Post on 03-Jul-2022
Herramientas computacionales de cribado virtual,
acoplamiento molecular y metodologías 3D-QSAR
aplicadas a inhibidores de Zinc Proteasas ACE2 y MMP9
ROSA MERCEDES BALDIRIS AVILA
I
CONTENIDO
RESUMEN ............................................................... ¡Error! Marcador no definido.
SUMMARY............................................................... ¡Error! Marcador no definido.
CAPITULO 1. ........................................................................................................... 7
1.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 7
1.2 REFERENCIAS ............................................................................................ 15
CAPITULO 2 .......................................................................................................... 19
2. METALOPROTEINASAS ............................................................................... 19
2.1. INHIBICIÓN DE LAS METALOPROTEINASAS .......................................... 21
2.1.1. Otros inhibidores endógenos de las MMPs ........................................... 22
2.1.2. Metaloproteinasa 9 ................................................................................ 23
2.1.3. Desarrollo de TIMPs como moléculas terapéuticas............................... 23
2.2. SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA-ALDOSTERONA (RAAS) ................. 25
2.3. REFERENCIAS .......................................................................................... 32
CAPITULO 3. .......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………39
3.1 INTRODUCCIÓN ............................................ ¡Error! Marcador no definido.
3.1.1 MÉTODOS CUANTITATIVOS ESTRUCTURA ACTIVIDAD (QSAR).
.......................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
3.2. CoMFA .......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
3.3. CoMSIA ......................................................... ¡Error! Marcador no definido.
3.4. METODOLOGÍA DE DOCKING O ACOPLAMIENTO ... ¡Error! Marcador no
definido.
3.5 REFERENCIAS. ............................................. ¡Error! Marcador no definido.
CAPITULO 4. ......................................................................................................... 40
SCREENING VIRTUAL: UTILIZANDO EL ACOPLAMIENTO MOLECULAR Y
EL ANÁLISIS 3D-QSAR DE INHIBIDORES LAS METALOPROTEINASAS DE
MATRIZ ........................................................................................................... 40
4.1 INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 40
4.2 DETALLES COMPUTACIONALES .............................................................. 42
II
4.2.1 Conjunto de datos .................................................................................. 42
4.3. MODELADO MOLECULAR ......................................................................... 49
4.3.1. Alineamiento molecular ........................................................................ 50
4.3.2. Modelos CoMFA y CoMSIA ................................................................... 51
4.4. ANÁLISIS DE MÍNIMOS CUADRADOS PARCIALES (PLS) ....................... 52
4.5. ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO MOLECULAR ........................................ 52
4.6. OPTIMIZACIÓN CON PRECURSORES LEAPFROG ................................. 53
4.7. CRIBADO VIRTUAL .................................................................................... 54
4.8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................... 55
4.8.1. Conformación de unión de 2-Amino-N-3,3-trimetil butanamida ............. 55
4.8.2. Estudio de acoplamiento molecular ....................................................... 56
4.8.3 Análisis CoMFA y CoMSIA ..................................................................... 59
4.8.4 Optimización de Precursores con LeapFrog .......................................... 66
4.8.5 Cribado virtual ........................................................................................ 67
4.9. La actividad inhibidora ................................................................................. 69
4.10.CONCLUSIONES ....................................................................................... 73
4.11. REFERENCIAS ......................................................................................... 74
CAPITULO 5. ......................................................................................................... 78
DISEÑO DE INHIBIDORES DE ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA
2 (ACE2) POR CRIBADO Y OPTIMIZACIÓN DE LEADS (CABEZA DE SERIE)
........................................................................................................................... 78
5.1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 78
5.2. PREPARACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS, BÚSQUEDA
CONFORMACIONAL Y CONSENSO ................................................................. 79
5.3. ESTUDIOS QSAR ....................................................................................... 80
5.4. OPTIMIZACIÓN DE LA CABEZA DE SERIE (LEADS) ............................... 82
5.5. CRIBADO VIRTUAL .................................................................................... 82
5.6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................... 84
5.6.1. Acoplamiento molecular (Docking) ........................................................ 84
5.6.2. Cálculos LeagFroog .............................................................................. 86
III
5.6.3. Cálculos QSAR ..................................................................................... 87
5.6.4. Predicciones ADMET y predicciones de similitud de medicamentos. .. 89
5.7. CONCLUSIONES ........................................................................................ 95
5.8. REFERENCIAS .......................................................................................... 95
6.CONCLUSIONES GENERALES ........................................................................ 99
APÉNDICE............................................................... ¡Error! Marcador no definido.
LISTA DE PUBLICACIONES ................................... ¡Error! Marcador no definido.
IV
7
CAPITULO 1.
1.1 INTRODUCCIÓN El zinc es un oligoelemento, considerado como el elemento más influyente en la
síntesis de proteínas. Su deficiencia se asocia casi siempre con la síntesis de la
proteína reducida. En los últimos años también se ha encontrado otros impactos
como es el del metabolismo del nitrógeno de las enzimas de zinc, como es el caso
de las proteasas y enzimas de péptidos [1].
En este orden de ideas una metaloproteinasa o metaloproteasa es una enzima que
genera proteólisis (proteasas), y que en su funcionamiento es necesaria la
presencia de metales tales como los átomos de zinc o cobalto. Las zinc proteasas
que son el objeto de nuestro estudio son importantes en multiples funciones a nivel
bioquímico, tales como descomponer colágeno, que se encuentra en los espacios
entre las células de los tejidos. Estas proteínas son relevantes en la participación
de procesos como curación de heridas, la angiogénesis y la metástasis de células
tumorales entre muchas otras funciones.
En forma general podemos afirmar que las metaloproteinas son moléculas que
coordinan la proteína con el ión metálico por medio de tres ligandos. Estos ligandos
son aminoácidos que pueden variar entre Histidina, Glutamato, Aspartato, Lisina y
Arginina. Además, de la molécula de agua que se utiliza para la proteólisis está
unida con el ion metálico en el centro catalítico de la enzima y se pueden clasificar
en endo o exopeptidos de acuerdo a si la proteína es clivada al final o no.
La escisión de enlaces peptídicos es esencial para la vida, y los factores
responsables de la escisión son las enzimas metaloproteasas. Estas enzimas en su
mayoría son hidrolasas dependientes de Zinc [2]. La regulación de una amplia gama
de las funciones biológicas, es realizada partiendo de estudios estructurales de
8
estas proteínas, indispensables para la comprensión de su función y el diseño de
nuevos agentes terapéuticos altamente específicos para modular su actividad [3].
Las zinc proteasas son clasificadas en clanes, tribus y familias, teniendo en cuenta
su patrón proteico ancestral. Muchas metaloproteasas son miembros de la tribu
Zincinas, y estás se dividen en los clanes gluzincinas, aspzincinas y metzincinas
[4]. Las metzincinas son subdivididas en 7 familias: astacinas,
Adams/adamalisins/reprolisinas, Serralisinas, metaloproteinasas de matriz,
snapalisinas, leishmanolisinas y pappalisinas [5]. Estas metalopeptidasas, se
caracterizan por poseer un motivo característico con una secuencia consenso de
zinc, HEXXH y una vuelta que a su vez contiene un aminoácido.
Desde una perspectiva médica y farmacéutica, las metaloproteínas que contienen
zinc son las de mayor importancia. Entre los muchos ejemplos de este tipo de zinc
proteasas tenemos la ACE (enzima convertidora de Angiotensina) y la nueva clase
de metaloproteinasas llamadas metaloproteinasas de matriz o Matrixinas (MMPs),
debido a que poseen gran importancia como blancos terapéuticos [6,7]
Toda esta química de las zinc metaloproteinasas es posible modelarla a través del
uso de técnicas computacionales con la cual se pretende ganar a través de este
estudio conocimiento sobre aspectos estructurales de este tipo de moléculas.
La utilización masiva de los computadores como se hace hoy en día ha
transformado dramáticamente casi todas las actividades científicas. tal como la
conocíamos antes del advenimiento masivo del uso de los computadores.
Convirtiendo a la computación en una disciplina que maneja altos estándares en
diferentes tipos de áreas del conocimiento dándoles con su metodología soluciones
reales a su problemática particular. La computación complementa y orienta
esfuerzos hacia la creación y desarrollo de una variada gama de aplicaciones con
las que resuelven las necesidades de los usuarios de las ciencias e ingenierías. Sin
lugar a dudas una de las áreas de mayor impacto y repercusión tanto a nivel
9
académico como a nivel industrial es lo que se ha denominado Química
Computacional (QC). El creciente interés por la QC en las universidades y en
industrias, tales como la industria la Farmacéutica, (solo por nombrar un ejemplo
de los muchos que se podrían nombrar) ha traído como consecuencia el desarrollo
de nuevas técnicas y herramientas en el área de química computacional con
múltiples aplicaciones para una variedad de retos tecnológicos y científicos.
Obviamente con el desarrollo de computadores con gran potencia de cálculo y cada
día a costos más económicos, ha hecho que el uso de las técnicas de visualización
por computador y de programas informáticos con interfaces de usuario amigables
haya facilitado el uso de herramientas computacionales en la química y además que
este uso no solo se haya limitado al químico especializado en el área de química
cuántica computacional si no que se use extensivamente como una herramienta
habitual para el químico experimental que lo usa como parte de ayuda ara la
interpretación de sus datos experimentales. [8]
La QC tiene por objeto el estudio de fenómenos químicos por medio del uso de los
computadores como herramienta principal para cumplir con su objetivo de estudio.
Cabe anotar en este punto que no son los computadores el eje central de la QC,
sino las bases teóricas y conceptuales en que se fundamentan las que permiten
estudiar las propiedades y transformaciones de las moléculas sin ir al laboratorio
[8,9].
La idea detrás de la química computacional es usar la estructura molecular e
investigar mediante diversas herramientas de cómputo una serie de propiedades y
atributos físicos y químicos que poseen las moléculas. Los cálculos de las
propiedades se hacen a través de métodos matemáticos y algoritmos
computacionales, estos últimos combinados con las leyes fundamentales de la
física y de la química, de tal forma que puedan determinarse algunas de las
propiedades moleculares y de esta forma entender o explicar los comportamientos
observados de forma experimental [8,9].
10
Las moléculas son consideradas por los químicos y físicos como un conjunto de
partículas cargadas, en las que existen unos núcleos cargados positivamente y
electrones cargados negativamente. La fuerza física impulsora importante en este
caso para el entendimiento de los fenómenos químicos como tal son las
interacciones entre partículas cargadas, que trae como consecuencia que las
moléculas posean diferentes propiedades [9].
Históricamente la QC puede ser vista como un desarrollo de la Química Teórica
(QT) con un objetivo claro que es el de investigar el comportamiento de diferentes
tipos de estructuras moleculares mediante el uso de computadores para conocer su
comportamiento y propiedades [10].
Existen diferentes definiciones de lo que es la química computacional quizás la más
usada de ella es la de LIpkowitz y Boyd en la que ellos definen la QC “como aquellos
aspectos de la química que son explicados o realizados mediante el uso de
computadores” [11].
La QC se puede dividir en dos grandes ramas las cuales hacen uso de una amplia
gama de métodos matemáticos y aproximaciones. Estas dos ramas son la Mecánica
Molecular (MM) y la Mecánica Cuántica (MC) [10]. Los métodos de la MM, hacen
uso de las leyes de la física clásica al núcleo molecular sin considerar explícitamente
los electrones. Los métodos de la MC se basan en el uso de la ecuación de
Schrödinger para la descripción de una molécula haciendo uso de estructura
molecular. Los métodos de la MC se pueden dividir en tres grandes grupos: Los
métodos ab inicio, los métodos de la Teoría del Funcional de la Densidad (DFT) y
los métodos semiempiricos [9].
La QC incluye aspectos tales como el modelado molecular, uso de herramientas
computacionales, diseño molecular asistido por computador, bases químicas de
11
datos, búsqueda de datos en bases químicas, diseño de síntesis orgánica y
desarrollo de algoritmos computacionales entre otros [8-14].
A través de la QC, podemos realizar: determinaciones de estructura electrónica,
optimización de geometrías, cálculos de frecuencia, localización de estructuras de
transición, análisis de distribución de carga y electrón, construcción de superficies
de energía potencial (SEP), cálculos cinéticos (constantes de velocidad para
reacciones químicas) y cálculos termodinámicos (calores de reacción), entre
muchos tipos de propiedades que pueden calcularse a través del uso de los
computadores y los algoritmos diseñados para tal fin [15].
La predicción de propiedades moleculares a través del uso de cálculos tanto MC
como de la MM de la estructura molecular por medio de algoritmos computacionales
ayuda a crear modelos predictivos y de validación que se pueda aplicar a diversos
tipos de investigaciones y de aplicaciones [16-25]. Es por ello que los enfoques
computacionales que facilitan el diseño molecular en el cual se describen las
interacciones o la reactividad de forma específica con otra(s) moléculas o con
segmentos de proteínas o dianas biológicas en un ambiente de cálculos
computacionales que simulen el modelo biológico real son hoy en día de vital
importancia para generar resultados que guíen la experimentación o sirvan de
apoyo para esta [11,12, 15].
La aplicación y uso de los cálculos de la química cuántica y computacional han
aumentado progresivamente a través de los años con unas aplicaciones usadas
para una gran variedad de sistemas moleculares. Esto ha sido posible hoy en día
debido a los grandes avances hechos en las facilidades computacionales y en la
creación de mejores programas y de mejores computadores disponibles en el
mercado. Lo que ha permitido el manejo cada vez más eficiente de una gran
cantidad de datos cada vez más complejos. El avance del hardware y el software
parece no detenerse pero aun el tamaño de los sistemas moleculares objeto de
12
estudio es aún un factor limitante, pero se sigue trabajando en la solución adecuada
a esta carencia [26, 27].
Para el uso de los métodos de la QC es importante encontrar un punto de partida
desde las consideraciones teóricas de la química, que permitan explorar la
diversidad de opciones que presenta QC. El uso de aproximaciones propias de los
métodos de la QC no significa que una aproximación no pueda ser útil ya que
ocasiones los métodos dan resultados parecidos o iguales a los valores
experimentales. Es que frecuentemente en las prácticas algunas veces solo se
requiere de una solución aproximada para guiar un experimento y obtener
resultados tangibles y darnos una compresión del problema estudiado [15,27].
La QC dispone de teorías, modelos y aproximaciones para resolver problemas
químicos. Estos modelos no pueden ser del todo exactos por lo que es necesario
en ese caso conocer su grado de aplicabilidad de cada teoría modelo y aplicación.
En general existen dos formas de usar la QC, una es a través de una forma
interpretativa reproduciendo un experimentos de esa forma obteniendo un
conocimiento detallado que permita dar una explicación satisfactoria a los
resultados obtenidos y a partir de estas elaborar una teoría o hipótesis de trabajo.
La otra es tomando en cuenta la capacidad predictiva que tiene la QC como puede
ser el caso de hacer modificaciones de la composición molecular y luego extraer
propiedades de estas sin que la molécula haya sido ni siquiera sintetizada [26, 27].
En ningún caso, la aplicación de la química computacional sustituye la
experimentación en el laboratorio, sino que sirven como una herramienta versátil
para estudiar el funcionamiento de la materia. Una de las grandes ventajas de la
QC es que evita el desperdicio de materia prima empleada para conseguir
materiales que presenten las características deseadas.
