia que possui excelentes propriedades nutritivas e
funcionais Como resultado de inuacutemeros estudos realizados novos conhecimentos sobre
as propriedades tecnoloacutegicas e fisioloacutegicas de suas proteiacutenas constituintes tecircm
contribuiacutedo para incrementar a sua aplicaccedilatildeo como ingrediente alimentiacutecio Os
concentrados de proteiacutena do soro constituem uma importante fonte de ingredientes
funcionais utilizados em diversas formulaccedilotildees alimentares incluindo carnes processadas
produtos laacutecteos e de panificaccedilatildeo (KINSELLA WHITEHEAD 1989 DE WIT 1998
HUFFMAN HARPER 1999)
A β-lactoglobulina (β-LG) eacute a principal proteiacutena do soro de leite bovino
constituindo ao redor de 50 do seu total pelo que tende a comandar o comportamento
geral do sistema de proteiacutenas de soro (PALAZOLO et al 2000) A sua estrutura
particular do tipo lipocalina apresenta uma espeacutecie de caacutelice de caraacuteter hidrofoacutebico o
qual lhe confere propriedades funcionais de grande importacircncia para a induacutestria de
alimentos como a capacidade de emulsificaccedilatildeo formaccedilatildeo de espuma geleificaccedilatildeo e de
ligaccedilatildeo com aromatizantes (MORR FOEGEDING 1990) Com o desenvolvimento do
processo de ultrafiltraccedilatildeo com membranas ela pode ser obtida na sua forma nativa em
grandes quantidades e com alto grau de pureza (MAUBOIS et al 1987 IMAFIDON
FARKYE SPANIER 1997 HUFFMAN HARPER 1999)
A estrutura da β-LG contribui para que ela seja uma proteiacutena bastante estaacutevel em
soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH apresentando no entanto diferentes estados de
associaccedilatildeo (TAULIER CHALIKIAN 2001) Pela sua caracteriacutestica estrutural a β-LG eacute
uma proteiacutena especialmente resistente agrave proteoacutelise pela pepsina e quimotripsina (REDDY
KELLA KINSELLA 1988) A β-LG eacute considerada como a proteiacutena com maior potencial
alergecircnico dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985
SEacuteLO et al 1999)
A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e o aquecimento geralmente utilizado no
processamento de alimentos com diversas finalidades pode ocasionar desnaturaccedilatildeo
Alteraccedilotildees na estrutura da proteiacutena podem alterar sua funcionalidade e tratamentos
aplicados no processamento tecircm o potencial de transformar a estrutura nativa em estados
natildeo nativos (FARREL et al 2002) Alguns efeitos indesejaacuteveis podem surgir como a
perda de solubilidade poreacutem um tratamento controlado pode tambeacutem originar efeitos
1 Introduccedilatildeo 3
desejaacuteveis tais como uma melhora nas propriedades funcionais de superfiacutecie (espumante
e emulsificantes) (IBRAHIM KOBAYASHY KATO 1993)
A descontaminaccedilatildeo de alimentos pela radiaccedilatildeo ionizante eacute um processo seguro
eficiente e ambientalmente limpo (FARKAS 1998) Tem sido uma das tecnologias mais
discutidas e polecircmicas dos uacuteltimos anos no entanto estaacute aprovada em 37 paiacuteses
(BRENNNAND 1995) A irradiaccedilatildeo com raios gama eacute um tratamento que vem sendo
utilizado como meio de diminuir a carga microbiana de diversos alimentos
proporcionando maior vida de prateleira A radiaccedilatildeo gama em dose que atenda ao
requisito de pasteurizaccedilatildeo poderia levar vantagem sobre o tratamento teacutermico ao evitar a
exposiccedilatildeo da proteiacutena a temperaturas que conhecidamente estariam causando efeitos
deleteacuterios afetando suas propriedades funcionais Aleacutem disso o tratamento permite a
aplicaccedilatildeo direta da radiaccedilatildeo na sua embalagem final (FARKAS 1998)
Existe tambeacutem grande potencial de aplicaccedilatildeo da radiaccedilatildeo para propoacutesitos
tecnoloacutegicos como por exemplo a obtenccedilatildeo de melhorias na cor de produtos caacuterneos
(BYUN et al 1999) e das propriedades mecacircnicas de filmes comestiacuteveis biodegradaacuteveis
desenvolvidos com proteiacutenas (BRAULT DrsquoAPRANO LACROIX 1997 SABATO et al
2001 LETENDRE et al 2002) Biofilme obtido de soluccedilotildees de proteiacutenas de soro de leite
irradiadas exibiu melhores propriedades que os obtidos por tratamento teacutermico (LE TIEN
et al 2000) A radiaccedilatildeo ionizante tambeacutem tem sido estudada como meio para reduzir a
imunogenicidade de alguns aleacutergenos do leite como a β-lactoglobulina (LEE et al 2001)
No entanto faltam estudos sobre o efeito da irradiaccedilatildeo na estrutura e processo de
agregaccedilatildeo essenciais para o entendimento e controle de suas propriedades tecnoloacutegicas
e nutricionais Para explicar a mudanccedila conformacional e o comportamento na
desnaturaccedilatildeo da proteiacutena eacute necessaacuterio o conhecimento completo da sua estrutura No
caso da β-LG tem-se informaccedilotildees detalhadas da sua estrutura seja por difraccedilatildeo de raios-
X da proteiacutena cristalizada ou por Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica (NMR) da proteiacutena em
soluccedilatildeo As macromoleacuteculas em soluccedilatildeo apresentam importantes efeitos de
espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) que permitem determinar vaacuterias
caracteriacutesticas geomeacutetricas tais como raio de giro dimensatildeo maacutexima volume superfiacutecie
molecular e curvas de distribuiccedilatildeo de distacircncias intramoleculares relacionadas com a
forma da moleacutecula (PESSEN KUMOSINSKI TIMASHEFF 1971 WITZ TIMASHEFF
LUZZATI 1964) Estes efeitos permitem caracterizar o estado conformacional da proteiacutena
e suas alteraccedilotildees decorrentes dos diversos tratamentos
1 Introduccedilatildeo 4
As teacutecnicas de SAXS e de dicroiacutesmo circular tecircm sido utilizadas com sucesso nas
anaacutelises dos estados de associaccedilatildeo da β-LG induzidos por sais (BALDINI et al 1999) e
das caracteriacutesticas de oligocircmeros isolados resultantes de tratamento teacutermico da β-LG
(CARROTA et al 2001 2003) A desnaturaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da β-LG induzida por
pressatildeo e temperatura foram tambeacutem monitoradas por SAXS em estudo de Panick
Malessa e Winter (1999)
Este estudo tem como objetivo avaliar as mudanccedilas conformacionais da proteiacutena
por efeito da radiaccedilatildeo gama e tentar delinear o possiacutevel processo de agregaccedilatildeo utilizando
as teacutecnicas analiacuteticas de espalhamento de raios-X a baixos acircngulos dicroiacutesmo circular
fluorescecircncia cromatografia de exclusatildeo molecular e eletroforese em gel de
poliacrilamida Nestas circunstacircncias mostra-se interessante a irradiaccedilatildeo da β-LG tanto
no estado soacutelido como em diferentes graus de atividade de aacutegua e em soluccedilatildeo para
melhor avaliar a magnitude do efeito produzido na proteiacutena em estudo
2 Objetivos 5
2 OBJETIVOS
2 Objetivos 6
2 OBJETIVOS
21 Objetivo Geral
Estudar as alteraccedilotildees estruturais o processo de agregaccedilatildeo e a funcionalidade da β-LG submetida agrave radiaccedilatildeo gama
22 Objetivos especiacuteficos
Estudar as alteraccedilotildees nas estruturas secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG tratada
com radiaccedilatildeo gama utilizando dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia
Delinear o processo de formaccedilatildeo de oligocircmeros e de agregaccedilatildeo utilizando a
teacutecnica de SAXS e cromatografia de exclusatildeo molecular
Estudar o mecanismo envolvido na oligomerizaccedilatildeo e agregaccedilatildeo da proteiacutena e
propor modelos para os oligocircmeros formados
Estudar a funcionalidade da proteiacutena irradiada mediante estudo da sua
capacidade ligante de retinol e de sua digestibilidade
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 7
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 8
3 REVISAtildeO BIBLIOGRAacuteFICA
31 Proteiacutenas do soro de leite
Historicamente as proteiacutenas do soro de leite foram consideradas produto residual
na induacutestria de fabricaccedilatildeo do queijo Nas uacuteltimas deacutecadas ganharam o status de produto
de alto valor agregado ao serem obtidas na forma de concentrados proteacuteicos com
diferentes teores de proteiacutenas As proteiacutenas do soro incluem α-lactalbumina β-
lactoglobulina albumina seacuterica bovina lactoferrina lactoperoxidase imunoglobulinas e
uma variedade de fatores de crescimento
As proteiacutenas de soro cumprem papel importante na nutriccedilatildeo por serem uma fonte
excepcionalmente rica e balanceada de aminoaacutecidos (REGESTER et al 1996) aleacutem de
apresentarem accedilotildees fisioloacutegicas especiacuteficas in vivo (McINTOSH et al 1998) Entre as
accedilotildees fisioloacutegicas a elas atribuiacutedas estatildeo estimulante do sistema imunoloacutegico
antioxidante antihipertensiva antitumoral protetora da mucosa gaacutestrica contra a
agressatildeo de agentes ulcerogecircnicos protetora contra vaacuterios tipos de cacircncer antiviral e
antibacterial Importantes artigos de revisatildeo abordando as variadas propriedades
fisioloacutegicas destas proteiacutenas tecircm sido publicados (MARSHALL 2004 SGARBIERI 2004)
Por outro lado elas apresentam boas propriedades funcionais tecnoloacutegicas que derivam
principalmente da sua elevada solubilidade em uma ampla faixa de pH Destacam-se o
poder geleificante a propriedade formadora de espuma e a capacidade de emulsificar
quantidades significantes de lipiacutedeos (MARSHALL HARPER 1988)
A β-lactoglobulina eacute a principal proteiacutena do soro do leite bovino perfazendo de 7 a
12 do total de proteiacutenas no leite desnatado (WONG CAMIRAND PAVLATH 1996) Sua
funccedilatildeo bioloacutegica ainda natildeo estaacute totalmente elucidada no entanto vaacuterios experimentos
tecircm revelado que a proteiacutena nativa eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
como retinol e aacutecidos graxos (PANICK MALESSA WINTER 1999) Sua estrutura do tipo
lipocalina lhe confere a caracteriacutestica de ser a principal proteiacutena alergecircnica do leite
(SPIES 1973 OTANI UCHIO TOKITA 1985 KURISAKI et al 1982 CLEMENT et al
2002)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 9
32 β-Lactoglobulina
321 Caracteriacutesticas estruturais
A estrutura da β-LG eacute responsaacutevel pela sua estabilidade em soluccedilatildeo em um amplo
intervalo de pH e tambeacutem pelas suas propriedades funcionais capacidade geleificante
emulsificante formadora de espuma e ligante de pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas
(MORR FOEGEDING 1990)
3211 Estruturas primaacuteria e secundaacuteria
A β-LG eacute uma pequena proteiacutena globular constituiacuteda por 162 aminoaacutecidos
apresentando duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre A estrutura secundaacuteria consiste
de folhas-β antiparalelas formadas por nove filamentos-β (β-strands) A estrutura cristalina
mostra que o monocircmero consiste predominantemente de folhas-β (50) e uma pequena
porccedilatildeo de heacutelices-α (15) estruturas ao acaso ou desordenadas (15) e estruturas turns
(20) (PAPIZ et al1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al 1997)
Diversas variantes foram identificadas no leite bovino mas as duas principais satildeo
a β-LG A e B que apresentam diferenccedilas nos aminoaacutecidos na posiccedilatildeo 64 e 118 sendo
Asp64 e Val118 para β-LG A e Gly64 e Ala118 para a β-LG B A massa molar da variante
geneacutetica A eacute 18362 Da e da variante B 18276 Da O ponto isoeleacutetrico da β-LG eacute ao
redor de 52 levemente mais alto para a variante B que para a variante A (FOX
McSWEENEY 1998)
3212 Estrutura terciaacuteria
A conformaccedilatildeo espacial da β-LG foi completamente elucidada por Brownlow et al
(1997) Possui oito filamentos β denominadas de A agrave G (Figura 1) formando folhas-β
antiparalelas que se arranjam formando uma espeacutecie de caacutelice ou barril achatado capaz
de ligar e acomodar pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas no seu interior A β-LG eacute entatildeo
categorizada como um membro da famiacutelia das lipocalinas que compreende as proteiacutenas
com funccedilatildeo de transporte (ROUVINEN et al 1999) A estrutura tambeacutem conteacutem um curto
filamento-β (I) (em vermelho na Figura 1) uma heacutelice 310 entre os filamentos A e B uma
heacutelice-α entre os filamentos H e I (cor laranja na Figura 1) e uma heacutelice 310 C-terminal A
Figura 1 apresenta a estrutura da β-LG baseada em dados cristalograacuteficos de raios-X do
Banco de Dados de Proteiacutenas e produzida usando MOLSCRIPT (KRAULIS 1991)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 10
Figura 1 Diagrama em fitas da β-lactoglobulina indicando as posiccedilotildees de substituiccedilatildeo dos aminoaacutecidos nas
isoformas A e B (Ref BOTELHO et al 2000)
322 Relaccedilatildeo estrutura- funccedilatildeo
3221 Estrutura e propriedades tecnoloacutegicas Alteraccedilotildees conformacionais da proteiacutena a partir do seu estado nativo tecircm levado agrave
elucidaccedilatildeo da relaccedilatildeo estrutura-funccedilatildeo em estudo da capacidade de formaccedilatildeo e de
estabilizaccedilatildeo de espuma (PHILLIPS HAWKS GERMAN 1995) ou na propriedade de
formaccedilatildeo de geacuteis da β-LG (STADING LANGTON HERMANSSON 1993)
A capacidade da β-LG de ligar-se aos aacutecidos graxos tem sido explorada em seu
uso como agente emulsificante na induacutestria de alimentos (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI
1985) As propriedades emulsificantes da β-LG mudam dependendo do pH Menor
atividade emulsificante e de superfiacutecie foi observada em meio aacutecido (pH 3) quando
comparada a meio neutro possivelmente devido agrave baixa flexibilidade das moleacuteculas neste
pH (SHIMIZU SAITO YAMAUCHI 1985)
A formaccedilatildeo de filme interfacial e a de espuma satildeo predominantemente
dependentes da hidrofobicidade superficial e da flexibilidade da proteiacutena Qualquer
mudanccedila que altere um destes fatores resultaraacute em mudanccedila nas propriedades de
formaccedilatildeo de espuma do sistema Phillips Hawks e German (1995) observaram forte
correlaccedilatildeo entre a estrutura secundaacuteria da β-LG em soluccedilatildeo e as propriedades
espumantes
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 11
Proteiacutenas globulares formam dois tipos de geacuteis dependendo da quantidade de
carga que a proteiacutena nativa carrega A β-LG que eacute uma proteiacutena globular forma geacuteis
particulados brancos na regiatildeo de pH 4-6 e geacuteis transparentes constituiacutedos por uma rede
de filamentos finos abaixo e acima deste intervalo de pH (LANGTON HERMANSSON
1992)
A estrutura conformacional do tipo lipocalina eacute a responsaacutevel pela interaccedilatildeo da β-
LG com o retinol e pequenos aacutecidos graxos Em 1972 Futterman e Heller usando teacutecnica
de fluorescecircncia demonstraram que a β-LG bovina assim como a proteiacutena ligante de
retinol (RBP) formam complexos com retinol soluacuteveis em aacutegua A ligaccedilatildeo de retinol com
β-LG envolve principalmente interaccedilotildees hidrofoacutebicas (FUGATE SONG 1980 JANG
SWAISGOOD 1990) Assim a porccedilatildeo apolar do ligante eacute amplamente responsaacutevel pela
ligaccedilatildeo e o siacutetio de ligaccedilatildeo provavelmente inclui resiacuteduos de triptofano que servem para
fixar o anel da β-ionona do retinol (FUGATE SONG 1980) Vaacuterios estudos tecircm sido feitos
com o propoacutesito de definir os siacutetios de ligaccedilatildeo existentes na β-LG para o retinol mas um
consenso natildeo tem sido atingido Para Papiz et al (1986) e Cho Batt e Sawyer (1994) o
retinol liga-se na regiatildeo interna do caacutelice hidrofoacutebico Jaacute para Monaco et al (1987) e
Lange et al (1998) o siacutetio de ligaccedilatildeo estaria na regiatildeo externa da estrutura proteica na
fenda de entrada do caacutelice Moleacuteculas como porfirinas e bilirubinas se ligam na entrada da
cavidade localizada atraacutes da heacutelice-α (ZSILA 2003)
Eacute conhecido que in vitro a β-LG liga fortemente uma moleacutecula de retinol por
monocircmero mas observaccedilotildees de Dufour e Haertle (1990) apontam que a estequiometria
pode ser dobrada quando a β-LG estaacute no estado molten globule que pode ser induzido
por mudanccedilas na polaridade do meio
Estudos sobre a ligaccedilatildeo da β-LG com ligantes em soluccedilatildeo tem sido realizados
utilizando diversas teacutecnicas espectroscoacutepicas incluindo Ressonacircncia Nuclear Magneacutetica
(NMR) cromatografia de afinidade e equiliacutebrio de diaacutelise (WANG ALLEN SWAISGOOD
1997 CURLEY et al 1999 RAGONA et al 2000 SAWYER KONTOPIDIS 2000
MURESAN VAN DER BENT DE WOLF 2001) A maioria dos estudos cristalograacuteficos
com ligantes (palmitato retinol e colesterol) tem mostrado que estes se ligam dentro da
cavidade central da proteiacutena (QIN et al 1998 WU et al 1999 SAWYER KONTOPIDIS
2000) O efeito desta ligaccedilatildeo eacute um aumento na estabilizaccedilatildeo da proteiacutena agrave desnaturaccedilatildeo
teacutermica e pela ureacuteia (DUFOUR BERTRAND-HARB HAERTLEacute 1993 PUYOL et al
1994 JAMESON ADAMS CREAMER 2002) Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) foi usada para estudo da estabilidade teacutermica da β-LG ligada ao retinol (PUYOL et
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 12
al 1994) O pico de temperatura maacutexima e a entalpia aparente de desnaturaccedilatildeo da β-LG
mostraram um leve aumento quando comparada agrave β-LG natildeo ligada (795plusmn 05degC e
2675plusmn265 kJmol respectivamente)
A percepccedilatildeo de aromatizantes em alimentos eacute altamente influenciada pelas
interaccedilotildees entre eles e outros componente da matriz A forccedila e natureza das interaccedilotildees
afetam a liberaccedilatildeo do aroma durante o processamento ou consumo de alimentos
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000) Em soluccedilatildeo aquosa a presenccedila de β-LG induz
diminuiccedilatildeo da volatilidade da maioria dos compostos aromatizantes hidrofoacutebicos
principalmente devido agraves interaccedilotildees na cavidade central da proteiacutena diminuindo
significativamente a percepccedilatildeo do odor Em emulsotildees a presenccedila de β-LG na interface
oacuteleo-aacutegua aumenta a resistecircncia agrave transferecircncia de massa para a maioria dos compostos
hidrofoacutebicos o que pode induzir a alguma persistecircncia do aroma durante a degustaccedilatildeo
(GUICHARD LANGOURIEUX 2000)
A propriedade da β-LG de se ligar a um sem nuacutemero de pequenas moleacuteculas
hidrofoacutebicas passa a ser de grande interesse para a induacutestria farmacecircutica e de
alimentos Dentre os ligantes mais estudados com relaccedilatildeo a β-LG estatildeo o retinol
(DUFOUR MARDEN HAERTLEacute 1990 FUGATE SONG 1980 BYCHKOVA et al 1992
CHO BATTS SAWYERS 1994) aacutecido retinoacuteico (ZSILA BIKAacuteDI SIMONYI 2002) retinil
acetato β-caroteno (DOUFOUR HAERTLEacute 1991) colesterol protoporfirina (DUFOUR
MARDEN HAERTLEacute 1990) bilirubina (ZSILA 2003)
Em estudo de Moller Stapelfeldt e Skibsted (1998) o tratamento com alta pressatildeo
hidrostaacutetica (ateacute 400 MPa) levou a β-LG a apresentar propriedades antioxidantes
relacionadas ao grupo tiol da β-LG Na proteiacutena desnaturada pela accedilatildeo da alta pressatildeo o
grupo sulfidrila livre fica mais exposto e ativo Este grupo atuaria como antioxidante
interrompendo a propagaccedilatildeo da cadeia de peroxidaccedilatildeo do aacutecido linoleacuteico em emulsotildees
oacuteleo em aacutegua formando radicais estaacuteveis na reaccedilatildeo com grupos peroxi de lipiacutedeos
ROO + R-SH ROOH + R-S
A β-LG apresenta efeito protetor na destruiccedilatildeo teacutermica do aacutecido ascoacuterbico em
soluccedilatildeo aquosa (DAI-DONG NOVAK HARDY 1990) O efeito protetor pode ser devido
ao efeito antioxidante do grupo tiol presente nos resiacuteduos de cisteiacutena da proteiacutena
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 13
3222 Estrutura e propriedades fisioloacutegicas da β-LG
Estudos sobre propriedades fisioloacutegicas da β-LG mostram os diversos efeitos que
esta proteiacutena poderia causar no organismo enquanto manteacutem em parte sua conformaccedilatildeo
nativa ou quando hidrolisada pela accedilatildeo das enzimas proteoliacuteticas digestivas Alguns
exemplos satildeo apresentados a seguir
Puyol et al (1995) utilizaram monocamadas de ceacutelulas Caco-2 (cultura de tecido
como enteroacutecito de carcinoma de coacutelon humano) para estudar o efeito da β-LG na
absorccedilatildeo e transporte do retinol e aacutecido palmiacutetico Esta linha de ceacutelulas possui
caracteriacutesticas morfoloacutegicas e bioquiacutemicas similares agraves das ceacutelulas intestinais absortivas
como a polarizaccedilatildeo e a expressatildeo de vaacuterias enzimas da borda de escova O estudo
demonstrou que a β-LG como proteiacutena ligante pode facilitar a entrada de aacutecido palmiacutetico e
retinol por essas ceacutelulas
Neurath et al (1996) verificaram que a β-LG ligada ao anidrido 3-hidroxiftaacutelico
forma um composto (3-HP-β-LG) que bloquea o viacuterus HIV ligando-se ao receptor do viacuterus
Ouwehand et al (1997) descreveram o poder da β-LG em inibir a adesatildeo de
enteropatoacutegenos agraves glicoproteiacutenas de ileostomia humana impedindo a infecccedilatildeo em um
primeiro estagio da colonizaccedilatildeo Quando as pontes dissulfeto eram reduzidas a proteiacutena
natildeo mais apresentava esta atividade sugerindo que sua estrutura com as pontes
dissulfeto e aacutereas circundantes preservadas eram cruciais para ela apresentar esta
atividade
Em estudo realizado por Nagaoka et al (2001) foi observado que peptiacutedeos
triacutepticos derivados da β-LG bovina induziram a supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
evidenciado tanto pelas medidas de absorccedilatildeo de colesterol in vivo como pelo estudo in
vitro com ceacutelulas Caco-2 O peptiacutedeo derivado da β-LG IIAEK pode influenciar
poderosamente o niacutevel de colesterol seacuterico e a sua atividade hipocolesterolecircmica foi maior
que a do medicamento β-sitosterol em ratos O estudo sugere que haveria uma interaccedilatildeo
direta no epiteacutelio intestinal entre o colesterol misturado agraves micelas e o hidrolisado triacuteptico
da β-LG Esta interaccedilatildeo causaria inibiccedilatildeo da solubilidade micelar de colesterol levando
assim agrave supressatildeo da absorccedilatildeo do colesterol
A digestatildeo proteoliacutetica por tripsina gera alguns peptiacutedeos com atividade bactericida
(PELLEGRINI et al 2001) A atividade bactericida dos fragmentos de β-LG que eram
negativamente carregados foi restrita a bacteacuterias Gram-positivas
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 14
Mullaly Meisel e Fitzgerald (1997) analisaram a atividade antihipertensiva de
hidrolisados enzimaacuteticos de β-LG determinada pela capacidade de inibiccedilatildeo da enzima
conversora da angiotensina I Os autores reportaram que permeados de 3 kDa de
hidrolisados triacutepticos apresentaram maior atividade que os hidrolisados triacutepticos natildeo
fracionados e maior atividade que a proteiacutena natildeo hidrolisada equivalente a 87 de
inibiccedilatildeo e com um C50 de 130 mgL (mg de proteiacutena por litro de hidrolisado)
323 Digestibilidade da β-LG
A estrutura compacta da β-LG estabilizada por duas pontes dissulfeto faz desta
proteiacutena um substrato pobre para muitas enzimas A β-LG nativa eacute hidrolisada facilmente
pela tripsina mas eacute resistente agrave digestibilidade peacuteptica e quimiotriacuteptica O aquecimento
ateacute 70degC natildeo altera sua resistecircncia agrave digestibilidade peacuteptica e somente o tratamento
teacutermico agrave temperatura entre 80 - 90degC diminui sua resistecircncia agrave hidroacutelise (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
Outros tratamentos como o de alta pressatildeo hidrostaacutetica ou o uso de diferentes
solventes podem aumentar sua susceptibilidade agrave hidroacutelise enzimaacutetica (DIB et al 1996
STAPELFELDT et al 1996)
Os efeitos da radiaccedilatildeo gama na digestibilidade in vitro e na liberaccedilatildeo de
aminoaacutecidos da β-LG foram investigados por Voisine Parent e Savoie (1990) em
amostras liacutequidas ou congeladas (ambas com aw 093) ajustadas a pH 52 ou 70 e em
amostras secas (aw 013) e irradiadas com doses de 1-50 kGy A composiccedilatildeo
aminoaciacutedica a digestibilidade in vitro e a liberaccedilatildeo de aminoaacutecidos natildeo foram diminuiacutedas
pela irradiaccedilatildeo ateacute as mais altas doses (50 kGy) Os autores concluiacuteram que a qualidade
nutricional da β-LG natildeo foi afetada pela irradiaccedilatildeo nas doses recomendadas para o
processamento de alimentos (lt10 kGy)
324 Propriedades antigecircnicas e alergecircnicas
A atividade antigecircnica de proteiacutenas refere-se ao reconhecimento de alguns
epiacutetopos nas proteiacutenas por anticorpos especiacuteficos (ABBAS LITCHMAN 2005) e o termo
ldquoalergiardquo refere-se agraves condiccedilotildees cliacutenicas causadas por resposta imune improacutepria e
prejudicial em pessoas geneticamente predispostas A alergia alimentar eacute definida como
uma reaccedilatildeo adversa a um alimento devido a um mecanismo imunoloacutegico envolvendo
principalmente reaccedilotildees mediadas pelas imunoglobulinas E (Ig-E) (BUSINCO BRUNO
GIAMPIETRO 1998)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 15
Quase todas as proteiacutenas do leite satildeo antigecircnicas e embora nem todas as
substacircncias antigecircnicas tenham sido caracterizadas como alergecircnicas elas devem ser
consideradas como alergecircnicas potenciais (SPIES 1973) A atividade alergecircnica das
proteiacutenas β-LG α-lactalbumina (α-La) albumina de soro bovina (BSA) e caseiacutena tem sido
as mais estudadas dentre as proteiacutenas do leite (SPIES 1973)
A β-LG se apresenta como particularmente alergecircnica devido a sua caracteriacutestica
conformacional Em anos recentes tem se evidenciado que praticamente todos os
aleacutergenos respiratoacuterios caracterizados a niacutevel molecular do tipo animal pertencem a
famiacutelia das lipocalinas agrave qual tambeacutem pertence a β-LG (MAumlNTYJAumlRVI RAUTIAINEN
VIRTANEN 2000)
Estudos reportados inicialmente por Otani Uchio e Tokita (1985) e Kurisaki et al
(1982) mostraram que a estrutura terciaacuteria da β-LG era necessaacuteria para sua
imunoreatividade Recentemente CLEMENT et al (2002) realizaram um estudo completo
da antigenicidade da β-LG utilizando anticorpos monoclonais (mAb) Eles reportaram que
natildeo somente na heacutelice-α e laccedilos externos havia regiotildees antigecircnicas mas que tambeacutem as
folhas β continham epiacutetopos (CLEMENT et al 2002)
Ao que parece segundo Seacutelo et al (1999) nenhuma forma estrutural em particular
eacute responsaacutevel por um grau maior de alergenicidade na β-LG Os epiacutetopos satildeo numerosos
e amplamente difundidos ao longo da moleacutecula Eles podem estar localizados nas partes
hidrofoacutebicas da moleacutecula inacessiacuteveis para os anticorpos IgE na conformaccedilatildeo nativa da
proteiacutena mas chegam a ser bio-acessiacuteveis depois do processo digestoacuterio Hidrolisados de
