Post on 13-Oct-2020
XICongresode
laSociedad
Españolade
Farmacia
IndustrialyGalénica.25
AniversarioSEFIG.Alicante
68
febrero2013
2
XICongresode
laSociedad
Españolade
Farmacia
IndustrialyGalénica.
25aniversario
SEFIG
Universidad
MiguelHernándezde
Elche
HotelMeliá
Alicante
68
febrero2013
Librode
AbstractsdelXICongresode
laSEFIG,
68
febrero2013,Alicante,España
ISBN10:84
6956868
XISBN
13:97884
6956868
2
XICongresode
laSociedad
Españolade
Farmacia
IndustrialyGalénica.25
AniversarioSEFIG.Alicante
68
febrero2013
3
Presentación
Enrepresentación
delComité
Organizador
quierodaros
labienvenida
aAlicante
eneste
añode
celebracionespara
todosnosotros.Por
unaparte
secelebra
el25aniversario
dela
SEFIGy
porotro
los15
añosde
nuestrajoven
Universidad.
Estasfechas
señaladasson,
habitualmente,
motivo
dealegría
ytam
biénoportunidades
parala
reflexión,la
revisió nde
loya
hechoy
laplanificación
delas
nuevasm
etasy
retospor
delante.Conesa
filosofíay
contoda
nuestrailusión
elcom
itéorganizador
ycientífico
haelaborado
unprogram
aque
quierereflejar
elestado
más
actualde
lainvestigación
enFarm
aciay
ademásofrecerespacio
paraeldebate
yla
expresiónde
opinionesy
pro puestas.Enuna
etapaen
quela
profesiónFarm
acéuticase
cuestionadesde
tantosámbitosquisiéram
osqueeste
congresosirviera
paradejarconstancia
denuestras
capacidadesy
nuestracontribución
esencialen
elm
undodel
medicam
entoy
lasalud
engeneral.
Sigamos
mirando
altopara
poderdecir
como
elpoetaoriolano
“Altosoy
dem
iraralaspalm
eras”.
Querem
osagradecer
alos
ponentessu
contribucióna
laexcelencia
científicadelcongreso
ya
lasentidades
colaboradoraspor
suapoyo.
Como
PresidentadelCom
itéO
rganizadortengo
queexpresar
mireconocim
ientoy
gratituda
mis
compañeros
porsu
esfuerzopara
queelprogram
a,los
actossociales,la
organizaciónlogística
yelm
aterialparalos
congresistassean
dela
mayor
calidadposible.Deseam
osque
vuestraparticipación
seainolvidable
anivelcientífico
ypersonaly
queAlicante,com
osede
yelÁrea
deFarm
aciay
TecnologíaFarm
acéuticade
laU
niversidadM
iguelHernández,como
anfitriona,hayan
alcanzadovuestrasexpectativasen
este25
aniversario.
MªdelValBerm
ejoSanz
PresidentadelCom
itéO
rganizador
XICongresode
laSociedad
Españolade
Farmacia
IndustrialyGalénica.25
AniversarioSEFIG.Alicante
68
febrero2013
4
Comité
deHonor
Excm
a. Sra. Dña Sonia C
astedo Ram
os
Alcaldesa de A
licante
Sr. D. Jesús T. Pastor C
iurana
Rector M
agnífico de la Universidad M
iguel Hernández de E
lche
Sr. D Jorge M
anzanares Robles
Decano de la Facultad de Farm
acia de la Universidad M
iguel Hernández de E
lche
Sra. Dña. M
ª del Carm
en Peña López
Presidente del Consejo G
eneral de Colegios O
ficiales de Farmacéuticos
Sr. D. Jaim
e J. Carbonell M
artínez
Presidente del Colegio O
ficial de Farmacéuticos de la Provincia de A
licante
XICongresode
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Comité
Organizador
Presidenta: Mª del V
al Berm
ejo Sanz
Secretaria: Isabel González Á
lvarez
Tesorera: Marta G
onzález Álvarez
Vocales
Víctor M
angas Sanjuán
Elsa Lopez P
intor
Veronica V
ivancos Góm
ez
Mª Teresa M
artínez Martínez
Sarín C
olon Useche
Isabel Lozoya Agulló
Ignacio González G
arcía
Pedro G
arcía Salom
Juan Laborda Álvarez
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Comité
CientíficoPresidenta:
Isabel González Á
lvarez, UN
IVER
SID
AD
MIG
UEL H
ERN
ÁN
DEZ
Vocales:
Mª R
OS
AR
IO A
BE
RTU
RA
S R
AM
OS
JO
AQ
UIM
ALM
ELA
NA
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RR
O
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LICIA
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IVE
RS
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D D
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FAR
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UN