13
Aunque la QC como rama de la química ha sido exitosa en los aspectos antes
descritos cabe anotar que la QC y sus resultados no son sustitutos de los resultados
obtenidos a través del trabajo de experimentación en el laboratorio sino que
constituye una herramienta útil para la interpretación y predicción de algunos
aspectos de la estructura molecular. Entre los sistemas incluidos están los metales,
las proteínas, policristales, moléculas con actividad farmacológica, moléculas de
interés biológico entre los muchos sistemas moleculares que se pueden estudiar a
través de la QC [26, 27].
Hay muchas herramientas en la química computacional que se pueden aplicar en el
diseño de nuevas moléculas, tales como lo son los métodos de la relación
estructura-actividad (3D-QSAR). Estos métodos han demostrado ser una
herramienta computacional eficiente que ayuda a diseñar estructuras con
aplicaciones en algunos casos a moléculas de interés biológico. Entre los métodos
(3D-QSAR) hay técnicas, tales como el Análisis Comparativo de Campos
Moleculares (CoMFA, en inglés comparative molecular field analysis) y el Análisis
Comparativo de los Indices de Similitud Molecular (CoMSIA, en inglés Comparative
Molecular Similarity Indices), que han ayudado a entender el problema del receptor
y su interacción con el fármaco [28,29].
Bajo este contexto, en el capitulo 4 de esta tesis, se hizo uso de la técnica de
acoplamiento molecular y un análisis 3D-QSAR obteniéndose nuevos
conocimientos sobre la relación entre los valores de IC50 experimentales de una
serie de compuestos Nbiaril éter sulfonamida hidroxamatos y los descriptores
obtenidos a través de los programas CoMSIA y CoMFA. La información estructural
de la serie Nbiaril éter sulfonamida hidroxamatos fueron tomados de los trabajos
reportados por Yang y colaboradores [30,31] como potenciales inhibidores de las
metaloproteinasas (MMPs). Estas MMPs corresponden a una familia de
endopeptidasas que contienen zinc dependientes de calcio que son responsables
de la remodelación tisular y la degradación de la matriz extracelular (ECM),
14
incluyendo colágenos, elastinas, gelatina, glicoproteínas de la matriz, y
proteoglicanos. En este estudio, la proteína diana es la MMP9, que pertenece a la
familia gelatinasa. La información obtenida sobre la estructura molecular puede ser
utilizada para comprender las interacciones de los receptores del fármaco de este
tipo de moléculas como inhibidores potenciales de Metaloproteinasas (MMPs).
Seguidamente en el capítulo 5 se trabajó con un grupo de moléculas muy similares
a fármacos desarrollados por Dales et al., 2002, [32] los cuales fueron diseñados
computacionalmente y poseen alta afinidad in sillico para la enzima convertidora de
angiotensina 2. Esta enzima es una nueva diana prometedora tanto en la
enfermedad cardiorenal como también en algunas infecciones por coronavirus,
donde se ha establecido como el receptor funcional del agente etiológico del
síndrome respiratorio agudo severo SARS-CoV, o SCV) y el coronavirus humano,
Coronavirus NL63, o virus HCoV-NL63 [6,7] hoy en día la ACE2 se considera un
objetivo importante en el control de este tipo de enfermedades. [33]
En este estudio, un conjunto de moléculas de sustrato análogas se optimizaron por
medio del módulo de LeapFrog del paquete de SYBYL 7.0 [34]. Más tarde, fueron
determinados los compuestos con baja biodisponibilidad oral, utilizando los
programas Molinspiration [35] y Molsoft [36]. Del mismo modo, Osiris [37] se utilizó
para el cribado de los compuestos teniendo en cuenta los posibles efectos
secundarios. Al final de varias etapas de selección, siete candidatos fueron
obtenidos como posibles medicamentos antivirales que cumplen con todos los
criterios evaluados desde el punto de vista teórico. Estas moléculas podrían ser
susceptibles a futuros estudios in vitro e in vivo. Estos ligandos diseñados fueron
finalmente evaluados por relacion cuantitativa estructura-actividad, y un conjunto de
21 moléculas fueron utilizadas para llevar a cabo los modelos QSAR, de los cuales
se obtuvieron valores adecuados (q2 = 0,652 y r2 = 0.962), para validar el modelo
obtenido para esta serie de compuestos [38].
15
1.2. REFERENCIAS
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19
CAPITULO 2
GENERALIDADES
2. METALOPROTEINASAS
El termino Metaloproteína es una palabra que se usa en forma genérica para
designar a una proteína la cual contiene como cofactor a ión metálico. Este ión
metálico, se une a la proteína en un sitio activo. Al igual que con todas las enzimas,
en las metaloproteinaass la forma del sitio activo es trascendental para la actividad
de la proteína. El ión metálico se encuentra normalmente en un bolsillo cuya forma
se ajusta el sustrato. El ión metálico tiene como rol principal catalizar una serie de
reacciones que son difíciles de lograr en la química orgánica, sino es por la vía de
la catálisis [1].
Las metaloproteinas usualmente juegan un papel importante en muchas funciones
vitales en el funcionamiento de nuestro organismo. Se conoce por ejemplo que la
matriz extracelular (MEC) está formada por una gran cantidad de componentes que
se pueden clasifican en tres grandes grupos que son los proteoglicanos y
glucosaminoglicanos, las proteínas estructurales (colágeno y elastina), y las
proteínas de adhesión (fibronectina y laminina) [1-6].
Las metaloproteinasas de la matriz son enzimas sintetizadas por diferentes células
del tejido conectivo, como fibroblastos, osteoblastos, odontoblastos y también
células de defensa como los leucocitos (polimorfonucleares y macrófagos). Las
MMPs son proteasas extracelulares requeridas en numerosos procesos
relacionados con el desarrollo, la regeneración y la enfermedad. Debido a que las
MMPs digieren distintos componentes de la matriz extracelular, contribuyen con
diversos procesos fisiológicos, como el remodelado normal de tejidos, la
angiogénesis, el desarrollo embrionario del tejido conjuntivo, la ovulación, la
20
apoptosis, la cicatrización de heridas y otros procesos importantes para la salud
humana [7].
La actividad catalítica de las MMPs es controlada por los inhibidores tisulares de
metaloproteinasas de la matriz (TIMPs). En condiciones fisiológicas y patológicas
es evidente que se pierde el equilibrio existente entre MMPs con respecto a la de
TIMPs, este desequilibrio interviene en la rotura de la matriz extracelular (MEC). Las
metaloproteinasas de la MEC (MMPs), tienen como misión degradar de manera
proteolítica directa las proteínas integrantes de dicha MEC (por ejemplo, colágeno,
fibronectina y proteoglicanos) en su medioambiente inmediato y activar factores de
crecimiento, receptores de superficie y moléculas de adhesión [1-5, 7], pero también
se sabe que actúan como mediadores químicos, regulando la función de moléculas
bioactivas como las citoquinas y quimioquinas, e intervienen en la destrucción del
tejido y la respuesta inmune relacionada con la inflamación [2].
Las MMPs se clasificaron según el tipo de componente de la matriz extracelular
(MEC) que son capaces de degradar [7]. Así, las MMPs quedaron agrupadas en:
colagenasas (MMP1, 8, 13), gelatinasas (MMP2, MMP9), estromilisinas (MMP3, 10,
11, 7), y matrilisinas (MMP7, MMP26). Hoy en dia esa clasificación no se usa mucho
y actualmente se usa una clasificación según su número y estructura. A partir de
esto y sabiendo que las MMPs tienen una estructura común que comparten
básicamente esta familia de proteinas que consiste de cuatro dominios
conservados: 1. un péptido señal o predominio, situado en el extremo
aminoterminal, 2. un propéptido o prodominio, de aproximadamente unos 80-90
aminoácidos que contienen una cisteína conservada que mantiene la enzima en
estado latente, 3. el domino catalítico, que consta de unos 160-170 aminoácidos
contiene el sito activo altamente conservado donde se encuentran las tres histidinas
que se unen al zinc catalítico [4-5] y 4. un dominio tipo hemopexina de
aproximadamente unos 200 residuos, presente en todas las MMPs, excepto en
MMP7, MMP26 y MMP23, presentan. Este dominio cuando está presente, ejerce
21
influencia sobre la unión a inhibidores (TIMP), a ciertos sustratos y a algunas
actividades proteolíticas [8].
Hay otros subgrupos de las MMPs que poseen otros dominios adicionales
específicos, como son las gelatinasas MMP2 y MMP9 que se diferencian de las
otras MMPs porque tienen tres dominios fibronectina (FN) tipo II dentro del extremo
amino-terminal [9]. Otras MMPs tales como las MMP14, 15, 16 y 24 tienen un
dominio transmembrana seguido de una corta cola citoplásmica de 20 aminoácidos
en el extremo carboxilo-terminal. Adicionalmente, MMP17 y MMP25 poseen una
región hidrofóbica [10-11].
Las MMPs tienen como substrato a las proteínas de la matriz extracelular (MEC) y
su actividad es regulada por inhibidores endógenos. El adecuado balance entre
ambas moléculas es fundamental para mantener la homeostasis. Debido al papel
que desempeñan en diferentes tipos de patologías [10].
2.1. INHIBICIÓN DE LAS METALOPROTEINASAS
Las MMPs son consideradas blancos para el desarrollo de estrategias terapéuticas.
Los avances en el conocimiento de sus mecanismos de activación, la especificidad
de sustratos y los mecanismos de inhibición por los inhibidores tisulares (TIMP) de
estas enzimas, han permitido el diseño de inhibidores sintéticos. La actividad de las
MMPs se bloquea por inhibidores generales, como la macroglobulina α2, presentes
en plasma y fluidos tisulares como el fluido sinovial, la trombospondina-1 y la
trombospondina-2 y por inhibidores más específicos, como los TIMPs 1-4 [12].
Hasta el momento se han podido identificar cuatro TIMP humanos, TIMP 1, 2, 3 y
4, los cuales están anclados en la MEC o son secretados en el espacio extracelular.
Los TIMPS coordinan el sitio catalitico a Zn2+ y se enlazan al sitio activo de MMPs
de modo similar que el sustrato. Los TIMPs son proteínas secretadas que pueden
22
ser encontradas en la superficie celular en asociación con las proteinas de
membrana. Todos los cuatro tipos inhiben todas las formas activas de las MMPs
estudiadas hasta el momento [12-13].
Los 4 tipos de TIMPs poseen muchas similaridades básicas, pero poseen
características moleculares, bioquímicas y patrones de expresión bastantes
diferentes. Esto podría significar que cada uno de ellos tiene un rol específico. Los
TIMPs tienen pesos moleculares de ~21 kDa y son variablemente glucosilados,
poseen 6 puentes disulfuros y tres bucles en los dominios N-terminales e
interaccionan con tres bucles C subterminal. Muchas de las funciones biológicas
de estas proteínas son atribuibles a la secuencias del dominio N-terminal, aunque
el dominio subterminal media las interacciones con los dominios catalíticos de
MMPs y los dominios hemopexinas de MMP2 y MMP9 [13].
2.1.1. Otros inhibidores endógenos de las MMPs
Se conoce de la existencia de varios tipos de proteínas endógenas que también son
inhibidoras de las MMPs, y algunas de ellas contienen dominios que son homólogos
a los dominios inhibidores de TIMP. RECK (proteína rica en cisteína, que induce la
reversión con motivos Kazal), es un inhibidor de las MMPs de la superficie celular y
un regulador clave de la integridad de la MEC y de la angiogénesis [14-15]. Este es
también el caso del TFPI2 (tissue factor pathway-inhibitor-2), una serina proteasa
que puede funcionar como inhibidora de las MMPs. Otro inhibidor es el C-terminal
del procolágeno intensificador (PCPE), que libera un fragmento C-terminal similar al
dominio inhibidor de los TIMP, el cual posee actividad inhibidora de las MMPs [12].
De igual manera los inhibidores crípticos de las MMPs pueden estar escondidos en
los dominios NC1 (canstatina) del colágeno tipo IV o en el dominio de unión a la
laminina de la agrina, los cuales son similares en su estructura a los TIMP. Otra
modificación por especies reactivas de oxigeno e internalización han sido
demostradas para silenciar la actividad de MMPs [16].
23
Dada la selectividad y efectividad de los TIMPs para bloquear la actividad catalítica
de las MMPs, se han utilizado como inhibidores de la migración tumoral [11].
Actualmente se están desarrollando nuevos inhibidores sintéticos basados en
mimetizar el sitio catalítico de la MMP. Este es el caso de los inhibidores comerciales
Batimastat (BB-94) o Marimastat (BB-2516) [17]. Además, existen otros compuestos
no peptídicos, capaces de inhibir la actividad de las MMPs, como son los derivados
de tetraciclinas, bifosfonatos, o un componente del té verde que se encuentra
actualmente en fase III de estudios clínicos. Sin embargo, los resultados obtenidos
con estos inhibidores no han tenido la eficacia esperada [18].
2.1.2. Metaloproteínasa 9
Hablando ya específicamente sobre la MMP9 (gelatinasa B), esta es expresada
constitutivamente por muchos tipos celulares incluyendo fibroblastos, keratinocitos,
células endoteliales, condrocitos, monocitos, macrófagos alveolares, leucocitos
polimorfonucleares y osteoclastos. Existe como un zimógeno inactivo con dominio
propeptido, el cual es removido para ser activada. Posee un dominio de fibronectina
localizado dentro del sitio catalítico, el cual permite la unión y procesamiento del
colágeno desnaturalizado o gelatina, sugiriendo su papel en la remodelación del
colágeno. Esta gelatinasa degrada un amplio espectro de moléculas tales como
colagenos tipo I, IV, V, VII, X, IX, elastina, fibronectina, agrecano, vitronectina,
laminina pero también moléculas que no pertenecen a la MEC incluyendo el pro
factor de necrosis tumoral (FNT-α), factor de crecimiento transformante (TGF)-β,
pro-IL-1β, pro-IL-8 y proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-3 [5].
2.1.3. Desarrollo de TIMPs como moléculas terapéuticas
Aunque está claro que TIMPs son proteínas multifuncionales que poseen las dos
actividades, tanto las actividades inhibidoras y otras funciones diferentes, sus
atributos pueden ser explotadas en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas.
La tendencia actual de tratar de retomar el equilibrio MMP/TIMP para bloquear o
revertir la progresión de la enfermedad se debe ya sea la inhibición de la actividad
de MMP por fármacos de molécula pequeña o el aumento de la concentración local
24
de TIMPs por administración de una proteína recombinante o la transferencia de
genes. La mayoría de los ensayos clínicos con inhibidores de MMP sintéticos (MPI)
han resultado decepcionantes, debido principalmente a la falta de eficacia y los
efectos secundarios adversos. Sin embargo, en modelos animales los inhibidores
de MMPs han sido más eficaces en la prevención del crecimiento y la
vascularización de los tumores pre-malignos y son relativamente ineficaces contra
la enfermedad avanzada [19].
Por lo tanto, su pobre desempeño, en retrospectiva, es sorprendente dado el diseño
de los ensayos que se han realizado hasta la fecha [20-21], muchos de los cuales
involucró el uso de inhibidores de MMPs como terapias con un solo agente para
pacientes con enfermedad avanzada. Recientemente, sin embargo, los beneficios
de supervivencia se están detectando en algunos ensayos, incluyendo un estudio
de fase II de marimastat en el cáncer de páncreas avanzado [22]. Esto sugiere que,
cuanto más sabremos sobre las funciones precisas de estos compuestos, pueden
ser de mayor valor clínico. A pesar de los contratiempos el principio básico de la
inhibición terapéutica de MMPs se mantiene intacto y se aplica a diversas
enfermedades, incluyendo las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. Aunque
la evidencia reciente en los estudios preclínicos sugieren que la terapia basada en
genes usando TIMPs pueden tener un amplio potencial clínico, el diseño racional y
la evaluación de inhibidores sintéticos más selectivos pueden ser una vía a terapias
más eficaces.
