Post on 15-Jan-2016
description
Identification de facteurs
impliqués dans la
Mécanosensibilité colique.Alison Accarie / 1er année de thèse
Directeur de thèse : Pr. Michel Dapoigny
Directeurs du laboratoire : Pr. Alain Eschalier et Pr. Denis Ardid
UMR/INSERM 1107 Neuro Dol, Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la douleur
U1107 / Pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur
prise en charge insuffisante des douleurs chroniques
Introduction
Axe : Douleur viscérale
Douleurs abdominales
• Première cause de consultation en gastroentérologie
• Symptôme commun au SII et MICI en période de rémission
Douleurs coliques
SII : syndrome intestin irritableMICI : maladie inflammatoire chroniques de l’intestin
Introduction
hypersensibilité colique
Douleurs coliques
2/3 des cas
Introduction
Intégration centrale
Introduction
Mécanosensibilité colique : implication de canaux ioniques
ASIC (Acid sensing ion channels): sensible au pHTRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) : sensible au chaudTRPA (Transient Receptor Potential family A): sensible au stretch, température et irritants
Senseurs périphériques? Pas de rôle clair.
Stuart M. Brierley Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical 2010
Introduction
Identification d’un nouveau Facteur de Transcription dans cas de stimulation mécanique des tiges chez Arabidopsis & Popular sp. (Equipe MECA, UMR PIAF)
PtaZFP2
Expression précoce
Motif doigt de zinc
Mécanosenseurs présents aussi chez les plantes, avec équivalent génique chez l’animal
Introduction
Martin, 2009
Cinétique d’expression courte
Induit pour une stimulation
Phénomène de sensibilisation
NGF1-C/egr-4 équivalent génique de PtaZFP2 chez la souris
Introduction
Famille Egr :
4 sous types
Facteur de transcription / Gène de réponse précoce
Structure à doigt de zinc liaison à l’ADN Cys2-His2
Modulation d’expression de gènes lors de la transmission nerveuses
Même séquence de reconnaissance de l’ADN : GCC G/TGG GCG
Induction par NGF (culture cellulaire )
Zhican Qu 1998Impliqué dans stimuli douloureux
Egr-4 :
Deux principales études
Impliqué dans mecanosensation (vibris et cortex somata-sensoriel) suite à un stimulus mécanique physiologique
Introduction
(Mack et al., 1995).
PCR ARNm egr-4
Objectif de la thèse
Implications et rôles du facteur de transcription
EGR-4 en tant mécano senseur
Objectifs
Egr-4 impliqué dans Hypersensibilité colique chez l’animal?
Quels sont ces partenaires?
Par quels mécanismes cela passe-t-il?
Implications et rôles du facteur de transcription EGR-4 en tant que
mécanosenseurs
Plan de travail
Souris saines
Rôle dans Mécanosensibilité viscérale?
Quels sont les partenaires?
Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent?
Caractérisation de la cible
Plan de travail
Souris saines
Rôle dans Mécanosensibilité viscérale?
Implication dans hypersensibilité colique?
Quels sont les partenaires?
Dans quels tissus et à quel moment est-il le plus présent?
Caractérisation de la cible
Modèle post-infectieux
Modèle stress
Modification d’expression?
Changement de partenaires?
Cinétique différente?
Protocole
Souris wt sans traitement.
Distension à 100 µL pendant 10 s.
Prélèvement 30 min, 1h30 et 3h30 après distension.
Colon
• Partie distendue
Moelle
DRG viscéraux
• L6 et S1
seringue + sonde rectale
Premiers résultats IHC
Anticorps au point pour les trois structure
Colocalisation avec des fibres nerveuses plus précisement sensitives
Egr-4 nucléaire et/ou cytoplasmique
ParaffineAnti-NGFI-C 1:500Anti-goat (secondaire) 1:1000
Premiers résultats IHC
Colon
seringue + sonde rectale
Colon
Premiers résultats IHC
DRG cytoplasme DRG noyau
Colon
Premiers résultats IHC
Corne dorsale de la moelle épinière
DRG cytoplasme
DRG noyau
Egr-4 colon souris distendus vs non distendus
C 30 1h30
COLON
ARNmprotéine
baisse d’expression de egr 4 au niveau colique
Egr-4 DRG souris distendus vs non distendus
C 30 1h30
DRG
ARNm protéine
baisse d’expression de egr 4 dans les DRG
Egr-4 moelle souris distendus vs non distendus
Moelle
C 30 1h30
ARNm
protéine
augmentation de EGR4 dans la moelle.
Conclusion
Outils d’études (PCR, WB, IHC) disponibles et mis au point
Résultats avec des tendances différentes de ceux obtenus chez la plante et au niveau cérébral chez la souris (confirmation en cours).
Confirmation de l’intérêt de l’étude de cette cible dans la mécanosensibilité
Suite du travail
Cinétique d’expression du facteur.
DCR 30 (45) 1h (1h15) 1h30
DCR (1h) 1h30 (2h) 2h30 (3h) 3h30
ARNm
Proteine
Suite du travail
Cinétique d’expression du facteur.
Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount).
Suite du travail
Cinétique d’expression du facteur.
Localisation plus fine en immunohistologie (whole mount).
Identification des cibles et partenaires.
choc osmotique
qPCR
Culture cellulaireMODE-K
WBmicroarray
Merci de votre attention
Corrélation volume de distension-expression egr-4 ARN m et protéine
qPCR
Western Blot
Prélèvements au temps choisis
Distension des animaux avec différents volumes :
20 µl
40 µl
60 µl
80 µl
100 µl
120 µl
J-3 J-2 J0 J1 J2 J3 J9
Administration néomycine (2 g/mL) dans eau de boisson
Gavage PBS ou 109 CFU/souris
(AIEC LF82 ouMG1655)
Distension colorectale
Modèle post-infectieux
Souris KI pour le gène humain ceacam6 : site de liaison LF82
meilleure implantation des bactéries
Implantation électrodes
0 20 40 60 80 1000.0
0.5
1.0
1.5 WT ControlWT + LF82
*: significant vs non infected
WT + MG1655
Distension Volume (µL)
VM
R (
mV
/s)
0 20 40 60 80 1000.0
0.5
1.0
1.5 Ceacam6 ControlCeacam6 + LF82Ceacam6 + MG1655
*: significant vs non infected
*
*
Distension Volume (µL)
VM
R (
mV
/s)
DCR J9
Résultats modèle post-infectieux
Résultats modèle stress
Réponse moyenne de sensibilité colique DCR réalisée à l’age adulte