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RS
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NIV
ER
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CA
U
NIV
ER
SID
AD
DE
LA LA
GU
NA
U
NIV
ER
SID
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ALC
ALÁ
U
NIV
ER
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CO
MP
LUTE
NS
E D
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AD
RID
U
NIV
ER
SID
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CE
U C
AR
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NA
L HE
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UN
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RS
IDA
D A
LFON
SO
X EL S
AB
IO
UN
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IDA
D D
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UN
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RS
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D D
E B
AR
CE
LON
A
UN
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RS
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D D
E V
ALE
NC
IA
UN
IVE
RS
IDA
D C
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SA
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LO
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RS
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D S
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TIAG
O D
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OM
PO
STE
LAU
NIV
ER
SID
AD
DE
L PA
IS V
AS
CO
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Programa
6febrero
2013
8:309:30
Entregadocum
entación
9:3010:20
SesiónInauguraldelIX
Congreso
10:3014:00
Primera
SesiónM
oderadoras:IsabelGonzálezAlvarezy
MarivalBerm
ejo
10:3011:20
ConferenciaPlenaria.
Academia
andIndustry
Consortium:
CollaborativeResearch
onDrug
Development.Prof.
ShinjiYamashita.Setsunan
University,Japan.
11:3012:00
PausaCafé:Prim
eraSesión
dePosters
12:0012:50
ConferenciaPlenaria.
TheScience
PolicyDynam
icInsuring
Pharmaceutical
ProductQ
ualityand
Interchangeability:BCS
Discovery,Developm
ent,Regulation.
Prof.Gordon
Amidon.U
niversityofM
ichigan,USA.
13:0013:50
ConferenciaPlenaria.
Intestinalperm
eabilityconsiderations
when
formulating
lowsolubility
drugs.Prof.
ArikDahan.
BenGurion
University
ofthe
Negev,
Israel.
14:0015:50
Almuerzo
16:0017:50
SegundaSesión:
Mesa
RedondaPatrocinada
porSPLC
CRS:"Drug
DeliverySystem
s:Frombench
toClinic".
Moderadora:Prof.Ruth
Duncan
Ponentes:Prof.Ruth
Duncan.CardiffUniversity
(Prof.Emerita).Introduction.
DraM
aríaJosé
Vicent.Centrode
InvestigaciónPríncipe
Felipe.O
ralDelivery.
ProfMaria
J.Alonso.Universidad
Santiagode
Compostela.N
ovelPolymers.
Dra.M
ercedesPozuelo,
Bioncotech,BO
110,a
newconcept
ofanticancer
therapy
ProfAtilaHincal.Presidente
TUFTAD.U
niversityofHacettepe
(Prof.Emeritus).
Challengesforpharmaceuticalform
ulationscientistson
thenano
sizeddrug
deliverysystem
s
18:0018:30
EntregaPrem
ioInvestigación
SEFIG18:30
20:30ASAM
BLEAGEN
ERALSEFIG
21:0022:30
RecepciónVino
Bienvenida
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8
7febrero
201309:00
11:00Tercera
SesiónM
oderadoras:RosaHernándezy
VirginiaM
erino
9:009:50
ConferenciaPlenaria.
Lananotecnología
farmacéutica:
¿creamos,
copiamos
oinnovam
os?Prof.
Mª
JoseAlonso
Fernández.U
niversidadSantiago
deCom
postela
10:0010:50
ConferenciaPlenaria.
Polymer
Therapeuticsas
Nanom
edicines:N
owand
Future.Prof.Ruth
Duncan.CardiffUniversity,U
nitedKingdom
.
11:0014:00
CuartaSesión
Moderadores:Antonio
Rabascoy
Marta
GonzálezAlvarez
11:0011:35
Comunicacionesorales:Tecnología
Farmacéutica.I
Nueva
generaciónde
nanopartículaselaboradasa
basede
ésteresdesorbitán
(Span®80):potencialaplicación
enterapia
génica.APensado,GK
Zorzi,ESCarvalho,A
Sánchez,BSeijo.