β-LG retecircm a maior parte da immunoreatividade da proteiacutena nativa Vaacuterios peptiacutedeos
triacutepticos capazes de ligar-se especificamente agraves IgsE em humanos tecircm sido
identificados
33 Efeito do processamento na estrutura e nas propriedades da β-LG
As alteraccedilotildees estruturais da β-LG satildeo de grande interesse jaacute que suas
propriedades funcionais e bioloacutegicas satildeo altamente afetadas pela sua conformaccedilatildeo e pelo
seu estado de associaccedilatildeo (MORGAN et al 1999)
Meacutetodos de obtenccedilatildeo da proteiacutena na forma nativa permitem maior exploraccedilatildeo das
propriedades funcionais no processamento de produtos alimentiacutecios (DE JONGH
GROumlNEVELD DE GROOT 2001) Teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo satildeo utilizadas para a
obtenccedilatildeo de concentrados de proteiacutenas do soro natildeo desnaturadas (MAUBOIS et al
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 16
1987) A ultrafiltraccedilatildeo apresenta vaacuterias vantagens sobre outros processos de separaccedilatildeo jaacute
que natildeo envolve mudanccedila de fases pode ser conduzido a baixas temperaturas e pressatildeo
hidrostaacutetica natildeo afetando substacircncias termosensiacuteveis e natildeo precisa de reagentes
quiacutemicos (PORTER MICHAELS 1970)
A ultrafiltraccedilatildeo eacute a teacutecnica preferida para a fabricaccedilatildeo dos concentrados proteacuteicos
de soro com gt50 de proteiacutena (MORR FOEGEDING 1990) De acordo com Morr e Ha
(1993) a ultrafiltraccedilatildeo eacute um processo industrial utilizado para o fracionamento do soro
com o objetivo de produzir um concentrado proteacuteico de soro com alto teor de proteiacutena
Geralmente o processo eacute seguido de uma diafiltraccedilatildeo com aacutegua desionizada para a
remoccedilatildeo de lactose residual e dos minerais do retentado antes da secagem A diafiltraccedilatildeo
aumenta a pureza do concentrado proteacuteico e a funcionalidade dos ingredientes
(HUFFMAN 1996)
Na obtenccedilatildeo de proteiacutenas normalmente o processo de liofilizaccedilatildeo eacute utilizado para
conseguir maior estabilidade da proteiacutena na estocagem Em geral as proteiacutenas liofilizadas
satildeo mais estaacuteveis em meios com menor conteuacutedo de aacutegua (LAI TOPP 1999) Liu
Langer e Klibanov (1991) reportaram um estudo sobre agregaccedilatildeo de proteiacutenas liofilizadas
no estado soacutelido induzidas pela umidade A umidade residual normalmente eacute considerada
a responsaacutevel pela instabilidade quiacutemica de proteiacutena e peptiacutedeos no estado soacutelido (LIU
LANGER KLIBANOV 1991)
A interaccedilatildeo aacuteguaproteiacutena eacute bem representada pelas isotermas de sorccedilatildeo Uma
isoterma de sorccedilatildeo se define como a representaccedilatildeo do conteuacutedo de aacutegua em um alimento
(g de aacutegua por g de mateacuteria seca) como funccedilatildeo da pressatildeo de vapor em equiliacutebrio (pp0)
a uma temperatura constante (FENNEMA 1996) As isotermas de sorccedilatildeo fornecem
informaccedilotildees importantes para otimizar formulaccedilotildees nos processos de concentraccedilatildeo e de
desidrataccedilatildeo empacotamento condiccedilotildees de crescimento microbiano e a estabilidade
fiacutesica e quiacutemica do produto como uma funccedilatildeo de seu conteuacutedo de aacutegua (HARDY
SCHER BANON 2002)
As isotermas de sorccedilatildeo de umidade das proteiacutenas e biomoleacuteculas geralmente
exibem forma sigmoidal Vaacuterios modelos teoacutericos tecircm sido propostos para descrever
isotermas de sorccedilatildeo de biomoleacuteculas ou proteiacutenas Entre eles estatildeo o modelo simplificado
de Langmuir o de Brunauer e colaboradores e o meacutetodo de GAB desenvolvido por
Guggenheim Anderson e De Bocircer (HAGEMAN et al 1992 HARDY SCHER BANON
2002) Ainda que os paracircmetros de hidrataccedilatildeo avaliados por estes modelos sejam de
limitado significado fiacutesico (KUNTZ KAUZMANN 1974) estas teorias satildeo ainda
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 17
empregadas para predizer mudanccedilas na mobilidade em aacutegua e estabilidade da proteiacutena
(IGLESIAS BUENO 1999)
Os diferentes graus de hidrataccedilatildeo ou quantidade de aacutegua na proteiacutena pode ser um
indicativo da flexibilidade de sua moleacutecula podendo resultar num comportamento diferente
frente aos tratamentos Moleacuteculas da proteiacutena hidratada poderatildeo ser mais susceptiacuteveis a
mudanccedilas estruturais pela diferente atividade da aacutegua nos vaacuterios graus de hidrataccedilatildeo
(RUPLEY CARERI 1991)
331 Influecircncia do pH
A β-LG eacute uma proteiacutena bastante estaacutevel em soluccedilatildeo em um amplo intervalo de pH
apresentando no entanto diferentes estados de associaccedilatildeo A β-LG experimenta cinco
transiccedilotildees induzidas por pH que podem ser identificadas no intervalo de pH 1-13
(TAULIER CHALIKIAN 2001)
A primeira transiccedilatildeo comeccedila em pH 2 mas natildeo eacute completada mesmo em pH 1
Neste pH a β-LG retem a maior parte de sua estrutura secundaacuteria mas satildeo evidentes
algumas alteraccedilotildees na estrutura terciaacuteria A segunda transiccedilatildeo ocorre entre pH 25 e 4 e
tem sido identificada como uma transiccedilatildeo de diacutemero a monocircmero A terceira transiccedilatildeo
ocorre entre pH 45 e pH 6 e resulta em uma leve mudanccedila na sua estrutura terciaacuteria mas
sem qualquer alteraccedilatildeo significativa na secundaacuteria (TAULIER CHALIKIAN 2001)
Timasheff et al (1966) qualificaram a transiccedilatildeo da forma nativa e compacta (N)
existente em pH 6 para a forma aciacutedica (Q) em pH ~45 como ldquomudanccedila conformacional
da β-LG induzida por pHrdquo Alguns autores mencionam que em pH ~45 a β-LG estaacute
propensa a formar octacircmeros (TIMASHEFF et al 1966 McKENZIE SAWYER 1967)
mas em estudo de Taulier e Chalikian (2001) anaacutelises de anisotropia de fluorescecircncia e
anaacutelises volumeacutetricas natildeo revelaram nenhum indiacutecio de octamerizaccedilatildeo da proteiacutena neste
pH
A quarta transiccedilatildeo ocorre entre pH 65 e pH 85 e eacute conhecida como transiccedilatildeo de
Tanford (TAULIER CHALIKIAN 2001) Ela eacute acompanhada por alteraccedilotildees na estruturas
secundaacuteria e terciaacuteria da β-LG que sendo alteraccedilotildees mais bem localizadas natildeo causam
uma mudanccedila global na conformaccedilatildeo da proteiacutena A principal alteraccedilatildeo estrutural da
proteiacutena estaacute relacionada com o deslocamento da alccedila EF que abre o interior do caacutelice
acima de pH 75 A transiccedilatildeo eacute tambeacutem acompanhada por uma mudanccedila no
microambiente da Tyr42 causando uma alteraccedilatildeo de 5 graus na orientaccedilatildeo relativa dos
monocircmeros no diacutemero (OLIVEIRA et al 2001 BROWNLOW et al 1997)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 18
A quinta transiccedilatildeo ocorre entre pH 9 e pH 125 identificada tambeacutem como
desnaturaccedilatildeo induzida por aacutelcalis Ela resulta em ruptura de toda e qualquer estrutura de
tipo dimeacuterica nativa em monocircmeros desnaturados No estado desnaturado em pH 125 haacute
uma diminuiccedilatildeo significativa da estrutura secundaacuteria e pouca rigidez da estrutura terciaacuteria
No entanto estima-se que aproximadamente 20 das folhas-β e 10 das heacutelice-α satildeo
preservadas (CASAL KOumlHLER MANTSCH 1988 TAULIER CHALIKIAN 2001) A
desnaturaccedilatildeo da β-LG induzida por aacutelcalis eacute irreversiacutevel (TAULIER CHALIKIAN 2001)
332 Efeito do aquecimento A β-LG eacute uma proteiacutena termosensiacutevel e vaacuterios efeitos satildeo produzidos nela pela
accedilatildeo da temperatura Estudos sobre sensibilidade teacutermica da β-LG em pH neutro
mostram que modificaccedilotildees estruturais da proteiacutena representam os passos iniciais das
subsequumlentes mudanccedilas macroscoacutepicas Entre elas perda de solubilidade e exposiccedilatildeo
de regiotildees adequadas para diferentes tipos de interaccedilatildeo com outros componentes em
sistemas complexos (IAMETTI et al 1996)
A desnaturaccedilatildeo teacutermica ocorre em diferentes estaacutegios caracteriacutesticos e em
temperaturas relativamente definidas Estes passos podem levar agrave modificaccedilotildees
reversiacuteveis (ao redor de 50oC) ou irreversiacuteveis (acima de 65-70oC) Em meio neutro o
aquecimento origina em primeiro lugar a monomerizaccedilatildeo da proteiacutena dimerizada (nativa)
(CROGUENNEC et al 2003) seguida por perda da conformaccedilatildeo globular compacta
Forma-se um estado intermediaacuterio de maior flexibilidade da estrutura terciaacuteria e maior
volume onde haacute aumento de grupos hidrofoacutebicos expostos denominado de estado
moltem globule (CARROTA et al 2001) Em seguida ocorre a associaccedilatildeo (intermolecular
de estruturas folhas-β) e agregaccedilatildeo atraveacutes de pontes dissulfeto e interaccedilotildees hidrofoacutebicas
(SHIMADA CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 PRABAKARAN DAMODARAN 1997
PALAZOLO et al 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999 PHOTCHANACHAI
KITABATAKE 2001)
Estudos sobre a β-LG tratada termicamente utilizando espalhamento de luz
estaacutetico e hidrodinacircmico apontam como primeira etapa a formaccedilatildeo de oligocircmeros
soluacuteveis metaestaacuteveis linearmente interligados por ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares
(HOFFMANN et al 1996 ELOFSSON DEJMEK PAULSSON 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 19
Durante o processamento do leite em escala industrial a β-LG eacute apontada como
responsaacutevel pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo que conduz agrave obstruccedilatildeo e
consequumlente ineficiecircncia dos trocadores de calor (SAWYER KONTOPIDIS 2000)
333 Influecircncia de alta pressatildeo hidrostaacutetica
O tratamento de alta pressatildeo tem sido muito estudado como meacutetodo alternativo ao
processo teacutermico tanto para preservaccedilatildeo como para melhorar a funcionalidade do
alimento (BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000) O uso de alta pressatildeo no leite
induz agrave inativaccedilatildeo microbiana e enzimaacutetica assim como tambeacutem modifica as
caracteriacutesticas fiacutesico-quiacutemicas dos componentes do leite (MESSENS VAN CAMP
HUYGHEBAERT 1997)
O tratamento de alta pressatildeo tem sido investigado como alternativa para a
formaccedilatildeo de geacuteis de proteiacutenas do soro do leite no lugar do aquecimento principalmente
porque alimentos processados por alta pressatildeo reteacutem as propriedades sensoriais e
nutricionais do produto fresco e porque os geacuteis assim formados tecircm texturas uacutenicas
(KANNO et al 1998 DUMOULIN OZAWA HAYASHI 1998)
A investigaccedilatildeo dos efeitos da pressatildeo nas reaccedilotildees de desnaturaccedilatildeo e
procedimentos de geleificaccedilatildeo eacute guiada pela relativa importacircncia da β-LG no
processamento de alimentos e tambeacutem em parte pela possibilidade de extrair β-LG do
soro por meio de alta pressatildeo (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Nos estudos sobre tratamentos a alta pressatildeo da β-LG verifica-se que haacute
similaridade com os fenocircmenos ocorridos no tratamento teacutermico Dependendo da pressatildeo
aplicada mudanccedilas reversiacuteveis e irreversiacuteveis acontecem (BOTELHO et al 2000
BELLOQUE LOPEZ-FANDINO SMITH 2000 PANICK MALESSA WINTER 1999
FUNTENBERGER DUMAY CHEFTEL 1997 YANG et al 2001) Em geral pode-se
dizer que entre 100-150 MPa haacute um comeccedilo da monomerizaccedilatildeo Jaacute entre 140 e 250 MPa
haveria modificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria mas as estruturas β natildeo satildeo completamente
quebradas ateacute pressatildeo de 330 MPa Entre 300-400 MPa a estrutura da β-LG apresenta
grande flexibilidade e retiradas as condiccedilotildees de pressatildeo ela se re-natura (monocircmero
modificado) Ao aumentar a pressatildeo para 600 e 900 MPa haacute formaccedilatildeo de agregados
estabilizados por interaccedilotildees hidrofoacutebicas e principalmente por ligaccedilotildees de intercacircmbio
tiol-dissulfeto Em estudo por NMR do efeito da alta pressatildeo na β-LG Belloque Lopez-
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 20
Fandintildeo e Smith (2000) concluiacuteram que os agregados resultantes seriam poliacutemeros de
proteiacutenas bem estruturadas
Valores de pressatildeo de 600 e 900 MPa estatildeo acima dos requeridos para a
preservaccedilatildeo de alimentos (IAMETTI et al1997)
334 Efeitos da radiaccedilatildeo gama No processo de irradiaccedilatildeo gama utiliza-se como fonte de energia o Cobaltondash60
(60Co) Durante o processo de decaimento o 60Co emite raios gama que satildeo aproveitados
para tratar diversos produtos meacutedicos farmacecircuticos cosmeacuteticos e alimentos com o
objetivo de inativar ou eliminar organismos indesejaacuteveis (microacutebios patoacutegenos insetos e
parasitas) (DELINCEacuteE 1998 FARKAS 1998 GROLICHOVAacute DVORAacuteK MUSILOVAacute
2004)
No caso dos alimentos no Brasil as normas gerais para irradiaccedilatildeo aprovadas
pela Divisatildeo Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria de Alimentos (DINAL) em 080385
estabeleciam que a dose meacutedia global absorvida natildeo deveria exceder os 10kGy com a
finalidade de assegurar a sua inocuidade sob os pontos de vista toxicoloacutegico nutricional e
microbioloacutegico Esta legislaccedilatildeo foi revisada e atualizada pela Resoluccedilatildeo RDC n21 de 26
de janeiro de 2001 da Diretoria Colegiada da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria
publicada no DOU de 29 de janeiro de 2001 (ANVISA 2001) Trata-se de um
ldquoRegulamento teacutecnico para irradiaccedilatildeo de alimentosrdquo Segundo a Resoluccedilatildeo RDC n 21
fica liberada a irradiaccedilatildeo de qualquer tipo de alimento observadas as seguintes
condiccedilotildees a dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida a dose maacutexima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometeria as
propriedades funcionais e ou atributos sensoriais do alimento
Comparada com outras tecnologias de esterilizaccedilatildeo a irradiaccedilatildeo com raios gama
apresenta uma evidente vantagem ambiental sem emissotildees toacutexicas sem impacto sobre
a qualidade da aacutegua e do ar e sem resiacuteduos nocivos (FARKAS 1998)
A aplicaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo gama em concentrados ou isolados proteacuteicos de soro de
leite obtidos por teacutecnicas de ultrafiltraccedilatildeo por membranas pode fornecer a garantia de
qualidade bacterioloacutegica (ausecircncia de geacutermes) requerida dada agrave facilidade com que uma
contaminaccedilatildeo microbiana pode vir a acontecer no processo de obtenccedilatildeo destes materiais
(DIAS 2003)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 21
Embora a pasteurizaccedilatildeo seja considerada como tratamento satisfatoacuterio para a
descontaminaccedilatildeo de alimentos liacutequidos ela natildeo eacute tatildeo adequada para alimentos soacutelidos
ou ingredientes secos (FARKAS 1998)
Os procedimentos de sanitizaccedilatildeo quiacutemica tecircm problemas inerentes no que
concerne a resiacuteduos e poluiccedilatildeo ambiental (FARKAS 1998) Neste sentido eacute que a
irradiaccedilatildeo de alimentos surge como alternativa de descontaminaccedilatildeo para o futuro
(CORRY et al 1995)
Moleacuteculas de proteiacutena irradiada no estado soacutelido absorvem diretamente a
radiaccedilatildeo produzindo vaacuterios radicais O chamado ldquoefeito diretordquo pode levar agrave modificaccedilatildeo
parcial ou total da configuraccedilatildeo da proteiacutena Em soluccedilotildees aquosas de proteiacutena a radiaccedilatildeo
atua primeiro sobre as moleacuteculas de aacutegua produzindo espeacutecies ativas como radicais
hidroxila (bullOH) e eleacutetrons hidratados (eaq-) que iratildeo reagir com resiacuteduos de aminoaacutecidos
num processo chamado de ldquoefeito indiretordquo da radiaccedilatildeo O grau de modificaccedilatildeo no estado
soacutelido eacute muito menor se comparado ao observado no estado aquoso Esta diferenccedila pode
ser atribuiacuteda agrave recombinaccedilatildeo dos radicais (RHrarr Rbull + bullH rarrRH) devido agrave baixa mobilidade
das espeacutecies no estado soacutelido (YAMAMOTO 1992)
Os resiacuteduos de aminoaacutecidos que conteacutem enxofre (cisteiacutena cistina e metionina) e
os que contecircm anel aromaacutetico (fenilalanina tirosina triptofano) e histidina satildeo as partes
das proteiacutenas mais sensiacuteveis agrave radiaccedilatildeo particularmente quando em soluccedilatildeo aquosa
Estes resiacuteduos de aminoaacutecidos facilmente formam radicais livres por reaccedilatildeo com bullOH e
satildeo mais adiante facilmente oxidados ou ligados ao anel de resiacuteduos de aminoaacutecidos
aromaacuteticos resultando em ligaccedilotildees cruzadas ou agregaccedilatildeo (YAMAMOTO 1992
SEVILLA BECKER YAN 1990)
A radiaccedilatildeo gama natildeo eacute a uacutenica capaz de produzir transformaccedilotildees quiacutemicas e
nutricionais nos alimentos Estudos demonstraram que ateacute 10 kGy estas transformaccedilotildees
na maioria dos alimentos satildeo pequenas e raramente exclusivas de produtos irradiados
sendo semelhantes ao resultado de outros processos de conservaccedilatildeo como cozimento
secagem extrusatildeo e outros (DIEHL 1995)
Natildeo obstante alguns alimentos como leite e produtos laacutecteos natildeo satildeo adequados
para serem irradiados devido ao desenvolvimento de aromas indesejaacuteveis Tambeacutem
alguns vegetais e frutas frescas natildeo toleram doses acima de 2-3 kGy pela destruiccedilatildeo das
vitaminas A esterilizaccedilatildeo pode tambeacutem afetar o sabor e textura em muitos produtos
(CRAWFORD RUFF 1996)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 22
A produccedilatildeo de radicais livres tem sido a principal razatildeo do questionamento sobre a
seguranccedila dos produtos irradiados No entanto produtos radioliacuteticos natildeo satildeo exclusivos
da irradiaccedilatildeo pois tambeacutem satildeo produzidos em outros tratamentos de alimentos como o
teacutermico ao tostar patildeo fritar ou secar alimentos por liofilizaccedilatildeo (ICGFI 1991)
A maioria das alegaccedilotildees sobre os aspectos adversos da irradiaccedilatildeo natildeo se aplicam
agraves doses tiacutepicas aprovadas para pasteurizaccedilatildeo e sim agraves doses mais elevadas requeridas
para esterilizaccedilatildeo Haacute trecircs niacuteveis de dosagem comumente recomendados dependendo
da finalidade de aplicaccedilatildeo dose baixa (ateacute 1 kGy) para desinfecccedilatildeo e demora no
processo de amadurecimento dose meacutedia (1-10 kGy) para pasteurizaccedilatildeo e dose alta
(10-50 kGy) para esterilizaccedilatildeo (CRAWFORD RUFF 1996 WHO 1999)
Lee et al (2001) avaliaram a aplicaccedilatildeo da tecnologia de irradiaccedilatildeo alimentar como
meacutetodo para reduzir a alergia provocada pelo leite Tratando caseiacutena e β-LG com
radiaccedilatildeo gama os autores observaram diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas e
antigecircnicas in vitro utilizando o meacutetodo ELISA Os autores sugeriram que esta diminuiccedilatildeo
das propriedades alergecircnicas seria resultado de mudanccedilas estruturais das proteiacutenas e
possivelmente de mascaramento dos epiacutetopos devido agrave agregaccedilatildeo molecular
A teacutecnica claacutessica utilizada para descontaminaccedilatildeo de alimentos eacute o aquecimento
mas outras tecnologias estatildeo ganhando popularidade e a alta pressatildeo hidrostaacutetica tem
sido proposta como alternativa aos jaacute estabelecidos procedimentos de sanitizaccedilatildeo teacutermica
(IAMETTI et al 1997) O efeito da radiaccedilatildeo gama e de uma combinaccedilatildeo de alta pressatildeo
e irradiaccedilatildeo sobre a qualidade microbioloacutegica de carne de porco fresca foi descrito por
Paul et al (1997) O estudo mostrou um efeito sinergiacutestico ao ser aplicada uma
combinaccedilatildeo de radiaccedilatildeo e alta pressatildeo melhorando a qualidade sensorial e a seguranccedila
microbioloacutegica do produto
34 Teacutecnicas analiacuteticas para anaacutelise estrutural de proteiacutenas em soluccedilatildeo
Pesquisas utilizando espectroscopia de UVVis fluorescecircncia dicroiacutesmo circular
(CD) espectroscopia de ressonacircncia nuclear magneacutetica (NMR) calorimetria diferencial de
varredura (DSC) dispersatildeo oacuteptica rotatoacuteria (ORD) espectroscopia de infravermelho com
transformada de Fourier assim como dispersatildeo de luz e espalhamento de raios-X a
baixos acircngulos tecircm conseguido desvendar as mais diversas mudanccedilas de estrutura em
estudo de enovelamento (folding) e desenovelamento (unfolding) de proteiacutenas aleacutem de
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 23
permitir o monitoramento das diferentes propriedades fiacutesico-quiacutemicas de proteiacutenas em
soluccedilatildeo
Cada uma destas teacutecnicas investiga diferentes alteraccedilotildees estruturais A
espectroscopia UVVis e fluorescecircncia por exemplo monitora as interaccedilotildees de um grupo
prosteacutetico ou um fluoroacuteforo como triptofano com seu microambiente Dicroiacutesmo circular eacute
sensiacutevel principalmente agrave estrutura secundaacuteria (KAUFFMANN et al 2001)
Espectroscopia de NMR pode fornecer informaccedilotildees sobre determinados resiacuteduos de
aminoaacutecidos (DYSON WRIGHT 1996) contudo os espectros sobre estados
desnaturados satildeo difiacuteceis de interpretar A espectroscopia de infravermelho com
transformaccedilatildeo de Fourier (FTIR) por outro lado eacute capaz de distinguir claramente entre
todos os tipos de estrutura secundaacuteria eacute sensiacutevel agrave estrutura terciaacuteria e capaz de detectar
reaccedilotildees de um soacute resiacuteduo numa escala de tempo de um nanosegundo Jaacute a teacutecnica de
espalhamento de raios X a baixos acircngulos (SAXS) permite obter informaccedilotildees do tamanho
e forma de uma moleacutecula (proteiacutena) em soluccedilatildeo (ARAI et al1998) A teacutecnica denominada
de ldquostopped-flowrdquo utilizando SAXS eacute relevante em estudos relacionados com o
enovelamento e desenovelamento de proteiacutenas
341 Dicroiacutesmo Circular (CD)
O Dicroiacutesmo Circular (CD) eacute uma teacutecnica oacuteptica que permite a detecccedilatildeo e
quantificaccedilatildeo da quiralidade das estruturas moleculares Denomina-se de CD a absorccedilatildeo
diferencial das componentes circularmente polarizadas agrave esquerda e agrave direita da radiaccedilatildeo
polarizada plana Este efeito ocorre quando um cromoacuteforo eacute opticamente ativo (quiral)
situaccedilatildeo alcanccedilada em trecircs condiccedilotildees (1) intrinsecamente por razatildeo estrutural ou (2) por
estar ligado covalentemente a um centro quiral ou (3) por ser colocado num ambiente
assimeacutetrico Na praacutetica o instrumento de CD (espectropolariacutemetro) natildeo recombina os
componentes apenas detecta os dois componentes separadamente e em seguida
apresenta o dicroiacutesmo a um dado comprimento de onda expresso como a diferenccedila em
absorbacircncia dos dois componentes ( ∆A = Aesq- Adirei) ou como a elipticidade em graus (θ)
(θ = tan-1(ba) onde b e a satildeo o os eixos menor e maior da elipse resultante Haacute uma
relaccedilatildeo numeacuterica simples entre ∆A e θ (θ em graus) θ = 3298∆A (KELLY PRICE 1997)
A elipcidade molar por resiacuteduo de aminoaacutecido (θmr) eacute a unidade mais usada para
descrever o dicroiacutesmo circular em pesquisas envolvendo proteiacutenas e peptiacutedeos Eacute
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 24
necessaacuterio considerar o caminho oacuteptico l a concentraccedilatildeo c a massa molar M e o nuacutemero
de resiacuteduos nr da proteiacutena
A Figura 2 mostra um esquema simplificado de um sistema para medir dicroiacutesmo
circular
Figura 2 Esquema mostrando as partes de um espectropolariacutemetro (Ref LORENZI 2002)
A maioria dos espectropolariacutemetros convencionais fornece dados espectrais
confiaacuteveis entre ~190 e 300 nm Em anos recentes o uso da radiaccedilatildeo siacutencrotron como
fonte de luz intensa levou ao desenvolvimento da teacutecnica de espectroscopia de dicroiacutesmo
circular por radiaccedilatildeo siacutencrotron (SRCD) que permite obter espectros em menores
comprimentos de onda no ultravioleta no vaacutecuo (VUV) incluindo a faixa entre 160 e 190
nm (WALLACE 2000)
Informaccedilatildeo estrutural a partir de CD Um espectro de CD eacute obtido quando o sinal eacute medido como funccedilatildeo do
comprimento de onda Geralmente dividem-se os espectros gerados para proteiacutenas em
duas regiotildees UV-proacuteximo e UV-longiacutenquo Na regiatildeo do UV-proacuteximo as cadeias laterais
de resiacuteduos aromaacuteticos (fenilalanina tirosina e triptofano) absorvem na faixa 250-290 nm
Na regiatildeo do UV-longiacutenquo (tipicamente de 180-190 a 240 nm) absorve principalmente o
grupo peptiacutedico Em compostos modelos que contecircm ligaccedilotildees dissulfeto o acircngulo
rdmr nlc
Msdotsdot
sdotθ=θ (1)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 25
diheacutedrico desta ligaccedilatildeo pode ser deduzido do espectro de CD na regiatildeo 240-290 nm
(KELLY PRICE 1997)
Espectro de CD no UV-longiacutenquo Eacute conhecido desde muitos anos que as diferentes formas de estrutura secundaacuteria
encontradas em peptiacutedeos e proteiacutenas exibem distintos espectros de CD no UV-longiacutenquo
(KELLY PRICE 1997) Foram criados espectros modelos utilizando amostras de
conformaccedilatildeo secundaacuteria ldquopurardquo como os obtidos de soluccedilotildees de poli-L-lisina com
variaccedilotildees de temperatura e pH o que provoca a formaccedilatildeo de 100 de heacutelice α 100 de
folhas β e 100 de estrutura randocircmica
A Figura 3 mostra os espectros caracteriacutesticos das estruturas secundaacuterias
conhecidas
Figura 3 Espectro padratildeo de 100 de folhas-β 100 de heacutelices-α e 100 de estruturas randocircmicas (Ref
BRAHMS amp BRAHMS 1980)
Os espectros de CD que caracterizam heacutelice α possuem duas bandas negativas
uma em 222nm (nrarrπ) e outra em 208nm (πrarrπparalela) de mesma intensidade e uma
positiva em 190nm (πrarrπperpendicular) Os espectros caracteriacutesticos para folha β apresentam
uma banda negativa em 216nm (πrarrπ) e uma positiva em 195nm (nrarrπ) Por uacuteltimo os
espectros que representam as estruturas randocircmicas apresentam uma banda negativa
intensa em ~200nm (nrarrπ) e uma faixa positiva por volta de 218nm (πrarrπ) (YANG et al
1986)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 26
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo satildeo a soma dos muacuteltiplos fracionaacuterios dos
componentes estruturais de uma proteiacutena isto eacute representam o conteuacutedo de estruturas
secundaacuterias de tipo heacutelice α estruturas β e estruturas desordenadas (random coil)
A tarefa de deduzir as contribuiccedilotildees dos diferentes formas estruturais a partir de