Dada la gran importancia que tiene en múltiples funciones en el cuerpo humano las
metaloproteinasas de matriz (MMPs) en esta tesis doctoral se estudiaron inhibidores
de MMP9, derivados de un conjunto de moléculas del tipo Nbiaril éter
sulfonamida hidroxamato, como blanco terapéuticos con potente actividad
inhibidora.
25
2.2. SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA-ALDOSTERONA
(RAAS)
El sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) es un regulador clave
homeostático de función vascular, pero también parece tener un rol importante en
la homeostasis metabólica y el desarrollo de la diabetes según lo que se conoce de
su campo de acción hasta el día de hoy [23]. El efector primario de RAAS es el
octapeptido AngiotensinaII (AngII), que regula los niveles circulantes y tisulares los
cuales son influenciados por la proporción síntesis y degradación. La enzima
convertidora de angiotensina (ACE) es la principal enzima que sintetiza AngII [29-
30]. El sistema RAS posee dos vías ACE/AT1/Ang II y ACE2/Mas/Ang-(1- 7). ACE1
y ACE2 son responsables de la regulación de los niveles y actividad de AngII.
La enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), fue identificada solamente en el
año 2.000 [24], y se le atribuyen efectos directos sobre la función cardiaca, tales
como su papel regulador esencial en el desarrollo del corazón y un efecto protector
del sistema cardiovascular. El descubrimiento de ACE2 ha sido considerado ser la
principal alternativa del sistema RAS [25-26]. ACE2 ha sido identificada en varios
tejidos: vasos sanguíneos [27-28], corazón [25, 30-31], riñón [32-34], hígado [35],
páncreas, cerebro [36], músculo esquelético y testículos.
ACE2 es desde el punto de vista químico una carboxipeptidasa que tiene como
función convertir la angiotensina I a angiotensina 1-9, debido a la pérdida de un
aminoácido, dando lugar a un peptido de función desconocida. A su vez ACE le
hace perder otro aminoácido y convierte a la angiotensina II en angiotensina 1-7 con
efecto vasodilatador. Esta habilidad de ACE2 limita la activación patofisiologica de
RAS e identifica su potencial de blanco terapéutico para el tratamiento de las
enfermedades cardiovasculares.
26
ACE2 es una proteína de membrana tipo 1 con dominio catalítico sobre la superficie
extracelular, codificada por el gene ACE2 localizado en el cromosoma Xp22 [25-26].
La secuencia de aminoácidos de ACE2 posee aproximadamente un 40% de
homología con el dominio catalítico N-terminal de ACE y una región hidrofóbica
cercana al C-terminal que funciona como un anclaje de membrana.
ACE2 es una monocarboxipeptidasa, que in vitro puede catalizar el clivaje del
residuo C-terminal de los péptidos Ang I, desArg-bradykinina, neurotensina 1–13, y
kinetensina [25], como bien catalizar la hidrólisis del residuo C-terminal de Ang II
[26]. ACE2 puede hidrolizar apelina- 13 y dinorfina A 1–13 con alta actividad [37],
pero es más importante el efecto biológico de degradar Ang II a Ang 1-7, que lo
hace con una eficiencia catalítica 400 veces mayor que con Ang II como un sustrato
que con Ang I.
De este modo, ACE2 puede limitar la acción vasoconstrictora de Ang II a través de
su degradación, así como contrarrestar las acciones de Ang II a través de la
formación de Ang 1-7 que se reporta que tiene acciones vasodilatadoras y anti-
fibróticas [38], en la Ang 1-7 o el receptor Mas [39] Ang 1-7 tiene otras acciones de
relevancia cardiovascular incluyendo natriuresis, diuresis, la inhibición del
crecimiento celular y efectos antiateroscleróticos [40].
Esta enzima es considerada un importante regulador de la función del corazón, pero
otras de sus funciones involucra su papel como receptor funcional de la
glucoproteina de ambos coronavirus, en el caso de infecciones por coronavirus
humanos SARS y HCoV-NL63.
Entre las otras funciones de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), se
ha demostrado tanto in vitro como in vivo que esta es un receptor funcional para
SARS-CoV [48-49], por unión al dominio de enlace al receptor (RBD, aminoácidos
319–510) de la proteína S [41-42]. Adicionalmente, existen 23 sitios potenciales de
27
N glucosilación en la proteínas S del SARS-CoV [45], y dos más en el RBD.
Usualmente la unión del ligando induce la endocitosis del receptor, varios estudios
demuestran que el enlace de la proteína S a la ACE2 endógena resulta en una baja
regulación de la expresión de ACE2 en la superficie, implicando una internalización
de ACE2 [42].
REGULACION DE LA EXPRESIÓN DE ACE2 SOBRE LA SUPERFICIE
CELULAR
Los niveles y funciones de las proteínas de superficie celular pueden ser controladas
en varias vías, incluyendo la modulación de expresión de genes, la secreción de la
proteína desde la superficie celular, la internalización y el agrupamiento en
microdominios lipídicos dentro de la membrana plasmática.
Muchas proteínas de membrana, particularmente las transmembranales tipo I, son
sometidas a un evento de secreción mediante clivaje proteolitico, comunmente
conocido como “shedding” en el cual el ectodominio de la proteína es clivado por
una proteinasa, a menudo una metaloproteinasa de matriz MMP o una desintegrina
o una metaloproteinasa de la familia (ADAM) y luego es liberada dentro del espacio
extracelular [46]. En este proceso tal vez es liberado un ligando, permitiendo que
estos se unan al receptor (ejemplo, citoquinas tales como TNFα) o simplemente
para regular los niveles bajos o la actividad de una proteína sobre la superficie
celular. ACE2 (junto con su homologo ACE) está sujeto a un evento de ectodomino
“shedding”, liberando un ectodominio cataliticamente activo, regulado por la
activación de proteincinasa C e involucra un miembro de la familia ADAM, TACE
(enzima convertidora de TNFα) [47-48]. Aunque la significancia fisiológica del
mecanismo de liberación no está claro, el incremento de niveles de ACE2
circulantes detectados en la enfermedad cardiovascular [49] y su habilidad de
clivaje de ACE2 (soluble) para reducir la infectividad del SARS-CoV, esta bien
determinada [42]. Sin embargo, la baja regulación de TACE mediada por los RNAi
reduce la habilidad del SARS para infectar células Huh7 (línea celular del hepatoma
28
humano) [50], sugiriendo que el rol del evento de “shedding” de ACE2 en la infección
del SARS es realmente más complejo de lo que parece.
Comúnmente, las regiones transmembranales de las proteínas son sujetas a fuerte
clivaje intramembrana, generando un fragmento corto carboxi terminal, por ejemplo
mediante un proceso determinado regulado de proteolisis intramembrana (RIP) [51].
Este mecanismo llamado “Shedding” se ha demostrado para un gran número de
proteínas, principalmente la proteina Notch y para proteinas precursora en
Alzheimer´s (APP), pero también para el homologo de ACE2, ACE [52], que el
fragmento carboxilo terminal es hábil para iniciar eventos de señalización
produciendo cambios en la expresión de genes blancos. Tales mecanismos de
señalización ocurren seguidos del mecanismo de liberación de ectodominios de los
remanentes de ACE2. El dominio citoplásmatico de ACE2 es conocido sin embargo,
por tener un rol regulatorio, ambos en términos de liberación de los ectodominios
[48], y grado de infección por SARs [50]. La asociación de la cola citoplásmatica con
proteínas de ubiquitinación de unión a calcio, como calmodulina, reduce la liberación
de este ectodominio sugiriendo el rol de la calmodulina en la regulación de la
expresión de ACE2 sobre la superficie celular. El rol del dominio citoplásmatico
sobre la infección de SARS es controversial [50], se ha reportado recientemente
que la entrada de SARS-CoV es dependiente de la presencia del dominio
citoplásmatico de ACE2, este descubrimiento contrasta directamente con [53-54],
quienes sugieren que la entrada no es dependiente de la presencia de este dominio.
Estas diferencias permanecen sin resolver pero se deben a diferencias en los
sistemas experimentales usados.
ACE2, es un estrecho homólogo de ACE, reduce la generación de Ang II catalizando
la conversión de Ang I en Ang1-9 y facilitar la hidrólisis de Ang II a Ang1-7. Ang1-7
ha sido reconocido como un inhibidor potencial endógeno de la cascada clásica de
RAS. Por lo tanto, el eje ACE2-Ang1-7 puede ser un importante modulador negativo
de la bioactividad de Ang II, contrarrestando los efectos de ACE en los niveles
29
tisulares de Ang II. La elevación anormal de ACE combinada con una disminución
de la expresión de ACE2 puede estar implicada en procesos fibróticos in vitro e in
vivo, y el mecanismo puede implicar la expresión y la activación de MMPs
específicas [8]. Recientemente, varios estudios han notificado niveles de MMPs
elevados, especialmente de MMP-2 y MMP-9, y la asociación entre estas MMPs y
el desarrollo de patogenesis de exudados pleurales, no obstante, consideran la
proporción ACE/ACE2 combinada con la actividad de MMP9 como un biomarcador
potencial para el diagnostico de tuberculosis pleural [55]. En otros casos, como la
inflamación cardiovascular y daño al miocardio, se sugiere el papel critico de bajos
niveles de ACE2 como aceleradores del daño y su sobreexpresión como acción
preventiva mediada por Ang II, asociado a bajos niveles de MMP2 [3,8, 11].
Kuan et al., 2013 [56], han descrito las relaciones entre AngII, ACE2 y MMP2. En
este estudio fue demostrado que ACE2 incrementa la actividad de MMP2 y Ang II
inhibe este efecto através de la via de señalización del receptor tipo 1 (AT1R) y
ERK1/2. Ang II también reduce el efecto de ACE2 sobre los niveles de ERK1/2, la
actividad de ACE2, y la expresión de adam17 en HCFs. Adicionalmente, estas
reducciones mediadas por Ang II podrían ser atenuadas por antagonistas AT1R
como el medicamento valsartan. En conclusión, estos resultados ayudan a aclarar
como ACE2 y Ang II interactuan para regular la expresión de MMP-2 y controlan la
remodelación de tejido en la enfermedad coronaria.
A partir de estos resultados podríamos inferir que la sobreexpresión significativa de
ACE2 puede atenuar procesos fibróticos, reduciendo los niveles de Ang II y
amplificando los de Ang 1-7, al mismo tiempo que inhibe la expresión del colágeno
y de ACE debida a una sobreexpresión de MMPs. Los datos reportados indican que
Ang II actua via AT1R para elevar la actividad de las MMP, y los antagonistas de
AT1R pueden inhibir la activación de MMPs. Por lo tanto, ACE2 regula la expresión
de MMPs, especialmente MMP2 y MMP9 para atenuar la patogénesis de
hipertensión, disfunción del corazón y fibrosis cardiaca.
30
La deficiencia de ACE2 produce un incremento de la fosforilación de las vías de
señalización de ERK1/2 y sobreregula la actividad MMP2. Sin embargo, la pérdida
de ACE2 también incrementa los niveles de AngII, lo cual podría amplificar la
degradación de la matriz extracelular mediada por la actividad de MMP2 y MAPKs.
Algunos autores indican que Ang II mediada por AT1R para inducir NADPH oxidasa
y la activación de MMP [57-58] Estos resultados demuestran que la sobreexpresión
de ACE2 regula el eje ACE/Ang II/AT1R y eje ACE2/Ang-(1-7)/Mas afectan la
sobreexpresión de citoquinas pro-inflammatorias, colageno, y MMPs. La deficiencia
de ACE2 produce un incremento de la fosforilación de las vías de señalización de
ERK1/2 y JNK1/2, sobre regulando MMP-2, MMP-9, y citoquinas. Sin embargo, la
perdida de ACE2 es también asociada con el incremento de los niveles de Ang II,
actividad NADPH oxidasa, y generación de superoxido que podría producir un
aumento de la degradación de la matrixextracelular mediada por MMP y deficiencia
de ACE2 en el miocardio, incrementando la hipertrofia patológica y el rendimiento
sistólico [59]. De hecho, la ACE2 puede actuar via NADPH oxidasa y citoquinas
inflamatorias para regular la expresión de MMP-2.
INHIBIDORES DE ACE2
Una de las diferencias entre las enzimas ACE y ACE2, es la especificidad del
inhibidor. ACE2 no es inhibida por inhibidores clásicos de ACE (enalapril, lisinopril,
captopril), lo cual puede deberse a que ACE es un peptidil-dipeptidasa y ACE2 es
una carboxipeptidasa [25-26].
Los dos inhibidores de ACE2 comúnmente utilizados son MLN-4760 [58] y DX600
de los cuales sólo el último es comercialmente disponible. DX600 fue originalmente
identificado sobre la base de su habilidad para inhibir ACE2 purificada. Este peptido
posee 26 aminoácidos, contiene dos residuos de cisteinas libres que tienen a
polimerizarse, esta polimerización y su oxidación podrían afectar la unión e
31
inhibición a ACE2. Por tal razón, el fabricante recomienda su disolución el mismo
día de su uso [60].
ACE2 es considerada un importante blanco terapéutico para controlar la
enfermedad cardiovascular y el síndrome respiratorio agudo severo (SARS).
Recientemente, estructuras cristalinas resueltas por alta resolución de la unión de
ACE2 a su inhibidor, han brindado información sobre las bases moleculares
basados en ensayos de acoplamiento molecular para identificar inhibidores de
ACE2 y compuestos que bloqueen la fusión viral del coronavirus [62].
El coronavirus SARS CoV, la principal causa del SARS, realiza su entrada en las
células endoteliales pulmonares por la fusión de membranas en la unión a esta
ectoenzima. Esta interacción está mediada por el proteína Spike [63, 42], causando
la expresión de altos niveles de ACE2 en estas células [64]. Estas razones, han
incentivado el desarrollo de moduladores de ACE2 con la expectativa que en vivo
la activación de ACE2 llevaría a protección y al éxito del tratamiento para la
hipertensión y otras enfermedades cardiovasculares. En contraste, se espera que
los inhibidores de ACE2 bloqueen interacciones proteicas entre ACE2 y la proteina
S de SARS-CoV, e inhiban la infección por SARS-CoV. Además, se espera que los
inhibidores de ACE2 pudieran ser potencialmente importante en los mecanismos de
la hipertensión. A pesar de esta urgencia, sólo unos pocos estudios han intentado
desarrollar inhibidores potenciales y activadores de ACE2 [60-61, 65].
La estructura cristalina del el SARS-CoV en complejos con la ACE2 han revelado
en detalle las interaciones existentes entre el virus y el recpetor. El análisis de estas
interaciones no cubre aspectos importantes de los mecanismos de la invasion de
SARS-CoV. El origen y la severidad de la epidemia del SARS pueden servimos
como guia para estudios futuros. Esta aproximación fue usada para determinar la
estructura cristalina y podría extenderse a estudios con interacciones con otros virus
y sus receptores celulares. Nuestro objetivo en esta tesis fue determinar basado en
32
estudios de relación estructura actividad, identificar moléculas cabezas de series
(Leads) capaces de la inhibición de la actividad de ACE2 y bloqueando el SARS-
CoV basado en estructuras cristalinas ACE2.