Theeffectivenessofedelfosine
lipidnanoparticlesin
enhancingthe
drugcytotoxicity
inbreastcancercells.A
AznarGómez,B
LasaSaracíbar,A
EstellaHerm
osode
Mendoza,M
JBlancoPrieto.
Invivo
administration
ofVEGFreleasing
biodegradablenanospheresin
am
ousem
odel(APP/Ps1)ofAlzheimer’sdisease.E
Herrán,RPerez
Gonzalez,M
Igartua,JLPedraz,E
Carro,RMHernández.
11:3512:00
PausaCafé:Segunda
Sesiónde
Posters.
12:0012:50
ConferenciaPlenaria.
Novedades
enBioequivalencia.
Dr.Alfredo
GarciaArieta.Agencia
Españolade
Medicam
entosyProductosSanitarios.
13:0014:00h
Comunicacionesorales:Tecnología
Farmacéutica.II
Optim
izaciónde
laactividad
dedoxorrubicina
encáncer de
mam
am
edianteuna
nanoplataforma
polimérica
biodegradable.JL.Arias,CM
elguizo ,JPrados,R
Ortiz,L
Cabeza,MA
Ruiz,RLuque,B
Gónzalez,VGallardo,A
Aránega.
Sistemassupram
olecularesdepoloxam
inaciclodextrina
simvastatina
como
promotoresde
diferenciaciónde
célulasmadre
aosteoblastos.SM
NSim
ões,FVeiga,JJTorres
Labandeira,ACFRibeiro,A
Concheiro,CAlvarez
Lorenzo.
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Nanopartículasdepolicaprolactona
como
sistema
deliberación
controladade
fármacospara
aplicacióntópica.A
Melero,A
Ourique,A
Pohlmann,S
Guterres,RBeck,U
FSchaeffer.
Acquiringknow
ledgeon
antibacterialeffectofbioactiveglassby
neurofuzzylogic.M
M.Echezarreta,M
Landin.
Longterm
controlledbrain
deliveryofm
icroencapsulatedGDN
Finduces
functionalandstructuralrecovery
ofthedopam
inergicnigrostriatalpathw
ayin
parkinsonianm
onkeys.EGarbayo,E
Ansorena,HLana,JL
Lanciego,MJ
BlancoPrieto.
14:0015:50
Almuerzo
16:0018:00
Quinta
SesiónM
oderadores:IñakiFernándezdeTrocónizy
VicenteG.Casabó
16:0016:50
ConferenciaPlenaria.Terapia
Personalizadaen
laInfección
porelVIH:
Aplicaciónde
CriteriosFarmacocinéticosy
Farmacogenéticos.Prof.
Mª
JoseGarcía
Sánchez.U
niversidadde
Salamanca.
17:0017:50
Comunicacionesorales:Biofarm
aciay
Farmacocinética.
Estudiosfarmacológicoscon
Dpencilam
ina:correlaciónde
niveles plasmáticos
ycerebralesvs.eficacia
clínica.AO
rrico,LM
artíPrats,MJCano
Cebrián,LGranero,A
Polachey
TZornoza.
Modelosbasadosen
reglasyQ
SPRpara
lapredicción
dela
permeabilidad
enCaco
2.MA
CabreraPérez,H
PhamThe,M
Bermejo,IGonzález
ÁlvarezyT
Garrigues.
Análisisdeun
modelo
detrescom
partimentospara
elestudiodeltrasporte
ym
etabolizaciónde
fármacosen
monocapasde
célulasCaco2.
M.Llabrés.
Developmentofa
PBPKm
odelfortheanticancerdrug
vivia009and
itsmain
metabolite
administered
asanew
deliverysystem
inrats.M
.Matoses
Osborne,C
Tudela,MJGarrido,TA
Bennet,JBallesteros,LCaveda,IF
Trocóniz.
Modificación
delmodelo
nolinealpara
elcálculode
laperm
eabilidaden
monocapascelulares.V
Mangas
Sanjuan,IGonzalezAlvarez,VG
Casabó,MBerm
ejo.
18:0018:20
PausaCafé:Tercera
SesiónPóster
18:3020:00
ActoCelebración
25aniversario
SEFIG.
21:30h
–Cena
deGala
XICongresode
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Farmacia
IndustrialyGalénica.25
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8febrero
2013
09:0014:30
CuartaSesión
9:0011:30
Mesa
Redonda.Título:
Farmacia
Clínica,Atención
Farmacéutica,
Farmacia
Asistencialy....