qualquer espectro observado natildeo eacute simples Diversas tentativas tecircm sido realizadas com
base em procedimentos sofisticados de ajustes de curvas envolvendo conjuntos de
espectros de proteiacutenas bem caracterizadas de estrutura secundaacuteria conhecida
(geralmente estruturas que tecircm sido determinadas por cristalografia de raios-X de alta
resoluccedilatildeo) Entre os procedimentos mais conhecidos estatildeo CONTIN (PROVENCHER
GLOCKNER 1981) SELCON3 (SREERAMA WOODY 1993 SREERAMA
VENYAMINOV WOODY 1999) CDSSTR (COMPTON JOHNSON 1986) VARSLC
(MANAVALAN JOHNSON 1987) e K2d (ANDRADE et al 1993)
Em estudos da β-LG utilizando dicroiacutesmo circular os resultados encontrados na
quantificaccedilatildeo da estrutura secundaacuteria da forma nativa podem variar dependendo
principalmente das condiccedilotildees de pH e concentraccedilatildeo das amostras e metodologia utilizada
no caacutelculo Na literatura os resultados reportados mostram valores aproximados de 10-
15 para estrutura α-heacutelice 40-50 para folhas-β (GRIFFIN et al 1993 QI et al 1997)
valores estes sustentados em estudos de estrutura cristalina por raios-X (PAPIZ et al
1986 MONACO et al 1987 BROWNLOW et al1997 QIN et al 1998 1999) e em
estudos por NMR (BELLOQUE SMITH 1998)
Espectro de CD no UV-proacuteximo Cada um dos aminoaacutecidos aromaacuteticos tem maacuteximo de absorccedilatildeo em comprimento
de onda caracteriacutestico triptofano em 290 nm tirosina entre 275 e 282 nm e fenilalanina
entre 255 e 270 nm
Trecircs fatores tendem a influenciar a intensidade das bandas aromaacuteticas em CD (1)
a rigidez da proteiacutena quanto maior a mobilidade das cadeias laterais menor a
intensidade das bandas (2) interaccedilotildees entre aminoaacutecidos aromaacuteticos que eacute
especialmente significativo se a distacircncia entre eles for menor que 1 nm (3) nuacutemero de
aminoaacutecidos aromaacuteticos Proteiacutenas com grande nuacutemero desses aminoaacutecidos podem
apresentar banda menor que a esperada em CD devido agraves contribuiccedilotildees positivas e
negativas dos mesmos Observa-se tambeacutem que os sinais em UV-proacuteximo e na regiatildeo
do visiacutevel no espectro satildeo muito mais fracos do que aqueles obtidos em UV-longiacutenquo
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 27
refletindo uma concentraccedilatildeo molar muito menor de cromoacuteforos comparada com as
ligaccedilotildees peptiacutedicas presentes (KELLY PRICE 1997)
342 Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS)
O SAXS eacute uma teacutecnica que permite o estudo de macromoleacuteculas em soluccedilatildeo como
as proteiacutenas com dimensotildees tiacutepicas de 1-100 nm A partir desta teacutecnica podem ser
determinados tamanho molecular forma molecular e estrutura terciaacuteria (baixa resoluccedilatildeo)
A teoria de espalhamento a baixos acircngulos pode ser encontrada detalhadamente
descrita em vaacuterios livros texto como o de Guinier e Fournet (1955) Glatter e Kratky
(1982) entre outros
O SAXS pode ser usado para investigar a conformaccedilatildeo global da proteiacutena pela
mediccedilatildeo de seu raio de giro e pela funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) que satildeo
sensiacuteveis agraves dimensotildees e forma da partiacutecula (PANICK MALESSA WINTER 1999)
Geralmente uma soluccedilatildeo monodispersa de proteiacutenas eacute um requisito necessaacuterio para
investigaccedilotildees de SAXS
SAXS eacute tambeacutem muito adequado para visualizar processos de desnaturaccedilatildeo ou de
associaccedilatildeondashdissociaccedilatildeo O desenovelamento espacial da estrutura nativa de uma
proteiacutena sob desnaturaccedilatildeo por exemplo pode ser claramente seguido pelo aumento do
raio de giro (GLATTER KRATKY 1982)
Para uma soluccedilatildeo de partiacuteculas a intensidade do espalhamento I(q) pode ser
escrita em termos da funccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) onde q eacute o vetor de
espalhamento e r a distacircncia entre pares de pontos contidos no volume da partiacutecula
Sendo
θ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ π
= senq1
4 (2)
onde θ eacute a metade do acircngulo de espalhamento e λ eacute o comprimento de onda da radiaccedilatildeo
utilizada
drqr
senqr)r(p)q(I intπ= 4 (3)
A funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distacircncias p(r) estaacute dada pela transformada de Fourier
da intensidade espalhada medida I(q)
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 28
( )( ) ( )dqqrsenqrqI)r(p intinfin
π=
0221
(4)
A funccedilatildeo p(r) fornece informaccedilatildeo essencial sobre a partiacutecula e p(r) 0 para r =
Dmax
O quadrado do raio de giro Rg da partiacutecula espalhadora eacute obtido do segundo
momento normalizado de p(r)
rdr)r(p
drr)r(pR maxR
maxR
g
intint=
0
2
02
2 (5)
Vaacuterias equaccedilotildees para determinaccedilatildeo da massa molar satildeo apresentadas em
diversos trabalhos (GLATTER KRATKY 1982)
Tendo-se dados da intensidade espalhada para q=0 I(0) em escala absoluta
(referida ao espalhamento por um eleacutetron) pode-se obter a massa molar da partiacutecula
espalhadora jaacute que
(6)
_M)()(I νρ∆= 1
21 0 (7)
_)(
)(IMνρ∆
=2
11
0 (8)
sendo _ν o volume parcial especiacutefico da partiacutecula espalhadora e M1 a massa molar (em
gramas) da partiacutecula espalhadora Sabendo que a massa molar MM eacute definida como MM =
M1 NA sendo NA o nuacutemero de Avogadro tem-se para a massa molar da partiacutecula
espalhadora
νρ∆
=)()(INM A
M 21 0
(9)
221 0 V)()(I ρ∆=
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 29
Um graacutefico de Kratky (KRATKY 1982) q2 x I(q) vs q eacute muito uacutetil para descrever
caracteriacutesticas estruturais dos variados estados conformacionais Um maacuteximo no graacutefico
de Kratky ou curva em forma de sino corresponde a uma estrutura globular compacta
da proteiacutena (KATAOKA et al 1993 1995 LATTMAN FIEBIG DILL 1994)
Devido ao tamanho relativamente pequeno da partiacutecula o espalhamento de
raios-X a baixos acircngulos de uma soluccedilatildeo de proteiacutena pode dar informaccedilatildeo valiosa do
estado de agregaccedilatildeo e do formato da proteiacutena (GLATTER KRATKY 1982 GUINIER
FOURNET 1955)
343 Fluorescecircncia
Todas as moleacuteculas absorvem luz No entanto um nuacutemero relativamente
pequeno de espeacutecies moleculares (geralmente hidrocarbonetos poliaromaacuteticos
conjugados ou heterociacuteclicos) emite luz como resultado da absorccedilatildeo da luz Se essa
emissatildeo eacute imediata isto eacute tem origem em um estado de excitaccedilatildeo eletrocircnica singlete
esse fenocircmeno eacute denominado de fluorescecircncia (LAKOWICZ 1983)
Estes fenocircmenos estatildeo ilustrados no diagrama de estados eletrocircnicos na Figura
4
Figura 4 Diagrama de Jablonski para o sistema de niacuteveis de energia utilizando uma moleacutecula de benzeno S0 eacute o niacutevel fundamental S1 eacute o niacutevel denominado singlete do qual quando o eleacutetron volta ao niacutevel fundamental emite luz fluorescente (Ref ATVARS e MARTELLI 2002)
Fosforescecircncia
S0
S1
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 30
Fluorescecircncia intriacutenseca de proteiacutenas e peptiacutedeos
Dentre os 20 aminoaacutecidos usualmente encontrados em proteiacutenas os aromaacuteticos
fenilalanina tirosina e triptofano satildeo os uacutenicos com intensidade de fluorescecircncia suficiente
para ser medida diretamente em soluccedilatildeo A fluorescecircncia destes resiacuteduos eacute uma
ferramenta altamente especiacutefica e sensiacutevel no estudo de enovelamento e conformaccedilatildeo de
proteiacutenas Mudanccedilas na fluorescecircncia intriacutenseca podem ser usadas para monitorar
alteraccedilotildees estruturais numa proteiacutena (LAKOWICZ 1983 CHEN BARKLEY 1998)
A fluorescecircncia de uma proteiacutena enovelada eacute o resultado da fluorescecircncia de cada
resiacuteduo aromaacutetico Os trecircs resiacuteduos tecircm distintos comprimentos de onda de absorccedilatildeo e
emissatildeo Eles diferem enormemente nos seus rendimentos quacircnticos e tempos de vida
Devido a estas diferenccedilas e agrave transferecircncia de energia por ressonacircncia de uma
fenilalanina proacutexima para a tirosina e de uma tirosina para o triptofano o espectro de
fluorescecircncia de uma proteiacutena contendo os trecircs resiacuteduos eacute parecido com o espectro do
triptofano (EFTINK 1991)
A fluorescecircncia e o rendimento quacircntico do triptofano satildeo muito maiores que dos
outros dois aminoaacutecidos aromaacuteticos A intensidade rendimento quacircntico e comprimento
de onda de maacutexima emissatildeo de fluorescecircncia do triptofano satildeo muito dependentes do
solvente Quando a polaridade do solvente ao redor do resiacuteduo de triptofano diminui o
espectro de fluorescecircncia eacute deslocado para comprimentos de onda menores (blue-shift) e
a intensidade da fluorescecircncia aumenta Resiacuteduos que estatildeo ldquoenterradosrdquo no centro
hidrofoacutebico de proteiacutenas podem ter um deslocamento no seu espectro de 10 a 20nm
comparado a triptofanos da surperfiacutecie da proteiacutena A fluorescecircncia desse resiacuteduo pode
ser suprimida por grupos aciacutedicos protonados vizinhos como aacutecido aspaacutertico ou glutacircmico
(CHEN BARKLEY 1998)
A tirosina como o triptofano apresenta alta absorccedilatildeo agrave 280nm e quando excitada
por luz nesse comprimento de onda tem tambeacutem o mesmo perfil de emissatildeo O resiacuteduo
de tirosina eacute um emissor mais fraco que o triptofano mas ela ainda assim pode contribuir
significativamente para a fluorescecircncia de proteiacutenas pois geralmente estaacute presente em
grande nuacutemero A fluorescecircncia da tirosina pode ser facilmente suprimida por um resiacuteduo
de triptofano proacuteximo devido agrave transferecircncia de energia Aleacutem disso a tirosina sofre
ionizaccedilatildeo no estado excitado o que pode resultar na perda do proacuteton do grupo hidroxila
aromaacutetico levando agrave supressatildeo da fluorescecircncia deste resiacuteduo
A fenilalanina com apenas um anel benzecircnico e um grupo metila eacute pouco
fluorescente A sensibilidade experimental (produto entre rendimento quacircntico e
3 Revisatildeo Bibliograacutefica 31
absorvidade molar maacutexima) eacute muito baixa para este resiacuteduo A fluorescecircncia da
fenilalanina eacute observada somente na ausecircncia de tirosina e triptofano (MOCZ 2006)
O comprimento de onda do maacuteximo na intensidade de fluorescecircncia (λmaacutex) eacute
universalmente e inquestionavelmente usado como um indicador de exposiccedilatildeo agrave aacutegua
Por exemplo como indicador de quanto profundamente o Trp estaacute enterrado na proteiacutena
Um deslocamento do maacuteximo da intensidade de fluorescecircncia para comprimentos de
onda maiores (red shift) eacute garantido num ambiente polar somente se haacute suficiente
mobilidade dos grupos polares para relaxar ao redor do dipolo apresentado pelo Trp
(CALLIS 1997)
A β-LG conteacutem dois resiacuteduos de triptofano Trp 19 e Trp 61 O exame da estrutura
da β-LG determinada por cristalografia por raios-X mostra que o Trp 19 estaacute enterrado no
caacutelice hidrofoacutebico e eacute essencialmente inacessiacutevel ao solvente enquanto o Trp 61 estaacute em
uma posiccedilatildeo substancialmente exposta ao solvente e tambeacutem muito proacuteximo agrave ponte
dissulfeto formada entre Cys 66 e Cys 160 (BROWNLOW et al 1997) A fluorescecircncia
intriacutenseca da proteiacutena eacute quase exclusivamente atribuiacuteda ao Trp 19 (CHO BATT
SAWYER 1994 MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999a) No entanto o Trp 19
pode ter sua fluorescecircncia intriacutenseca diminuiacuteda pela proximidade do Arg 124 que se
localiza a somente 30-40 Aring do anel indol do Trp 19 (BROWNLOW et al 1997) Tem sido
demonstrado que a Arginina conduz a uma eficiente supressatildeo da fluorescecircncia em
outras proteiacutenas (YU et al 1992)
32
4 Material e meacutetodos 33
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
4 Material e meacutetodos 34
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 Material e reagentes
Material β-LG BioPURE Betalactoglobulina (variantes A e B ~95 de
proteiacutena aw= 022) foi doada pela Davisco Foods International Inc (Le Sueur MN USA)
Reagentes
Acetonitrila grau cromatograacutefico (J T Baker Mallinckrodt Baker Xalostoc
Meacutexico) metanol grau cromatograacutefico (JT Baker Mallinckrodt Baker Phillipsburg USA)
Outros reagentes utilizados foram de grau analiacutetico reagente de Ellman 5 5rsquo-
dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) Sigma (D-8130) da Sigma-Aldrich Chemie
(Steinheim Germany) β-mercaptoetanol (Merck Hohenbrunn Germany) ureacuteia foi obtida
da Merck (Darmstadt Germany) o dodecilsulfato de soacutedio (SDS) (Sigma L5750) as
enzimas pepsina e tripsina sal soacutedica do aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico (EDTA)
(Sigma ED2SS) e o retinol todo-trans (Sigma R7632) com pureza miacutenima de 95 foram
comprados da Sigma Chemical Co (St Louis MO USA)
Aacutegua ultra pura (182 MΩ) foi obtida em purificador Maxima ultra pure water Elga
(Elga High Wycombe England)
Preparaccedilatildeo de amostras de β-LG soacutelida com diferentes aw
Para obter β-LG com diferente aw β-LG em poacute (aw =022) foi rapidamente passada
atraveacutes de uma fina nuvem de aacutegua atomizada gerada por um vaporizador de ultrasom
(MOD US-2000 ICEL Manaus AM Brasil) Porccedilotildees da proteiacutena hidratada foram
colocadas em dessecadores em atmosfera de umidade relativa (UR) constante de 529
utilizando soluccedilatildeo saturada de Mg(NO3)2 e de 751 com soluccedilatildeo saturada de NaCl
a 25 degC ateacute alcanccedilar o equiliacutebrio As medidas de aw das amostras foram feitas apoacutes 2
dias usando um aparelho AquaLab Modelo Serie 3TE (Decagon Devices IncPullman
WA USA) A aw das amostras apoacutes o equiliacutebrio foi 053 para as amostras equilibradas agrave
UR de 529 e 074 para as equilibradas agrave UR de 751
Preparaccedilatildeo de amostras em soluccedilatildeo
Soluccedilotildees de β-LG (aw=022) em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de proteiacutena foram
preparadas em tampatildeo fosfato 10 mM pH 70 com aacutegua ultra pura para serem irradiadas
Soluccedilotildees de β-LG em concentraccedilotildees de 1 mgmL e 01 mgmL foram preparadas em
tampatildeo fosfato 10 mM e pH 70 a partir de β-LG sem irradiar e irradiadas na forma soacutelida
e em soluccedilatildeo para anaacutelise por Dicroiacutesmo Circular no UV proacuteximo e longiacutenquo
respectivamente Para anaacutelise de fluorescecircncia intriacutenseca as amostras tinham uma
concentraccedilatildeo de 1 mgmL em tampatildeo fosfato 10 mM
4 Material e meacutetodos 35
42 Meacutetodos
421 Delineamento experimental
No presente trabalho foi utilizada a proteiacutena β-LG comercial BioPURE da Davisco
fornecida em poacute em embalagem de papel aluminizado impermeaacutevel O tratamento de
irradiaccedilatildeo da proteiacutena foi realizado nas amostras soacutelidas e nas amostras em soluccedilatildeo As
amostras de β-LG no estado soacutelido foram preparadas em trecircs atividades de aacutegua 022
053 e 074 e as amostras em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3 e 10 mg mL como
explicado em Material e Meacutetodos na seccedilatildeo Material e reagentes
A irradiaccedilatildeo das amostras no estado soacutelido e em soluccedilatildeo foi efetuada no Centro
de Tecnologia das Radiaccedilotildees do IPEN-CNENSP e no Departamento de Irradiaccedilatildeo de
Alimentos do CENA na ESALQ-Piracicaba As amostras foram submetidas a diferentes
doses de radiaccedilatildeo (0 10 25 50 100 250 e 500 kGy)
Nas Tabelas 1 e 2 podem ser visualizados o delineamento experimental e a
nomenclatura utilizada para as amostras
Tabela 1Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG soacutelida e nomenclatura das amostras
Tabela 2 Condiccedilotildees experimentais do tratamento de irradiaccedilatildeo das amostras de β-LG em soluccedilatildeo e nomenclatura das amostras
Tratamento Dose kGy
Concentraccedilatildeo de proteiacutena (mgmL)
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 3 10 C0S3 C0S10 Tratada em soluccedilatildeo 1 3 10 C1S3 C1S10 25 3 10 C25 S3 C25S10 5 3 10 C5S3 C5S10 10 3 10 C10S3 C10S10 25 3 10 C25S3 C25S10 50 3 10 C50S3 C50S10
422 Irradiaccedilatildeo
As amostras foram irradiadas em irradiador de Co-60 Gamma cell 220 GC220
AECL (Ottawa Canadaacute) com atividade cia 12500ci taxa de dose 434 kGyh e Gamma
Tratamento Dose kGy
Atividade de aacutegua A1 A2 A3
Nomenclatura das amostras
Sem tratamento 0 022 053 074 C0A1 C0A2 C0A3 Tratada solida 1 022 053 074 C1A1 C1A2 C1A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 5 022 053 074 C5A1 C5A2 C5A3 10 022 053 074 C10A1 C10A2 C10A3 25 022 053 074 C25A1 C25A2 C25A3 50 022 053 074 C50A1 C50A2 C50A3
4 Material e meacutetodos 36
cell 220 Excel (Northern Canadaacute) com atividade cia 2600ci taxa de dose 0974 kGyh
com doses de radiaccedilatildeo entre 1 e 50 kGy agrave temperatura ambiente
As amostras irradiadas no estado soacutelido (atividade de aacutegua 022 053 e 074)
foram acondicionadas em saquinhos de papel laminado (internamente plastificado)
selados agrave vaacutecuo As irradiadas em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL em fosfato de soacutedio 10 mM)
foram acondicionadas em tubos de vidro Pyrex (14 x 15 cm) com tampa de rosca sob
atmosfera normal As amostras foram mantidas a 4degC ateacute anaacutelises
423 Proteoacutelise enzimaacutetica
Foi realizada segundo Bertrand-Harb et al (2002) Amostras de β-LG foram
preparadas em concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo citrato de soacutedio 0015 M pH 25 e
incubadas a 37degC com pepsina em uma relaccedilatildeo de ES (pp) de 1100 por 17 horas Ao
final desse tempo a reaccedilatildeo foi interrompida ajustando-se o pH para 70 por adiccedilatildeo de
quantidades apropriadas de soluccedilatildeo tampatildeo de TRIS-HCl 1 M pH 89
Para a hidroacutelise com tripsina amostras de β-LG foram preparadas na
concentraccedilatildeo de 2 mgmL em tampatildeo Tris-HCl 02 M pH 80 e incubadas a 37degC em uma
relaccedilatildeo de ES (pp) de 1200 por 17 horas A hidroacutelise foi interrompida por abaixamento
do pH a 20 com a adiccedilatildeo de HCl 02 N As amostras hidrolisadas foram mantidas
congeladas (-18 degC) ateacute anaacutelise por RP-HPLC eou por espectrometria
424 Meacutetodos espectrofotomeacutetricos
Dicroiacutesmo Circular (CD) Os espectros de CD foram registrados em um espectropolariacutemetro JASCO J-720
acoplado com banho de aacutegua RD306 (Japan Spectroscopic Co Japan) nas seguintes
condiccedilotildees temperatura 225degC velocidade de varredura = 100 nmmin largura de
banda=10 nm resoluccedilatildeo=1 nm (para UV-longiacutenquo) 02 nm (para UV-proacuteximo) tempo de
resposta= 1 seg (no UV-longiacutenquo) 025 seg (no UV-proacuteximo) e 9 acumulaccedilotildees As
amostras de β-LG foram analisadas em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato 10 mM a pH 70 em
concentraccedilatildeo de 01 mgmL and 1 mgmL para UV-longiacutenquo e UV-proacuteximo
respectivamente A concentraccedilatildeo de proteiacutena foi estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1
ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984) Os espectros da proteiacutena foram obtidos
usando cubetas de quartzo ciliacutendricas de caminho oacuteptico de 01 cm (para UV-longiacutenquo
185-260 nm) e 10 cm (para UV-proacuteximo 250-350 nm) Para caacutelculo da estrutura
secundaacuteria foi utilizado o meacutetodo baseado em algoritmos CDSSTR como descrito por
Whitmore e Wallace (2004) na DICHROWEB (httpwwwcrystbbkacukcdweb)
4 Material e meacutetodos 37
Espalhamento de raios-X a baixos acircngulos (SAXS) As medidas de espalhamento a baixos acircngulos foram realizadas na linha SAXS do
Laboratoacuterio Nacional de Luz Siacutencrotron do Brasil (LNLS) Os experimentos foram feitos
usando um porta-amostra capilar (Oslash 15 mm) (CAVALCANTI et al 2004) a 20 degC
comprimento de onda do raio-X =1488 Aring e distacircncia amostra-detector de 7449 mm
Amostras de β-LG (3 e 10 mgmL) foram avaliadas em tampatildeo de fosfato de soacutedio 10 mM
Para cada amostra quatro frames de 10 min foram coletados O tratamento dos dados foi
feito usando o programa TRAT1D (OLIVEIRA 2003) Correccedilotildees padratildeo e caacutelculos de
erros estatildeo incluiacutedos nesta rotina Para a anaacutelise de dados foi usado o programa GNOM
(SEMENYUK SVERGUN 1991) Este programa permite o ajuste teoacuterico e o caacutelculo da
funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) O programa CRYSOL (SVERGUN
BARBERATO KOCH 1995) foi usado para efetuar o caacutelculo das curvas teoacutericas de
SAXS a partir das coordenadas cristalograacuteficas e permitiu o ajuste dos dados
experimentais de espalhamento
Grupos tiol (-SH) livres totais Os grupos SH totais foram determinados usando o reagente de Ellman (55rsquo-
ditiobis (2-acido nitrobenzoico)) (DTNB) de acordo com Yang et al (2001) O DTNB
usado em concentraccedilatildeo 25 mM foi preparado em tampatildeo fosfato (10 mM pH 70)
contendo ureacuteia 80 M e sal dissoacutedico de aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico (EDTA) 1 mM
Uma aliacutequota de 05 mL de soluccedilatildeo de β-LG em concentraccedilatildeo de 5 mgmL em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi misturada com 195 mL de tampatildeo fosfato de soacutedio
(10 mM pH70) contendo ureacuteia 80 M e EDTA 1 mM e adicionados 005 mL da soluccedilatildeo
de DTNB (25 mM) Depois de 15 minutos foi medida a absorbacircncia a 412 nm e estimado
o nuacutemero de moles de SH por mol de β-LG utilizando um coeficiente de extinccedilatildeo de
13600 M-1 cm-1 para caacutelculo dos moles de SH (YANG et al 2001 ELLMAN 1959) A
concentraccedilatildeo da β-LG foi medida pela absorbacircncia das amostras a 280 nm usando o
coeficiente de extinccedilatildeo molar de 17600 M-1cm-1 (DUFOUR HOA HAERTLEacute 1994 EIGEL
et al 1984)
Fluorescecircncia Medidas de fluorescecircncia Intriacutenseca e de fotometria de fluorescecircncia foram obtidas
utilizando um Espectrofluoriacutemetro Hitachi F-4500 (Hitachi Tokyo Japan)
Fluorescecircncia Intriacutenseca do Trp foi medida para avaliar o grau de desnaturaccedilatildeo
da proteiacutena Foram utilizadas amostras de β-LG (1 mgmL) em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de
4 Material e meacutetodos 38
soacutedio 10 mM pH 70) Foram usadas λexc=280 nm e λemiss=350-450 nm largura de banda
de 5 nm fendas de excitaccedilatildeo=25 nm e de emissatildeo=5 nm velocidade de varredura =240
nmmin e PMT voltagem =700 V
Fotometria de fluorescecircncia das bitirosinas foi realizada para estimar o conteuacutedo
de ligaccedilotildees cruzadas entre radicais tirosil formados no tratamento de irradiaccedilatildeo da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987) Amostras de β-LG diluiacutedas a 05 mgmL
em soluccedilatildeo tampatildeo (fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram utilizadas Utilizou-se
comprimento de onda de excitaccedilatildeo de 325 nm e as medidas de intensidade de
fluorescecircncia foram obtidas no comprimento de onda de emissatildeo de 416 nm Foi fixada
uma velocidade de varredura de 240 nmmin e uma fenda de excitaccedilatildeo e de emissatildeo em
5 nm
Fotometria de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG realizada para avaliar o grau
do poder ligante de β-LG irradiada segundo meacutetodo empregado por Subramaniam Steel
e Gafni (1996) Neste meacutetodo monitora-se o aumento da fluorescecircncia do retinol a 470
nm apoacutes ligaccedilatildeo a β-LG Aliacutequotas de retinol (15 microL) dissolvido em etanol em
concentraccedilatildeo 3 mM satildeo adicionados agrave uma cubeta contendo 3 mL de proteiacutena 10 mgmL
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) Os componentes satildeo cuidadosamente
misturados e deixados para equilibrar durante 3-4 minutos antes de fazer a leitura de
fluorescecircncia logo adiciona-se mais uma aliacutequota e assim sucessivamente ateacute os valores
da leitura ficarem constantes Utiliza-se excitaccedilatildeo a 330 nm e emissatildeo a 470 nm A
velocidade de varredura se fixou em 240 nmmin e as fendas de emissatildeo e excitaccedilatildeo em
10 e 5 nm respectivamente
Espectrofotometria de UV e Visiacutevel
Transmitacircncia
A transmitacircncia das amostras de β-LG dissolvidas em tampatildeo fosfato de soacutedio (10
mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 10 mgmL de proteiacutena (com exceccedilatildeo das amostras
irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL) foi medida a 550 nm Foi utilizado
um espectrofocirctometro UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Fullerton CA USA)
Absorbacircncia
As medidas de absorbacircncia a 280 nm de soluccedilotildees de β-LG foram efetuadas
utilizando espectrofotocircmetro de UV-Visiacutevel BECKMAN DU-70 (Beckman Fullerton CA
4 Material e meacutetodos 39
USA) A concentraccedilatildeo de β-LG em soluccedilotildees preparadas para as diversas anaacutelises foi
estimada usando ε280nm=17600 M-1cm-1 ou ε280nm = 096 mL mg-1cm-1 (EIGEL et al 1984)
Para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo proteica nos hidrolisados de β-LG com
pepsina foram retiradas aliacutequotas de 2 mL e misturadas com 2 mL de soluccedilatildeo 20 de
aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) e centrifugadas a 10000 g por 10 min agrave temperatura ambiente
Foi medida a absorbacircncia a 280 nm para avaliar o grau de degradaccedilatildeo da proteiacutena Para
caacutelculo do teor proteacuteico foram utilizados os mesmos coeficientes de extinccedilatildeo molar
usados para caacutelculo da concentraccedilatildeo de proteiacutena acima mencionada (REDDY KELLA
KINSELLA 1988)
425 Meacutetodos cromatograacuteficos
Cromatografiacutea Liquida de Alta Eficiecircncia de fase reversa (RP-HPLC) Esta teacutecnica foi utilizada para avaliar o grau de pureza da β-LG utilizada no
trabalho Foi tambeacutem utilizada para estudo do perfil cromatograacutefico dos proteolisados
triacutepticos e peacutepticos utilizando o meacutetodo descrito por Croguennec et al (2003) O caacutelculo
das aacutereas dos peptiacutedeos no cromatograma foi realizado como indicado por Otte et al
(1997)
Em todas as anaacutelises um volume de 20 microL de amostra foi injetado manualmente
no cromatoacutegrafo liacutequido de marca Varian (Varian Walnut Creek CA USA) que inclui
bomba Varian 9012 detector de absorbacircncia UV-VIS de duplo comprimento de onda
Varian 9050 e o software Star Chromatography Workstation munido de coluna Varian C18
(250 mm x 45 mm DI) As condiccedilotildees cromatograacuteficas foram temperatura da coluna 40degC
fluxo de 10 mLmin A fase moacutevel foi composta de solvente A aacuteguaaacutecido trifluoroaceacutetico
(991) e solvente B acetonitrila aacutegua e aacutecido trifluoroaceacutetico (65351) Os solventes
foram filtrados atraveacutes de membrana 045 microm (Millipore) e sonicados por 10 min em
ultrasom Foi aplicado um sistema de gradiente iniciado com 20 de solvente B
passando para 100 em 30 min decrescendo para 20 aos 40 min O detector foi fixado
em 214 nm
Cromatografia liquida de alta eficiecircncia de exclusatildeo molecular (SE-HPLC)