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40
CAPITULO 3.
SCREENING VIRTUAL: UTILIZANDO EL ACOPLAMIENTO
MOLECULAR Y EL ANÁLISIS 3D-QSAR DE INHIBIDORES LAS
METALOPROTEINASAS DE MATRIZ
4.1 INTRODUCCIÓN
El término Metaloproteína se usa en forma general o genérica para referirse a una
proteína que contiene un ion metálico como cofactor. La presencia de un metal en
las metaloenzimas permite que estas lleven a cabo funciones tales como reacciones
del tipo redox que no pueden ser realizadas por el conjunto limitado de grupos
funcionales que se encuentran en los aminoácidos [1].
Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son una familia de proteínas
endopeptidasas dependientes de calcio que contienen zinc, responsables del
remodelado de tejidos y la degradación de la matriz extracelular (ECM), incluyendo
colágenos, elastina, gelatina, glicoproteínas de la matriz, y proteoglicanos [2,3]. Las
MMPs están implicadas en la maduración, reparación y la curación de la matriz,
junto con la proliferación celular y la movilidad. Las MMPs también juegan un papel
crítico en el desarrollo celular, la morfogénesis de tejidos, cicatrización de heridas y
la apoptosis [4,5]. Las MMPs han mostrado su participación en una gran variedad
de procesos fisiológicos y patológicos que requieren remodelación tisular:
enfermedades inflamatorias, la artritis reumatoide, la osteoartritis, la angiogénesis,
el crecimiento tumoral [6], la invasión tumoral, metástasis [7], esclerosis múltiple y
la enfermedad de Alzheimer [5-8]. Además, ha sidomuy bien documentado que
están implicadas en la enfermedad periodontal [2,9], en la destrucción de las
articulaciones [5], el lupus sistémico eritrematoso, la enfermedad poliquística renal,
el aneurisma de aorta abdominal, la angina inestable y el infarto agudo del miocardio
[8]. Por estas razones, el interés en el desarrollo de inhibidores de MMPs se ha
41
incrementado considerablemente en los últimos años debido a su uso potencial
como tratamiento para las patologías antes mencionadas.
La proteína objetivo en este estudio es la MMP9, que pertenece a la familia
gelatinasa. Esta proteína tiene un sustrato de preferencia de colágeno
desnaturalizado, colágenos tipos IV y V, elastina y gelatina tipo I [10]. La proenzima
de MMP9 tiene un peso molecular de 92 kDa, y después de la escisión, la MMP9
activa tiene 64-67 kDa [10]. MMP9 es una proteína homotetramerica que tiene un
centro catalítico, el cual contiene un ión de zinc responsable de la escisión. MMP-9
también contiene un bolsillo hidrofóbico llamado S1' que probablemente le
proporciona selectividad [11].
Hay muchas herramientas en la química computacional que se pueden aplicar en el
diseño de nuevas moléculas, tales como los métodos de acoplamiento molecular y
la relación cuantitativa estructura-actividad tridimensional (3D-QSAR). Los métodos
de acoplamiento han demostrado ser una herramienta computacional eficiente que
ayuda a diseñar estructuras con posibles aplicaciones médicas [5]. Las técnicas de
relación cuantitativa de estructura-actividad tridimensional (3D-QSAR), tales como
el análisis comparativo molecular (CoMFA) y el análisis comparativo de los índices
de similitud molecular (CoMSIA), han sido de mucha utilidad y han ayudado a
comprender la interacción receptor–fármaco [11,12].
En este estudio se usó un análisis de acoplamiento molecular (docking) y un análisis
cuantitativo de relación estructura actividad tridimensional (QSAR- 3D), utilizando
un conjunto de moléculas del tipo Nbiaril éter sulfonamida hidroxamato,
reportadas por Yang y colaboradores recientemente [3,14]. Estas moléculas
funcionan como inhibidores potenciales de MMPs. De hecho, este tipo de
inhibidores han demostrado excelentes actividades inhibidoras contra MMPs y
varios han sido considerados como potenciales candidatos a fármacos. A partir de
estas observaciones fue posible formular nuevos modelos de predicción derivados
42
a partir de los valores experimentales de actividad inhibidora in vitro IC50 y sus
descriptores obtenidos de programas CoMSIA y CoMFA [13].
4.2 DETALLES COMPUTACIONALES
4.2.1 Conjunto de datos
Las moléculas tomadas como objetivo de estudio fueron una serie de compuestos
de Nbiaril éter sulfonamida hidroxamato, específicamente los datos de la
actividad inhibidora in vitro (IC50, nmol/L). El conjunto consta de un total de 66
compuestos que se dividió en un conjunto de entrenamiento (54 compuestos) para
generar modelos 3D-QSAR (Tablas 1-7) y un conjunto de pruebas (12 compuestos)
para evaluar la capacidad predictiva de los modelos resultantes (Tablas 1-7). Los
compuestos del conjunto de prueba fueron seleccionados manualmente de tal forma
que en el conjunto de datos se incluya la diversidad estructural y una amplia gama
de actividad de los compuestos objetos de este estudio.
Las actividades inhibidoras de MMP9 fueron convertidas a valores correspondientes
de pIC50 (-log IC50) y se utilizaron como variables dependientes en el análisis CoMFA
y CoMSIA. El complejo con el código 1GKC fue tomado del depositado en la base
de datos Protein Data Bank (PDB) con una resolución de 2,3 Å, utilizado para
nuestro estudio de acoplamiento.
43
Tabla 1. Modelos 3D-QSAR (CoMSIA y CoMFA) para el conjunto de compuestos
relacionados.
CoMSIA CoMFA
Mol X Y R1 R2 R3 Actualb Pred δ Pred δ
8 O CH Me Me —- -0.82 -0.86 0.04 -0.698 -0.12
(R)-5aa O CH Me Me OH -1.08 -1.809 0.73 -1.688 -0.61
(S)-5a O CH Me Me OH -0.89 -1.635 0.74 -1.334 0.44
(R)-7 O CH Me Me OMe -0.89 -1.511 0.62 -1.056 0.16
(S)-7 O CH Me Me OMe -0.58 -1.114 0.53 -0.771 0.19
(S)-5b O CH Et Me OH -1.45 -1.722 0.27 -1.183 -0.26
(S)-5c O CH n-Pr Me OH -2.09 -1.989 -0.1 -1.753 -0.34
(S)-5d O CH i-Pr Me OH -2.46 -2.3 -0.16 -2.623 0.17
(S)-5e O CH Ph Me OH -2.54 -1.791 -0.75 -2.38 -0.16
(S)-5f O CH Bn Me OH -1.97 -1.898 -0.07 -1.78 -0.19
(S)-5g O CH (piridina-3il)CH2 Me OH -1.84 -1.968 0.13 -2.082 0.24
(S)-5ha O CH (piridina-3il)CH2 Me OH -1.73 -1.833 0.1 -1.564 -0.17
(S)-5i O CH N-Me2 Me OH -2.39 -2.095 -0.29 -2.362 -0.02
(S)-5j O CH Me H OH -1.59 -1.748 0.16 1.355 -0.24
(S)-5l O CH Me CF3 OH -1.15 -1.595 0.45 -1.244 0.1
(S)-5m O NMe CF3 OH -2.67 -2.145 -0.53 -2.49 -0.18
(S)-5n S CH Me Me OH -1.73 -1.664 -0.07 -1.417 -0.32
(S)-5o S CH Me F OH -2.02 -1.903 -0.11 -1.733 -0.28
aConjunto compuestos de prueba
44
Tabla 2. Modelos 3D-QSAR (CoMSIA y CoMFA) para el conjunto de
compuestos relacionados.
CoMSIA CoMFA
Molécula R2 Actual Pred Δ Pred δ
3a H -2.58 -2.155 -0.43 -2.44 -0.14
3b Me -1.49 -1.702 0.21 -1.806 0.32
Tabla 3. Modelos 3D-QSAR (CoMSIA y CoMFA) para el conjunto de
compuestos relacionados.
CoMSIA CoMFA
Molécula R2 Actual Pred Δ Pred δ
9ª Me -2.97 -2.334 -0.64 -3.005 0.03
9b i-Pr -2.38 -2.681 0.3 -2.157 -0.23
aConjunto compuestos de prueba
45
Tabla 4. Modelos 3D-QSAR (CoMSIA y CoMFA) para el conjunto de
compuestos relacionados.
CoMSIA CoMFA
Molécula R2 Actual Pred Δ Pred Δ
(S)13a 4-MePh -1.64 -1.867 0.22 -1.752 0.11
(S)13b 4-ClPh -1.67 -2.163 0.49 -2.136 0.46
(S)13c 4-MeoPh -1.96 -1.792 -0.17 -1.837 -0.12
aConjunto compuestos de prueba
Tabla 5. Modelos 3D-QSAR (CoMSIA y CoMFA) para el conjunto de
compuestos relacionados.
CoMSIA CoMFA
Molécula R2 Actual Pred δ Pred Δ
(S)14a 4-FPh -3.68 -3.173 -0.51 -3.511 0.17
(S)14b 4-ClPh -2.99 -3.046 0.05 2.89 -0.1
(S)14ca 4-CF3Ph -3.17 -2.994 -0.18 -2.745 -0.43
aConjunto compuestos de prueba
46
Tabla 6. Modelos 3D-QSAR (CoMSIA y CoMFA) para el conjunto de
compuestos relacionados.
CoMSIA CoMFA
Molécula R2 Actual Pred δ Pred Δ
(S)3a Me -0.89 -1.582 0.69 -1.432 0.54
(S)3b Cl -0.67 —- —- -1.56 0.89
(S)3ca CF3 -1.15 -2.103 0.96 -2.122 0.98
aConjunto compuestos de prueba.
Tabla 7. Estructura y actividades biológicas de las moléculas de estudio.
OHNH N N
S
O O
CH3
O
NR
2
R3
O
R1
47
CoMFA
Compuesto R1 R2NR3 IC50b IC50 Predicho δ
(S)-8aa CF3 i-Pr NH -0.38 -0.88 0.5
(R )-8b Me i-Pr NH -1.49 -1.147 -0.34
(S)-8b Me i-Pr NH 0.28 0.182 0.1
(S)-8c Me i-Bu NH -0.11 -0.029 -0.08
(S)-8d Me (ciclopentil)NH -0.23 -0.122 -0.11
(S)-8e Me (Piridin-4-il)CH2NH -0.25 -0.336 0.08
(S)-8f Me (Piridin-3-il)CH2NH -0.45 -0.376 -0.07
(S)-8g Me (Piridin-2-il)CH2NH -1.36 -1.131 -0.23
(S)-8h Me PhCH2NH -0.85 -0.471 -0.38
(S,R)-8i Me
-0.18 -0.23 0.05
(S,S)-8i Me 0.27 0.342 -0.07
(S)-8ja Me PhNH 0.28 -0.287 0.57
(S)-8k Me (4-F)PhNH -0.11 -0.146 0.03
(S)-8la Me (3-F)PhNH 0.05 -0.318 0.37
(S)-8m Me (3-Cl)PhNH -1.3 -1.098 -0.02
(S)-8na Me (3-MeO)PhNH 0.21 -0.409 0.62
(S)-8oa Me (Naftilen-2-il)NH -1.93 -1.536 -0.4
(S)-11 Me --------- -2.08 -2.149 0.07
(S)-12 Me ---------- -0.73 -0.777 0.05
NH
Me
Ph
R
NH
Me
Ph
S
48
(S)-8p CF3 i-Pr NMe -0.94 0.776 -0.17
(S)-8q CF3 i-Pr NCH2Ph -1.83 -1.835 0
(S)-8r CF3 i-Pr NCH2CH2NHCbz -1.46 -1.444 -0.02
(S)-8s CF3
-0.46 -0.366 -0.1
(S,cis)-8t CF3 -0.04 -0.274 0.23
(S)-8u CF3 -0.5 -0.477 -0.03
(S)-8v CF3 -0.68 -0.534 -0.15
(S)-8wa CF3
-0.23 -0.568 0.34
(S)-8x CF3
-0.36 -0.207 -0.15
(S)-8y CF3
-0.28 -0.191 -0.09
(S)-8za CF3 -0.4 -0.273 -0.13
(S)-8aa CF3 -1.23 -1.459 0.23
(S)-8bb CF3 -2.41 -2.503 0.09
ON
ON
NN S
OO
NN
O
SNO
O
N
N OH
N
O
NHMe
N
NN Cl
49
(S)-8cca Cl
-0.3 0.403 0.1
(S,cis)-8dd Cl
0.34 0.106 0.23
(S)-8ee Me
-0.28 -0.379 0.1
(S,cis)-8ff Me
0.17 0.018 0.15
aMoléculas del conjunto de prueba. bActividad biológica expresada como −𝑙𝑜𝑔𝐼𝐶50 contra la actividad de la MMP-9
4.3. MODELADO MOLECULAR
Todos los estudios de modelización molecular se realizaron utilizando el paquete
informático de modelado molecular SYBYL 7.0. Los estudios CoMFA y CoMSIA
requieren que las estructuras 3D de las moléculas a analizar estén alineados según
una plantilla con la conformación adecuada, suponiendo que es una conformación
bioactiva [8]. Sin embargo, debido al hecho de que no se conocían conformaciones
bioactivas de estos inhibidores, las conformaciones obtenidas de menor energía se
tomaron como base para el estudio del acoplamiento molecular y las estructuras de
mayor chemscore fueron utilizadas como estructuras iniciales para realizar los
cálculos 3D-QSAR.
Las minimizaciones de energía se realizaron con el campo de fuerza de Tripos[15]
y la carga Gasteiger-Marsili [16] con el método dependiente de la distancia
dieléctrica y el método del gradiente conjugado. La carga Gasteiger-Marsili, arrojó
resultados estadísticos similares comparables con los métodos más precisos y que
ON
ON
ON
ON
50
requieren mucho más tiempo desde el punto de vista computacional [17]. El criterio
de convergencia fue de 0,05 kcal/mol. Posteriormente, se obtuvo la conformación
de energía más baja encontrada para cada estructura de la optimización de
geometrías de estos compuestos utilizando el programa Gaussian 09 [18] con el
método de Hartree-Fock (HF) a nivel 3-21G* [19] que es adecuado para los fines
del presente estudio.
4.3.1. Alineamiento molecular
Uno de los más importantes parámetros ajustables en 3D-QSAR es el alineamiento
relativo de las moléculas de unas a otras que tienen conformación comparable y
una orientación similar en el espacio [12]. El componente más activo es la molécula
S,cis-8dd la cual fue utilizada como plantilla para la superposición, suponiendo que
su conformación representa la conformación más bioactiva del Nbiaril éter
sulfonamida hidroxamato a nivel de sitio activo de la enzima. Cada análogo se
mantuvo alineado a la plantilla de rotación y traslación para minimizar la raíz de la
desviación cuadrática media (RMSD) entre átomos en la plantilla y los átomos
correspondientes en el análogo mediante la opción ALIGN en la base de datos
SYBYL. El fragmento común aparece en la Tabla 1. Las estructuras utilizadas en la
alineación fueron las que obtuvieron las puntuaciones Chemscore más altas de
acoplamiento. Los compuestos alineados se muestran en la Figura 1.
51
Figura 1. Alineación relativa de todas las moléculas entre sí (Compuesto más activo
S,CIS-8dd se utilizó como una plantilla para superposición).