Moderador:
Prof.EduardoL.M
ariñoHernández.Catedrático
deFarm
aciaGalénica
DirectorUnidad
deFarm
aciaClínica
yFarm
acoterapia.Universidad
deBarcelona.
Ponentes:Prof.Ana
María
SantoveñaEstévez.Vicedecana
dela
Facultadde
Farmacia.
Universidad
deLa
Laguna
Prof.Cecilia
FernándezLastra.
Catedráticade
Farmacia
Clínicay
Farmacoterapia.Coordinadora
deFarm
aciaAsistencial.
Universidad
deBarcelona
Prof.M
ariaLuisa
GonzálezRodríguez.
Directoradel
Departamento
deFarm
aciay
TecnologíaFarm
acéutica.Universidad
deSevilla
Prof.Diego
Marro
Ramón.
Director,M
ásterU
niversitarioen
AtenciónFarm
acéuticay
Farmacoterapia.U
niversidadde
SanJorge
11:3012:00
PausaCafé:Cuarta
SesiónPóster
12:0013:00
Comunicaciones
orales:Docencia,Atención
Farmacéutica
yFarm
aciaClínicaM
oderadores:EduardoM
ariñoy
AliciaRodriguez
RiesgoCardiovascularde
losAntiinflamatoriosN
oEsteroideosy
surepercusión
enelm
anejodelpaciente
condolore
inflamación.E
Lopez
LaDerm
ofarmacia
enla
formación
delFarm
acéuticoen
laUniversidad
deSevilla.M
JLucero.
Primera
valoracióndel41st
ESCPSym
posiumon
ClinicalPharmacy.Barcelona
2012.ELM
ariño,PM
odamio,C
FernándezLastra.
13:0014:30
Mesa
Redonda:Reflexión
sobreel
procesode
implantación
delos
nuevosGradosenFarm
acia:repercusiónen
lasenseñanzasdelÁreade
Farmacia
yTecnología
Farmacéutica
Moderadora
Prof.AliciaRodriguez.Universidad
delPaísvasco
Ponentes:Prof.
AliciaRodríguez.
Universidad
delPaís
Vasco.Estado
actualde
laim
plantacióndelGrado
enFarm
acia
XICongresode
laSociedad
Españolade
Farmacia
IndustrialyGalénica.25
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11
Prof.JoséB
Fariña.Universidad
dela
Laguna.Efectode
laim
plantacióndel
gradoen
Farmacia
enlos
objetivosform
ativosde
laTecnología
Farmacéutica:
¿Qué
hayde
nuevo?
Prof.TeresaGarrigues.U
niversidadde
Valencia.Retosyoportunidadespara
lam
ovilidaden
elGradoen
Farmacia
14:30Clausura
del Congreso
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ConferenciasPlenarias
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TheScience
PolicyDynam
icInsuring
PharmaceuticalProductQ
ualityand
Interchangeability:BCSDiscovery,Developm
ent,RegulationGordon
L.Amidon
CharlesR.Walgreen,Jr.ProfessorofPharm
acyAnd
PharmaceuticalSciences
CollegeofPharm
acyThe
University
ofMichigan
AnnArbor,M
ichigan48109
1065
Ithasbeenover10
yearssincethe
FDApublished
theBiopharm
aceuticsClassificationSystem
(BCS)guidance(http://w
ww
.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInform
ation/Guidances/default.htm)
Thisguidance
describeshow
drugperm
eabilityand
solubilityand
productdissolutioncan
beused
toclassify
drugsand
drugproducts
anddeterm
inein
vitrobioequivalence
(BE)standards
fororal
drugproducts.
Thisguidance
was
basedon
FDAand
Swedish
MPA
supportedresearch
andsubjected
toextensive
publicdiscussion
anddebate
beforeregulatory
implem
entation(1).Theoreticalanalysisand
experimentalresults
indicatedthata
drugperm
eability/solubilityclassification
scheme
canbe
usedas
abasis
todeterm
ineim
provedoraldrug
productdissolution
standards,for
therapeuticequivalence,
thatboth
reduceregulatory
requirementsand
improve
pharmaceuticalproductquality.
Inthe
caseofBCS
ClassIdrugs
inrapidly
dissolvingdrug
products,gastricem
ptyingisthe
ratedeterm
iningstep
fordrugabsorption,plasm
alevelsare
insensitiveto
formulation
changesand
noIVIVC
isexpected.