A anaacutelise de exclusatildeo molecular foi realizada em um sistema de cromatografia
liacutequida de alta eficiecircncia consistindo de uma bomba Varian 9012 um detector de
absorbacircncia de duplo comprimento de onda Varian 9050 e o software Star
Chromatography Workstation (todos da Varian Walnut Creek CA USA) que permite a
4 Material e meacutetodos 40
obtenccedilatildeo e processamento da informaccedilatildeo cromatograacutefica Volume de 20 microL de β-LG 05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) foi aplicado a uma coluna RES-
ELUT-SEC 3000 (300 x 775 mm di) (Varian Palo Alto CA USA) e eluiacuteda com tampatildeo
fosfato de soacutedio (50 mM NaCl 015 M pH 68) a um fluxo de 08 mLmin e monitorada por
absorccedilatildeo a 280 nm A massa molar aparente correspondente aos picos eluiacutedos foi
estimada a partir de uma curva de calibraccedilatildeo construiacuteda usando marcadores da Bio-Rad
(Hercules CA USA) tiroglobulina bovina (670 kDa) gama globulina bovina (158 kDa)
ovalbumina (44 kDa) mioglobulina (17 kDa) e vitamina B-12 (135 kDa)
426 Eletroforese em gel de poliacrilamida em condiccedilotildees nativa
desnaturante e redutora
As anaacutelises de PAGE e SDS-PAGE da β-LG sem tratamento e da β-LG irradiada
foram realizadas como descrito por Laemmli (1970) utilizando equipamento Phast
System Pharmacia Biotech (Pharmacia LKB Biotechnology Uppsala Sweden) usando
geacuteis Phast-System de 125 (Amersham Bioscience Uppsala Sweden)
As amostras foram preparadas em tampatildeo de amostra contendo SDS contendo
ou natildeo 5 β-mercaptoetanol e aquecidas a 95degC por 5 min Os geacuteis foram corados com
Comassie Brilliant Blue R250 Um kit de marcadores de baixa massa molar (144-94 kDa)
da Pharmacia (Upsala Sweden) foi usado para calibraccedilatildeo
427 Isoterma de sorccedilatildeo
A isoterma de sorccedilatildeo foi obtida segundo meacutetodo proposto por Labuza Kaanane e
Chen (1985) As amostras de β-LG com umidade inicial de 43 foram colocadas em
sistemas fechados contendo soluccedilotildees saturadas de sais de LiCl MgCl2 K2CO3 Mg(NO3)2
NaCl KCl e BaCl2 a 25degC por 12 dias tempo em que o equiliacutebrio foi alcanccedilado Os dados
foram analisados pelo modelo GAB (Guggenheim ndash Anderson ndash de Bocircer) utilizando o
programa Water Analyzer Series ndash IsothermBETGAB Versatildeo 205p As anaacutelises foram
feitas em triplicata
428 Anaacutelises Estatiacutesticas
As anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas pelo programa SASreg Statistical
Analysis System (Cary North Carolina USA SAS Institute Inc SAS Campus Drive)
Version 80 2000 Os resultados experimentais foram submetidos agrave anaacutelise de variacircncia e
as meacutedias comparadas pelo teste de Tukey ao niacutevel de significacircncia de 5
5 Resultados e Discussatildeo 41
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
5 Resultados e Discussatildeo 42
5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
51 Caracterizaccedilatildeo da β-LG
A β-LG apresentou teor de proteiacutena de 936plusmn06 umidade de 429plusmn002 e
atividade de aacutegua de 022plusmn 001 medida agrave 25degC
O grau de pureza foi avaliado por eletroforese em gel com e sem desnaturante e
por cromatografia liacutequida de fase reversa
A Figura 5 mostra o perfil eletroforeacutetico da β-LG com aw inicial de 022 no sistema
PAGE (A) e no SDS-PAGE (B)
Figura 5 Perfil eletroforeacutetico da β-LG (aw022) A PAGE e B SDS-PAGE em gel de poliacrilamida de 12
Linha 1 padratildeo massa molar da Pharmacia (144-94 kDa) linha 2 amostra de β-LG
Na eletroforese em gel PAGE (Figura 5 A) observa-se a presenccedila de duas bandas
na parte inferior do gel a inferior correspondendo agrave β-LG variante A e a superior agrave
variante B (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 YANG et al 2001) Jaacute na
eletroforese SDS-PAGE (Figura 5B) observa-se apenas uma banda pois as cargas de
ambas as variantes se igualam dando origem a uma banda uacutenica correspondente agrave β-LG
monocircmero de massa molar ~184 kDa que corresponde ao valor aproximado para uma
mistura das variantes A e B da β-LG
A
B
β-LG Var B Var A
β-LG Var A e B
M(kDa) 94 67 43 30 201 144
1 2 1 2
5 Resultados e Discussatildeo 43
No cromatograma de fase reversa (Figura 6) observa-se um pico no tempo de
~46-47 minutos de eluiccedilatildeo dividido em dois maacuteximos que correspondem agrave β-LG variante
B o primeiro e agrave variante A o segundo (CAESSENS et al1999 ELGAR et al 2000)
Figura 6 Cromatograma de RP-HPLC da β-LG (aw=022) Aliacutequotas de 20 microL de soluccedilatildeo de β-LG (05
mgmL em tampatildeo fosfato de soacutedio 10 mM pH 70) foram injetados numa coluna C18 equilibrada a 40 degC A
eluiccedilatildeo foi feita com fluxo de 10 mL min em gradiente de acetonitrila e a absorbacircncia monitorada a 214 nm
A anaacutelise de eletroforese e a cromatografia de fase reversa sugerem que a β-LG
possui alto grau de pureza indicado pela presenccedila exclusiva do pico da β-LG no
cromatograma (Figura 6) e pela uacutenica banda na regiatildeo que corresponde ao monocircmero da
proteiacutena em meio desnaturante com SDS (Figura 5 B)
A isoterma obtida para a β-LG (Figura 7) tem a forma caracteriacutestica das isotermas
da maioria dos alimentos O conteuacutedo de aacutegua na monocamada (M0) foi de 00728 g por 1
g de soacutelidos (corresponde a ~74 moleacuteculas de aacutegua por mol de β-LG monocircmero)
No presente experimento amostras de β-LG soacutelida com aw de 022 053 e 074
foram submetidas a tratamento de irradiaccedilatildeo e segundo a isoterma de sorccedilatildeo mostrada
na Figura 7 estes valores de aw correspondem aproximadamente a 6 12 e 18 g de aacutegua
100 g de produto seco respectivamente Estes valores de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem
garantir sua estabilidade enquanto natildeo for submetida a tratamento (LAI TOPP 1999 LIU
LANGER KLIBANOV 1991 RUPLEY CARERI 1991)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
β-LG Var B
β-LG Var A Abs
(UA)
5 Resultados e Discussatildeo 44
Figura 7 Isoterma de sorccedilatildeo da β-LG a 25degC
Diferentes graus de hidrataccedilatildeo da proteiacutena podem significar diferentes
susceptibilidades aos tratamentos como o de irradiaccedilatildeo onde reaccedilotildees ou alteraccedilotildees
poderatildeo ocorrer e afetar a sua estabilidade Eacute conhecido que agrave baixa atividade de aacutegua
fatores importantes como a falta de flexibilidade conformacional e resistecircncia a reaccedilotildees
envolvendo ligaccedilotildees covalentes contribuem para uma maior estabilidade da proteiacutena
(ZAKS 1992)
52 Efeitos da radiaccedilatildeo gama na β-LG
Os resultados foram agrupados considerando trecircs aspectos importantes (1)
mudanccedilas estruturais (2) agregaccedilatildeo e (3) mecanismo de agregaccedilatildeo para explicar melhor
a amplitude dos efeitos da irradiaccedilatildeo gama na proteiacutena β-LG
521 Mudanccedilas estruturais
As mudanccedilas estruturais foram avaliadas por anaacutelises de fluorescecircncia intriacutenseca
dicroiacutesmo circular e grupos sulfidrila livre Embora as anaacutelises de SAXS tambeacutem forneccedilam
dados estruturais estes seratildeo expostos no item sobre agregaccedilatildeo
Fluorescecircncia intriacutenseca
Amostras irradiadas soacutelidas
Foram feitas medidas de fluorescecircncia intriacutenseca para avaliar modificaccedilotildees
estruturais da proteiacutena irradiada As amostras irradiadas soacutelidas (aw 022 053 e 074) com
doses ateacute 50 kGy natildeo mostraram diferenccedilas com respeito agrave amostra natildeo irradiada (Figura
8 A B C) apresentando a mesma intensidade e igual maacuteximo (333 nm) na curva de
Kb = 085 C = 870 Mo = 00728 g H2O g solids 1281 cal mole H2O
5 Resultados e Discussatildeo 45
fluorescecircncia As pequenas variaccedilotildees na intensidade entre as amostras estatildeo dentro do
erro experimental de ~10 (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
C0A1 C10A1 C25A1 C50A1
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
C0A2 C10A2 C25A2 C50A2
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000C
C0A3 C10A3 C25A3 C50A3
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
Figura 8 Espectros de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada soacutelida com 0 10 25 e 50 kGy (A) Amostras
(aw 022) C0A1 C10A1 C25A1 e C50A1 (B) ( aw 053) amostras C0A2 C10A2 C25A2 e C50A2 e (C) (aw
074) amostras C0A3 C10A3 C25A3 e C50A3
5 Resultados e Discussatildeo 46
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
As amostras de proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com exceccedilatildeo da irradiada a 10 kGy
e concentraccedilatildeo de 10 mgmL (C10S10) apresentaram diminuiccedilatildeo da intensidade de
fluorescecircncia em conjunto com deslocamento do maacuteximo da intensidade para
comprimentos de onda maiores (red-shift) (Figura 9)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000A
343nm
339nm
336nm333nm
C0S10 C10S10 C25S10 C50S10
Inte
nsid
ade
Fluo
resc
ecircnci
a (U
A)
comprimento de onda (nm)
280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
0
2000
4000
6000
8000
10000B
345nm
348nm
333nm
C0S3 C10S3 C25S3 C50S3
Inte
nsid
ade
fluor
escecirc
ncia
(UA
)
comprimento de onda (nm)
Figura 9 Espectro de fluorescecircncia intriacutenseca da β-LG irradiada em soluccedilatildeo com 0 10 25 e 50 kGy (A)
(10mgmL) amostras C0S10 C10S10 C25S10 C50S10 e (B) β-LG (3mgmL) amostras C0S3 C10S3
C25S3 e C50S3 λexc=280 nm e λemiss= 300-450 nm
5 Resultados e Discussatildeo 47
As curvas correspondentes agrave β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo 10
mgmL (C10S10 C25S10 e C50S10) (Figura 9A) apresentaram maacuteximos de intensidade
de fluorescecircncia em 336 339 e 343 nm respectivamente A amostra natildeo irradiada
(C0S10) apresentou maacuteximo de intensidade em 333 nm indicando a ocorrecircncia de um
deslocamento para o vermelho (red-shift) de 3 6 e 10 nm para as amostras irradiadas
com 10 25 e 50 kGy respectivamente
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL com 10 e 25 kGy
(C10S3 e C25S3) apresentaram maacuteximos de intensidade de fluorescecircncia nos
comprimentos de onda 348 e 345 nm respectivamente (Figura 9B) Para a dose de 50
kGy (C50S3) o maacuteximo natildeo foi definido exatamente devido aos baixos valores de
intensidade de fluorescecircncia mas estima-se que esteja entre 351-359 nm Considerando
o maacuteximo da curva da β-LG sem irradiar em 333 nm houve um deslocamento para o
vermelho de 15 12 e ~18 nm para as amostras irradiadas com 10 25 e 50 kGy
respectivamente
O deslocamento para o vermelho eacute decorrente da maior estabilizaccedilatildeo do estado
excitado do Trp ao passar de um meio apolar para outro mais polar ou mais exposto ao
solvente o que poderia ser uma indicaccedilatildeo de desnaturaccedilatildeo da proteiacutena (CHEN
BARKLEY 1998 CALLIS 1997) Os valores de deslocamento para o vermelho relatados
na literatura satildeo de ~13 nm para a desnaturaccedilatildeo da β-LG pela accedilatildeo da ureacuteia 8M (YANG
et al 2001) 18 nm na presenccedila de ureacuteia 948 M (CRAEMER 1995) e de 20 nm na
presenccedila de cloreto de guanidiacutenio 6M (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996) Outros
valores de deslocamento para o vermelho encontrados na literatura satildeo 4 nm quando a
β-LG eacute submetida a pressatildeo de 600 MPa (YANG et al 2001) e ~8 nm quando a β-LG eacute
submetida ao aquecimento ateacute 85degC (MANDERSON HARDMAN CRAMER 1999b)
Embora o deslocamento para o vermelho tenha sido observado para algumas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ele natildeo eacute suficiente para caracterizar desnaturaccedilatildeo pois
deve ser analisado juntamente com a intensidade da fluorescecircncia
Observou-se diminuiccedilatildeo na intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca do Trp nas
amostras C25S10 C50S10 C10S3 C25S3 e C50S3 (Figura 9A e B) o que natildeo seria
esperado para amostras de β-LG que apresentam deslocamento para o vermelho ou
desnaturaccedilatildeo Para a β-LG ao contraacuterio do que ocorre para a maioria das proteiacutenas
globulares que apresentam desnaturaccedilatildeo por aquecimento ou por reagentes quiacutemicos
desnaturantes o deslocamento para o vermelho vem acompanhado de aumento na
intensidade da fluorescecircncia (YANG et al 2001 VALENTE-MESQUITA BOTELHO
5 Resultados e Discussatildeo 48
FERREIRA 1998) devido possivelmente agrave diminuiccedilatildeo da supressatildeo da fluorescecircncia do
triptofano na proteiacutena desnaturada A diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia
observada nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo neste experimento poderia ser explicada
ao menos parcialmente pela ocorrecircncia de perda de Trp devido agrave irradiaccedilatildeo ou porque o
Trp passou a ocupar uma posiccedilatildeo com maior supressatildeo que na estrutura nativa devido agrave
nova conformaccedilatildeo ou agregaccedilatildeo da proteiacutena
Com respeito ao deslocamento para o vermelho apresentado pelas amostras
irradiadas em soluccedilatildeo duas observaccedilotildees satildeo relevantes a primeira eacute que as bandas de
fluorescecircncia apresentam alargamento indicando que espeacutecies fluorescentes diferentes
do Trp podem estar interferindo no espectro de fluorescecircncia e consequumlentemente o
deslocamento para o vermelho mostrado natildeo corresponda exclusivamente ao Trp
mudando de ambiente A segunda eacute que com a irradiaccedilatildeo pode ter ocorrido
desestabilizaccedilatildeo do estado singlete fundamental (S0) do Trp para um valor de energia
mais alto mais proacuteximo do estado excitado (S1) Ao sofrer excitaccedilatildeo o Trp emitiraacute
fluorescecircncia de menor energia ao voltar a este estado singlete fundamental alterado
gerando um deslocamento para o vermelho que natildeo teria como causa a mudanccedila de
ambiente do Trp de um meio apolar para um ambiente mais polar
Desta forma embora a ordem de grandeza dos valores de deslocamento para o
vermelho observados nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo seja similar aos encontrados
em caso de desnaturaccedilatildeo por calor ou por desnaturantes quiacutemicos natildeo representa o
mesmo grau de alteraccedilatildeo estrutural A possibilidade de ter ocorrido desestabilizaccedilatildeo do
estado singlete fundamental do Trp e do surgimento de outras espeacutecies fluorescentes nas
amostras irradiadas em soluccedilatildeo que influenciariam nos valores de deslocamento para o
vermelho levam a supor uma alteraccedilatildeo estrutural maior da que realmente aconteceu
Dicroiacutesmo Circular (CD) Foram analisadas por dicroiacutesmo circular as amostras irradiadas soacutelidas e em
soluccedilatildeo com doses de irradiaccedilatildeo de 0 10 e 50 kGy
Amostras irradiadas soacutelidas
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
Para o caacutelculo da estrutura secundaacuteria das amostras foi utilizado o programa
CDSSTR (WHITMORE WALLACE 2004 COMPTON JOHNSON 1986)
(httpwwwcrystbbkacukcdweb) do servidor DICHROWEB e os resultados encontram-
5 Resultados e Discussatildeo 49
se na Tabela 5 Antes de definir o meacutetodo de caacutelculo do conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria foram testados diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de CD para
a amostra C0A1 com o propoacutesito de visualizar as diferenccedilas no conteuacutedo da estrutura
secundaacuteria inerentes ao meacutetodo de caacutelculo Para esta amostra (C0A1) os valores obtidos
utilizando os trecircs meacutetodos de caacutelculo apresentaram boa concordacircncia Foi escolhido o
meacutetodo CDSSTR por apresentar maiores facilidades de entrada dos dados no software
correspondente
Tabela 3 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da amostra natildeo irradiada C0A1 obtido por
diferentes meacutetodos de deconvoluccedilatildeo do espectro de UV-longiacutenquo
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas
CDSSTR 13 33 23 29
SELCON 143 341 226 269
CONTIN 166 329 221 286 A faixa de comprimento de onda analisado foi de 190-240 nm em todos os meacutetodos
Na literatura encontram-se diferentes valores para o conteuacutedo de estrutura
secundaacuteria da β-LG nativa (Tabela 4) que satildeo influenciados principalmente pela faixa de
comprimento de onda utilizada na anaacutelise Destaca-se por exemplo as diferenccedilas
encontradas para a mesma amostra analisada utilizando o meacutetodo SELCON (valores em
negrito na Tabela 4) ao considerar faixas diferentes de comprimento de onda
Tabela 4 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG no estado nativo reportados na
literatura
meacutetodo heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas autor
X-rays 68 512 99 321 Brownlow et al 1997
PROSEC 12 51 11 26 Phillips et al 1995
CONTIN 166 452 123 258 Griffin et al 1993
Regressatildeo 15 54 12 19 De Jongh 2001
SELCON 10 50 8 35 Qi et al 1997
SELCON 28 22 17 33 Qi et al 1997
Todas amostras foram analisadas a pH 70 com exceccedilatildeo de amostra analisada a pH 68 analisada a pH 675 e na faixa de 170-260 nm mesma amostra que em analisada a pH 675 e na faixa de 200-260 nm
5 Resultados e Discussatildeo 50
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras de proteiacutena natildeo irradiadas e
das irradiadas no estado soacutelido (com diferente aw) satildeo mostrados nas Figuras 10 11 e 12
Para as amostras natildeo irradiadas o espectro de CD mostrou um extremo negativo ao
redor de 216 nm um cruzamento no dicroiacutesmo zero a 203 nm e um extremo positivo ao
redor de 195 nm caracteriacutesticas que sinalizam um alto conteuacutedo de filamentos-β (CHANG
WU YANG 1978) A deconvoluccedilatildeo de espectro mostrou conteuacutedo de 13 de heacutelices-α
33 de filamentos-β 23 de turns e 30 de estrutura desordenadas confirmando a
predominacircncia de estruturas β (Tabela 5) Os valores calculados estatildeo na faixa do
conteuacutedo da estrutura secundaacuteria reportada por outros autores que tambeacutem utilizaram
dicroiacutesmo circular no caacutelculo para β-LG nativa como alguns jaacute mostrados na Tabela 4
(GRIFFIN et al 1993 KUWAJIMA YAMAYA SUGAI 1996 QI et al 1997
PRABAKARAN DAMODARAN 1997 CROGUENEC et al 2004)
Os espectros de CD das amostras irradiadas com doses de 10 e 50 kGy (Figuras
10 11 e 12) foram quase idecircnticos na forma e intensidade aos das amostras natildeo
irradiadas ressaltando que nas amostras irradiadas com 50 kGy o maacuteximo negativo em
216 nm (indicaccedilatildeo de estrutura folhas-β) (KELLY PRICE 1997) deslocou-se para um
comprimento de onda mais baixo ~207- 209 nm indicando efeito batocrocircmico Este efeito batocrocircmico junto com o aumento na intensidade negativa do dicroiacutesmo
no espectro caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas (MATSUURA
MANNING 1994) No entanto como o aumento de intensidade somente observado para
as amostras C50A2 e C50A3 foi muito pequeno a formaccedilatildeo de estruturas desordenadas
natildeo ocorreu nestas amostras como avaliado pelo caacutelculo das estruturas secundaacuterias ao
utilizar o meacutetodo de CDSSTR (Tabela 5)
5 Resultados e Discussatildeo 51
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A1 C10A1 C50A1
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda
Figura 10 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 022) natildeo irradiada (C0A1) irradiada soacutelida com dose
de 10 kGy (C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A2 C10A2 C50A2
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 11 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 053) natildeo irradiada (C0A2) irradiada soacutelida com 10kGy
(C10A2) e com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 52
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000
1500000
C0A3 C10A3 C50A3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 12 Espectros de UV-longiacutenquo da β-LG (aw = 074) natildeo irradiada (C0A3) irradiada soacutelida com 10 kGy
(C10A3) e com 50 kGy (C50A3)
Tabela 5 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria de amostras de β-LG irradiada soacutelida
Amostra heacutelices-α filamentos-β turns desordenadas Total C0A1 13 33 23 29 98
C10A1 13 32 23 31 99 C50A1 14 31 23 31 99 C0A2 13 34 23 30 100
C10A2 14 32 23 31 100 C50A2 13 33 23 30 99 C0A3 13 33 23 31 100
C10A3 13 32 23 30 99 C50A3 13 33 24 30 100
A deconvoluccedilatildeo dos espectros de UV-longiacutenquo indicou que natildeo ocorreram
alteraccedilotildees no conteuacutedo de heacutelices-α (~13) ou filamentos-β (~33) nas amostras de β-
LG irradiadas no estado soacutelido independente da aw ou das doses de irradiaccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
Os espectros de CD no UV-proacuteximo das amostras irradiadas no estado soacutelido
estatildeo apresentados nas Figuras 13 14 e 15 Independente da aw os espectros de CD
foram similares aos espectros de CD no UV-proacuteximo reportados na literatura para a β-LG
na forma nativa mostrando picos negativos em 260 266 275 285 292 nm sinais
associados com a riacutegida estrutura terciaacuteria da β-LG nativa (KUWAYIMA YAMAYA
5 Resultados e Discussatildeo 53
SUGAI 1996 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b) Somente uma pequena
diminuiccedilatildeo na intensidade do dicroiacutesmo foi observada ao ser aumentada a dose de
radiaccedilatildeo
240 260 280 300 320 340 360
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-05
00
05
C0A1 C10A1 C50A1
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 13 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG com aw 022 natildeo irradiada (C0A1) irradiada com 10 kGy
(C10A1) e com 50 kGy (C50A1)
240 260 280 300 320 340 360
-4
-3
-2
-1
0
C0A2 C10A2 C50A2
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 14 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 053 natildeo irradiada (C0A2) irradiada com 10 kGy (C10A2) e
com 50 kGy (C50A2)
5 Resultados e Discussatildeo 54
240 260 280 300 320 340 360-5
-4
-3
-2
-1
0
C0A3 C10A3 C50A3
CD
comprimento de onda (nm)
Figura 15 Espectro no UV-proacuteximo da β-LG aw 074 natildeo irradiada (C0A3) irradiada com 10 kGy (C10A3) e
com 50 kGy (C50A3)
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura secundaacuteria UV-longiacutenquo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL e 3 mgmL
apresentaram o dicroiacutesmo no UV-longiacutenquo mostrados nas Figuras 16 e 17
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S10 C10S10 C50S10
comprimento de onda (nm)
Figura 16 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiadas com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
[θ]
(deg
cm
2 dm
ol-1
)
5 Resultados e Discussatildeo 55
180 190 200 210 220 230 240 250 260 270
-1500000
-1000000
-500000
0
500000
1000000 C0S3 C10S3 C50S3
[θ] (
deg
cm2 d
mol
-1)
comprimento de onda (nm)
Figura 17 Espectro no UV-longiacutenquo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3 mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras C10S10 e C50S10 foram
similares ao espectro da amostra controle natildeo irradiada mas exibiram aumento negativo
da elipticidade e um deslocamento dos maacuteximos negativos para comprimentos de onda
mais curtos de 219 para ~207 nm (Figura 16) Nas amostras C10S3 e C50S3 (Figura 17)
estas mudanccedilas foram mais draacutesticas com alteraccedilatildeo na forma e na intensidade relativa
do CD e tambeacutem deslocando a banda negativa para uma posiccedilatildeo de comprimento de
onda mais baixo 202-205 nm Isto sugere que tanto a dose de irradiaccedilatildeo como a
concentraccedilatildeo de proteiacutena das amostras irradiadas foram as responsaacuteveis pelas
alteraccedilotildees estruturais que originaram a diferenccedila entre os espectros de UV-longiacutenquo
Para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a concentraccedilatildeo menor gerou alteraccedilotildees mais
significativas
Apesar destas alteraccedilotildees as amostras apresentam apenas pequenas diferenccedilas
no conteuacutedo de folhas-β e heacutelices-α que a proteiacutena natildeo irradiada (Tabela 6)
5 Resultados e Discussatildeo 56
Tabela 6 Conteuacutedo de estrutura secundaacuteria da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3mgmL e
10mgmL)
Amostra heacutelices- α filamentos-β turns desordenadas Total C0S3 12 34 23 30 99
C10S3 9 31 25 34 99 C50S3 13 30 24 33 100 C0S10 12 34 23 30 99
C10S10 12 32 24 31 99 C50S10 12 32 24 32 100
Os espectros de CD no UV-longiacutenquo das amostras irradiadas em soluccedilatildeo
mostraram as mesmas caracteriacutesticas espectrais da β-LG submetida a tratamento teacutermico
ou a alta pressatildeo hidrostaacutetica
Nos estudos sobre alteraccedilotildees estruturais por CD da β-LG submetida a tratamento
teacutermico as principais caracteriacutesticas aumento da intensidade negativa da banda que
caracteriza uma estrutura β e o seu desvio para comprimentos de onda mais baixos satildeo
geralmente mantidas ainda que sejam utilizadas diferentes condiccedilotildees de pH
concentraccedilatildeo de proteiacutena ou tempo de aquecimento (GRIFFIN et al 1993 MATSUURA
MANNING 1994 QI et al 1997 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b
CARROTA et al 2001 CHEN et al 2005) O mesmo eacute observado para tratamentos com
alta pressatildeo (YANG et al 2001) Diferenccedilas nos resultados entre estes estudos devem-
se principalmente agraves diferenccedilas na metodologia analiacutetica (diferente faixa de comprimento
de onda analisada) na interpretaccedilatildeo ou no caacutelculo do conteuacutedo das diversas estruturas
secundaacuterias a partir dos espectros
Um estudo interessante de Carrota et al (2001) mostra que os espectros de CD
no UV-longiacutenquo do diacutemero da β-LG nativa (Figura 18(a) espectro 1) eacute diferente do
diacutemero natildeo nativo e dos oligocircmeros da β-LG formados no primeiro estaacutegio do tratamento
teacutermico (Figura 18 (a) espectros 2 e 3) O espectro correspondente ao diacutemero natildeo nativo
e aos oligocircmeros eacute praticamente o mesmo e similar aos obtidos para as soluccedilotildees de β-LG
irradiadas (Figuras 16 e 17)
Com base no estudo de Carrota et al (2001) e nos resultados obtidos no presente
trabalho conclui-se que (1) a mudanccedila estrutural de diacutemero nativo para natildeo nativo pode
ser capaz de causar a mudanccedila no espectro de CD comum para todos os tratamentos por
aquecimento no primeiro estaacutegio (lt65degC) onde ocorre a formaccedilatildeo de oligocircmeros (2) as
propriedades dos diacutemeros natildeo nativos que originam tais caracteriacutesticas espectrais podem
ser atribuiacutedas tambeacutem a outros oligocircmeros como triacutemeros ou tetracircmeros produzidos por
5 Resultados e Discussatildeo 57
aquecimento da β-LG (Carrota et al 2003) jaacute que apresentam o mesmo tipo de espectro
e (3) que os oligocircmeros formados por irradiaccedilatildeo devem apresentar alguma propriedade
similar aos oligocircmeros produzidos por aquecimento jaacute que tambeacutem apresentam espectro
de CD no UV-longiacutenquo muito parecidos
Figura 18 Espectro do dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo (a) e UV-proacuteximo (b) de β-LG (1) β-LG diacutemero na
sua forma nativa antes do aquecimento e (2) (3) e (4) produtos formados apoacutes aquecimento ateacute 85degC e
isolados por filtraccedilatildeo em gel (2) diacutemero metaestaacutevel (3) oligocircmeros (4) agregados (Ref CARROTA et al
2001)