4.3.2. Modelos CoMFA y CoMSIA
Las moléculas del conjunto de datos de entrenamiento alineadas se colocaron en
una caja tridimensional de tal manera que todo el conjunto estuviese incluido en
ella. La energía de campos estéricos (potenciales de Lennard-Jones), y
electrostáticos (Potencial Coulombico) se calculó usando un carbono de prueba sp3.
La energía total fue truncada a ±30 kcal/mol, aplicando Tripos como campo de
fuerza.
Los campos CoMFA generados automáticamente fueron escalados
automaticamente por el método CoMFA-STD de SYBYL. Los indices de semejanza
(descriptores) se obtuvieron de acuerdo con Klebe et al, [20] usando una caja cúbica
como la que se utiliza en los cálculos CoMFA. Cinco campos de índice de similaridad
CoMSIA disponibles en el paquete informatico SYBYL (estérico, electrostático,
hidrofóbico, donador y aceptor de enlace de hidrógeno), fueron evaluados utilizando
el carbono de prueba. Se seleccionó el tipo gaussiano como dependiente de la
52
distancia entre el punto de la caja y cada átomo de la molécula, mientras que el
factor de atenuación α fue ajustado a 0.3.
4.4. ANÁLISIS DE MÍNIMOS CUADRADOS PARCIALES
(PLS)
El método de los mínimos cuadrados parciales (PLS) [21] implementado en el
módulo QSAR de SYBYL se utilizó para construir y validar los diferentes modelos.
Para la validación cruzada se usó un filtro de columna ajustado a 2.0 kcal/mol para
acelerar el análisis y reducir el ruido. Los descriptores CoMFA/CoMSIA sirven como
variables independientes y los valores pIC50 como la variable dependiente en el
análisis de regresión PLS.
Normalmente, la validación cruzada es usada para comprobar la predictividad del
modelo derivado. Los resultados del análisis corresponden a una ecuación de
regresión con muchos coeficientes. Para la validación cruzada [15,22], se empleó
el método LOO (por su sigla en inglés Leave One Out) en el que un compuesto es
eliminado del conjunto de datos y su actividad es predicha usando el modelo
derivado del resto de moléculas del conjunto. El número óptimo de componentes
(Nc) arrojado se usó para derivar el modelo no validado, obtener un R² convencional
no-validado (q2) y el más bajo error estándar de predicción (EEP). Para obtener
límites estadísticos confiables en el análisis, se aplicó un método de muestreo
(bootstraping) con 100 grupos.
4.5. ESTUDIOS DE ACOPLAMIENTO MOLECULAR
Los cálculos de acoplamiento molecular (Docking) son un poderoso método de
búsqueda computacional, utilizados para localizar las orientaciones de uniones más
apropiadas y las diferentes conformaciones de Nbiaril éter sulfonamida
hidroxamato que interactúan con MMP9. En este estudio se utilizó el programa de
acoplamiento molecular GOLD (versión 3.0), el cual tiene un algoritmo genético
53
(AG) para la búsqueda de las diferentes conformaciones acopladas [12]. Todos los
heteroátomos incluyendo cofactores, moléculas de agua y los ligandos fueron
retirados de la proteína, excepto el ion de zinc catalítico y tres moléculas de agua
localizadas en el sitio activo. Es importante decir que todos los ligandos se utilizaron
en su forma protonada con ZBG cargado negativamente (hidroxamato).
4.6. OPTIMIZACIÓN CON PRECURSORES LEAPFROG
LeapFrog (LF) es una herramienta de novo para diseñar una serie de potenciales
moléculas de ligandos activos incluso cuando la estructura del receptor es
desconocida [23]. Es utilizado para proponer nuevas moléculas al realizar cambios
pequeños y frecuentes sobre la estructura molecular base, haciendo una rápida
evaluación de la energía de enlace de las nuevas moléculas, y mantener o descartar
las variaciones basadas en los resultados a diferencia de otros métodos.
El cálculo de la energía de enlace en LeapFrog se realiza por tres componentes
principales a saber, entalpías estéricas, electrostáticas, y enlace de hidrógeno
implícitos del enlace ligando-cavidad utilizando el campo de fuerza de Tripos. Sin
embargo, LeapFrog, coordina al átomo ligandos que se han agrupado para
aumentar la velocidad y la energía de enlace de cada átomo-ligando es calculado
como si el átomo fuera situado realmente en el centro de un cubo que contiene ese
átomo. Una expresión lineal simple proporciona entonces la energía de interacción
entre el sitio activo y ese átomo ligando particular.
El algoritmo LeapFrog hace uso de los contornos CoMFA para la generación de su
cavidad para el diseño de nuevos compuestos. Hay dos maneras distintas para
realizar este proceso. Una es mediante el mapeo directo punto por punto de las
propiedades de una plantilla CoMFA a una cavidad intermedia de la plantilla de la
misma resolución, y la otra es por interpolación de los valores de la cavidad
intermedia de la plantilla, que son cercanos a los espacios de los valores de la
54
plantilla utilizada por LF. La cavidad así obtenida se utilizó para generar los puntos
del sitio. La carga de un sitio átomo es positiva, negativa o lipofílica. Su valor se
compara con 1.0. Si la carga de átomo es menor en magnitud que 1.0 el punto es
un sitio lipofilico; si es mayor de + 1.0, el punto de sitio busca un átomo negativo; y
si es inferior a 1,0, el punto de sitio busca un átomo positivo en el fragmento que se
aproxima [24].
Los resultados del análisis PLS descritos anteriormente en la región del contorno se
utilizaron para los cálculos de generación de cavidad en nuestro estudio. El modo
OPTIMIZE del LeapFrog fue usado para la optimización de los ligandos, 5.000
movimientos fueron realizados [21,25]. Las moléculas S8b, S8C, S8D, S8e, SR8i,
SS8i, S8j, S8k, S8l, S8n, S,cis-8T, S8w, S,cis-8DD, S,cis-8 fueron sometidas
utilizando el modo OPTIMIZAR por su mejor energía de enlace.
La Tabla 8 muestra la frecuencia de los movimientos. Además, se generó un grupo
de ligandos basados en el modelo CoMSIA, por cambios manuales de los grupos
en algunas de las moléculas más activas con el fin de encontrar posibles ligandos
más activos que los ligandos objeto de este estudio.
Tabla 8. Frecuencia de movimientos para la optimización de las estructuras
por LeagFrog.
Join Fuse New Fly Twist Refine Bridge Complement Save Weed Crossover Prune
6 1 0 1 1 4 0 0 2 2 1 0
4.7. CRIBADO VIRTUAL
Un buen candidato a fármaco debe tener un comportamiento farmacocinético
apropiado, además de su alta potencia. Por esta razón, en este estudio, hemos
hecho una proyección de tomar los ligandos generados por LeapFrog con la mejor
55
energía de enlace. Adicionalmente, llevamos a los ligandos generados en base al
modelo CoMSIA. Las herramientas utilizadas para la selección fueron el servidor
Molinspiration (www.molinspiration.com) y Q-ADME (www.qlead.com) para el
cálculo de los parámetros de las cinco reglas de Lipinski [23]. Molinspiration utiliza
la estadística bayesiana sofisticada para comparar las estructuras de los ligandos
representativos que trabajan en el sitio de destino en particular. Para las
propiedades toxicológicas se utilizó el software Q-tox, que forma parte del paquete
de demostración (Quantum farma-Quantum Pharmaceuticals). Por último, se
calcularon pKas para todos los ligandos que pasaron el excrutinio. Es importante
decir que este parámetro se calculó utilizando una versión de demostración de
ACDLabs (www.ilabs.com).
4.8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.8.1. Conformación de unión de 2-Amino-N-3,3-trimetil
butanamida
Con el fin de determinar la conformación de unión probable de estos 2-amino-N-3,3-
trimetilbutanamida, se utilizó el programa GOLD para acoplar todos los compuestos
en los sitios activos de la MMP9. La fiabilidad de acoplamiento fue validado usando
la estructura de rayos X conocida de MMP9 (1GKC) en un complejo con el ligando
molecular 2-amino-N-3,3-trimetilbutanamida. El ligando 2-amino-N-3,3-
trimetilbutanamida fue reacoplado al sitio de unión de MMP9 y la conformación
correspondiente a la más alta ChemScore fue seleccionada como la conformación
de unión más probable.
La RMSD entre las conformaciones de 2-amino-N-3-3-trimetilbutano cocristalizadas
y reacopladas fueron iguales a 0,82 Å, lo que sugiere una alta fiabilidad de
capacidad de acoplamiento de GOLD en la reproducción del modo de unión
experimentalmente observado para inhibidores de MMP9 y que el parámetro fijado
56
para la simulación GOLD era razonable para volver a producir la estructura de rayos
X.
4.8.2. Estudio de acoplamiento molecular
Todos los 69 inhibidores fueron acoplados en los puntos de unión de MMP9
utilizando GOLD. El programa GOLD fue capaz de encajar muy bien todos los
ligandos dentro de la enzima, y lo más importante que existe reproducibilidad en la
posición del grupo hidroxamato y la sulfonamida, y también en el grupo biaril éter.
Los gráficos de acoplamiento proporcionaron información adicional relativa a la
posición ordenada de las tres moléculas de agua e identificaron el átomo de zinc
catalítico que se coordina en el sitio activo (Figura 2).
Figura 2. Cocristalizado y reacoplado de 2-amino-N-3,3-trimetil butanamida en los
sitios activos de la MMP9.
Todos los 69 inhibidores adoptaron casi la misma posición que el ligando base, no
sólo en la interacción y la distancia del grupo hidroxamato con el ión zinc, sino
57
también los anillos aromáticos que se colocan dentro del bolsillo S1'. La Figura 3
(a), (b) y (c) representa el modelo de interacción del inhibidor acoplado S,cis-8dd, el
compuesto más activo entre todo el conjunto de datos, que se llevó a cabo en el
sitio activo de la MMP9. El Inhibidor de S,cis-8dd se une a los sitios activos y hace
varias interacciones con la enzima.
Como se muestra en la Figura 3a, el grupo hidroxamato de S,cis-8dd tiene una
distancia apropiada con relación al ion zinc, sólo existe una diferencia de unos pocos
angstrom con el ligando base (cocristalizado) y la geometría adecuada.
Figura 3a. Modelo de interacción del inhibidor acoplado S,CIS-8dd en el sitio activo
de la MMP9.
En la Figura 3b se representan los enlaces de hidrógeno entre los residuos que
forman parte del sitio de unión, entre los cuales tenemos los residuos de la enzima,
Pro421, Leu 188, Gly 186 y Tyr 423. Estas interacciones polares son muy similares
58
al ligando base 9, sólo es diferente en el grupo que interactúa con residuos de Leu
188, ya que en el ligando acoplado es el grupo sulfonamida y en el ligando base la
interacción. En este punto es crucial la geometría que adopta el zinc en el complejo
y la distancia de interacción con el ligando.
Figura 3b. Modelo de interacción del inhibidor acoplado S,CIS-8dd en el sitio activo
de la MMP-9.
Por último, la Figura 3c representa el bolsillo S1', que alberga el grupo Nbiaril
éter sulfonamida hidroxamato. Es posible observar claramente cómo el anillo final
está muy cerca de los residuos Tyr423, y Ala y Val, lo que confirma la naturaleza
hidrófoba del bolsillo. Esto se esperaba debido a la naturaleza de los anillos
aromáticos. Todas las interacciones hidrofóbicas que se han explicado
anteriormente, son muy importantes para la actividad y selectividad de los
inhibidores [2,24].
59
Figura 3c. Modelo de interacción del inhibidor acoplado S,CIS-8dd en el sitio activo
de la MMP-9.
4.8.3 Análisis CoMFA y CoMSIA
Fueron utilizadas las técnicas CoMFA y CoMSIA para derivar modelos 3D-QSAR
en la serie de compuestos Nbiaril éter sulfonamida hidroxamato que actúan
como inhibidores de MMP9. Los confórmeros de más alto score obtenidos del
docking molecular proteína-ligando por medio del programa ChemScore fueron
usados para este estudio en esta tesis. También todos los compuestos fueron
alineados por el método de alineación en DATABASE.Con el fin de obtener el
modelo de CoMSIA fueron utilizadas 54 y 12 moléculas entrenamiento y de prueba,
respectivamente. Las moléculas R8ee, S3C y S5K fueron retiradas del modelo,
porque tenían altos valores residuales (outliers). La razón de este hecho es que
estas moléculas tienen una estructura y configuración diferente. El poder predictivo
de los modelos 3D-QSAR fue obtenido utilizando el conjunto de entrenamiento.
60
Además, se evaluó mediante las actividades biológicas predichas de las moléculas
de prueba.
La contribución de los campos estéricos y electrostáticos de CoMFA (Tabla 9) arrojó
una validación cruzada de valores q2=0,501 con cuatro componentes, una
validación no cruzada de valor R2=0,938, F=189.431 y un análisis de muestreo
(bootstrapped) R2=0,959. La contribución de los campos estéricos y electrostáticos
fue de 55,2% y 44,8%, respectivamente. Los contornos CoMFA se generaron
utilizando este modelo. Las gráficas de las actividades predichas y reales para los
conjuntos de moléculas se representan en la Figura 4.
Figura 4. Actividades reales vs predichas para el conjunto de moléculas de
entrenamiento y de prueba con campo CoMFA.
-4,00
-3,00
-2,00
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
-4 -3,5 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
pIC
50P
RED
ICD
ICH
A
pIC50 REAL
61
Tabla 9. Contribución de los campos estérico y electrostático CoMFA, y campos
hidrofóbicos CoMSIA.
Parámetros CoMFA CoMSIA
Estadísticos PLS
Validación cruzada (LOO)q2(Coeficiente de correlación CV). 0.501 0.528
N (Números de componentes). 4 3
EEP (Error estándar de predicción). 0.710 0.688
Validación no cruzadar2(Coeficiente de correlación). 0.938 0.852
EEE (Error de estándar estimado) 0.25 0.385
F(Radio F) 189.431 96.150
Contribución de campo(%)
Estérico 55.2 29.2
Electrostático 44.8 36.4
Hidrofóbico 34.4
Los contornos generados por el modelo CoMFA fueron muy similares a CoMSIA,
por lo tanto serán explicados en el modelo de análisis CoMSIA. La contribución de
los campos estérico, electrostático e hidrofóbico CoMSIA (Tabla 9) produjeron una
validación cruzada q2=0,528 con tres componentes, y una validación no cruzada de
R2=0.852, F=96,15 y un valor de muestreo de 0.909. La contribución de los campos
estérico, electrostático e hidrofóbico fueron 29.2%, 36.4% y 34.4% respectivamente.
Los contornos CoMFA se generaron utilizando este modelo. Las gráficas de las
actividades predichas y reales para los conjuntos de moléculas se representan en
la Figura 5.
62
Figura 5. Actividades reales vs predichas para el conjunto de moléculas de
entrenamiento y de prueba con campo CoMSIA.
Los contornos estérico, electrostáticos e hidrofóbicos CoMSIA se muestran en la
Figura 6a, 6b y 6c. Las interacciones estéricas están representados por los
contornos verdes y amarillos; los contornos verdes indican regiones donde los
grupos voluminosos aumentan la actividad, mientras contornos amarillos indican las
regiones donde grupos voluminosos disminuyen la actividad.
Las interacciones electrostáticas se muestran en los contornos azules y rojos; los
contornos azules indican regiones donde los grupos electropositivos aumentan la
actividad, mientras que los contornos rojos indican regiones donde los grupos
electronegativos aumentan la actividad. Por otro lado, los mapas de contorno
hidrófobos están representados por los poliédros amarillos que indican las regiones
donde los sustituyentes hidrófobos son favorecídos y los poliédros blancos, indican
las regiones desfavorecidas.