Thusbioequivalence
(BE)can
beassured
byproduct
dissolution!
Furtherextensions
ofw
aiversof
invivo
BEstudies
toClass
2and
Class3
drugand
drugproducts
canbe
developedbased
onm
oredetailed
dissolutionconsiderations
particularlyin
vitrodissolution
methods
basedon
thein
vivodissolution
processes.For
example
theEuropean
regulatoryagency
(EMA)
allows
biowaivers
forBCS
ClassIII
drugproducts.This
presentationw
illprovidean
overviewof
thedevelopm
ent,currentstatus
andfuture
extensionsofthe
BCSbased
approachto
regulatingoraldrug
productbioequivalencebased
onan
invitro
dissolutionstandard.Iw
illalsohighlight
theprocess
ofscience
basedregulatory
change,the
significanceof
regulatoryresearch,
andthe
importance
ofpublic
discussionand
debateofregulatory
sciencedevelopm
entsandissues.
1. G
.L. Am
idon, H. Lennernas, V
.P Shah and J.R. C
rison, A theoretical basis for a
biopharmaceutic
drug classification:
the correlation
of in
vitro drug
product dissolution and in vivo bioavailability, Pharm
. Res., 12, 413 (1995).
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IntestinalPermeability
Considerationswhen
Formulating
LowSolubility
Drugs:TheSolubility
Permeability
InterplayArik
Dahan,Ph.D.Departm
entofClinicalPharmacology
SchoolofPharmacy
BenGurion
University
oftheN
egevIsrael
Em
ail:arikd@bgu.ac.il
While
eachofthe
two
keyparam
etersoforaldrug
absorption,thesolubility
andthe
permeability,has
beencom
prehensivelystudied
separately,therelationship
andinterplay
between
thetw
ohas
beenlargely
ignored.Forinstance,w
henform
ulatinga
lowsolubility
drugusing
varioussolubilizationtechniques:w
hatarew
edoing
tothe
apparent permeability
when
we
increasethe
solubility?Perm
eabilityis
equalto
thedrug's
diffusioncoefficient
throughthe
mem
branetim
esthe
mem
brane/aqueouspartition
coefficientdivided
bythe
mem
branethickness.
Thedirect
correlationbetw
eenthe
intestinalperm
eabilityand
them
embrane/aqueous
partitioning,w
hichin
turnis
dependenton
thedrug's
apparentsolubility
inthe
GIm
ilieu,suggests
thatthe
solubilityand
theperm
eabilityare
closelyassociated,exhibiting
certaininterplay
between
them,and
thecurrentview
oftreatingthe
oneirrespectively
oftheotherm
aynotbe
sufficient.
Inthis
lecture,Iwilldescribe
theresearch
havebeen
donethus
far,andpresentnew
data,toshed
lightonthissolubility
permeability
interplay.Ithasbeenshow
nthatdecreased
apparentperm
eabilityaccom
paniedthe
solubilityincrease
when
usingdifferent
solubilizationm
ethods.On
theother
hand,we
haverecently
revealedthatw
henincreasing
theapparent
solubilityby
supersaturatione.g.
viaam
orphoussolid
dispersions,the
solubilityperm
eabilityinterplay
iscircum
vented,and
higherdrug
fluxthrough
them
embrane
andoverallabsorption
isachieved.
Overall,the
solubilityperm
eabilityinterplay
cannotbeignored
when
usingsolubility
enablingform
ulations;looking
solelyat
thesolubility
enhancement
thatthe
formulation
enablesm
aybe
misleading
with
regardsto
predictingthe
resultedabsorption,and
hence,the
solubilityperm
eabilityinterplay
must
betaken
intoaccount
tostrike
theoptim
alsolubility–perm
eabilitybalance,in
ordertom
aximize
theoverallabsorption.
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Farmacia
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15
Academia
andIndustry
Consortium:Collaborative
Researchon
DrugDevelopm
ent.ShinjiYam
ashita,Ph.D.Faculty
ofPharmaceuticalSciences
SetsunanU
niversity,Japan.