O diacutemero natildeo nativo e estaacutevel da β-LG caracterizado por Carrota et al (2001) por
dicroiacutesmo circular parece corresponder ao mesmo diacutemero caracterizado por Croguenec et
al (2003 2004) e conhecido como estado de molten globule diacutemero estaacutevel gerado pelo
aquecimento da β-LG Por esta razatildeo poder-se-ia concluir que as propriedades estruturais
da forma molten globule poderiam ser as responsaacuteveis pela geraccedilatildeo do espectro
caracteriacutestico de CD no UV-longiacutenquo No molten globule a estrutura secundaacuteria
permanece praticamente inalterada mas a estrutura terciaacuteria diferente da nativa
apresenta maior mobilidade ou flexibilidade das cadeias laterais mas ainda mantendo
certo grau de compactaccedilatildeo (PTITSYN 1995)
Nas amostras C10S10 C50S10 C10S3 e C50S3 a mudanccedila para λ menor bem
como o aumento da intensidade do maacuteximo negativo do dicroiacutesmo no espectro de UV-
longiacutenquo foram significativas o que caracterizaria a formaccedilatildeo de estruturas
desordenadas (MATSUURA MANNING 1994) No entanto o caacutelculo da estrutura
secundaacuteria natildeo mostrou aumento destas estruturas (Tabela 6) o que parece indicar que a
1 2
3
4
123
4
5 Resultados e Discussatildeo 58
avaliaccedilatildeo apenas destes dois paracircmetros natildeo eacute suficiente para caracterizar a formaccedilatildeo
de estruturas desordenadas
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Estrutura terciaacuteria UV-proacuteximo
As amostras irradiadas em soluccedilatildeo (Figuras 19 e 20) apresentaram grande
diminuiccedilatildeo na magnitude dos picos maior nas doses mais altas de radiaccedilatildeo e
concentraccedilatildeo de proteiacutena mais baixa indicando perda do dicroiacutesmo aromaacutetico Esta perda
de dicroiacutesmo pode representar perda de estrutura terciaacuteria da proteiacutena (PTITSYN 1995
DOLGIKH et al 1981 MATSUURA MANNING 1994)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
C0S10 C10S10 C50S10
C D
comprimento de onda
Figura 19 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentracatildeo de 10 mgmL natildeo
irradiada (C0S10) e irradiada com 10 kGy (C10S10) e 50 kGy (C50S10)
240 260 280 300 320 340
-4
-3
-2
-1
0
1
C0S3 C10S3 C50S3C
D
comprimento de onda (nm)
Figura 20 Espectro de CD no UV-proacuteximo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 3mgmL natildeo
irradiada (C0S3) e irradiada com 10 kGy (C10S3) e 50 kGy (C50S3)
5 Resultados e Discussatildeo 59
Reduccedilatildeo substancial da intensidade dos picos foi observada na amostra de β-LG
C10S10 (10 mgmL irradiada com 10 kGy) sendo maior a diminuiccedilatildeo no pico em ~292nm
correspondente ao Trp enquanto o completo desaparecimento dos picos foi observado na
amostra C50S10 (Figura 19) Amostras com menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL)
apresentaram reduccedilatildeo quase total do sinal de dicroiacutesmo jaacute em dose de 10 kGy (C10S3)
(Figura 20)
As medidas de fluorescecircncia das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
sugerem que natildeo somente pode ter ocorrido a mudanccedila no ambiente do Trp mas
tambeacutem perda deste aminoaacutecido Este fato indicaria que nas anaacutelises de CD no UV-
proacuteximo os sinais diminuiacutedos do dicroiacutesmo podem ter sido causados em parte pela perda
do Trp No entanto natildeo se descarta a possibilidade de ter havido modificaccedilatildeo no
ambiente do Trp originado por alguma modificaccedilatildeo estrutural que permitiu uma maior
mobilidade dos grupos laterais sem prejuiacutezo da perda estrutural do caacutelice hidrofoacutebico e
estruturas β e α
Os resultados de CD no UV-longiacutenquo sinalizaram a manutenccedilatildeo da estrutura
secundaacuteria dos produtos gerados (oligocircmeros) na soluccedilatildeo irradiada e que estes produtos
tendo as mesmas caracteriacutesticas de CD no UV-longiacutenquo que os produzidos por
aquecimento poderiam ter igualmente uma estrutura terciaacuteria semelhante agrave de molten
globule No entanto se compararmos os espectros de CD no UV-proacuteximo (Figuras 19 e
20) com os obtidos em estudo de tratamento da β-LG com aquecimento (Figura 18)
pode-se observar que no tratamento com radiaccedilatildeo os espectros natildeo mostraram as
bandas tiacutepicas atribuiacutedas a ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares (sinalizadas por uma seta
no graacutefico (b) da Figura 18 espectros 2 e 3) na faixa de comprimento de onda 260-290
nm (CARROTA et al 2001 MANDERSON CREAMER HARDMAN 1999b KUWAJIMA
YAMAYA SUGAI 1996) Isto indica que a β-LG irradiada em soluccedilatildeo natildeo apresenta
exatamente as caracteriacutesticas que configuram o estado de molten globule dos oligocircmeros
produzidos nos primeiros estaacutegios do aquecimento da proteiacutena
Grupos sulfidrila livres
A β-LG apresenta duas pontes dissulfeto e uma cisteiacutena livre teoricamente um
grupo SH por monocircmero de β-LG Este grupo SH livre se encontra protegido na
superfiacutecie interdimeacuterica (BROWNLOW et al 1997 BRITTAN et al 1997)
Os grupos sulfidrila livres determinados com reagente Ellman estatildeo reportados na
Tabela 7 Nas amostras irradiadas no estado soacutelido os grupos sulfidrila livres diminuiacuteram
5 Resultados e Discussatildeo 60
significativamente em algumas amostras agrave medida que a dose de irradiaccedilatildeo foi
aumentando ateacute um maacuteximo de ~11 de perda na dose de 50 kGy
Tabela 7 Teor de grupos sulfidrila (-SH) livre em amostras de β-LG natildeo irradiada
irradiada soacutelida (aw 022 053 e 074) e irradiada em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) Dose de
irradiaccedilatildeo em kGy Resultados expressos como moles-SH mol de β-LG
Moles SH mol de β-LG β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
090plusmn001ab1 090plusmn001a1 088plusmn001abc1 086plusmn000abc1 085plusmn001bcd1 083plusmn004cd1 080plusmn001d1
aw 053
090plusmn002a1 090plusmn001a1 089plusmn001ab1 089plusmn002a1 087plusmn002ab1 085plusmn003ab1 081plusmn003b1
aw 074
090plusmn003a1 088plusmn001ab1 086plusmn001ab1 086plusmn002ab1 087plusmn002ab1 084plusmn001b1 084plusmn003b1
3 mgmL
090plusmn001a1 059plusmn002b3 051plusmn002c3 043plusmn001d3 025plusmn001ef3 028plusmn000e3 022plusmn002f2
10 mgmL
092plusmn001a1 073plusmn002b2 069plusmn002bc2 064plusmn002c2 051plusmn003d2 038plusmn000e2 026plusmn001f2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo no entanto a perda de sulfidrila livre foi muito
maior A proteiacutena em concentraccedilatildeo de 3mgmL teve uma perda de ~75 quando irradiada
com 10kGy enquanto as amostras em concentraccedilatildeo de 10 mgmL somente tiveram esse
iacutendice de perda com 50 kGy A maior sensibilidade do grupo tiol em amostras com baixa
concentraccedilatildeo de proteiacutena sugere que a degradaccedilatildeo deste grupo esta relacionada com a
maior interaccedilatildeo com espeacutecies ativas resultantes da radioacutelisis da aacutegua que seriam
produzidas em maior quantidade nas amostras mais diluiacutedas configurando a ocorrecircncia
do efeito indireto da radiaccedilatildeo
Quando a proteiacutena eacute desnaturada por tratamento teacutermico ou por alta pressatildeo
hidrostaacutetica o grupo SH livre fica mais exposto e se torna mais reativo promovendo
reaccedilotildees de intercacircmbio tiol-dissulfeto que conduzem agrave formaccedilatildeo de agregados ligados
por pontes dissulfeto intermoleculares verificando-se entatildeo diminuiccedilatildeo na quantidade de
grupos SH livres (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 SHIMADA CHEFTEL 1989
IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997) No presente estudo embora tenha sido
5 Resultados e Discussatildeo 61
verificada diminuiccedilatildeo dos grupos SH a formaccedilatildeo de agregados da proteiacutena e a
contribuiccedilatildeo dos grupos SH na formaccedilatildeo de ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares precisou
ser estudada e os resultados seratildeo apresentados posteriormente Destaca-se no entanto
que como as amostras irradiadas apresentaram cheiro caracteriacutestico de produtos
sulfurados mais evidente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo e com doses maiores eacute
possiacutevel que tenha ocorrido algum grau de decomposiccedilatildeo dos resiacuteduos de aminoaacutecidos
que conteacutem sulfidrilas como a cisteiacutena Sabe-se que a cisteiacutena eacute um dos aminoaacutecidos
mais sensiacuteveis agrave irradiaccedilatildeo podendo sofrer oxidaccedilatildeo por accedilatildeo de radicais livres
(GARRISON 1987)
522 Agregaccedilatildeo
Agregaccedilatildeo da β-LG devido agrave irradiaccedilatildeo foi avaliada mediante anaacutelises de turbidez
eletroforese em gel PAGE SE-HPLC e SAXS
Turbidez As amostras irradiadas na forma soacutelida e em soluccedilatildeo apresentaram-se liacutempidas e
transluacutecidas apoacutes a radiaccedilatildeo com todas as doses (1-50 kGy) e a turbidez medida por
transmitacircncia a 550nm praticamente natildeo foi alterada (Tabela 8) indicando natildeo haver
formaccedilatildeo de agregados visiacuteveis como mostrado pelos valores de transmitacircncia mantidos
na ordem de 90 A leitura da transmitacircncia da amostra irradiada em concentraccedilatildeo de 3
mgmL foi feita nesta mesma concentraccedilatildeo e apresentou valores de transmitacircncia
comparativamente maiores que os das amostras lidas na concentraccedilatildeo de 10 mgmL
Estes resultados parecem indicar que prevaleceu o efeito de diluiccedilatildeo frente a qualquer
outro esperado pelo tratamento por irradiaccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 62
Tabela 8 Transmitacircncia () medida a λ=550 nm da β-LG natildeo irradiada e irradiada soacutelida
(aws 022 053 e 074) lida em soluccedilatildeo (10 mgmL) em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM
pH 70) e β-LG irradiada em soluccedilatildeo de tampatildeo fosfato (10 mM pH 70) a 3 e 10(mgmL)
lida nestas mesmas concentraccedilotildees
Transmitacircncia
β-LG
00 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy 100 kGy 250 kGy 500 kGy
aw 022
9095plusmn087a3 9162plusmn015a2 8973plusmn014a3 8980plusmn085a3 9068plusmn148a2 9284plusmn049a2 9122plusmn124a34
aw
053 8875plusmn175c4 9226plusmn092a2 9197plusmn042ab2 9230plusmn074a2 9318plusmn006a2 9160plusmn020ab2 9045plusmn151bc4
aw 074
9258plusmn136a23 9330plusmn171a2 9194plusmn076ab2 8958plusmn136b3 9333plusmn078a2 9161plusmn284ab2 9276plusmn021a23
3 mgmL
9737plusmn019a1 9699plusmn027a1 9669plusmn039a1 9656plusmn037a1 9646plusmn053a1 9723plusmn020a1 9659plusmn034a1
10 mgmL
9344plusmn038a2 9324plusmn069a2 9308plusmn084a2 9313plusmn065a2 9320plusmn064a2 9415plusmn010a2 9337plusmn013a2
Media de trecircs determinaccedilotildees plusmn desvio padratildeo Medias seguidas da mesma letra em cada linha e do mesmo nuacutemero em cada coluna natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) As amostras irradiadas soacutelidas com ateacute 10 kGy independente da aw natildeo
mostraram diferenccedilas na eletroforese natildeo desnaturante (PAGE) apresentando o mesmo
perfil que a amostra correspondente natildeo irradiada (linha 6 nos geacuteis A B e C Figura 21)
As amostras com aw 053 (Figura 21D) e 074 (Figura 21E) irradiadas com dose de 50 kGy
apresentaram pequeno aumento da densidade corada na regiatildeo do gel (marcada como r
acima das 2 bandas correspondentes a β-LG (variantes A e B) indicando a presenccedila de
produtos de carga e massa diferentes da nativa
5 Resultados e Discussatildeo 63
Figura 21 Eletroforese em gel PAGE da β-LG irradiada na forma de poacute (A) e (D) β-LG aw 022 (B) e (E) β-
LG aw 053 (C) e (F) β-LG aw 074 Em (A) (B) (C) (D) (E) e (F) a linha 1 corresponde ao padratildeo de massa
molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) Em (A) (B) e (C) as linhas 2 3 4 5 e 6 correspondem agraves
amostras de β-LG irradiadas com dose de 10 5 25 1 e 0 kGy respectivamente Em (D) (E) e (F) a linha 2
corresponde agrave dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy e a linha 3 a 25 kGy
A B C
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
1 2 3
F
1 2 3
β-LG
D
1 2 3
β-LG
r
E
β-LG
r r
5 Resultados e Discussatildeo 64
Figura 22 Perfil eletroforeacutetico nativo PAGE das amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo (A) β-LG irradiada
em soluccedilatildeo 3mgmL (B) β-LG irradiada em soluccedilatildeo 10mgmL Em (A) e (B) a linha 1 corresponde ao padratildeo
de massa molar de proteiacutenas da Pharmacia (144-94 kDa) a linha 2 3 4 5 e 6 agrave β-LG irradiada com doses
de 10 5 25 1 e 0 kGy
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo o perfil eletroforeacutetico obtido em condiccedilotildees
natildeo desnaturantes (PAGE) (Figura 22A e B) mostrou diminuiccedilatildeo das bandas
correspondentes agrave β-LG (variantes A e B) e aumento da densidade corada nas regiotildees
acima destas bandas com o aumento da dose de radiaccedilatildeo Isto sugere a formaccedilatildeo de
produtos com carga diferente da nativa eou com maior massa molar O efeito eacute mais
acentuado nas amostras de β-LG irradiada em concentraccedilatildeo menor (3 mgmL) (Figura
22A) melhor evidenciado na linha 2 onde se observa que a proteiacutena concentra-se quase
que integralmente na parte superior do gel de separaccedilatildeo e natildeo em toda a faixa da linha 2
como na Figura 22B indicando que houve maior agregaccedilatildeo da proteiacutena na amostra mais
diluiacuteda (3 mgmL)
Cromatografia de Exclusatildeo Molecular Os perfis cromatograacuteficos de SE-HPLC da amostra de β-LG irradiada com doses
de 0 5 10 25 e 50 kGy no estado soacutelido (aw = 022) e em soluccedilatildeo nas concentraccedilotildees 3 e
10 mgmL satildeo mostradas nas Figuras 23 24 e 25
β-LG irradiada soacutelida com doses de 5 10 25 e 50 kGy (C5A1 C10A1 C25A1 e
C50A1) (Figura 23) exibe perfil cromatograacutefico similar ao obtido para a amostra natildeo
irradiada (C0A1) (Figura 23) Para todas as amostras a eluiccedilatildeo se deu em ~93 minutos
A B
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
β-LG Var B Var A
5 Resultados e Discussatildeo 65
sob forma de um pico uacutenico com um maacuteximo que corresponde agrave massa molar meacutedia
aparente (MM) de 35 kDa calculada a partir de uma curva padratildeo de massa molar
previamente construiacuteda Esta eacute uma indicaccedilatildeo de que sob estas condiccedilotildees a β-LG existe
como diacutemero e natildeo foi modificada pela radiaccedilatildeo gama em doses de ateacute 50 kGy
0 2 4 6 8 10 12
00
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10 35kDa
Abs
orbacirc
ncia
a 2
80nm
(UA
)
Tempo de eluiccedilatildeo (min)
C0A1 C5A1 C10A1 C25A1 C50A1
Figura 23 Perfil de SE-HPLC da β-LG (aw =022) irradiada soacutelida com doses de 0 5 10 25 e 50 kGy
O perfil do SE-HPLC da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (10 mgmL) (Figura 24)
mostrou que o pico correspondente ao diacutemero observado na amostra controle (C0S10)
diminuiu quando a dose de irradiaccedilatildeo aumentou e novos picos correspondentes a
produtos de maior massa molar que 35 kDa eluiram em tempos menores entre 45 a 9
minutos Agrave medida que se aumentou a dose de radiaccedilatildeo houve aumento da massa molar
dos produtos para ~60kDa MM ~90 kDa e MM~300 kDa e outros de massa maior eluiram
no volume morto
5 Resultados e Discussatildeo 66
Figura 24 Perfil SE-HPLC da β-LG (10mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S10) e irradiadas com 5 kGy
(C5S10) 10 kGy (C10S10) 25 kGy (C25S10) e 50 kGy (C50S10)
Os perfis das amostras irradiadas em concentraccedilatildeo menor da proteiacutena (3 mgmL)
(Figura 25) mostraram que houve formaccedilatildeo de agregados por efeito da radiaccedilatildeo como foi
no caso da amostra irradiada na concentraccedilatildeo de 10 mgmL (Figura 24) Em geral para
uma mesma dose de radiaccedilatildeo os produtos resultantes da irradiaccedilatildeo da amostra de
concentraccedilatildeo 3 mgmL satildeo de maior massa molar que os formados a partir da amostra de
concentraccedilatildeo 10 mgmL A exceccedilatildeo seria a amostra C50S3 cujo perfil mostra que
contraacuterio ao observado na amostra C50S10 mostra produtos de massa menor que a
amostra C25S3
Em nenhum caso nas amostras irradiadas soacutelidas ou em soluccedilatildeo houve indiacutecios
de ter ocorrido monomerizaccedilatildeo da β-LG jaacute que natildeo foi observado nos cromatogramas
nenhum pico ou maacuteximo no tempo de eluiccedilatildeo em ~10 minutos
5 Resultados e Discussatildeo 67
Figura 25 Perfil SE-HPLC da β-LG (3mgmL) amostra natildeo irradiada (C0S3) e irradiadas com 5 kGy (C5S3)
10 kGy (C10S3) 25 kGy (C25S3) e 50 kGy (C50S3)
SAXS Os resultados mostrados a seguir foram agrupados por dose de radiaccedilatildeo e pelo
estado da amostra quando foi irradiada (soacutelida ou em soluccedilatildeo) As amostras natildeo
irradiadas foram consideradas controle As amostras irradiadas soacutelidas foram estudadas
nas doses 0 5 10 25 e 50 kGy e as amostras irradiadas em soluccedilatildeo nas doses 0 5 e 10
kGy
A partir das medidas de SAXS foram obtidos a curva de intensidade de
espalhamento SAXS a funccedilatildeo (pr) obtida da transformada de Fourier da intensidade de
espalhamento o graacutefico de Kratky e a curva da intensidade de espalhamento com base
na estrutura cristalograacutefica sendo apresentadas dentro de cada figura com as letras A B
C e D respectivamente
Amostras irradiadas na forma soacutelida
As intensidades de espalhamento e ajuste teoacuterico realizado com o programa
GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991) para a proteiacutena natildeo irradiada com aw 022 053 e
074 satildeo mostradas na Figura 26A Para as trecircs amostras os dados foram muito
similares com boa relaccedilatildeo sinalruiacutedo apresentando modulaccedilatildeo nas curvas de
espalhamento tiacutepica de partiacuteculas globulares
5 Resultados e Discussatildeo 68
A transformada de Fourier da intensidade de espalhamento fornece a curva de
distribuiccedilatildeo de pares de distacircncias p(r) (GUINIER FOURNET 1955) a qual provecirc
indicaccedilotildees sobre a forma da partiacutecula Na Figura 26B estatildeo apresentadas as curvas da
funccedilatildeo p(r) calculadas a partir do ajuste dos dados experimentais com o programa
GNOM
A forma das curvas de intensidade (Figura 26A) e da funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de
distacircncias p(r) (Figura 26B) indicam que as amostras natildeo irradiadas independente da
atividade de aacutegua apresentaram a mesma conformaccedilatildeo Pela forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 26B) verifica-se que a partiacutecula possui uma conformaccedilatildeo ligeiramente prolata
(GUINIER FOURNET 1955 GLATTER KRATKY 1982)
Das medidas de SAXS obtiveram-se os valores para o raio de giro (Rg) por ajuste
teoacuterico da intensidade utilizando o programa GNOM (SEMENYUK SVERGUN 1991)
Deste ajuste verificou-se que as proteiacutenas natildeo irradiadas C0A1 C0A2 e C0A3 possuem
raios de giro com valores de 240plusmn03 235plusmn04 e 254plusmn08 Aring respectivamente Os
valores estatildeo um pouco acima dos encontrados para a proteiacutena dimeacuterica nativa que pode
ser calculada da estrutura cristalina (215 Aring) (SVERGUN BARBERATO KOCH 1995) e
dos valores encontrados em experimentos com β-LG nativa em soluccedilatildeo (PANICK
MALESSA WINTER 1999 WITZ TIMASHEFF LUZZATI 1964 GREEN et al 1979)
Valores similares aos obtidos em nosso estudo foram encontrados por Carrota et al
(2003) (254plusmn04 Aring) e no estudo por espalhamento de necircutrons a baixo-acircngulo (SANS)
realizado por Verheul et al (1999) (236plusmn02 Aring)
Do ajuste teoacuterico tem-se tambeacutem a extrapolaccedilatildeo dos dados para q=0 Com a
intensidade na origem (I(0)) eacute possiacutevel determinar a massa molar da proteiacutena Os valores
da massa molar para as diferentes amostras natildeo irradiadas junto com as maacuteximas
dimensotildees obtidas das curvas p(r) encontram-se na Tabela 9
5 Resultados e Discussatildeo 69
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001In
tens
idad
e (U
A)
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
0 20 40 60 80
0
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C0A1 C0A2 C0A3
00 01 02 03 0400
20x10-5
40x10-5
60x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT C0A2 FIT C0A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0A1 C0A2 C0A3 C0A1 FIT Dro0025 Ra1800 C0A2 FIT Dro0025 Ra1800 C0A3 FIT Dro0043 Ra1800
Figura 26 Caracterizaccedilatildeo por SAXS das amostras de β-LG natildeo irradiadas (amostras controle) (A) curva de
intensidade de espalhamento (B) funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias (C) graacutefico de Kratky e (D) curva
teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos As amostras de β-LG analisadas foram C0A1 C0A2 e
C0A3
A informaccedilatildeo sobre o grau de compactaccedilatildeo das proteiacutenas pode ser obtido atraveacutes
da anaacutelise dos graacuteficos de Kratky (Iq2 vs q) (GLATTER KRATKY 1982) Na Figura 26C
estatildeo apresentados os graacuteficos de Kratky para as amostras natildeo irradiadas Observa-se
que todas elas apresentam conformaccedilatildeo globular compacta indicada pela forma de sino
(GLATTER KRATKY 1982)
A conformaccedilatildeo da proteiacutena se mostrou idecircntica agrave da proteiacutena cristalizada como eacute
visto do ajuste na Figura 26D Neste caacutelculo utiliza-se a estrutura cristalograacutefica da
proteiacutena β-lactoglobulina (1BEBPDB) a partir da qual o caacutelculo teoacuterico da intensidade de
espalhamento eacute feito e os dados experimentais satildeo ajustados tendo-se como paracircmetros
de ajuste a largura da camada de aacutegua no entorno da proteiacutena e o contraste de densidade
eletrocircnica desta camada de aacutegua Observa-se que em todos os casos houve bom ajuste
dos dados experimentais A anaacutelise conjunta mostrou que as amostras soacutelidas estudadas
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 70
nas trecircs diferentes aw antes de serem irradiadas (C0A1 C0A2 e C0A3) estavam
monodispersas e com a proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
As amostras que foram irradiadas na forma soacutelida com diferentes aw e dose de 5
kGy natildeo mostraram diferenccedilas entre elas (Figura 27A) nem com as natildeo irradiadas A
conformaccedilatildeo geral da proteiacutena foi a mesma conforme indica a forma da funccedilatildeo p(r)
(Figura 27B) A irradiaccedilatildeo tambeacutem natildeo alterou a compactaccedilatildeo da proteiacutena indicada pela
forma do graacutefico de Kratky (Figura 27C) A manutenccedilatildeo da forma estrutural eacute confirmada
pelo oacutetimo ajuste pela estrutura cristalograacutefica (Figura 27D)
Os raios de giro Rg para as amostras C5A1 C5A2 e C5A3 foram 235plusmn04
240plusmn03 e 238plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 encontram-se na Tabela 9
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C5A1 C5A2 C5A3
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
7x10-5
Iq2
q [Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT C5A2 FIT C5A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1BEB FIT
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5A1 C5A2 C5A3 C5A1 FIT Dro0025 Ra1800 C5A2 FIT Dro0025 Ra1800 C5A3 FIT Dro0018 Ra1800
Figura 27 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 50 kGy de dose de radiaccedilatildeo gama
A
C
B
D
5 Resultados e Discussatildeo 71
Tabela 9 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG submetida a diversas doses de radiaccedilatildeo gama (0 5 10 25 e 50 kGy) na forma
soacutelida com diferentes aw (A1022 A2053 e A3074)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmax (Aring) Oligocircmeros
C0A1 0 240plusmn03 36plusmn2 82 Diacutemero
C0A2 0 235plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C0A3 0 254plusmn08 34plusmn2 82 Diacutemero
C5A1 5 235plusmn04 36plusmn2 82 Diacutemero
C5A2 5 240plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C5A3 5 238plusmn03 35plusmn2 82 Diacutemero
C10A1 10 238plusmn05 36plusmn2 82 Diacutemero
C10A2 10 242plusmn04 33plusmn2 82 Diacutemero
C10A3 10 235plusmn02 35plusmn4 82 Diacutemero
C25A1 25 234plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C25A2 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C25A3 25 237plusmn02 34plusmn2 82 Diacutemero
C50A1 50 237plusmn02 34plusmn3 82 Diacutemero
C50A2 50 239plusmn02 33plusmn3 82 Diacutemero
C50A3 50 242plusmn03 34plusmn3 82 Diacutemero
As curvas de espalhamento para a proteiacutena irradiada com 10 kGy mostradas na
Figura 28A satildeo semelhantes agraves apresentadas pelas amostras natildeo irradiadas (Figura
26A) natildeo apresentando diferenccedilas entre as amostras com diferentes aw
As amostras irradiadas com 10 kGy no estado soacutelido natildeo apresentaram mudanccedilas
conformacionais decorrentes da dose de radiaccedilatildeo como tambeacutem foi observado para as
amostras irradiadas com dose de 5 kGy A forma da funccedilatildeo p(r) eacute bastante parecida em
todos os casos (Figura 28B) assim como o grau de compacidade eacute o mesmo indicado
pelo graacutefico de Kratky (Figura 28C) O oacutetimo ajuste dos dados usando a estrutura
cristalograacutefica (Figura 28D) indica que a proteiacutena manteve a forma nativa Os valores das
dimensotildees maacuteximas continuaram a ser de 82 Aring para todas elas O Rg deu os valores de
238plusmn05 242plusmn04 e 235plusmn02 Aring para as amostras C10A1 C10A2 e C10A3
respectivamente
5 Resultados e Discussatildeo 72
00 01 02 03 041E-5
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
p(r)
r[Aring]
C10A1 C10A2 C10A3
00 01 02 03 040
2x10-5
4x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT C10A2 FIT C10A3 FIT
00 01 02 03 04
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C10A1 C10A2 C10A3 C10A1 FIT Dro0030 Ra1800 C10A2 FIT Dro0028 Ra1800 C10A3 FIT B C
Figura 28 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como na Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 100 kGy de dose de radiaccedilatildeo
Na Figura 29A a 29D observa-se que mesmo com a dose de radiaccedilatildeo de 25 kGy a
proteiacutena manteve sua conformaccedilatildeo nativa Para a amostra com aw 074 observou-se
aumento na regiatildeo final da funccedilatildeo p(r) (Figura 29B) o que pode indicar a presenccedila de
uma pequena fraccedilatildeo de agregados No entanto o oacutetimo ajuste com a estrutura
cristalograacutefica (Figura 29D) indica que natildeo ocorreram mudanccedilas conformacionais na
proteiacutena
Os raios de giro Rg para as amostras C25A1 C25A2 e C25A3 foram 234plusmn02
237plusmn02 e 237plusmn02 Aring respectivamente Os valores com as maacuteximas dimensotildees
C D
A B
5 Resultados e Discussatildeo 73
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9
00 01 02 03 04
10-4
10-3
10-2
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
0 20 40 60 8000
40x10-5
80x10-5
12x10-4
p(r)
r[Aring]
C25A1 C25A2 C25A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
Iq2 (a
rb u
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 FIT C25A2 FIT C25A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C25A1 C25A2 C25A3 C25A1 Fit C25A2 Fit C25A3 Fit
Figura 29 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 somente que as
amostras foram submetidas a 250 kGy
Similarmente ao obtido para as amostras irradiadas com 25 kGy observa-se que a
dose de radiaccedilatildeo de 50 kGy favoreceu o aparecimento de agregados no sistema