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
-4 -3 -2 -1 0 1
pIC
50
PR
EDIC
HA
pIC50 REAL
-2,58
-1,49
-2,97
-2,38
-1,64
-1,67
-1,96
-3,68
-2,99
-3,17
-0,82
-1,08
-0,89
63
La Figura 6a representa campos estéricos de CoMSIA, que muestran los dos
contornos verdes prominentes que implican el anillo aromático final y el ciclo de 4-
oxapiperidina en la configuración S. Los compuestos con sustituyentes voluminosos
apropiados en carbono alfa mantienen la alta actividad inhibidora de MMP9, como
Scis8ff, S, cis8t, S8n, S8j, y SS8i. Sin embargo, es necesario hacer hincapié en que
no cualquier sustituyente voluminoso puede mejorar la actividad inhibidora, como
es el caso de los compuestos S8aa y S8bb. El compuesto heterocíclico S8bb no
encaja en la región poliédrica favorecida, por el contrario es atravesado por la región
poliédrica desfavorecida lo que nos hace pensar que el bolsillo S1 'de la MMP9 no
permite sustituyentes más largos.
Figura 6a. Contornos estérico, electrostáticos e hidrófobos CoMSIA.
La estereoquímica en el carbono alfa es otro aspecto importante para la actividad
de estos tipos de compuestos. Podemos ver por ejemplo compuestos como S8b
con una alta actividad (0,52 nM) y su estereoisómero (R8b) cuya actividad es
aproximadamente 60 veces menor (30, 90 nM).
64
Otro par de compuestos que también pertenece a este caso son S5ad/R5ad (0,5
veces) y S7d/R7d (3 veces); Sin embargo, en los compuestos S8ee y R8ee el
cambio es dramático, porque la actividad disminuye aproximadamente 150 veces.
En relación a los sustituyentes de sulfonamida es claramente visible que existe una
relación inversa entre el volumen y la actividad inhibidora. De esta manera,
cambiando el tamaño de metilo ((S) -5a) a etil ((S)-5b), n-propilo ((S) -5c), isopropilo
((S)-5d), NMe2 ((S)-5i), y fenilo ((S)-5e), hay notable disminución de actividad.
Con respecto a la sustitución del éter biaril, podemos observar el acoplamiento de
los compuestos S,cis-8dd y S, cis-8ss. En este par de compuestos, a pesar de
haberse sustituido con diferentes propiedades fisicoquímicas, Cl (S,cis-8dd) y Me
(S,cis-8ss), muestran actividad inhibitoria similar.
Por esta razón, podemos inferir que el descriptor, que explica la actividad a este
nivel, es estérico. Esto se confirma con S8s, S8ee, S8cc, Scis8t, que sustituyó, CF3,
presenta menos actividad que Cl o metilo sustituido.
Ahora bien, en el análisis de los campos electrostáticos CoMSIA (Figura 6b), hay
una región poliédrica azul sobre el anillo 4-oxa-piperidina en S,cis-8dd; a pesar de
esto, este compuesto mantiene una buena actividad. Este hecho podría ser el
resultado de las interacciones estéricas apropiadas proporcionada por el anillo
anteriormente mencionado. Los compuestos S8s, S,cis8t, S8x, tienen estas
características. Los compuestos S8s y S8x sólo difieren en el anillo aromático. S8s
(2,9 nM) tiene un anillo-oxa piperidina mientras S8x (2,3 nM) tiene una piperidina.
En el caso del compuesto S8s, que es uno de los compuestos menos activos de
este conjunto. Esta baja actividad puede ser a su electrostática desfavorecida
circundante alrededor del anillo heterocíclico. Tal vez el átomo de oxígeno está
disminuyendo la actividad de este compuesto. Sin embargo, si comparamos las
moléculas S8s y S,cis8t, está última molécula tiene un grupo en cada uno de los
átomos de carbono cerca de oxígeno (Tabla 1).
65
La actividad de esta molécula es 2,8 veces mayor que S8s y 2,1 más que S8x. Por
lo tanto, a pesar de que el campo electrostático CoMSIA muestra un contorno
desfavorecido en S, cis8t, con un sustituyente voluminoso apropiado sustituyendo
el carbono alfa, suministrado mayor actividad. Todos estos resultados confirman el
papel de la estereoquímica del carbono alfa, cerca al grupo hidroxamato.
Figura 6b. Contornos estérico,electrostáticos e hidrófobos CoMSIA.
Por último, los campos hidrofóbicos CoMSIA muestran un contorno con forma de
gancho, colocado en el grupo biaril éter. La naturaleza de este grupo permite las
interacciones hidrofóbicas, que explica, la disminución de la actividad cuando los
anillos son muy distantes o demasiado cerca y cuando existe un grupo rígido entre
ellos. Esto confirma que el bolsillo S1' de la MMP9 requiere una conformación
especial de la molécula.
Un caso especial son las moléculas S13, a, b y c. Estas moléculas tienen un grupo
acetileno conectados a ambos anillos. Este hecho da una gran rigidez al sustituirlo
y causa una conformación indeseable dando como consecuencia una disminución
66
de la actividad de estas moléculas. Obviamente, hay un contorno desfavorable que
rodea los anillos en estas moléculas.
Figura 6c. Contornos estérico, electrostáticos e hidrófobos CoMSIA.
Del mismo modo, las moléculas S14, a y b, muestran una disminución brusca de la
actividad que se atribuyó a un átomo de carbono adicional a la conexión de los
anillos. Este hecho causa un aumento de la flexibilidad en el grupo biaril éter,
cambiando la conformación de estas moléculas. En este caso también se observa
que los anillos están alrededor de un contorno voluminoso desfavorecido.
4.8.4 Optimización de Precursores con LeapFrog
Los resultados del análisis PLS descritos anteriormente en CoMFA junto con los
archivos de las regiones fueron usados para el diseño. Fueron escogidas como
moléculas de inicio de Leapfrog las 14 más activas reportadas por Yang, et al., 2008,
las cuales fueron: s8b, s8c, s8d, s8e, sr8i, s8j, s8k, s8l, s8n, scis-8t, s8w, scis-8dd,
scis-8ff.
67
Los ligandos fueron optimizados por el programa de manera automática, en el cual
a través del movimiento JOIN eran cambiados los sustituyentes y a través de los
movimientos SAVE y WEED eran guardadas o eliminadas respectivamente, según
tuvieran bajas o altas energías. Las moléculas escogidas fueron las primeras 5 cuya
energía de enlace fuera mejor a la estructura de referencia. Subsiguientemente,
fueron extraídas y sometidasa todo el proceso descrito anteriormente en la
metodología. El modelo utilizado para la predicción de estas nuevas moléculas fue
el modelo CoMSIA ya que con este se obtuvo un mayor q² y además dicho modelo
al poseer un mayor número de descriptores puede explicar de una mejor manera la
actividad.
4.8.5 Cribado virtual
4.8.5.1 Predicción de la propiedades farmacocinéticas (regla de los
cinco Lipinsky’s)
Para la cribado virtual, se tomaron las cinco moléculas con mejor energía de enlaces
obtenidas por LeapFrog. Esas 70 estructuras fueron optimizadas usando el método
de Hartree-Fock nivel 3-21G*. También hemos tomado el grupo de moléculas
obtenidas mediante el modelo CoMSIA.Por lo tanto, comenzamos nuestra
proyección con 64 moléculas.
El primer paso fue la predicción de las propiedades farmacocinéticas con el servidor
gratuito MOLISPIRATION [26]. Los descriptores calculados fueron: el coeficiente
de partición (miLogP), el peso molecular (MW), el número de átomos, la superficie
molecular polar (TPSA), el número de donadores de enlaces de hidrógeno (OHNH),
el número de aceptores de enlace de hidrógeno (ON), el número de enlaces rotables
(nrotb) y el volumen molecular. Es importante anotar que en este estudio nosotros
no tomamos estrictamente las cinco reglas. Por ejemplo, con respecto al peso
molecular, 500 Da, cambiamos a un máximo de 600 Da, en el caso de enlaces
rotables cambiamos el límite de 10 a 13. La razón para hacer estos cambios se debe
68
a que este tipo de medicamentos no necesariamente debe administrarse por vía
oral, esta administración puede ser realizada por vía intravenosa o intramuscular.
Además, MMP9 es una proteína extracelular, razón por la cual, el fármaco no
cruzaría cualquier membrana. Se han utilizado dos moléculas de control:
batimastato y ácido acetilsalicílico. En la Tabla 10 se presentan los valores del
descriptor de moléculas que pasaron la primera etapa del cribado.
Tabla 10. Valores de descriptores para moléculas que pasaron la primera etapa del
cribado virtual.
Mo
lécu
la
milo
g P
TP
SA
Nú
mero
de
áto
mo
s
Peso
Mo
lecu
lar
Nú
mero
ON
Nú
mero
OH
NH
Vio
lacio
nes
Ro
tab
ilid
ad
nu
méri
ca
Vo
lum
en
Batimastatina 3.122 107.522 31 463.625 7 4 0 11 417.065
ASA 1.434 63.604 13 180.159 4 1 0 3 155.574
Lpf_2 2.346 132.886 33 471.539 10 4 0 10 406.864
Lpf_5 4.438 99.178 34 489.638 8 2 0 9 450.734
Lpf_6 3.781 111.205 34 490.626 9 3 0 9 450.734
Lpf_28 4.360 143.224 36 512.588 10 5 1 12 446.864
Lpf_29 2.298 140.222 36 520.652 10 5 1 13 471.524
Lpf_39 4.253 134.435 38 540.642 10 4 1 9 475.424
Lpf_58 4.038 102.416 39 556.729 9 2 1 8 509.308
Lpf_60 4.728 132.886 39 549.653 10 4 1 12 484.460
Lpf_73 3.335 133.134 36 514.604 10 4 1 10 449.221
Lpf_78 4.527 136.650 39 553.616 10 4 1 12 472.83
Lpf_89 3.459 119.994 35 504.653 9 4 1 11 462.996
Lpf_96 2.714 132.021 35 505.641 10 5 1 11 458.596
Lpf_96sr 3.113 117.201 37 527.643 9 3 1 13 474.595
Lpf_97 4.004 117.201 39 555.697 9 3 1 14 507.958
Lpf_99 4.871 107.967 37 523.655 8 3 1 10 471.811
Lpf_113 4.541 108.412 42 639.493 9 2 1 11 470.325
Lpf_114 4.503 120.439 44 640.725 10 3 1 9 549.621
Lpf_137 2.971 128.640 39 587.495 10 3 1 10 447.045
Lpf_138 3.014 134.435 39 586.511 10 4 1 10 450.616
Lpf_140 4.063 134.435 42 626.576 10 4 1 10 489.231
69
S8bisop 4.161 107.967 32 463.600 8 3 0 11 427.350
S8bisop3f 4.451 107.967 35 517.570 8 3 1 12 442.086
S8bisop1f 4.104 107.967 32 467.563 8 3 0 11 415.720
S8b1cl 4.411 107.967 32 484.018 8 3 0 11 424.325
S8bisop1br 4.542 107.967 32 528.469 8 3 1 11 428.674
S8bch1f 4.387 107.967 34 495.617 8 3 0 13 449.324
S8bch1cl 4.695 107.967 34 512.072 8 3 1 13 457.928
S8bch1br 4.826 107.967 34 556.523 8 3 1 13 462.278
4.9. La actividad inhibidora
El siguiente paso fue observar las moléculas con mejor actividad que las moléculas
activas de nuestro modelo QSAR. Para este objetivo fue necesario preparar
moléculas de la misma vía como los modelos QSAR. La actividad se predijo usando
el modelo CoMSIA. Las estructuras con esta característica se muestran en la Tabla
11.
Tabla 11. Las moléculas con mejor actividad inhibidora que el mejor modelo de
moléculas activas.
Molécula Actividad inhibitoria (logIC50)
72 0.51
73 0.62
76 0.51
77 0.66
78 0.64
79 0.53
80 0.58
81 0.58
82 0.56
Después del análisis de la actividad inhibidora, el siguiente paso fue calcular la
toxicidad teórica de moléculas. Usando el software Q-tox que calcula la dosis letal
50 (DL50). Este software permite valorar que las moléculas en proceso de selección
tendrían una dosis letal apropiada.
70
Para determinar si el programa Q-tox podría ser utilizado, se hizo la predicción de
la DL50 por un medicamento conocido. Se eligió el ácido acetilsalicílico (DL50=2
g/kg). Además, se tomó como referencia la molécula batimastato, ya que es el
mismo tipo de medicamento del inhibidor de MMP9. Por lo tanto, para pasar esta
etapa del filtro, nuestras moléculas deben tener un DL50 mayor que 0,6 g/Kg. Todas
las moléculas tenían esta característica, por esta razón todos pasaron a la siguiente
etapa. La Tabla 12 muestra las DL50 que se predijeron para estas moléculas.
Tabla 12. Predicción de Toxicidad Teórica (DL50) para las moléculas que se aprueba
el análisis inhibitorio.
Molécula Dosis Letal50(LD50)
g/Kg(Rodent)byQ-Tox Acido acétil salicílico
1.85 Batimastato
Naa
0.60
72 0.90
73 1.40
76 1.00
77 0.70 78 1.30
79 1.70
80 0.60
81 1.20
82 0.80
A continuación, se procede a hacer predicciones de posible efectos tóxicos de estas
moléculas. Para lograr este objetivo hemos usado el servidor gratuito Osiris
(http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/). El proceso de predicción Osiris se
lleva a cabo por un conjunto de fragmentos estructurales pre-computados que
generan alerta de toxicidad en caso de que se encuentren en la estructura
considerada. Este programa genera alerta tóxica de mutagenicidad,
tumorigenicidad, irritabilidad y efectos reproductivos. Estas predicciones se
muestran en la Tabla 13.
Tabla 13. Índices de predicción de toxicidad para del conjunto de moléculas
estudiadas.
71
Molécula Mutagenicidad Tumorigenicidad Irritabilidad Efectos
reproductivos
72 Si No Si No
73 Si No Si No
76 Si No Si No
77 Si No Si No
78 Si No Si No
79 Si No Si No
80 Si No Si No
81 Si Si Si Si
82 Si No Si No
Las alertas de toxicidad de rendimiento Osiris son predicciones no exactas; Por lo
tanto, tomamos sólo los resultados para observar los posibles efectos tóxicos que
tendrían las moléculas propuestas como fármacos inhibidores de MMP9. La
excepción a este hecho es que se observó en la molécula 81 desde todos los
aspectos calculados de toxicidad que arrojaron un nivel de riesgo alto, por lo que se
decidió descartar esta molécula. El resto de las moléculas muestran un nivel medio
de la toxicidad en la mutagenicidad y un alto nivel de toxicidad en la sensibilización
de la piel. A pesar de estos resultados, proponemos 8 nuevas moléculas como
posibles inhibidores de MMP9 que, en teoría, podrían ser más activo que las
moléculas modelo. A continuación, en la Tabla 14 muestra la estructura de estas
moléculas propuestas.