indicados pelo aumento da p(r) a valores maacuteximos de r para a β-LG com aw 074 (Figura
30B) Isto eacute uma indicaccedilatildeo de que o niacutevel de hidrataccedilatildeo da amostra exposta agrave radiaccedilatildeo
pode influenciar na formaccedilatildeo de agregados Verifica-se que em todos os casos houve
bons ajustes com os dados experimentais
B A
C D
5 Resultados e Discussatildeo 74
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
0 20 40 60 8000
20x10-5
40x10-5
60x10-5
80x10-5
10x10-4
12x10-4
14x10-4
p (r)
r[Aring]
C50A1 C50A2 C50A3
00 01 02 03 0400
30x10-5
60x10-5
90x10-5
12x10-4
I q
2
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q(Aring-1)
C50A1 C50A2 C50A3 C50A1 FIT C50A2 FIT C50A3 FIT
Figura 30 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D e de amostras de β-LG como em Figura 26 As
amostras foram submetidas a 500 kGy de radiaccedilatildeo gama
Os raios de giro Rg para as amostras C50A1 C50A2 e C50A3 foram 237plusmn02
239plusmn02 e 242plusmn03 Aring respectivamente Os valores com as dimensotildees maacuteximas
derivadas da curva p(r) bem como as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da
intensidade para q=0 se encontram na Tabela 9 Estes resultados em conjunto indicam
que as amostras irradiadas soacutelidas com dose de 50 kGy estavam monodispersas e com a
proteiacutena na mesma conformaccedilatildeo
Pelos resultados de SAXS as amostras irradiadas na forma soacutelida natildeo tiveram
mudanccedila estrutural quando comparadas agrave amostra natildeo irradiada Nas condiccedilotildees de pH
estudadas (pH 70) esta estrutura mostrou ser como a nativa na faixa de dose de
radiaccedilatildeo 0-50 kGy
A B
C D
5 Resultados e Discussatildeo 75
Amostras irradiadas em soluccedilatildeo
Amostras de β-LG foram irradiadas em soluccedilatildeo em duas concentraccedilotildees 3mgmL e
10 mgmL Nestas mesmas concentraccedilotildees foram analisadas por SAXS
Embora as amostras natildeo irradiadas tenham sido analisadas em diferentes
concentraccedilotildees ambas apresentaram curvas semelhantes com bom ajuste com a
estrutura cristalograacutefica (Figura 31D) indicando que natildeo haacute diferenccedilas estruturais entre
elas e a proteiacutena nativa
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
0 20 40 60 800
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C0S3 C0S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT C0S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C0S3 C0S10 C0S3 FIT Dro0037 Ra1800 C0S10 FIT Dro0025 Ra1780
Figura 31 A curva de intensidade de espalhamento B funccedilatildeo de distribuiccedilatildeo de distancias C graacutefico de
Kratky e D curva teoacuterica calculada a partir dos dados cristalograacuteficos Amostras de β-LG em soluccedilatildeo de
tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de proteiacutena de 3 mgmL e 10 mgmL natildeo
irradiadas Os raios de giro Rg das amostras C0S3 e C0S10 (natildeo irradiadas) foram 248plusmn07 e
240plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva p(r)
e as massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 encontram-se
na Tabela 10
A B
DC
5 Resultados e Discussatildeo 76
Diferentemente das amostras irradiadas na forma soacutelida as amostras que foram
irradiadas em soluccedilatildeo com dose de 5 kGy apresentaram variaccedilotildees de tamanho Isto eacute
observado pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) na curva p(r) (Figura 32B)
e tambeacutem pela mudanccedila de sua forma Do graacutefico de Kratky (Figura 32C) observa-se que
os agregados formados tambeacutem possuem conformaccedilatildeo compacta como indicado pela
forma da curva Tambeacutem no ajuste com a estrutura cristalograacutefica (Figura 32D) observa-
se que a intensidade espalhada pelas amostras irradiadas em soluccedilatildeo natildeo eacute bem
ajustada pela curva de espalhamento calculada a partir dos dados da estrutura
cristalograacutefica da proteiacutena
00 01 02 03 04
1E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
1x10-4
p(r)
r[Aring]
C5S3 C5S10
00 01 02 03 040
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT C5S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
1
Inte
nsid
ade
(UA
)
q[Aring-1]
C5S3 C5S10 C5S3 FIT Dro0075 Ra1400 C5S10 FIT Dro0075 Ra1800
Figura 32 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG irradiadas em soluccedilatildeo
em tampatildeo fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose
de 5 kGy
O raio de giro Rg das amostras C5S3 e C5S10 (irradiadas com 5 kGy) foi 50plusmn02
e 303plusmn04 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da curva
DC
BA
5 Resultados e Discussatildeo 77
p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10 Semelhante aos resultados obtidos para a proteiacutena irradiada com 5 kGy
apresentados na Figura 32 as amostras irradiadas em soluccedilatildeo com 10 kGy apresentaram
formaccedilatildeo de agregados indicados pelo aumento do valor da maacutexima dimensatildeo (Dmax) da
funccedilatildeo p(r) (Figura 33B) A curva de espalhamento calculada a partir dos dados da
estrutura cristalograacutefica da proteiacutena tambeacutem natildeo consegue descrever corretamente a
intensidade espalhada mesmo para a amostra C10S10 onde houve leve agregaccedilatildeo
(Figura 33D)
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
0 50 100 150 200 2500
2x10-5
4x10-5
6x10-5
8x10-5
p(r)
r[Aring]
C10S3 C10S10
00 01 02 030
1x10-5
2x10-5
3x10-5
4x10-5
5x10-5
6x10-5
I q
2
q [Aring-1]
C10S3 C10S10 C10S3 FIT C10S10 FIT
00 01 02 03 041E-4
1E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 C10S10 FIT
Dro0075 Ra1400
Figura 33 Descriccedilatildeo de graacuteficos A B C e D como em Figura 31 Amostras de β-LG em soluccedilatildeo em tampatildeo
fosfato de soacutedio (10 mM pH 70) em concentraccedilatildeo de 3 mgmL e 10 mgmL irradiadas com dose de 10 kGy
O raio de giro Rg para as amostras C10S3 e C10S10 (irradiadas com 10 kGy) foi
69plusmn5 e 338plusmn06 Aring respectivamente Os valores das dimensotildees maacuteximas derivadas da
A
D
B
C
5 Resultados e Discussatildeo 78
curva p(r) e das massas molares calculadas do ajuste teoacuterico da intensidade para q=0 se
encontram na Tabela 10
Tabela 10 Paracircmetros estruturais obtidos pelas medidas experimentais de espalhamento
da β-LG em soluccedilatildeo (3 e 10 mgmL) submetida a diversas doses de irradiaccedilatildeo gama (0 5
e 10 kGy)
Amostra Dose (kGy) Rg (Aring) MM (kDa) Dmaacutex (Aring) Oligocircmero
C0S3 0 248plusmn07 33plusmn5 82 Diacutemero
C0S10 0 240plusmn04 35plusmn5 82 Diacutemero
C5S3 5 50plusmn2 ~100 180 Hexacircmero
C5S10 5 303plusmn04 ~50 100 Tetracircmero
C10S3 10 69plusmn5 ~350 250 Agregados
C10S10 10 338plusmn06 ~60 115 Tetracircmero
As amostras de proteiacutena irradiadas em soluccedilatildeo apresentaram alteraccedilatildeo dos
paracircmetros estruturais medidos por SAXS que sugerem mudanccedila estrutural Houve
aumento do raio de giro da moleacutecula e aumento do Dmaacutex que poderia estar indicando a
formaccedilatildeo de agregados Os valores experimentais de intensidade de espalhamento natildeo
se ajustaram agrave curva de intensidade calculada teoricamente a partir dos dados
cristalograacuteficos indicam estrutura diferente da nativa
Devido agrave β-LG ter a estrutura nativa bem definida por anaacutelise cristalograacutefica eacute
possiacutevel estimar aproximadamente a forma das moleacuteculas de proteiacutena aqui analisadas
agregadas ou natildeo atraveacutes de modelagem
Utilizando as amostras puras como padratildeo calculou-se a massa molar equivalente
para as outras amostras A β-lactoglobulina em condiccedilotildees nativas eacute um diacutemero de massa
molar 35340 Da (BROWNLOW et al 1997) Sendo assim a massa molar equivalente
obtida dos experimentos de SAXS forneceraacute indicaccedilatildeo do tamanho dos agregados
formados Do ajuste dos dados de SAXS obtiveram-se os paracircmetros estruturais em cada
caso
Pelos dados mostrados na Tabela 9 observa-se que as amostras irradiadas no
estado soacutelido independente da atividade de aacutegua natildeo sofreram alteraccedilatildeo da
conformaccedilatildeo como evidenciado pelos valores de Rg MM e Dmaacutex mantendo a
conformaccedilatildeo de diacutemero
5 Resultados e Discussatildeo 79
Diferentemente das amostras irradiadas soacutelidas as amostras irradiadas em
soluccedilatildeo (Tabela 10) apresentaram alteraccedilotildees estruturais evidenciadas pelos valores de
Rg MM e Dmaacutex indicando formaccedilatildeo de oligocircmeros Da Tabela 10 tem-se a indicaccedilatildeo da formaccedilatildeo de vaacuterios tipos de agregados Pela
massa molar equivalente deduz-se que se pode tratar de tetracircmeros hexacircmeros ou
agregados maiores
Para obter mais informaccedilotildees sobre a oligomerizaccedilatildeo da proteiacutena fez-se a
construccedilatildeo de modelos estruturais a partir dos dados experimentais utilizando como
subunidade base a estrutura cristalograacutefica do diacutemero da β-LG (registro em PDB
1BEBPDB) Ainda que a estrutura terciaacuteria da β-LG tenha sofrido alteraccedilotildees com a
irradiaccedilatildeo a utilizaccedilatildeo da estrutura cristalograacutefica para a construccedilatildeo do oligocircmero pode
ser vista como uma aproximaccedilatildeo para modelar estes oligocircmeros
Vaacuterios modelos foram construiacutedos e combinaccedilotildees lineares foram testadas para
determinar uma possiacutevel polidispersidade de tamanhos
Para estimar a fraccedilatildeo numeacuterica de diacutemeros (x) na mistura faz-se um caacutelculo
assumindo a presenccedila de tetracircmeros e diacutemeros no sistema A massa molar meacutedia (que eacute
dada pelo SAXS) seraacute uma composiccedilatildeo linear de cada parcela
( ) ( ) ( ) ( )222 1 tetracircmerodiacutemero MMxMMxMMmeacutedia sdotminus+sdot= (10)
E assim a fraccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros seraacute
( ) ( )( ) ( )22
22
diacutemerotetracircmero
tetracircmero
MMMMMMMMxDiacutemeros meacutedia
minus
minus=
(11)
)x(Tetracircmeros minus1 (12)
Amostra β LG em soluccedilatildeo (10mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S10)
Para descrever o comportamento da intensidade espalhada atraveacutes de oligocircmeros
da proteiacutena fez-se modelagem utilizando o programa MASSHA (KONAREV
PETOUKHOV SVERGUN 2001) Pelos paracircmetros estruturais apresentados na Tabela
10 para a amostra C5S10 haacute indicaccedilatildeo da presenccedila de tetracircmeros no sistema
Realizando o ajuste para obter o tetracircmero que melhor ajusta os dados experimentais
tem-se como resultado o mostrado na Figura 34
5 Resultados e Discussatildeo 80
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S10 Tetracircmero fit
Figura 34 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (10 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Neste caso o modelo tetrameacuterico consegue descrever quase corretamente os
dados experimentais confirmando a presenccedila destes na soluccedilatildeo Fazendo a estimativa
aproximada da populaccedilatildeo de diacutemeros e tetracircmeros na mistura obteve-se que 28
devem ser tetracircmeros e ~72 diacutemeros Do ajuste tem-se o modelo mostrado na Figura
35
Figura 35 Modelo de oligocircmero para a amostra C5S10
A contribuiccedilatildeo dos diacutemeros eacute maior do que a dos tetracircmeros e como este modelo
simplificado apenas leva em conta os tetracircmeros da mistura haacute forte influecircncia da parcela
dimeacuterica gerando distorccedilotildees no modelo tetrameacuterico No entanto o importante aqui eacute que
se pode constatar a presenccedila de tetracircmeros na mistura O raio de giro do modelo e sua
maacutexima dimensatildeo eacute 29 Aring e 113 Aring respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores
obtidos experimentalmente (303plusmn04 Aring e 100 Aring) mas esta diferenccedila dos valores deve-se
agrave influecircncia dos diacutemeros na soluccedilatildeo
5 Resultados e Discussatildeo 81
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (10 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy Apesar de os dados de SAXS e paracircmetros estruturais determinados indicarem a
presenccedila de agregados na proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo com 10 kGy parece natildeo ter
ocorrido agregaccedilatildeo desordenada Eacute possiacutevel que pequenos agregados tenham sido
formados mas possivelmente ainda existam proteiacutenas no estado monodisperso Pela
massa molar meacutedia e dimensatildeo maacutexima supotildee-se que os oligocircmeros sejam tetracircmeros
000 005 010 015 0201E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C10S10 Tetracircmero fit
Figura 36 Ensaio de modelagem da amostra C10S10
O ajuste dos dados experimentais foi muito satisfatoacuterio para o modelo tetrameacuterico
indicaccedilatildeo de presenccedila significativa de tetracircmeros no sistema
Testando a polidispersidade utilizaram-se as equaccedilotildees (10) (11) e (12) Para a
amostra C10S10 os resultados indicaram que ~58 das partiacuteculas componentes da
mistura eram tetracircmeros e ~42 ainda continuavam sendo diacutemeros O tetracircmero que
melhor ajustou aos dados experimentais eacute mostrado na Figura 37
Figura 37 Modelo de oligocircmero para a amostra C10S10
5 Resultados e Discussatildeo 82
A conformaccedilatildeo deste tetracircmero foi ligeiramente diferente da apresentada pela a
amostra irradiada com 5 kGy (Figura 34) Neste caso a contribuiccedilatildeo dos tetracircmeros eacute
maior do que a dos diacutemeros inverso ao que aconteceu com a amostra C5S10 Vale
ressaltar que este eacute um caacutelculo aproximado A intensidade de espalhamento possui
componentes dimeacutericos e tetrameacutericos e o programa ajustou os dados assumindo apenas
tetracircmeros No entanto como a fraccedilatildeo de tetracircmeros eacute maior do que a de diacutemeros
propotildee-se que esta conformaccedilatildeo deva estar bastante proacutexima da real uma vez que a
contribuiccedilatildeo para a intensidade dos diacutemeros acabaraacute sendo menor O raio de giro do
modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 3317 Aring e 1193 Aring respectivamente que estatildeo em
oacutetima concordacircncia com os valores obtidos experimentalmente (338plusmn06 Aring e 115 Aring)
Amostra de β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 5 kGy (C5S3)
Pela massa molar obtida e tambeacutem pela dimensatildeo maacutexima os agregados
formados podem ser hexacircmeros Das vaacuterias formas de se construir um hexacircmero de
proteiacutenas 1BEB apenas o arranjo sequumlencial (em linha) consegue fornecer um Dmax de
~180Aring O hexacircmero foi a conformaccedilatildeo escolhida e o ajuste eacute mostrado na Figura 38
00 01 021E-3
001
01
Inte
nsid
ade
(UA
)
q [Aring-1]
C5S3 Hexacircmero fit
Figura 38 Ensaio de modelagem da amostra β-LG (3mgmL) irradiada com dose de 5 kGy
Dos caacutelculos com a massa molar obtida a partir dos dados de SAXS e com os
valores esperados obteve-se uma populaccedilatildeo composta de 80 de hexacircmeros e 20 de
diacutemeros natildeo se descartando a possibilidade de haver tetracircmeros no sistema No entanto
testes com apenas tetracircmeros e oligocircmeros maiores natildeo fornecem resultados tatildeo bons
quanto para o caso de hexacircmeros O hexacircmero mais provaacutevel de estar sendo formado eacute
mostrado na Figura 39
5 Resultados e Discussatildeo 83
Figura 39 Modelo de oligocircmero para a amostra β-LG (3mgmL) irradiada com 5 kGy
O raio de giro do modelo e sua maacutexima dimensatildeo satildeo 43 Aring e 150 Aring
respectivamente que estatildeo proacuteximos dos valores obtidos experimentalmente (50plusmn2 Aring e
180 Aring) Como o obtido pelos dados de SAXS ainda eacute ligeiramente maior pode-se
especular a presenccedila de agregados maiores ainda na mistura mas pelo ajuste a maioria
deve ser de hexacircmeros e diacutemeros
Amostra β-LG em soluccedilatildeo (3 mgmL) irradiada com dose de 10 kGy
Nesta amostra houve formaccedilatildeo de agregados grandes e polidispersos de modo
que natildeo foi possiacutevel obter maiores informaccedilotildees Dos dados de SAXS tem-se apenas uma
informaccedilatildeo geral do tamanho destes agregados maacutexima dimensatildeo de ~250 Aring e massa
molar meacutedia de 350 kDa
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo observa-se em geral que haacute uma tendecircncia agrave
agregaccedilatildeo com o aumento da dose de radiaccedilatildeo e a diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de
proteiacutena
523 Mecanismo de agregaccedilatildeo
Nas anaacutelises apresentadas no item 522 comprovou-se que houve agregaccedilatildeo da
proteiacutena devido agrave irradiaccedilatildeo principalmente nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo Para
tentar elucidar o provaacutevel mecanismo envolvido na agregaccedilatildeo foram realizadas anaacutelises
de eletroforese em gel SDS-PAGE em condiccedilotildees redutoras e natildeo redutoras e detecccedilatildeo
de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil
5 Resultados e Discussatildeo 84
Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) Na Figura 40 observa-se que as amostras irradiadas em soluccedilatildeo (3 mgmL)
apresentaram perfis semelhantes tanto em condiccedilotildees natildeo redutoras (Figura 40A) como
redutoras (Figura 40B) Em ambas as condiccedilotildees verificou-se a presenccedila de produtos de
maior massa molar que a β-LG monocircmero devido agrave irradiaccedilatildeo evidenciado pelas regiotildees
coradas localizadas acima da banda monomeacuterica Para as amostras que receberam
doses de radiaccedilatildeo maiores 10 25 e 50 kGy (linhas 5 6 e 7) e em ambas as condiccedilotildees de
eletroforese observou-se alguns produtos de maior massa que natildeo conseguiram entrar
no gel de separaccedilatildeo No gel em condiccedilotildees redutoras (Figura 40B) observa-se leve
aumento na intensidade e aacuterea na banda monomeacuterica da β-LG em amostras irradiadas
ateacute 5 kGy (linha 4) concomitante agrave diminuiccedilatildeo nas respectivas linhas de produtos de maior
massa possivelmente produto da reduccedilatildeo de algumas pontes dissulfeto entre moleacuteculas
de β-LG agregadas No entanto o meio redutor natildeo resultou na desagregaccedilatildeo da maior
parte dos produtos de maior massa molar que ainda apresentam menor mobilidade que o
monocircmero da β-LG na regiatildeo central do gel ou que ficam retidos no gel de empilhamento
(Figura 40B linhas 5 6 e 7)
Figura 40 Caracterizaccedilatildeo da β-LG irradiada em soluccedilatildeo (3 mgmL) usando SDS-PAGE (A) sem redutor e
(B) com β-mercaptoetanol Linhas 1 2 3 4 5 6 e 7 doses de radiaccedilatildeo de 0 1 25 5 10 25 e 50 kGy
Linha 8 padratildeo de massa molar de proteiacutenas (144-940 kDa)
MkDa 940 670 430 300 201 144
β-LG
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
MkDa 940 670 430 300 201 144
B A
β-LG
5 Resultados e Discussatildeo 85
Estes resultados indicam que a irradiaccedilatildeo teve um efeito importante sobre a
proteiacutena em soluccedilatildeo dando origem agrave formaccedilatildeo de agregados de massa molar variada As
ligaccedilotildees dissulfeto intermoleculares parecem natildeo ser relevantes para a formaccedilatildeo destes
agregados ao contraacuterio do que tem sido relatado para tratamento teacutermico (SHIMADA
CHEFTEL 1989 IAMETTI et al 1996 HOFFMANN MIL 1997)
Fluorescecircncia de ligaccedilotildees cruzadas bitirosil As anaacutelises de fluorescecircncia foram realizadas para avaliar a possiacutevel participaccedilatildeo
de ligaccedilotildees entre radicais tirosil no processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena devido agrave
irradiaccedilatildeo Segundo Davies Delsignore e Lin (1987) a fluorescecircncia maacutexima das
bitirosinas se daacute entre 410 e 420 nm em amostras submetidas a λexc = 325 nm
Apoacutes realizar um teste de varredura na amostra C25S3 foi verificado que o
espectro apresentava maacuteximo em 411 nm (Figura 41) Este valor foi utilizado para avaliar
o teor de bitirosinas nas amostras
Figura 41 Espectro de fluorescecircncia de ldquobitirosilrdquo da amostra de β-LG irradiada em soluccedilatildeo (C25S3)
Os valores da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm satildeo mostrados na Figura 42
Aumento significativo da intensidade de fluorescecircncia a 411 nm caracteriacutestica de ligaccedilotildees
de bitirosinas foi observado nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo em relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada
5 Resultados e Discussatildeo 86
Figura 42 Intensidade de fluorescecircncia de bitirosil (ligaccedilotildees cruzadas) em amostras de β-LG natildeo
irradiadas e em amostras irradiadas soacutelidas e em soluccedilatildeo em concentraccedilatildeo de 10 e 3 mgmL ( λexc 325nm
λemis 411nm) Dentro de cada grupo de amostras (mesma aw ou mesma concentraccedilatildeo em mgmL) colunas
com letras iguais natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5 Nas colunas com igual cor
(correspondentes a uma mesma dose de irradiaccedilatildeo) valores com o mesmo nuacutemero natildeo diferem
significativamente entre si ao niacutevel de 5 (teste de Tukey)
Nas amostras irradiadas soacutelidas a aw natildeo foi fator determinante na formaccedilatildeo de
ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil Natildeo houve diferenccedilas estatiacutesticas (pgt005) entre as
amostras de β-LG com diferentes aw para uma mesma dose de irradiaccedilatildeo a natildeo ser na
amostra natildeo irradiada com aw 074 sugerindo um possiacutevel erro experimental Amostras
com uma mesma aw irradiadas com doses diferentes apresentaram diferenccedila estatiacutestica
com a natildeo irradiada mas natildeo entre elas
Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo numa mesma concentraccedilatildeo de proteiacutena
houve tendecircncia de aumento da fluorescecircncia com o aumento da dose de irradiaccedilatildeo
mostrando diferenccedilas significativas entre elas (plt005) A exceccedilatildeo foi a amostra C50S3
que apresentou menor intensidade de fluorescecircncia que a amostra C25S3 o que pode
sugerir que na irradiaccedilatildeo com doses maiores que 25 kGy o processo de agregaccedilatildeo
sofreu alguma alteraccedilatildeo refletida na diminuiccedilatildeo das ligaccedilotildees de bitirosil Isto eacute
corroborado pelas anaacutelises de SE-HPLC cujos resultados mostram para esta amostra
agregados de massa molar menor que na amostra C25S3
A menor quantidade de ligaccedilotildees bitirosil na amostra C50S3 sugere que enquanto
era atingida a dose de 50 kGy pode ter havido a formaccedilatildeo de agregados maiores que
depois sofreram uma clivagem por efeito da radiaccedilatildeo Uma outra hipoacutetese seria a
0
200
400
600
800
1000
1200
2
1
333
1
2
333
1
2
333 22122
c
a
b
d
a
b
c
daabbaabbabbc
aw=022 aw=053 aw=074 10mgmL 3mgmL
Fluo
resc
enci
a a
411
nm (U
A)
amostras de β-LG
0 kGy 10 kGy 25 kGy 50 kGy
5 Resultados e Discussatildeo 87
destruiccedilatildeo de alguns resiacuteduos de tirosina por efeito da alta dose de radiaccedilatildeo (50 kGy)
diminuindo assim a quantidade de radicais de tirosil disponiacuteveis ou ainda que radicais
tirosil tenham sofrido uma re-reduccedilatildeo pela accedilatildeo de O2- (espeacutecie resultante da radioacutelise da
aacutegua) desta maneira impedindo que ligaccedilotildees cruzadas de bitirosil ocorressem a 50 kGy
(PRUTZ BUTLER LAND 1983)
A fluorescecircncia de amostras irradiadas em soluccedilatildeo em diferentes concentraccedilotildees
mas com mesma dose foram estatisticamente diferentes (plt005) As amostras com
menor concentraccedilatildeo de proteiacutena (3 mgmL) apresentaram valores maiores com exceccedilatildeo
novamente da amostra C50S3 que apresentou menor fluorescecircncia de bitirosil que a sua
correspondente C50S10 indicando que a concentraccedilatildeo da proteiacutena irradiada eacute fator
importante para a quantidade de agregados formados independente da dose de radiaccedilatildeo
A presenccedila de ligaccedilotildees cruzadas de bitirosinas eacute um indiacutecio de que outras ligaccedilotildees
cruzadas mais difiacuteceis de serem identificadas possam tambeacutem estar ocorrendo nas
amostras submetidas agraves condiccedilotildees do estudo (SHINAR NAVOK CHEVION 1983)
524 Mudanccedilas na funcionalidade (poder ligante de retinol e
susceptibilidade agraves proteases)
Poder ligante do retinol
Assim como sua funccedilatildeo bioloacutegica as propriedades funcionais de uma proteiacutena
estatildeo diretamente relacionadas agrave sua estrutura No caso da β-LG sua funccedilatildeo bioloacutegica
natildeo eacute totalmente conhecida mas sabe-se que tem caracteriacutesticas de uma proteiacutena de
transporte e eacute capaz de ligar-se a pequenas moleacuteculas hidrofoacutebicas como retinol
(FUGATE SONG 1980 JANG SWAISGOOD 1990) Eacute conhecido que in vitro a β-LG
nativa liga uma moleacutecula de retinol por monocircmero e o siacutetio de ligaccedilatildeo mais provaacutevel eacute no
interior do caacutelice hidrofoacutebico (PAPIZ et al 1986 CHO BATT SAWYER 1994) Como o
retinol fluoresce significativamente quando ligado agrave β-LG a capacidade ligante da β-LG
mostraraacute que eacute maior quanto maior for a quantidade de retinol adicionada capaz de
produzir aumento na fluorescecircncia (SUBRAMANIAM STEEL GAFNI 1996)
As curvas de titulaccedilatildeo da β-LG com soluccedilatildeo de retinol 3 mM satildeo mostradas na
Figura 43 A proteiacutena irradiada soacutelida com 10 kGy que mostrou manter a sua estrutura
como nativa como avaliado por medidas de fluorescecircncia e dicroiacutesmo circular e SAXS
natildeo mostrou perda do poder ligante Nas amostras irradiadas em soluccedilatildeo a capacidade
5 Resultados e Discussatildeo 88
ligante da β-LG foi diminuiacuteda em ~40 para a amostra C10S10 e em ~80 para a
C10S3 comparada com a amostra natildeo irradiada mostrando que a perda foi maior na que
apresentou alteraccedilotildees mais significativas no dicroiacutesmo circular e fluorescecircncia intriacutenseca
Figura 43 Curvas de titulaccedilatildeo de fluorescecircncia do retinol ligado agrave β-LG λexc=330 nm e λemiss= 470nm
A perda do poder ligante observado sugere por um lado perda de estrutura
terciaacuteria que em algum grau tenha afetado o caacutelice hidrofoacutebico natildeo dando condiccedilotildees de
ligaccedilatildeo e acomodaccedilatildeo da moleacutecula de retinol ou por outro lado que algum tipo de
agregaccedilatildeo molecular tenha dificultado a entrada da moleacutecula ao siacutetio de ligaccedilatildeo dentro do
caacutelice hidrofoacutebico
Entretanto assim como com os resultados da fluorescecircncia intriacutenseca e de
dicroiacutesmo circular natildeo se descarta a hipoacutetese de que a possiacutevel perda de Trp pela
irradiaccedilatildeo tenha contribuiacutedo para a perda do poder de ligaccedilatildeo do retinol
Susceptibilidade agraves proteases
O estudo da digestibilidade das proteiacutenas pode ser uacutetil para estimar a sua
biodisponibilidade apoacutes terem sido aplicados tratamentos que possam afetar a sua
5 Resultados e Discussatildeo 89
estrutura Neste caso o tratamento de irradiaccedilatildeo com raios gama Nesta etapa foram
estudadas somente as amostras irradiadas soacutelidas com doses de 0 10 25 e 50 kGy
Ainda que natildeo tenham sido verificadas modificaccedilotildees estruturais na proteiacutena irradiada