Tabla 14. Estructura molecular de los candidatos finales
Molécula R1 R2NR3
72 CH3 (2,4)-dimetilpentil)NH
73 CH3 (1,1,1-trifluoro-2,4-dimetilpentil)NH
76 CH3 (2-fluoro-4-metilpentil)NH
77 CH3 (2-chloro-4-metilpentil)NH
78 CH3 (2-bromo-4-metilpentil)NH
79 CH3 (1-fluoro-2,4-dimetilpentil)NH
80 CH3 (1-chloro-2,4-dimetilpentil)NH
82 Cl (2,4-dimetilpentil)NH
72
Por último, hemos realizado predicciones de pKa para estas 8 moléculas mediante
un demo de laboratorio ACD obtenido de la página Web
(http://ilab.acdlabs.com/ilab/perl/work.pl). El perfil de estos candidatos finales,
incluyendo la respectiva predicción pKa se muestran en la Tabla 15.
Tabla 15. Predicciones de pKa para el conjunto de moléculas candidatos finales,
Molécula Predicciones
de CI50 (nM) miLogP
Dosis letal 50
(DL50) g/Kg
(Roedores) por
Q-Tox
Predicciones
de pKa
72 0.31 4.39 0.90 9.58
82 0.27 4.39 0.80 9.57
73 0.24 4.70 1.40 9.55
76 0.31 4.83 1.00 9.32
77 0.22 4.16 0.70 9.35
78 0.23 4.54 1.30 9.35
79 0.30 4.45 1.70 9.49
80 0.26 4.10 0.60 9.49
En este caso, también se utilizó el ácido acetil salicílico con el fin de determinar la
capacidad de predicción de este programa. La diferencia entre el pKa real y la
predicción del pKa de ASA era bastante pequeña (Tabla 15). Los valores de pKa de
los candidatos son alrededor de 9,4. Este hecho nos dice que estas moléculas
pueden ser caracterizadas como bases débiles. Es una buena característica si se
quieren utilizar como medicamento. Mirando este valor pKa podríamos considerar
que estas moléculas en el pH del estómago podrían ser lo suficientemente disueltas
e ionizadas. En pH intestinal, entre 5 y 7, estas moléculas serían mucho menos
ionizados, favoreciendo la cantidad de moléculas no ionizadas que realmente
pueden atravesar la pared intestinal y por lo tanto para llegar a la sangre, donde se
comportaría de una manera similar a la del intestino. Es importante decir que luego
del análisis de las características de volumen y peso molecular de nuestras
moléculas: podríamos inferir que una pequeña cantidad puede atravesar la barrera
hematoencefálica.
73
4.10. CONCLUSIONES
En este trabajo, mediante el uso de acoplamiento molecular y análisis 3DQSAR, fue
posible obtener nuevos conocimientos sobre la relación entre la información
estructural de una serie Nbiaril éter sulfonamida hidroxamato como inhibidores
potenciales de MMP.
El análisis de cribado virtual fue realizado con la predicción de las propiedades
farmacocinéticas (Las cinco reglasde Lipinski). Fueron identificadas las moléculas
con mejor actividad inhibidora que las moléculas modelo activos (batimastato y
ácido acetilsalicílico).
Algunos índices de toxicidad (mutagénesis, tumorigenicidad, irritabilidad y efectos
reproductivos) fueron predichos en las moléculas que pasaron el análisis inhibitorio.
Como resultado de la investigación, ocho nuevas moléculas se han propuesto como
posibles inhibidores de MMP9 y el pKa de estas moléculas se ha calculado
utilizando un software libre disponible.
En este trabajo se obtuvieron dos modelos 3DQSAR: un modelo CoMFA y un
modelo CoMSIA, ambos con valores de q2 por encima de 0.5 lo que nos indica que
son modelos confiables en cuanto a su capacidad predictiva, además de la robustez
la cual fue evaluada por medio de boostrapping. Estos modelos fueron construidos
con inhibidores MMP9 con su respectiva actividad inhibitoria reportada en el 2008
por Yang et al. Cabe destacar que estas moléculas fueron dockeadas previamente
al estudio de relación estructura-actividad por lo cual se obtuvieron modelos
teniendo en cuenta el receptor. Estos modelos pueden ser usados para el diseño
de otros inhibidores MMP9 de tipo N -β- Biaril sulfonamida hidroxamato.
74
Por otra parte, se diseñaron nuevos inhibidores de este tipo a partir de la utilización
de herramientas bioinformáticas se hizo un filtro que para encontrar entre todas las
moléculas que se diseñaron, las que tuvieran mejores características
farmacocinéticas y toxicológicas, porque no serviría tener moléculas muy activas,
pero que no se podrían usar como medicamento porque al estudiar sus
características farmacocinéticas y toxicológicas no fueran aptas, de los cuales,
después de un cribado solo reportamos 8, ya que además de ser mucho más
activas que sus precursoras, tienen en teoría buenas propiedades farmacocinéticas
y probablemente toxicológicas.
Este trabajo es quizás un aporte significativo ya que en nuestros días se están
desarrollando muchos tratamientos para una enfermedad tan devastadora como el
cáncer y entre más aportes haya a la ciencia en este aspecto, más rápido se
obtendrán alternativas que sean menos agresivas y más efectivas.
4.11. REFERENCIAS
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76
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78
CAPITULO 4.
Diseño de inhibidores de enzima convertidora de
angiotensina 2 (ACE2) por cribado y
optimización de leads (cabeza de serie)
5.1. INTRODUCCIÓN
La enzima convertidora de angiotensina monocarboxipeptidasa 2 (ACE2) es un
nuevo componente bioquímico del sistema renina-angiotensina cuyo
descubrimiento ha añadido una capa adicional de complejidad al concepto clásico
de este sistema de regulación cardiovascular [1]. Hasta ahora, sus roles fisiológicos
y patológicos no están completamente descifrados pero se ha informado de que
ACE2 está implicada en la biología cardiovascular y renal, la obesidad, la actividad
inflamatoria, y la diabetes [2, 5]. Esta enzima también se ha establecido como el
receptor funcional del coronavirus (el agente etiologico del sindrome respiratorio
agudo severo SARS- CoV, o SCV)y el coronavirus humano, Coronavirus NL63, o
virus HCoV-NL63 [6, 7]. Por estas razones, la ACE2 es considerada como un
objetivo importante en el control de estas enfermedades.
El desarrollo de agentes terapéuticos anti-SCV es de suma importancia debido a la
alta letalidad de infecciones SCV, su enorme impacto económico y social, sumado
a los temores de nuevos brotes, así como del posible uso indebido de tales virus
como armas biológicas [8]. Además, se sabe que diversos coronavirus se unen a
una región similar de ACE2 lo que implica que los ligandos ACE2 podrían inhibir
ambas infecciones por SCV y HCoV-NL63 [9, 10]. Aunque el virus HCoV-NL63 que
circula en la población humana es solo modestamente patogénico en la mayoría de
los casos, un inhibidor sería útil en el tratamiento de un subconjunto de casos graves
o formas más patógenas del virus [11]. En este trabajo se aplicaron métodos
79
computacionales para la obtención de inhibidores de la actividad de la fusión viral,
ya que previamente han demostrado su capacidad de apuntar a la enzima ACE2
[12].
5.2. PREPARACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS, BÚSQUEDA
CONFORMACIONAL Y CONSENSO
La estructura 1R4L [13] correspondiente a una cristalografía de rayos X del dominio
metalopeptidasa extracelular de ACE2 en el complejo con el ligando MLN-4760 se
extrajo de la base de datos Protein Data Bank (PDB) (Figura 1) [14].
Los inhibidores de ACE2 desarrollados por Dales et al. [15] fueron optimizados con
el objetivo de minimizar su energía, y cargados en el paquete SYBYL versión 7.0
(Figura 2) [16]. Además, se prepararon las estructuras optimizadas de estos
compuestos para llevar a cabo experimentos de acoplamiento molecular siguiendo
el mismo procedimiento.
Figura 1. Unión Inhibidor-enzima convertidora de angiotensina
monocarboxipeptidasa 2 (ACE2).
80
Figura 2. Componentes de los ligandos base sintetizados y evaluados por Dales.
El programa FlexX se utilizó como algoritmo de búsqueda para encontrar 100 poses
de unión de los ligandos con respecto a la estructura de la enzima 1R4L obtenida
de RCSB(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics) del PDB.
En la definición del sitio activo fueron tomados un radio de 7,2Å [3, 4, 5] para las
simulaciones de acoplamiento. Posteriormente, fue seleccionado una de las 100
poses a través del consenso rango por rango [17], entre las funciones de puntuación
G [18], PMF score [19], D score [20] y Chemscore [21].El mismo protocolo de
acoplamiento se llevó a cabo para cada estudio de relación cuantitativa estructura-
actividad (QSAR).
5.3. ESTUDIOS QSAR
Un conjunto de 21 compuestos (Tabla 1) tomados de la publicación de Dales et
al.[14] fueron utilizados para los análisis QSAR-3D y CoMSIA (análisis de índices
de similitud Comparativo Molecular). Estos modelos fueron desarrollados en el
paquete SYBYL 7.0 utilizando los ligandos en la Tabla 1, en su mejor clasificación
de poses después del acoplamiento en FlexX. Ninguna otra alineación de los
ligandos se realizó. Los descriptores CoMSIA (estérico, electrostático, hidrofóbico,
donador de enlace de hidrógeno, aceptor de enlace de hidrógeno) se calcularon con
el campo de fuerza estandar en Tripos en cada punto de la red tridimensional,
usando el carbono de prueba sp3 con carga +1 en CoMSIA.
81
Tabla 1. Valores de actividad biológica de los compuestos usados en los estudios
de CoMSIA.
R1 R2 R3 IC50
1RS* - CH(CH3)2 H 1.4
1SR - CH(CH3)2 H 2.2
1SS CH(CH3)2 H 1.2
2 - CH(CH3)2 Benzil 10
3 Benzyl CH(CH3)2 - 0,024
4 Benzyl Me - 0.30 5 Benzyl Ph - 0.34 6 Ciclohexyl CH2 CH(CH3)2 - 0.27
7* Ciclohexyl (CH3)2CH2 CH(CH3)2 - 0.010
8 4-NO2Benzyl CH(CH3)2 - 0.076
9 4-ClBenzyl CH(CH3)2 - 0.021
10 4-CF3Benzyl CH(CH3)2 - 0.052
11 4-MeBenzyl CH(CH3)2 - 0.032
12* 2-MeBenzyl CH(CH3)2 - 0.29
13 3-MeBenzyl CH(CH3)2 - 0.0042
14 3,4-diMeBenzyl CH(CH3)2 - 0.010
15 3,5-diMeBenzyl CH(CH3)2 - 0.0014
16RR 3,5-diClBenzyl CH(CH3)2 - 0.072
16RS 3,5-diClBenzyl CH(CH3)2 - 8.4
16SR* 3,5-diClBenzyl CH(CH3)2 - 0.470
16SS 3,5-diClBenzyl CH(CH3)2 - 0.00044
*Set de moléculas de pruebas de QSAR
El método de los mínimos cuadrados parciales (PLS) se implementó a través del
módulo QSAR de SYBYL, el cual se utilizó para construir y validar los diferentes
modelos. Se utilizó un filtró de columna ajustado a 2,0 kcal/mol para acelerar el
análisis y reducir el ruido. Los descriptores CoMSIA sirvieron como variables
independientes y los valores pIC50 como variable dependiente en el análisis de
regresión PLS.
El rendimiento de los modelos derivados fue calculado empleando el métodoLeave
One One(LOO) de validación cruzada. El número óptimo de componentes (Nc)
utilizado para derivar el modelo de validación no cruzada se define como el número
82
de componentes que conducen al más alto valor de r2 validación cruzada (q2) y el
más bajo error estándar de predicción (EEP). Para obtener los límites de confianza
estadística en el análisis, se realizó el muestreo (bootstrapping) con 100 grupos.
5.4. OPTIMIZACIÓN DE LA CABEZA DE SERIE (LEADS)
La optimización de estas moléculas fue realizada empleando el módulo de SYBYL
LeapFrog (LF). LF que es una herramienta de optimización de segunda generación
usada para diseñar una serie de potenciales moléculas de ligandos activos (cabeza
de serie). Los cálculos de energía de enlace en LF son realizadas por tres
componentes principales: estérico directo, electrostático, y entalpías de enlace de
hidrógeno implícitos de cavidad unión ligando, utilizando el campo de fuerza Tripos
[16]. Sin embargo, en LeapFrog, los átomos enlazados se coordinan para aumentar
la velocidad y la energía de enlace de cada átomo-ligando es calculado como si el
átomo fuera situado realmente en el centro del cubo que contiene ese átomo.
Una expresión lineal simple proporciona entonces la energía de interacción entre el
sitio y ese átomo de ligando particular. La energía total de esta interacción es
producto de la sumatoria de todos los átomos del ligando. Cuando se ejecutó el
programa de LF, el cubo creado contenía los 22 residuos más cercanos al ligando
co-cristalizado en 1R4L. Esta cavidad se utilizó para generar la interacción del
punto-sitio. La carga de un sitio átomo es positiva, negativa o lipofílica. No se utilizó
la energía de solvatación como cavidad opcional. En cada uno de los inhibidores de
la Tabla 1 se realizaron diez mil modificaciones estocásticamente.
5.5. CRIBADO VIRTUAL
In silico ADMET ha tomado un lugar cada vez más importante dentro de la línea de
desarrollo de fármacos. El proceso de optimización estructural en LF da lugar a una
profunda estructura química con alta eficiencia de ligando. Para evaluar su
verdadera utilidad farmacéutica se realizó un sucesivo filtrado por medio de los
83
servicios en línea [23] que fueron implementados por un conjunto de candidatos
propuestos basados en el modelo QSAR como se muestra en la Figura 3.
Las herramientas empleadas para la predicción de la similitud de medicamentos
fueron Molinspiration [http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties], Osiris [24]
y Molsoft [http://www.molsoft.com/mprop/]. La similitud de medicamentos puede ser
definida como un complejo balanceado de diversas propiedades moleculares y
características de la estructura que determinan si una molécula particular es similar
a los fármacos conocidos.
Figura 3. Procedimiento de filtros sucesivos utilizados en este estudio. Cinco
criterios se tuvieron en cuenta: afinidad al blanco, energía de Leap Froog,
parámetros de Lipinski, toxicidad de medicamentos y semejanza.
Se utilizó un amplio filtro para las propiedades de la similitud de medicamentos
conocidas como la regla de Lipinski o regla de cinco (RO5). Las reglas originales
(RO5) con compuestos activos por vía oral se definen mediante cuatro sencillos
84
rangos de parámetros fisicoquímicos, peso molecular (PM ≤ 500), coeficiente de
partición octanol-agua (log P) inferior a 5, donadores de enlaces de hidrógenos ≤5,
aceptor de enlace de hidrogeno ≤ 10), estos parametros están asociados con el
90% de los medicamentos oralmente activos que han alcanzado la fase II de estatus
clínico [25]. Por otra parte, la toxicidad es responsable que muchos de los
compuestos no alcancen el mercado y una vez que hayan sido aprobados también
se retiren un número significativo de compuestos [26].
5.6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.6.1. Acoplamiento molecular (Docking)
La definición del sitio activo se focalizó en la mayor parte de los recursos
computacionales, sobre el núcleo hidrófobo de la enzima. El sitio activo
profundamente empotrado y blindado de ACE2 es una característica estructural
común de las proteasas que sirven para evitar la proteólisis de grandes péptidos
estructurados [27]. El acoplamiento fue realizado por eHiTS 6,2 [28] que escanea
rigurosamente toda la proteína, confirmando que el sitio de unión de todos los
ligandos con la proteína de ACE2 es efectivamente el seleccionado para el
acoplamiento a través de FlexX.