soacutelida poderia haver alteraccedilatildeo na susceptibilidade agraves proteases devido agrave modificaccedilotildees
oxidativas em aminoaacutecidos causadas por bullOH ou bullOH + O2- que podem afetar a carga da
proteiacutena provocando alteraccedilotildees que poderiam aumentar a susceptibilidade proteoliacutetica da
proteiacutena (DAVIES DELSIGNORE LIN 1987 DAVIES LIN PACIFICI 1987)
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave tripsina
Os cromatogramas de fase reversa mostram o perfil da amostra C25A1 antes
e apoacutes a hidroacutelise com tripsina (Figura 44) O cromatograma da amostra antes da hidroacutelise
apresenta o pico correspondente agrave β-LG intacta (Figura 44(1)) O pico desaparece
completamente apoacutes a hidroacutelise como pode ser observado no cromatograma da Figura
44(2) com aparecimento de picos na regiatildeo mais hidrofiacutelica correspondentes aos
peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Os cromatogramas das amostras com diferentes aw e
doses de irradiaccedilatildeo hidrolisadas com tripsina mostraram perfis similares sem variaccedilatildeo no
nuacutemero eou intensidade relativa dos picos principais Os resultados evidenciaram a
hidroacutelise completa da β-LG pela accedilatildeo da tripsina
Figura 44 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do branco sem tripsina (1) e dos hidrolisados triacutepticos (2) da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 90
Susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina
O perfil cromatograacutefico da amostra da β-LG (aw 022) irradiada com 25 kGy e
hidrolisada com pepsina estaacute apresentado na Figura 45 No cromatograma (Figura 45)
observa-se que o pico correspondente agrave proteiacutena intacta ainda estaacute presente e na regiatildeo
mais hidrofiacutelica observam-se os picos dos peptiacutedeos liberados na proteoacutelise Isto indica
que a pepsina hidrolisou apenas parcialmente a proteiacutena
As amostras com aw 022 053 e 074 irradiadas com diferentes doses de
radiaccedilatildeo mostraram o mesmo tipo de perfil no cromatograma Parte da β-LG que natildeo foi
hidrolisada continua presente ainda que em proporccedilatildeo diferente com respeito aos
peptiacutedeos liberados para cada dose de radiaccedilatildeo como eacute mostrado mais adiante
mediante caacutelculo relativo das aacutereas dos picos nos cromatogramas Na regiatildeo dos
peptiacutedeos peacutepticos os principais picos e intensidade relativa entre eles foram mantidos
(resultados natildeo mostrados)
Figura 45 Cromatograma de fase reversa (RP-HPLC) do hidrolisado peacuteptico da β-LG (aw=022) irradiada com 25 kGy (C25A1) Eluiccedilatildeo feita a 1mgmL com gradiente de acetonitrilaaacutegua e temperatura de coluna de 40degC
Quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada maior foi a degradaccedilatildeo da β-LG pela
enzima originando maior quantidade relativa de peptiacutedeos como mostrado pelas aacutereas
dos cromatogramas apresentados na Figura 46 A aw das amostras natildeo foi importante no
aumento da digestibilidade
β-LG Var A Var B
Peptiacutedeos peacutepticos
Abs
orbacirc
ncia
a 2
14nm
(UA
)
5 Resultados e Discussatildeo 91
Figura 46 Aacutereas nos cromatogramas correspondentes agrave peptiacutedeos formados pela accedilatildeo da pepsina na β-LG irradiada a diferentes doses (0 10 25 e 50 kGy) Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
Para melhor avaliaccedilatildeo da accedilatildeo da pepsina sobre a proteiacutena irradiada utilizou-se
tambeacutem o meacutetodo espectrofotomeacutetrico descrito por Reddy Kella e Kinsella (1988) no
qual apoacutes a hidroacutelise separa-se a proteiacutena do material hidrolisado por precipitaccedilatildeo com
TCA O conteuacutedo proteacuteico do hidrolisado no sobrenadante eacute medido por absorbacircncia a
280 nm Os resultados satildeo mostrados na Figura 47
00
01
02
03
04
05
06
1
2
344
1
2
3
4
1
2
3
4
abb
a
aaa
aaaa
aa
Abs
orbacirc
ncia
(UA
)
0 10 25 50
Dose irradiaccedilatildeo (kGy)
aw 022 aw 053 aw 074
Figura 47 Absorbacircncia a 280nm dos sobrenadantes das amostras de β-LG irradiadas e hidrolisadas com pepsina apoacutes precipitaccedilatildeo com TCA da proteiacutena intacta Para uma mesma dose de radiaccedilatildeo colunas com letras iguais natildeo diferem significativamente ao niacutevel de 5 Nas colunas com cor igual (mesma aw) nuacutemeros iguais indicam que elas natildeo diferem significativamente entre si ao niacutevel de 5(teste de Tukey)
20
30
40
50
60
a
111
2
1231
233
1
3
a
a
a
a
a
baa
a
b
a
0 10 25 50
Pep
tiacutedeo
s (
aacutere
a)
Dose de irradiaccedilatildeo (kGy)
aw022 aw053 aw074
5 Resultados e Discussatildeo 92
As medidas espectromeacutetricas realizadas para avaliar o conteuacutedo de peptiacutedeos
liberados na proteoacutelise (Figura 47) mostraram semelhanccedila com os resultados obtidos pelo
meacutetodo cromatograacutefico (Figura 46) seguindo a tendecircncia de aumento da quantidade de
peptiacutedeos liberados quanto maior a dose de radiaccedilatildeo aplicada
A aw das amostras quando irradiadas natildeo foi determinante para as variaccedilotildees
encontradas na susceptibilidade da β-LG irradiada soacutelida agrave pepsina O aumento na
digestibilidade pela pepsina foi mais relacionado agrave dose de radiaccedilatildeo aplicada como
observado nas Figuras 46 e 47 Pode-se concluir que a irradiaccedilatildeo da β-LG na forma soacutelida natildeo alterou a
susceptibilidade da proteiacutena agrave accedilatildeo da tripsina na faixa de irradiaccedilatildeo e aw estudadas No
entanto a proteiacutena mostrou-se menos resistente a accedilatildeo da pepsina quanto maior a dose
de radiaccedilatildeo
6 Consideraccedilotildees finais 93
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
6 Consideraccedilotildees finais 94
6 CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo circular satildeo meacutetodos
geralmente utilizados para avaliar alteraccedilotildees de conformaccedilatildeo das proteiacutenas ao niacutevel de
estrutura terciaacuteria As medidas que satildeo obtidas por estas teacutecnicas estatildeo relacionadas com
o ambiente do Trp na proteiacutena (CALLIS et al 1997) No caso da proteiacutena ser desnaturada
por efeito de tratamento teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica alteraccedilotildees no comprimento
de onda da maacutexima intensidade de fluorescecircncia assim como perda de sinal de
dicroiacutesmo no UV proacuteximo podem ser observadas No presente estudo os resultados de
fluorescecircncia intriacutenseca embora tendo sugerido alteraccedilotildees na conformaccedilatildeo da β-LG
irradiada em soluccedilatildeo por ocorrecircncia de deslocamento para o vermelho do comprimento
de onda do maacuteximo da fluorescecircncia do Trp natildeo representam neste experimento o
mesmo significado no grau de alteraccedilotildees estruturais que em outros tratamentos como o
teacutermico ou alta pressatildeo hidrostaacutetica O deslocamento para o vermelho natildeo foi
acompanhado do aumento da intensidade de fluorescecircncia que normalmente ocorre no
processo de desnaturaccedilatildeo da β-LG (MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L
1999a YANG et al 2001) Os resultados de dicroiacutesmo circular no UV-proacuteximo da
proteiacutena irradiada mostraram perda do sinal de dicroiacutesmo o que sugere uma maior
exposiccedilatildeo do Trp ao solvente geralmente relacionada agrave perda da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1999b KUWAJIMA YAMAYA SUGAI
1999)
Como os resiacuteduos de aminoaacutecidos aromaacuteticos como o Trp satildeo sensiacuteveis agrave
radiaccedilatildeo gama e podem sofrer degradaccedilatildeo (GARRISON 1987) a perda de resiacuteduos de
Trp resultaria em diminuiccedilatildeo da intensidade de fluorescecircncia intriacutenseca e do sinal de
dicroiacutesmo Isto sugere que as teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca de Trp e de dicroiacutesmo
circular natildeo conduziram a resultados conclusivos neste estudo pela possibilidade de ter
ocorrido degradaccedilatildeo do resiacuteduo de Trp no processo de irradiaccedilatildeo e consequumlentemente
ter influenciado nos resultados superestimando o grau de alteraccedilatildeo conformacional
A conformaccedilatildeo estrutural ao niacutevel de estrutura terciaacuteria e quaternaacuteria pode
tambeacutem ser avaliada por SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC As anaacutelises das
amostras irradiadas soacutelidas mostraram similaridade nos resultados com relaccedilatildeo agrave amostra
natildeo irradiada (nativa) indicando nenhuma ou pequenas alteraccedilotildees estruturais devido agrave
irradiaccedilatildeo independente do grau de hidrataccedilatildeo das proteiacutenas Os resultados obtidos para
as amostras irradiadas em soluccedilatildeo foram diferentes dos obtidos para a proteiacutena natildeo
6 Consideraccedilotildees finais 95
irradiada evidenciando a formaccedilatildeo de agregados mesmo considerando-se que os
resultados de dicroiacutesmo circular no UV-longiacutenquo tenham sugerido a preservaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias da proteiacutena irradiada em soluccedilatildeo Os espectros de CD no UV-
longiacutenquo dos oligocircmeros formados na β-LG irradiada em soluccedilatildeo foram em geral muito
semelhantes aos reportados na literatura para os diacutemeros e tetracircmeros originados no
primeiro estaacutegio do aquecimento teacutermico (CARROTA et al 2001) A quantificaccedilatildeo das
estruturas secundaacuterias das amostras irradiadas que apresentaram oligomerizaccedilatildeo natildeo
mostraram diferenccedilas significativas nos conteuacutedos de heacutelices-α estruturas β e
desordenadas (Tabela 6) com respeito as amostras natildeo irradiadas (natildeo oligomerizadas)
A maioria dos relatos na literatura sobre oligocircmeros produzidos por aquecimento mostram
diminuiccedilatildeo das heacutelices-α e das estruturas β em favor do aumento das estruturas
desordenadas quando comparadas as amostras de β-LG sem tratamento Como pode
ser observado resultados conflitantes no conteuacutedo de estruturas secundaacuterias foram
obtidos a partir de espectros muito similares no UV-longiacutenquo o que sugere a
necessidade de explorar convenientemente os comprimentos de onda lt190 nm que
conhecidamente proporcionam dados mais confiaacuteveis das diferentes estruturas (KELLY
PRICE 1997) Medidas deste tipo satildeo possiacuteveis ao utilizar-se luz siacutencrotron que permite
a obtenccedilatildeo de espectros de alta qualidade ateacute comprimentos de onda de 160 nm no ultra-
violeta no vaacutecuo (WALLACE 2000)
A monomerizaccedilatildeo da β-LG natildeo foi observada em niacuteveis que pude-se ser detectada
por SE-HPLC onde natildeo foi observado o pico com massa menor que o diacutemero (~35 kDa)
como mostrado nas Figuras 24 e 25 Pelas medidas de SAXS o menor Rg das moleacuteculas
correspondeu ao estado de diacutemero com Rg ~ 24 Aring similar aos encontrados na literatura
(VERHEUL et al 1999 CARROTA et al 2003) natildeo sendo detectada a conformaccedilatildeo
monomeacuterica Nos agregados os dados de Rg e massa molar tambeacutem natildeo comportaram
composiccedilatildeo de triacutemeros ou pentacircmeros etc sinal da ausecircncia de monocircmeros no
sistema A ausecircncia da β-LG diacutemero em estado desnaturado pode ser constatada pela
observaccedilatildeo da relaccedilatildeo de ambos paracircmetros Rg e massa molecular apresentados na
Tabela 10
Os oligocircmeros formados devido agrave irradiaccedilatildeo mostraram alto grau de compacidade
da sua estrutura possivelmente pela preservaccedilatildeo da maior parte da estrutura terciaacuteria da
proteiacutena com a manutenccedilatildeo do nuacutecleo hidrofoacutebico e pelas ligaccedilotildees cruzadas formadas
entre as moleacuteculas de β-LG Os oligocircmeros formados e analisados por SAXS em
amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 10 kGy parecem ajustar-se bem a modelos de
6 Consideraccedilotildees finais 96
moleacuteculas linearmente agregadas e bem estruturadas Ligaccedilotildees cruzadas ldquobitirosilrdquo entre
moleacuteculas de diacutemeros de β-LG parecem ser as principais responsaacuteveis pela formaccedilatildeo de
poliacutemeros de alta massa molar muacuteltiplos de diacutemero O tipo de oligomerizaccedilatildeo induzido
pela irradiaccedilatildeo assemelha-se agrave produzida nos primeiros estaacutegios do tratamento teacutermico agrave
temperaturas entre 65-70degC (BAUER HANSEN OGENDAL 1998 CARROTA et al 2001
CARROTA et al 2003) Nesta faixa de temperatura as moleacuteculas de β-LG natildeo
apresentam desnaturaccedilatildeo suficiente para expor um grande nuacutemero de grupos
hidrofoacutebicos que levem agrave uma agregaccedilatildeo desordenada caracteriacutestica de tratamento
teacutermico mais severo (MANDERSON HARDMAN CREAMER 1998 MANDERSON
CREAMER HARDMAN 1999b CARROTA et al 2001) A agregaccedilatildeo ordenada permitiu
que amostras irradiadas em soluccedilatildeo ateacute 50 kGy em concentraccedilotildees de 3 e 10 mgmL de
proteiacutena mostraram-se completamente liacutempidas e transluacutecidas sem diferenccedilas
significativas nos valores de transmitacircncia medida agrave 550 nm mostrando que os
agregados formados foram soluacuteveis nestas condiccedilotildees do estudo (tampatildeo fosfato de soacutedio
10 mM e pH 7)
Eacute conhecido que a radiaccedilatildeo com raios gama produz diversas alteraccedilotildees quiacutemicas
como de oxidaccedilatildeo e quebra de alguns grupos nos resiacuteduos de aminoaacutecidos ou ateacute
fragmentaccedilatildeo da cadeia principal e formaccedilatildeo de radicais livres (GARRISON 1981)
Embora nem todos estes efeitos tenham sido avaliados neste experimento eacute possiacutevel que
tenham sido responsaacuteveis pelo iniacutecio do processo de agregaccedilatildeo ao causar alteraccedilotildees na
distribuiccedilatildeo de carga da proteiacutena com a formaccedilatildeo de radicais livres e contribuiacutedo para
uma maior flexibilidade da moleacutecula Os resultados das anaacutelises indicam que as
alteraccedilotildees conformacionais ocorridas foram menores que as normalmente observadas em
outros tratamentos como teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica onde a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena eacute relevante e agregados insoluacuteveis satildeo formados
Os resultados no presente trabalho mostram que natildeo houve diminuiccedilatildeo da
digestibilidade e nem alteraccedilotildees estruturais que comprometessem a funcionalidade da
proteiacutena irradiada no estado soacutelido com doses de ateacute 10 kGy Estudo anterior (VOISINE
PARENT SAVOIE 1990) tambeacutem mostra que natildeo houve nenhuma alteraccedilatildeo na
composiccedilatildeo aminoaciacutedica e na digestibilidade in vitro da β-LG irradiada ateacute 50 kGy
submetida a proteoacutelise sob accedilatildeo da pepsina e pancreatina avaliada pelo conteuacutedo de
nitrogecircnio e conteuacutedo de aminoaacutecidos no material hidrolisado Como no processamento
de alimentos geralmente satildeo utilizadas doses de radiaccedilatildeo ateacute um maacuteximo de 10 kGy
estes resultados sugerem que a irradiaccedilatildeo da proteiacutena ateacute com dose de 10 kGy poderia
6 Consideraccedilotildees finais 97
ser aplicada para melhorar a sua qualidade microbioloacutegica e obter β-LG adequada para
ser incluiacuteda em dietas proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade No entanto tratando-
se de proteiacutena proveniente de leite cuidados devem ser tomados para que a dose de
radiaccedilatildeo a ser empregada natildeo cause a formaccedilatildeo de aromas desagradaacuteveis que poderatildeo
surgir principalmente da degradaccedilatildeo de resiacuteduos de aminoaacutecidos que possuem grupo
tiol (CRAWFORD RUFF 1996)
Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho algumas alteraccedilotildees de
funcionalidade da β-LG pela radiaccedilatildeo reportados em estudos anteriores podem ser
complementados ou melhor explicados No estudo de Lee et al (2001) foi relatado que a
irradiaccedilatildeo com raios gama reduziu a alergenicidade de proteiacutenas do leite Segundo os
autores a diminuiccedilatildeo das propriedades alergecircnicas avaliadas pelo meacutetodo ELISA era
resultado de possiacuteveis alteraccedilotildees estruturais dos epiacutetopos e aglomeraccedilatildeo das proteiacutenas
por efeito da radiaccedilatildeo gama Os resultados do presente trabalho sugerem que a
diminuiccedilatildeo da alergenicidade da β-LG irradiada reportada por Lee et al (2001) pode ser
decorrente do efeito de recobrimento de alguns siacutetios na superfiacutecie da proteiacutena devido agrave
oligomerizaccedilatildeo das moleacuteculas mascarando assim os epiacutetopos da proteiacutena alergecircnica
sem ter havido no entanto significativas alteraccedilotildees estruturais na proteiacutena
Le Tien et al (2000) relataram que filmes obtidos de soluccedilotildees contendo proteiacutenas
do soro de leite (50 mgmL) na sua formulaccedilatildeo irradiadas com radiaccedilatildeo gama em doses
de 32-64 kGy apresentaram boas propriedades mecacircnicas atribuiacutedas pelos autores ao
tipo de ligaccedilotildees cruzadas produzidas (bitirosinas) o que resultou em filmes com estrutura
mais ordenada (estudo por difraccedilatildeo de raios X) e mais estaacutevel que os obtidos por
aquecimento No presente estudo como anteriormente mostrado (Figura 42) foi
constatada a produccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil na β-LG (principal componente das proteiacutenas
do soro de leite) irradiada em soluccedilatildeo confirmando analiticamente o relatado por Le Tien
et al (2000) Observamos tambeacutem que a formaccedilatildeo de ligaccedilotildees bitirosil eacute maior quanto
mais diluiacuteda a proteiacutena Baseado nisso eacute possiacutevel supor que diminuindo a concentraccedilatildeo
de proteiacutena nas soluccedilotildees (lt50 mgmL) menores doses de radiaccedilatildeo poderiam ser
suficientes para obter resultados similares aos de Le Tien et al (2000)
98
7 Conclusotildees 99
7 CONCLUSOtildeES
7 Conclusotildees 100
7 CONCLUSOtildeES
Os resultados do presente trabalho confirmaram que os efeitos da radiaccedilatildeo gama na
proteiacutena dependem das condiccedilotildees fiacutesico-quiacutemicas na qual a proteiacutena eacute irradiada Neste
trabalho os efeitos da irradiaccedilatildeo na β-LG soacutelida mesmo com diferentes graus de
hidrataccedilatildeo foram despreziacuteveis quando comparados ao observado na proteiacutena irradiada
em soluccedilatildeo
A radiaccedilatildeo em doses de ateacute 10 kGy natildeo promoveu alteraccedilotildees estruturais que
levassem a perda da funcionalidade ou da digestibilidade da β-LG irradiada no estado
soacutelido o que sugere que este tratamento poderia ser aplicado para melhorar a qualidade
microbioloacutegica da proteiacutena eou obter β-LG adequada para ser incluiacuteda em dietas
proteacuteicas em pacientes com baixa imunidade
Para a β-LG irradiada em soluccedilatildeo o estudo de SAXS mostrou alteraccedilotildees nos
paracircmetros de espalhamento que indicaram a formaccedilatildeo de agregados de moleacuteculas de β-
LG e com ajuda da construccedilatildeo de modelos foi possiacutevel descrever estes agregados como
sendo muacuteltiplos de diacutemeros de β-LG linearmente ordenados (tetracircmeros hexacircmeros
etc)
O mecanismo de agregaccedilatildeo da β-LG que inclui formaccedilatildeo de ligaccedilotildees cruzadas de
bitirosil mostrou-se diferente do que tem sido reportado para outros tratamentos fiacutesicos
como o teacutermico ou de alta pressatildeo hidrostaacutetica podendo gerar agregados com
caracteriacutesticas e propriedades diferentes o que poderia ampliar a sua aplicabilidade pela
industria de alimentos
As teacutecnicas de fluorescecircncia intriacutenseca e dicroiacutesmo circular no UV proacuteximo natildeo foram
conclusivas na avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais ao niacutevel de estrutura terciaacuteria devido
agrave possiacutevel influecircncia de perdas do cromoacuteforo Trp decorrentes da irradiaccedilatildeo No entanto
as teacutecnicas de SAXS eletroforese em gel e SE-HPLC foram apropriadas para a
elucidaccedilatildeo das alteraccedilotildees estruturais e do processo de agregaccedilatildeo da proteiacutena
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 101
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 102
ABBAS A K LICHTMAN A H Imunologia celular e molecular Traduccedilatildeo Claudia Reali 5 ed Rio de Janeiro Elsevier Editora Ltda 2005 580p ANDRADE M A CHACOacuteN P MERELO J J MORAacuteN F Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network Protein Engineering v 6 p 383-390 1993 ANVISA ndash Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria Resoluccedilatildeo ndash RDC ndeg 21 de 26012001 Disponiacutevel em lthttpwwwanvisagovbrlegisresol21_01rdchtmgt Acesso em 2 Agosto 2006 ARAI M IKURA T SEMISOTNOV G KIHARA H AMEMIYA Y KUWAJIMA K Kinetic refolding of β-lactoglobulin Studies by synchrotron X-ray scattering and circular dichroism absorption and fluorescence spectroscopy Journal of Molecular Biology v 275 p 149-162 1998 ATVARS T D Z MARTELLI C ldquoEspectroscopia eletrocircnica de emissatildeordquo Disponiacutevel em httpwwwchemkeyscom Acesso em 8 Marccedilo 2006 BALDINI G BERETTA S CHIRICO G FRANZ H MACCIONI E MARIANI P SPINOZZI F Salt-induced association of β-lactoglobulin by light and X-ray scattering Macromolecules v 32 p 6128-6138 1999 BAUER R HANSEN S OGENDAL L Detection of intermediate oligomers important for the formation of heat aggregates of β-lactoglobulin International Dairy Journal v 8 p 105-112 1998 BELLOQUE J LOacutePEZ-FANDINtildeO R SMITH G M A 1H-NMR Study on the effect of high pressures on β-lactoglobulin Journal of American Chemical Society v 48 p 3906-3912 2000 BELLOQUE J SMITH G M Thermal denaturation of β-lactoglobulin A 1H-FT-NMR study Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 1805-1813 1998 BERTRAND-HARB C BADAY A DALGALARRONDO M CHOBERT J-M HAERTLEacute T Thermal modifications of structure and co-denaturation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin induce changes of solubility and susceptibility to proteases Nahrung Food v 46 p 283-289 2002 BOTELHO M VALENTE-MESQUITA V OLIVEIRA K POLIKARPOV I FERREIRA S Pressure denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 267 p 2235-2248 2000 BRAHMS S BRAHMS J Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism Journal of Molecular Biology v 138 p 149-178 1980 BRAULT D DrsquoAPRANO G LACROIX M Formation of free-standing sterilized edible films from irradiated caseinates Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2964-2969 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 103
BRENNAND C P Ten most commonly asked question about food irradiation Disponiacutevel emltwwwphysicsisueduradinffoodhtmgt Acesso em 10 jan 2006 BRITTAN H MUDFORD J C NORRIS G E KITSON T M HILL J P Labelling the free sulphydryl group in β-lactoglobulin A B and C In International Dairy Federation Special Issue 9702 Milk Protein Polimorfism International Dairy Federation p 200-203 1997 BROWNLOW S CABRAL JH COOPER R FLOWER D YEWDALL S POLIKARPOV I NORTH A SAWYER L Bovine β-lactoglobulin at 18Aring resolution-still an enigmatic lipocalin Structure v 5 p 481-495 1997 BUSINCO L BRUNO G GIAMPIETRO P G Soy protein for the prevention and treatment of children with cow-milk allergy American Journal of Clinical Nutrition v 68 suplem p 1447S-1452S 1998 BYCHKOVA V BERNI R ROSSI G KUTYSHENKO V PTITSYN O Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH Biochemistry v 31 p 7566-7571 1992 BYUN M W LEE J W YOOK H S LEE K H KIM K P The improvement of color and shelf life of ham by gamma irradiation Journal of Food Protection v 62 p 1162-1166 1999 CAESSENS P VISSER S GRUPPEN H VORAGEN A β-lactoglobulin hydrolysis 1 peptide composition and functional properties of hydrolysates obtained by the action of plasmin trypsin and staphylococcus aureus V8 protease Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 2973-2979 1999 CALLIS P R 1La and 1Lb Transitions of tryptophan Applications of theory and experimental observations to fluorescence of proteins Methods in Enzymology v 278 p 113-150 1997 CARROTA R BAUER R WANINGE R RISCHEL C Conformational characterization of oligomeric intermediates and aggregates in β-lactoglobulin heat aggregation Protein Science v 10 p 1312-1318 2001 CARROTA R ARLETH L PEDERSEN J BAUER R Small-angle X-ray scattering studies of metastable intermediates of β-lactoglobulin isolated after heat-induced aggregation Biopolymers v 70 p 377-390 2003 CASAL HL KOumlHLER U MANTSCH H H Structural and conformational changes of β-lactoglobulin B an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature Biochimica et Biophysica Acta v 957 p11-20 1988 CAVALCANTI L P TORRIANI I L PLIVELIC T S OLIVEIRA C L P KELLERMANN G NEUENSCHWANDER R Two new sealed sample cells for small angle x-ray scattering from macromolecules in solution and complex fluids using synchrotron radiation Review of Scientific Instruments v 75 p 4541-4546 2004
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 104
CHANG C T WU C-S C YANG J T Circular dichroic analysis of protein conformation inclusion of the β-turns Analytical Biochemistry v 91 p13-31 1978 CHEN Y BARKLEY M D Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins Biochemistry v 37 p 9976-9982 1998 CHEN W L HWANG M T LIAU C Y HO J C HONG K C MAO S J T β-lactoglobulin is a thermal marker in processed milk as studied by electrophoresis and circular dichroic spectra Journal of Dairy Science v 88 p 1618-1630 2005 CHO Y BATT C SAWYER L Probing the retinol-binding site of bovine β-lactoglobulin The Journal of Biological Chemistry v 269 p 11102-11107 1994 CLEMENT G BOQUET D FROBERT Y BERNARD H NEGRONI L CHATEL J-M ADEL-PATIENT K CREMINON C WAL J-M GRASSI J Epitopic characterization of native β-lactoglobulin Journal of Immunological Methods v 266 p 67-78 2002 COMPTON L A JOHNSON W C Analysis of protein circular dichroism spectra for secondary structure using a simple matrix multiplication Analytical Biochemistry v 155 p155-167 1986 CORRY J E C JAMES C JAMES S J HINTON M SalmonellaCampylobacter and Escherichia coli O157H7 decontamination techniques for the future International Journal of Food Microbiology v 28 p 187-196 1995 CRAEMER L W Effect of sodium dodecyl sulfate and palmitic acid on the equilibrium unfolding of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 34 p 7170-7176 1995 CRAWFORD L M RUFF E H A review of the safety of cold pasteurization through irradiation Food Control v 7 p 87-97 1996 CROGUENNEC T BOUHALLAB S MOLLEacute D OrsquoKENNEDY B T MEHRA R Stable monomeric intermediate with exposed Cys-119 is formed during heat denaturation of β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 301 p 465-471 2003 CROGUENNEC T MOLLEacute D MEHRA R BOUHALLAB S Spectroscopic characterization of heat-induced nonnative β-lactoglobulin monomers Protein Science v 13 p 1340-1346 2004 CURLEY R W SUNDARAM A K FOWBLE J W ABILDGAARD F WESTLER W M MARKLEY J L NMR studies of retinoid-protein interactions the conformation of 13C-β-ionones bound to β-lactoglobulin B Pharmaceutical Research v 16 p 651-659 1999 DAI-DONG J X NOVAK G HARDY J Stabilization of vitamin C by β-lactoglobulin during heat treatment Science des Aliments v 10 p 393 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 105