Dentro del sitio específico de reconocimiento donde el enlace peptídico es clivado
fueron encontrados tres bolsillos que se muestran representados como una
superficie de Connolly en la Figura 4. El subsitio hidrófobo S1 está compuesto por
los residuos N51, W349, A348, T347, H374, H378, E402, y Y510. La Figura 4 muestra que la
cadena pseudo-Leu isobutilo de los inhibidores de la Tabla 1 encajan muy bien en
él [15], pero es lo suficientemente grande para dar cabida a cadenas más largas. A
diferencia, el entorno químico electrostático del subsitio S1' [16] favorece la
interacción con residuos polares de los sustratos naturales de ACE2 [29].
85
Este bolsillo delgado es uno de los factores determinantes de la mayor especificidad
del sustrato de ACE2. De hecho, la topología de S1 en ACE2 difiere de la de su
homólogo en ACE. S1' está compuesta por la cadena lateral de los residuos S128,
A342, V343, C344, H345, L359, M360, T371, E375, F504, H505, L503, y el enlace
disulfuro C334/C361 que limitan el tamaño de las cadenas de sustrato laterales P1
mientras que convenientemente están adaptados para acomodar el anillo de
imidazol y uno del grupo carboxilato de los ligandos de Dales y colaboradores.
Además, los sustituyentes voluminosos como N-3 en el anillo de imidazol
interactúan con una tercera cavidad en el ACE2 más allá de S'1 que podría
denominarse S'2 de acuerdo al modelo de interacción de Schechter y Berger [30],
ya que se une a sustratos funcionales. Este tercer bolsillo está constituido por los
residuos E145, L144, N149, W271 y R273.
Figura 4. Consenso de poses de un compuesto de la Tabla 1, acoplado en el sitio
activo de ACE2. Los grupos carboxilo se encuentran cerrados al átomo de Zn que
se muestra como una esfera roja. La cadena de pseudo-Leu isobutilo de los
inhibidores es orientada hacia el bolsillo S1.
86
El estudio de acoplamiento reveló que los inhibidores con estereoquímica 1SR y
16RR exhiben un modo inverso de la unión mediante la presentación de su bencilo
en el interior del subsitio S1 mientras que el inhibidor 7 se une de tal manera que
toda la estructura del inhibidor 2 está excluida de la subcavidad S1.
5.6.2. Cálculos LeagFroog
Se generó una gran base de datos por medio del algoritmo LeagFrog (LF), un
programa para la optimización de los ligandos acoplados a su molécula blanco. En
la mayoría de las simulaciones LF las estructuras retuvieron su lugar dentro de la
cavidad en la medida que la optimización automática procedía. El cálculo más difícil
fue el de ligando 7 que sólo produjo 2 moléculas de LF. En total se obtuvieron 2.372
estructuras aceptables. A partir de esta base de datos, se seleccionaron las
estructuras con la puntuación más alta de afinidad LF. Aunque cualquier átomo en
las estructuras de partida fue protegido contra posibles modificaciones de los anillos
de imidazol y núcleos de dicarboxilato de aminoácidos se conservaron excepto en
el caso de las dos primeras moléculas de la Tabla 1.
El modo de unión de uno de los LF genero estructuras en el sitio activo de ACE2
como se muestra en la Figura 5. Se comparte los dos grupos carboxilato de los
compuestos de Tabla 1. Estos grupos se coordinan al átomo de Zn pero el grupo
de unión es un grupo metileno en lugar de un grupo amino.
Adicionalmente, la cadena en S1 se agranda y posee dos átomos de flúor y un grupo
ceto para establecer interacciones electrostáticas con los residuos de N51 y E402.
Por último, el ligando E tiene un átomo de oxígeno que conecta el anillo de imidazol
a una etil-piridina que ocupa parcialmente el subsitio S2'. Un anillo de piridazina se
encuentra dentro de la estructura de varios medicamentos farmacéuticos [31]. Los
átomos de nitrógenos contienen compuestos heterocíclicos, piridazinas,
piridazinonas y ftalazinas que son importantes características estructurales de
muchos compuestos biológicamente activos y muestran diversas propiedades
87
farmacológicas, las estructuras LF-generadas encajan con alta complementariedad
en el sitio catalítico ACE 2.
Figura 5. Diseño de molécula D en el sitio activo de ACE2(LeagFroog). La piridina
orientada hacia el subsitio S2'.
5.6.3. Cálculos QSAR
Además, se construyeron modelos CoMSIA 3D-QSAR. El método de alineación
basado en el acoplamiento condujo a varios modelos significativos CoMSIA en
contraste con el modelo CoMFA y aquellos elaborados desde el módulo de Aligment
de SYBYL.Para seleccionar el mejor modelo CoMSIA se juzgaron las posibles
combinaciones de sus 5 propiedades fisicoquímicas estándar. Las estadísticas
respectivas de los modelos que tienen valores q2 por encima de 0,5 se resumen en
la Tabla 2. El mejor modelo CoMSIA de los ligandos producido por Dales fue de q2
= 0,652 y R2 = 0.962. El mejor modelo CoMSIA de los ligandos de la Tabla 2 obtuvo
88
valores q2 = 0,566 y r2 = 0.992. Del parámetro estérico se obtuvieron las mejores
estadísticas en ambos casos.
Tabla 2. Parámetros estadísticos de enlace de los modelos CoMSIA
Campo Parámetros estadísticos de los modelos QSAR
q2 r2f NCg EESh Valor F R2BS
i DEj
Sa, Eb, Dd 0.506 0.940 6 0.214 83.952 0.976 0.010
S, Ae 0.5 1.000 6 0.008 24808.95 1.000 0.000
Hc 0.506 1.000 10 0.014 7779.978 1.000 0.000
S 0.652 0.962 6 0.272 59.759 0.988 0.011
a Campo estérico
b Campo electrostático
c Campo hidrófobico
d Campo donador de puentes de hidrogeno
e Campo aceptor de puentes de hidrogeno
f Coeficiente de correlación cuadrado de
validación no cruzada
g Número de componentes
h Error estándar de predicción
i Corrida de 100 bootrapping
j Desviación estándar
Los mapas de contornos de la contribución estéricas de CoMSIA se representan
gráficamente en la Figura 6. La cual muestra que la mayor potencia de ligando 16
(que también se denomina MLN-4760) con respecto al ligando 2 se relaciona con la
superposición del resto de ligando 16 en los campos verdes.
De hecho, el anillo de benceno del ligando 16 está lejos del poliedro amarillo del
ligando 2 y los átomos de cloro en este anillo del ligando 16 van más allá de la región
verde. Además, el anillo de imidazol de ligando 16 cambia su orientación de manera
que el átomo N1 está mucho más separado de la región amarilla desfavorable del
campo estérico.
La actividad biológica de los quimiotipos generados-LF fueron calculadas por los
modelos CoMSIA. Los resultados mostrados en la Tabla 3 sugieren que son más
potentes que los inhibidores previamente reportados.
89
Figura 6. Comparación de la orientación poliedrica del modelo estérico del ligando
2 del Modelo CoMSIA en Dales (arriba) y 16 (Abajo) en los mapas de contorno.
Tabla 3. Actividad biológica de las estructuras generadas-LF.
Moléculas Predicción pIC50 mediante el modelo QSAR
A 3.46
B 3.71
C 3.64
D 3.52
E 3.99
F 3.90
G 4.00
5.6.4. Predicciones ADMET y predicciones de similitud de
medicamentos.
Los archivos generados por LF se convierten en formato SMILES por el traductor
Cactus (http://cactus.nci.nih.gov/servicios/traducen/). Posteriormente estas
90
moléculas fueron presentadas al servidor en línea MOLINSPIRATION para predecir
las importantes propiedades moleculares (logP, área de superficie polar, el número
de donadores y aceptores de enlaces de hidrógeno, peso molecular, el número de
átomos de oxígeno y átomos de nitrógeno, número de hidrógenos unidos a N y O,
número de violaciones, número de enlaces rotables y volumen). Después de
analizar los 77 principales compuestos de LF generados por la optimización
estructural se observó que un 50% de estos está en contra de la regla de Lipinski.
La predicción de la toxicidad antes de la síntesis de los compuestos asegura la
eliminación de compuestos con efectos tóxicos potenciales. Están disponibles un
número de sistemas en silico para la predicción de la toxicidad, que ayudan en la
clasificación de compuestos tóxicos y no tóxicos [32]. La evaluación de las
moléculas estudiadas se realizó por medio del explorador de rendimiento de
propiedad Osiris con 12 prototipos seleccionados. Dado que cualquier miembro del
conjunto pre calcula el fragmento característico estructural de compuestos dañinos
que se han encontrado en las estructuras cribadas, se puede afirmar que son tan
libres de efectos tóxicos que los medicamentos comercializados.Por lo tanto, indica
que no hay ni riesgo de mutagenicidad, la tumorigenicidad, irritabilidad, efectos no
reproductivos. Los controles positivos utilizados fueron; Ritonavir, ribavirina,
amantadina y aciclovir. Los fragmentos de las moléculas presentadas que dieron
origen a las alertas de toxicidad se muestran en la Tabla 6.
De acuerdo con Osiris el compuesto más potente de la Tabla 1, el MLN 4760
ligando co-cristalizado, resultó también ser mutagénico en virtud de una fracción de
anillo de benceno teniendo dos cloruros en posición meta. Sin embargo, un
compuesto que contiene un anillo de piridina halogenado superó la prueba de Osiris.
Adicionalmente, fue utilizado el servidor Molinspiration para predecir la bioactividad
sobre cuatro de los más importantes medicamentos blancos: ligandos de GPCR,
inhibidores de quinasa, moduladores del canal de iones, y los receptores nucleares.
91
El método implementado en Molinspiration utiliza la estadística bayesiana
sofisticada para comparar las estructuras de ligandos activos representativos, sobre
el blanco con estructura de moléculas inactivas y para identificar las características
típicas de la subestructura de moléculas activas.
Los descriptores calculados para las ocho entidades previamente tamizadas se
registran en la Tabla 4. Como controles positivos se incluyeron los medicamentos:
propanolol, Xilocaina, Imatinib y estradiol. Todos ellos son fármacos selectivos a las
clases de receptores anteriormente mencionados. La toxicidad celular no se
observó en las moléculas de ligandos ACE2 que se muestran en la Tabla 4, mientras
que la bioactividad se encuentra en cada molécula de control. La puntuación de
similitud de medicamentos también se calculó por el servidor en línea Molsoft
(http://www.molsoft.com/mprop/) (Tabla 5 y Figura 6).
Tabla 4. Bioactividad fuera del Blanco (Molinspiration).
Control de Candidato
Selectividad
Ligando GPCR
Modulador de canal iónico
Inhibidor de
quinasas
Ligando ReceptorNuclear
Propanol 0.32 0.21 0.27 1.04
Xilocaina 0.07 0.03 0.06 0.49
Imatinib 0.18 0.54 0.41 0.88
Estradiol 0.37 0.23 1.03 0.87
A 0.93 0.93 1.09 1.01
B 0.67 0.72 1.20 1.29
C 0.65 0.42 1.14 1.19
D 0.62 0.59 0.94 1.09
E 0.63 0.57 0.96 1.14
F 0.21 0.01 0.54 1.10
G 0.12 0.18 0.67 1.01
92
Tabla 5. Diseño de moléculas con la puntuación de medicamentos Molsoft
Los
parámetros de peso molecular calculados en Molsoft, aceptores y donadores de
enlaces de hidrógeno, logP, registros, PSA, volumen molecular (Tabla 6) y el
número de centros estereogénicos están registrados en la Tabla 7.
Molécula Puntuación
A 0.43
B 1.10
C 0.79
D 0.37
E 0.60
F 0.64
G 0.98
93
Figura 6. Scores producidos por el modelo Molsoft para la serie de candidatos
desde la posición 0.37 a 1.10 mostrando los obtenidos para medicamentos
similares.obtenidos con semejanza virtual.
94
Tabla 7. Estructuras de Screening
O
O
O
O
H
H
H
HH
H
H
HH
H
H
H
OO
O
N
NOCl
N
H
H
H
H H
H
H
H
H
H
A B
O
OO
O
N
NO
O
N
H
H
H
H
H
H HH
H NH
N+ O
-
O
O
N
N
OO O
-
CH2
C D
NH
N+ NH O
-
O
O
OO O
-
N
NH2
NH
N+ NH O
-
O
N
O O-
CH3
CH3
O
CH3
O
E F
NH
N+ O
-
O
N
O O-
Cl
O
CHF2
F
O
F
CH2
G H
95
5.7. CONCLUSIONES
Dado que en cualquier miembro de un conjunto precalculado se le han encontrado
características de fragmentos estructurales de compuestos dañinos en las
estructuras proyectadas, se puede afirmar que son tan libres de efectos tóxicos
como los medicamentos comercializados. Por lo tanto, indica que no habría riesgo
de mutagenicidad, la tumorigenicidad, irritabilidad y efectos no reproductivos.
Además, de acuerdo con los modelos de predicciones 3D-QSAR, las moléculas
diseñadas por LF son más potentes que los compuestos de partida y podrían ser
activas en el rango nano molar.
Anteriormente otros estudios habían logrado un aumento de las potencia de
moléculas bioactivas. En resumen, se proponen siete entidades terapéuticas que
tienen calculado alta similitud de medicamentos para ser sintetizado y evaluado
experimentalmente. Un obstáculo con respecto al quimiotipo A, B, y C es que ellos
podrían tiener varios centros quirales lo que implica que sean bastante difíciles de
sintetizar. Aunque la precisión de los métodos de predicción ADMET está limitada,
es posible que algunas de las moléculas en la Tabla 6 que pasaron todos los filtros
sean fármacos seguros y eficaces.
5.8. REFERENCIAS
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99
5. CONCLUSIONES GENERALES
El desarrollo de esta tesis doctoral tuvo dos líneas de trabajo una basada en
metaloproteinas y la otra basada en angiotensina 2 (ACE2). En estos dos estudios
se usaron aproximaciones teóricas las cuales nos dieron resultados interesantes en
ambos casos para la obtención de posibles nuevos inhibidores de este tipo de
proteínas.
En el caso de las metaloproteinas se obtuvo nuevo conocimiento a través de los
valores experimentales de IC50 y de los descriptores obtenidos a través de la
metodologías CoMSIA y CoMFA. La información obtenida de la serie deNbiaril
éter sulfonamida hidroxamatos como potenciales inhibidores de MMPs,
endopeptidasas que contienen un átomo metálico de zinc y son dependientes de
calcio.
Con respecto a la otra línea de investigación que tiene que ver con ACE2 se
encontró que la serie de ligandos usados en este trabajo eran un grupo de
moléculas similares a fármacos que poseen alta afinidad en silico para la enzima
convertidora de angiotensina. La ACE2 es en sí misma un objetivo prometedor tanto
en la enfermedad cardiorenal y algunas infecciones de coronavirus.
Buscando afinidad entre las dos líneas de investigación se sabe que una de las
funciones de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), se ha demostrado
tanto in vitro como in vivo que esta es un receptor funcional para SARS-CoV, por
unión al dominio de enlace al receptor (RBD, aminoacidos 319–510) de la proteína
S. Adicionalmente, existen 23 sitios potenciales de N glucosilación en la proteínas
S del SARS-CoV, y dos más en el RBD. Usualmente la unión del ligando induce la
endocitosis del receptor, varios estudios demuestran que el enlace de la proteina S
a la ACE2 endogena resulta en una baja regulación de la expresión de ACE2 en la
superficie, implicando una internalización de ACE2.