DAVIES K DELSIGNORE M LIN S Protein damage and degradation by oxygen radicals II Modification of amino acids The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9902-9907 1987 DAVIES K LIN S PACIFICI R Protein damage and degradation by oxygen radicals IV Degradation of denatured protein The Journal of Biological Chemistry v 262 p 9914-9920 1987 DE JONGH H H J GROumlNEVELD T DE GROOT J Mild isolation procedure discloses new protein structural properties of β-lactoglobulin Journal of Dairy Science v 84 p 562-571 2001 DELINCEacuteE H Detection of food treated with ionizing radiation Trends in Food Science amp Technology v 9 p 73-82 1998 DE WIT J N Nutritional and functional characteristics of whey proteins in food products Journal of Dairy Science v 81 p 597-608 1998 DIAS N F G P Estudo comparativo de propriedades imunestimulatoacuterias e antitumoral de concentrados proteacuteicos de soro de leite bovino da caseiacutena e de um isolado proteacuteico de soja comercial 2003 149p Tese (Doutor em Alimentos e Nutriccedilatildeo) ndash Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas Campinas 2003 DIB R CHOBERT J M DALGALARRONDO M HAERTLEacute T Secondary structure changes and peptic hydrolysis of β-lactoglobulin induced by diols Biopolymers v 39 p 23-30 1996 DIEHL J F Safety of irradiated foods 2 ed New York Marcel Dekker 1995 454p DOLGIKH D A GILMANSHIN R I BRAZHNIKOV E V BYCHKOVA V E SEMISOTNOV G V VENYAMINOV S Y PTITSYN O B α-lactalbumin compact state with fluctuating tertiary structure Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 136 p311-315 1981 DUFOUR E BERTRAND-HARB C HAERTLEacute T Reversible effects of medium dielectric constant on structural transformation of β-lactoglobulin and its retinol binding Biopolymers v 33 p 589-598 1993 DUFOUR E HOA G H HARTLE T High pressure effects on β-lactoglobulin interactions with ligands studied by fluorescence Biochimica et Biophysica Acta v 1206 p 166-172 1994 DUFOUR E HAERTLEacute T Binding of retinoids and β-carotene to β-lactoglobulin Influence of protein modifications Biochimica et Biophysica Acta v 1079 p 316-320 1991 DUFOUR E MARDEN M HAERTLEacute T β-lactoglobulin binds retinol and protoporphyrin IX at two different binding sites Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 277 p 223-226 1990
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 106
DUMOULIN M OZAWA S HAYASHI R Textural properties of pressure-induced gels of food proteins obtained under different temperatures including subzero Journal of Food Science v 63 p 92-95 1998 DYSON H J WRIGHT P E Insights into protein folding from NMR Annual Review of Physical Chemistry v 47 p 369-395 1996 EFTINK M R Fluorescence techniques for studying protein structure In Methods of Biochemical Analysis New York John Wiley amp Sons Inc v 35 1991 p 127-205 EIGELW N BUTLER J E ERNSTROM C A FARREL H M HARWALKER V R JENNES R WHITNEY R M Nomenclature of proteins of cowrsquos milk Journal of Dairy Science v 67 p 1599-1631 1984 ELGAR D F NORRIS C S AYERS J S PRITCHARD M OTTER D E PALMANO K P Simultaneous separation and quantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptone and caseinomacropeptide by reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene Journal of Chromatography A v 878 p 183-196 2000 ELLMANN G L Tissue sulfhydryl groups Archives of Biochemistry and Biophysics v 82 p 70-77 1959 ELOFSSON U DEJMEK P PAULSSON M Heat-induced aggregation of β-lactoglobulin studied by dynamic light scattering International Dairy Journal v 6 p 343-357 1996 FARKAS J Irradiation as a method for decontaminating food International Journal of Food Microbiology v 44 p 189-204 1998 FARREL H M QI P X BROWN E M COOKE P H TUNICK M H WICKHAM E D UNRUH J J Molten globule structures in milk proteins implications for potential new structure-function relationships Journal of Dairy Science v 85 p 459-471 2002 FENNEMA O R Food Chemistry 3 ed New York Marcel Dekker Inc 1996 1067p FOX P F McSWEENEY P L H Dairy Chemistry and Biochemistry London Blackie Academic amp Professional 1998 478p FUGATE R SONG P-S Spectroscopic characterization of β-lactoglobulin ndash retinol complex Biochimica et Biophysica Acta v 625 p 28-42 1980 FUNTENBERGER S DUMAY E CHEFTEL J C High pressure promotes β-lactoglobulin aggregation through SHS-S interchange reactions Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 912-921 1997 FUTTERMAN S HELLER J The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin β-lactoglobulin and the retinol-binding protein of human plasma Journal of Biological Chemistry v 247 p 5168-5172 1972
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 107
GARRISON W M Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides polypeptides and proteins Chemical Review v 87 p 381-398 1987 GLATTER O KRATKY O Small-angle X-rays scattering New York Academic Press 1982 GREEN D W ASCHAFFENBURG R CAMERMAN A COPPOLA J C DUNNILL P SIMMONS R M KOMOROWSKI E S SAWYER L TURNER E M C WOODS K F Structure of bovine β-lactoglobulin at 6 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 131 p 357-397 1979 GRIFFIN W G GRIFFIN M C A MARTIN S R PRICE J Molecular basis of thermal aggregation of bovine β-lactoglobulin A Journal of Chemical Society Faraday Transactions v 89 p 3395-3406 1993 GROLICHOVAacute M DVORAacuteK P MUSILOVAacute Employing ionizing radiation to enhance food safety- a review Acta Veterinaria Brunensis v 73 p 143-149 2004 GUICHARD E LANGOURIEUX S Interactions between β-lactoglobulin and flavour compounds Food Chemistry v 71 p 301-308 2000 GUINIER A FOURNET G In Small-angle Scattering of X-rays New York Wiley 1955 268p HAGEMAN M BAUER J POSSERT P DARRINGTON R Preformulation studies oriented toward sustained delivery of recombinant somatropins Journal of Agricultural and Food Chemistry v 40 p 348-355 1992 HARDY J SCHER J BANON S Water activity and hydration of dairy powders Lait v 82 p 441-452 2002 HOFFMANN M A ROEFS SP VERHEUL M VAN MIL P J DE KRUIF K G Aggregation of β-lactoglobulin studied by in situ light scattering Journal of Dairy Research v 63 p 423-440 1996 HOFFMANN M A VAN MIL P J Heat- induced aggregation of β-lactoglobulin role of the free thiol group and disulfide bonds Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 2942-2948 1997 HUFFMAN L Processing whey protein for use as a food ingredient Food Technology v 50 p 49-52 1996 HUFFMAN L M HARPER W J Maximizing the value of milk through separation technologies Journal of Dairy Science v 82 p 2238-2244 1999 IAMETTI S DE GREGORI B VECCHIO G BONOMI F Modifications occur at different structural levels during the heat denaturation of β-lactoglobulin European Journal of Biochemistry v 237 p 106-112 1996
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 108
IAMETTI S TRANSIDICO P BONOMI F VECCHIO G PITTIA P ROVERE P DALLrsquoAGLIO G Molecular modifications of β-lactoglobulin upon exposure to high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 23-29 1997 IBRAHIM H R KOBAYASHY K KATO A Improvement of the surface functional properties of β-lactoglobulin and α-lactalbumin by heating in a dry state Bioscience Biotechnology and Biochemistry v 57 p 1549-1552 1993 ICGFI (International Consultative Group on Food Irradiation) Facts about Food Irradiation FAOIAEAWHO Viena Auatria 1991 IGLESIAS O BUENO J L Water agar-agar equilibrium determination and correlation of sorption isotherms International Journal of Food Science and Technology v 34 p 209-216 1999 IMAFIDON G I FARKYE N Y SPANIER A M Isolation purificationand alteration of some functional groups of major milk proteins a review Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 37 p 663-689 1997 JAMESON G ADAMS J CREAMER L Flexibility functionality and hydrophobicity of bovine β-lactoglobulin International Dairy Journal v 12 p 319-329 2002 JANG HD SWAISGOOD H E Analysis of ligand binding and β-lactoglobulin denaturation by chromatography on immobilized trans-retinal Journal of Dairy Science v 73 p 2067-2074 1990 KANNO C MU T-H HAGIWARA T AMETANI M AZUMA N Gel formation from industrial milk whey proteins under hydrostatic pressure effect of hydrostatic pressure and protein concentration Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 417-424 1998 KATAOKA M HAGIHARA Y MIHARA K GOTO Y Moltem globule of cytochrome c studied by the small angle X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 229 p 591-596 1993 KATAOKA M NISHII I FUJISAWA T UEKI T TOKUNAGA F GOTO Y Structural characterization of the moltem globule and native states of apomyoglobin by solution X-ray scattering Journal of Molecular Biology v 249 p 215-228 1995 KAUFFMAN E DARNTON N C AUSTIN R H BATT C GERWERT K Lifetimes of intermediates in the β-sheet to α-helix transition of β-lactoglobulin by using a difusional IR mixer Proceedings of the National Academy Science v 98 p 6646-6649 2001 KELLY S M PRICE N C The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding Biochimica et Biophysica Acta v 1338 p 161-185 1997 KINSELLA J E WHITEHEAD D M Proteins in whey chemical physical and functional properties Advances in Food and Nutrition Research v 33 p 343-378 1989
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 109
KONAREV PV PETOUKHOV M V SVERGUN D I ldquoMASSHA ndash a graphic system for rigid body modelling of macromolecular complexes against solution scattering datardquo Journal of Applied Crystallography v 34 p 527-532 2001 KRATKY O Natural high polymers in the dissolved and solid state In Glatter O Kratky O Small angle X-ray scattering New York Academic Press p 361-386 1982 KRAULIS PJ MOLSCRIPT a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures Journal of Applied Crystallography v 24 p 946-950 1991 KUNTZ I D Jr KAUZMANN W Hydration of proteins and polypeptides Advances in Protein Chemistry v 28 p 239-345 1974 KURISAKI J NAKAMURA S KAMINOGAWA S YAMAUCHI K The antigenic properties of β-lactoglobulin examined with mouse IgE antibody Agricultural and Biological Chemistry Journal v 46 p 2069-2075 1982 KUWAJIMA K YAMAYA H SUGAI S The bursa-phase intermediate in the refolding of β-lactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy Journal of Molecular Biology v 264 p 806-822 1996 LABUZA T P KAANANE A CHEN J Y Effect of temperature on the moisture sorption isotherms and water activity of two dehydrated foods Journal of Food Science v 50 p 385-391 1985 LAEMMLI U K Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 Nature v 227 p 680-685 1970 LAI M C TOPP E M Solid-state chemical stability of proteins and peptides Journal of Pharmaceutical Sciences v 88 p 489-500 1999 LAKOWICZ J R Principles of fluorescence spectroscopy New York Plenum Press 1983 516p LANGE D C KOTHARI R PATEL R C PATEL S C Retinol and retinoic acid binding to a surface cleft in bovine β-lactoglobulin a method of binding site determination using fluorescence resonance energy transfer Biophysical Chemistry v 74 p 45-51 1998 LANGTON M HERMANSSON A-M Fine-stranded and particulate gels of β-lactoglobulin and whey protein at varying pH Food Hydrocolloids v 7 p 523-539 1992 LATTMAN E FIEBIG K M DILL K A Modeling compact denatured states of proteins Biochemistry v 33 p 6158-6166 1994 LEE J-W KIM J-H YOOK H-S KANG K-O LEE S-Y HWANG H-J Effects of gamma radiation on the allergenic and antigenic properties of milk proteins Journal of Food Protection v 64 p 272-276 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 110
LE TIEN C LETENDRE M ISPAS-SZABO P MATEESCU M A DELMAS-PATTERSON G YU H L LACROIX M Development of biodegradable films from whey proteins by cross-linking and entrapment in cellulose Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 5566-5575 2000 LETENDRE M DrsquoAacutePRANO G DELMAS-PATTERSON G LACROIX M Isothermal calorimetry study of calcium caseinate and whey protein isolate edible films cross-linked by heating and γ-irradiation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 50 p 6053-6057 2002 LIU W LANGER R KLIBANOV A Moisture-induced aggregation of lyophilized proteins in the solid state Biotechnology and Bioengineering v 37 p 177-184 1991 LOacutePEZ-DIacuteEZ E C BONE S An investigation of the water-binding properties of protein + sugar systems Physics in Medicine and Biology v 45 p 3577-3588 2000 LORENZI C C B Estudo estrutural de mastoparanos isolados de vespas solitaacuterias 2002 115p Dissertaccedilatildeo (Mestre em Biofiacutesica Molecular) - Instituto de Biociecircncias Letras e Ciecircncias Exatas Universidade Estadual Paulista 2002 MANAVALAN P JOHNSON W C Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra Analytical Biochemistry v 167 p 76-85 1987 MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on bovine β-lactoglobulin A B and C explored using thiol availability and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 3617-3627 1999a MANDERSON G CREAMER L HARDMAN M Effect of Heat Treatment on the Circular Dichroism Spectra of Bovine β-Lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4557-45671999b MANDERSON G HARDMAN M CREAMER L Effect of heat treatment on the conformation and aggregation of β-lactoglobulin A B and C Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 5052-5061 1998 MAumlNTYJAumlRVI R RAUTIAINEN J VIRTANEN Lipocalins as allergens Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 308-317 2000 MARSHALL K Therapeutic applications of whey protein Alternative Medicine Review v 9 p 136-156 2004 MARSHALL K R HARPER R J Whey protein concentrates Bulletin of the International Dairy Federation v 233 p 21-32 1988 MATSUURA J MANNING M Heat-induced gel formation of β-lactoglobulin A study on the secondary and tertiary structure as followed by circular dichroism spectroscopy Journal of Agricultural and Food Chemistry v 42 p 1650-1656 1994
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 111
MAUBOIS J L PIERRE A FAUQUANT J PIOT M Industrial fractionation of main whey proteins International Dairy Federation Bulletin v 212 p 154-159 1987 McKENZIE H A SAWYER W H Effect of pH on β-lactoglobulins Nature v 214 p1101-1104 1967 McINTOSH G H ROYLE P J LE LEU R K REGESTER G O JOHNSON M A GRINSTED R L KENWARD R S SMITHERS G W Whey proteins as functional food ingredients International Dairy Journal v 8 p 425-434 1998 MESSENS W VAN CAMP J HUYGHEBAERT A The use of high pressure to modify the functionality of food proteins Trends in Food Science amp Technology v 8 p 107-112 1997 MOCZ G The use of fluorescence in research into protein structure Disponiacutevel em lthttpcorebiotechhawaiieduppsidxhtmgt Acesso em 08 marccedilo 2006 MOLLER R STAPELFELDT H SKIBSTED Thiol reactivity in pressure-unfolded β-lactoglobulin antioxidative properties and thermal refolding Journal of Agricultural and Food Chemistry v 46 p 425-430 1998 MONACO H L ZANOTTI G SPADON P BOLOGNESI M SAWYER L ELIOPOULOS E E Crystal structure of the trigonal form of bovine β-lactoglobulin and its complex with retinol at 25 Aring resolution Journal of Molecular Biology v 197 p 695-706 1987 MORR C V FOEGEDING E A Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates A status report Food Technology v 44 p100-112 1990 MORR C V HA Y W Whey protein concentrates and isolates processing and functional properties Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 33 p 431-476 1993 MORGAN F VEacuteNIEN A BOUHALLAB S MOLLEacute D LEacuteONIL J PELTRE G LEVIEUX D Modification of Bovine β-Lactoglobulin by glycation in a powdered state or in an aqueous solution immunochemical characterization Journal of Agricultural and Food Chemistry v 47 p 4543-4548 1999 MULLALLY M M MEISEL H FITZGERALD R J Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey proteins International Dairy Journal v 7 p 299-303 1997 MURESAN S VAN DER BENT A DE WOLF F A Interaction of β-lactoglobulin with small hydrophobic ligands as monitored by fluorometry and equilibrium dialysis Nonlinear quenching related to protein-protein association Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 2609-2618 2001 NAGAOKA S FUTAMURA Y MIWA K AWANO T YAMAUCHI K KANAMARU Y TADASHI K KUWATA T Identification of novel hypocholesterolemic peptides derived
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 112
from bovine milk β-lactoglobulin Biochemical and Biophysical Research Communications v 281 p 11-17 2001 NEURATH A R JIANG S STRICK N LIN K LI Y-Y DEBNATH A K Bovine βminuslactoglobulin modified by 3minushydroxyphthalic anhydride blocks the CD4 cell receptor for HIV Nature Medicine v 2 p 230-234 1996 OLIVEIRA C L P TRAT1D ndash Computer program for SAXS data treatment LNLS Technical Manual MT012003 2003 OLIVEIRA K VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M SAWYER L FERREIRA S POLIKARPOV I Crystal structures of bovine β-lactoglobulin in the orthorombic space group C2221 European Journal of Biochemistry v 268 p 477-483 2001 OTANI H UCHIO T TOKITA F Antigenic reactivities of chemically modified β-lactoglobulins with antiserum to bovine β-lactoglobulin Agricultural and Biological Chemistry Journal v 49 p 2531-2536 1985 OTTE J ZAKORA M QVIST K OLSEN C BARKHOLT V Hydrolysis of bovine β-lactoglobulin by various proteases and identification of selected peptides International Dairy Journal v 7 p 835-848 1997 OUWEHAND A C SALMINEN S J SKURNIK M CONWAY P L Inhibition of pathogen adhesion by β-lactoglobulin International Dairy Journal v 7 p 685-692 1997 PALAZOLO G RODRIacuteGUEZ F FARRUGIA B PICOacute G DELORENZI N Heat treatment of β-lactoglobulin structural changes studied by partitioning and fluorescence Journal of Agricultural and Food Chemistry v 48 p 3817-3822 2000 PANICK G MALESSA R WINTER R Differences between the pressure- and temperature-induced denaturation and aggregation of β-lactoglobulin A B and AB monitored by FT-IR spectroscopy and small- angle X-ray scattering Biochemistry v 38 p 6512-6519 1999 PAPIZ M Z SAWYER L ELIOPOULOS E E NORTH A C T FINDLAY J B C SIVAPRASADARAO R JONES T A NEWCOMER M E KRAULIS P J The structure of β-lactoglobulin and its similarity to plasma retinol-binding protein Nature v 324 p383-385 1986 PAUL P CHAWLA S P THOMAS P KESAVAN P C Effect of high hydrostatic pressure gamma-irradiation and combination treatments on the microbiological quality of lamb meat during chilled storage Journal of Food Safety v 16 p 263-271 1997 PELLEGRINI A DETTLING C THOMAS U HUNZIKER P Isolation and characterization of four bactericidal domains in the bovine β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1526 p 131-140 2001
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 113
PESSEN H KUMOSINSKI T F TIMASHEFF S N The use of small-angle X-ray scattering to determine protein conformation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 19 p 698-702 1971 PHILLIPS L G HAWKS S E GERMAN J B Structural characteristics and foaming properties of β-lactoglobulin Effects of shear rate and temperature Journal of Agricultural and Food Chemistry v 43 p 613-619 1995 PHOTCHNACHAI S KITABATAKE N Heating of β-lactoglobulin a solution in a closed system at high temperatures Journal of Food Science v 66 p 647-652 2001 PORTER M C MICHAELS A S Applications of membrane ultrafiltration to food processing Proceedings of the Third International Congress of Food Science and Technology p 462-473 1970 PRABAKARAN S DAMODARAN S Thermal unfolding of β-lactoglobulin characterization of initial unfolding events responsible for heat-induced aggregation Journal of Agricultural and Food Chemistry v 45 p 4303-4308 1997 PROVENCHER S W GLOCKNER J Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism Biochemistry v 20 p 33-37 1981 PRUTZ W A BUTLER J LAND E J Phenol coupling initiated by one-electron oxidation of tyrosine units in peptides and histone International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics Chemistry and Medicine v 44 p 183-196 1983 PTITSYN O B Molten globule and protein folding Advances in Protein Chemistry v 47 p 83-229 1995 PUYOL P PEREZ M D PEIRO J M CALVO M Effect of binding of retinol and palmitic acid to bovine β-lactoglobulin on its resistance to thermal denaturation Journal of Dairy Science v 77 p 1494-1502 1994 PUYOL P PEREZ M D SANCHEZ L ENA J M CALVO M Uptake and passage of β-lactoglobulin palmitic acid and retinol across the Caco-2 monolayer Biochimica et Biophysica Acta v 1236 p 149-154 1995 QI X L HOLT C MCNULTY D CLARKE D T BROWNLOW S JONES G R Effect of temperature on the secondary structure of β-lactoglobulin at pH 67 as determined by CD and IR spectroscopy a test of the molten globule hypothesis Biochemical Journal v 324 p 341-346 1997 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin Biochemistry v 37 p 14014-14023 1998 QIN B Y BEWLEY M C CREAMER L K BAKER H M BAKER E N JAMESON G B Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine β-lactoglobulin Protein Science v 8 p 75-83 1999
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 114
RAGONA L FOGOLARI F ZETTA L PEREZ D PUYOL P de KRUIF K LOumlHR F RUumlTERJANS HMOLINARI H Bovine β-lactoglobulin Interaction studies with palmitic acid Protein Science v 9 p 1347-1356 2000 REDDY I KELLA N KINSELLA J Structural and conformational basis of the resistance of β-lactoglobulin to peptic and chymotryptic digestion Journal of Agricultural and Food Chemistry v 36 p 737-741 1988 REGESTER G O MCINTOSH G H LEE V W K SMITHERS G W Whey proteins as nutritional and functional food ingredients Food Australia v 48 p 123-128 1996 ROUVINEN J RAUTIAINEN J VIRTANEN T ZEILER T KAUPPINEN J TAIVAINEN A MAumlNTYJAumlRVI R Probing the molecular basis of allergy The Journal of Biological Chemistry v 274 p 2337-2343 1999 RUPLEY J A CARERI G Protein hydration and function In Advances in protein chemistry New York Academic Press Inc v 41 1991 p 37-170 SABATO S F OUATTARA B YU H DAacutePRANO G LE TIEN C MATEESCU M A LACROIX M Mechanical and barrier properties of cross-linked soy and whey protein based films Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 1397-1403 2001 SAWYER L KONTOPIDIS G The core lipocalin-β-lactoglobulin Biochimica et Biophysica Acta v 1482 p 136-148 2000 SEacuteLO I CLEacuteMENT G BERNARD C CHATEL J-M CREacuteMINON C PELTRE G Allergy to bovine β-lactoglobulin specificity of human IgE to tryptic peptides Clinical and Experimental Allergy v 29 p 1055-1063 1999 SEMENYUK V SVERGUN D I GNOM ndash A program package for small-angle scattering data-processing Journal of Applied Crystallography v 24 p 537-540 1991 SEVILLA M D BECKER D YAN M The formation and structure of the sulfoxyl radicals RSO RSOO RSO2OO from the reaction of cysteine glutathione and penicillamine thiyl radicals with molecular oxygen International Journal of Radiation Biology v 57 p 65-81 1990 SGARBIERI V C Propriedades fisioloacutegicas-funcionais das proteiacutenas do soro de leite Revista de Nutriccedilatildeo v 17 p 397-409 2004 SHIMADA K CHEFTEL J C Sulfhydryl groupdisulfide bond interchange reactions during heat-induced gelation of whey protein isolate Journal of Agricultural and Food Chemistry v 37 p161-168 1989 SHIMIZU M SAITO M YAMAUCHI K Emulsifying and structural properties of β-lactoglobulin at different pHs Agricultural Biological Chemistry v 49 p 189-194 1985
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 115
SHINAR E NAVOK T CHEVION M The analogous mechanisms of enzymatic inactivation induced by ascorbate and superoxide in the presence of copper The Journal of Biological Chemistry v 258 p 14778-14783 1983 SPIES J Milk allergy Journal of Milk and Food Technology v 36 p 225-231 1973 SREERAMA N VENYAMINOV S Y WOODY R W Estimation of the number of helical and strand segments in proteins using circular dichroism spectroscopy Protein Science v 8 p 370-380 1999 STADING M LANGTON M HERMANSSON A-M Microstructure and rheological behaviour of particulate β-lactoglobulin gels Food Hydrocolloids v 7 p 195-212 1993 STAPELFELDT H PETERSEN P H KRISTIANSEN K R QVIST K B SKIBSTED L H Effect of high hydrostatic pressure on the enzymic hydrolysis of β-lactoglobulin B by trypsin thermolysin and pepsin Journal of Dairy Research v 63 p 111-118 1996 SUBRAMANIAM V STEEL D GAFNI A In vitro renaturation of bovine B-lactoglobulin A leads to a biologically active but incompletely refolded state Protein Science v 5 p 2089-2094 1996 SVERGUN D I BARBERATO C KOCH M H J CRYSOL ndash a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates Journal of Applied Crystallography v 28 p 768-773 1995 TAULIER N CHALIKIAN T Characterization of pH-induced transitions of β-lactoglobulin Ultrasonic densimetric and spectroscopic studies Journal of Molecular Biology v 314 p 873-889 2001 TIMASHEFF S N MESCANTI L BASCH J J TOWNED R Conformational transitions of bovine β-lactoglobulins A B and C The Journal of Biological Chemistry v 241 p 2496-2501 1966 VALENTE-MESQUITA V BOTELHO M FERREIRA S Pressure-induced subunit dissociation and unfolding of dimeric β-lactoglobulin Biophysical Journal v 75 p 471-476 1998 VERHEUL M PEDERSEN J ROEFS S de KRUIF K Association behavior of native β-lactoglobulin Biopolymers v 49 p 11-20 1999 VOISINE R PARENT G SAVOIE L Effect of gamma irradiation parameters on the In-vitro digestibility of β-lactoglobulin Journal of the Science of Food and Agriculture v 52 p 221-230 1990 WALLACE B A Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures Journal of Synchrotron Radiation v 7 p 285-295 2000 WANG Q W ALLEN J C SWAISGOOD H E Binding of retinoids to β-lactoglobulin isolated by bioselective adsorption Journal of Dairy Science v 80 p 1047-1053 1997
8 Referecircncias Bibliograacuteficas 116
WHITMORE L WALLACE BA DICHROWEB an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data Nucleic Acids Research v 32 p 668-673 2004 WHO High-dose irradiation wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kGy WHO Technical Report Series 890 Geneva Switzerland 1999 WITZ J TIMASHEFF S N LUZZATI V Molecular interactions in β-lactoglobulin VIII Small-angle X-ray scattering investigation of the geometry of β-lactoglobulin A tetramerization Journal of American Chemical Society v 86 p 168-173 1964 WONG D CAMIRAND W PAVLATH A Structures and functionalities of milk proteins Critical Reviews in Food Science and Nutrition v 36 p 807-844 1996 WU S Y PEacuteREZ M D PUYOL P SAWYER L β-lactoglobulin binds palmitate within its central cavity The Journal of Biological Chemistry v 274 p 170-174 1999 YAMAMOTO O Effect of radiation on protein stability In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap12 p 361-421 YANG J T WU C-S C MARTINEZ H M Calculation of protein conformation from circular dichroism Methods in Enzymology v 130 p 208-269 1986 YANG J DUNKER K POWERS J CLARK S SWANSON G β-lactoglobulin molten globule induced by high pressure Journal of Agricultural and Food Chemistry v 49 p 3236-3243 2001 YU H COLUCCI W J McLAUGHLIN M L BARKLEY M D Fluorescente quenching in indoles by excited state proton transfer Journal of the American Chemical Society v 114 p 8449-8454 1992 ZAKS A Proteinndashwater interactions In Stability of protein pharmaceuticals Part A Chemical and physical pathways of protein degradation New York Plenum Press 1992 Cap 9 p 249-271 ZSILA F A new ligand for an old lipocalin induced circular dichroism spectra reveal binding of bilirubin to bovine β-lactoglobulin Federation of European Biochemical Societies (FEBS) Letters v 539 p 85-90 2003 ZSILA F BIKAacuteDI Z SIMONYI M Retinoic acid binding properties of the lipocalin member β-lactoglobulin studied by circular dichroism electronic absorption spectroscopy and molecular modeling methods Biochemical Pharmacology v 64 p 1651-1660 2002