Japanesepharm
aceuticalindustrieshave
developedm
anyofinnovative
medicines
sofarsuch
aspravastatin,tacrolim
us,which
made
Japanas
oneofthe
leadingcountries
inthe
pharma
business.However,w
iththe
adventofparadigmshiftin
drugdevelopm
ent,activityof
pharmaceutical
industrydecreased
graduallyin
Japan.In
spiteof
theirhigh
levelin
pharmaceuticalscience
andtechnology,rather
smaller
sizeof
companies
(compared
with
mega
companies
inU
SAand
EU)m
akesa
newdrug
development
verychallenging
becauseofthe
smallersize
ofcompound
library,databaseand
budget.Asoneofthe
possiblew
aystokeep
thehigh
activityof
drugdevelopm
ent,Japanese
companies
shouldshare
theknow
ledgeand
technologiesinsom
eparts.
ConsortiumofO
ralDrugAbsorption
Screeningw
ith25
Japanesepharm
aceuticalcompanies
was
organizedat2001.Finalgoalofthe
consortiumis
toestablish
theeffective
strategyfor
developmentoforaldrug
product.Also,itaims
togive
aplatform
form
utualinteractionof
researchersw
orkingin
differentcom
panies.During
past10
years,various
projectsw
ereperform
edin
theconsortium
relatingto
oraldrug
absorptionand
theiroutcom
esw
ereshared
with
allmem
bercompanies.In
thelecture,asan
organizer,activityofthe
consortiumw
illbe
presentedw
ithshow
ingoutcom
esof
2m
ainprojects
for“assessm
entof
oralabsorption
ofpoorlysoluble
drugs”and
“BCSClassification
toidentify
drugdevelopability
asoralproducts”.
Governmentalsupport
isalso
essentialtoactivate
theindustry.As
anew
strategyof
drugdevelopm
ent,earlyphase
clinicalstudy(exploratory
IND
(eIND)study)including
Microdosing
(MD)study
wasproposed
toenhance
successprobabilityofclinicaltrial.In
Japan,inorderto
promote
eIND
study,nationalprojecton
MD
clinicalstudystarted
at2008
(supportedby
NEDO
:N
ewEnergy
andIndustrial
TechnologyDevelopm
entO
rganization),entitled
as“Establishm
entofEvolutionalDrugDevelopm
entwith
theU
seofM
icrodosingClinicalTrial”.
Inthe
project,w
eperform
edm
orethan
30M
Dclinical
studiesw
ithm
arketeddrugs
tovalidate
theusefulness
ofthisnew
strategyand
toconstructthe
system(both
softandhard)
forconducting
MD
clinicalstudy
inJapan.
Furthermore,
we
challengedthe
molecular
imaging
studyw
ithPET
toinvestigate
theprocess
ofGI
absorptionand
subsequentbio
distributionof
orallyadm
inistereddrugs.
Thisis
alsoa
collaborativew
orkw
itha
governmental
researchcenter
“Riken”.As
asecond
issueof
thelecture,
resultsof
thisinnovative
work
willbe
highlightedw
ithem
phasizingthe
importance
ofintegrationofnew
XICongresode
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technologiesindrug
developmentsuch
asmolecularim
agingm
odalities.N
anopharmaceuticals:creating,innovating
orcopying?M
ariaJosé
AlonsoResearch
CenteronM
olecularMedicine
(CIMU
S),SchoolofPharmacy,
University
ofSantiagode
Compostela,Spain
Email:m
ariaj.alonso@usc.es
Despitethe
recentintroductionofthe
nanomedicine
termin
thescientific
arena,theorigin
ofnano
drugdelivery,dates
fromthe
early60’s.It
isthanks
tothese
originalideas,that
we
havecurrently
inthe
market
asignificant
number
ofnanopharm
aceuticals.How
ever,the
fullpotential
ofnanom
edicineis
stillto
come.
Thispotential
isprom
isingbecause
overthelastdecadesw
ehave
initiateda
nonreturn
pathway,w
hichisthe
adoptionof
transdisciplinaryand
translationalapproaches
tothe
designand
development
ofnew
nanopharmaceuticals.
Inparticular,
theadvances
made
overthe
lastdecade
havebeen
largelyrelated
tothe
progressm
adein
thebiom
edicalfield(im
provedknow
ledgeofdisease
mechanism
s,identification
ofnew
targetsand
newbioactive
compounds…
etc)and
thenanom
aterialsfield
(newbiom
aterialsand
nanotechnologies).The
nanopharmaceutical
technologyarea
hasalso
contributedm
akingit
feasiblethe
nanoencapsulationand
controlleddelivery
ofcom
plexm
olecules,as
well
asdefining
ways
toscale
upthe
productionof
nanomedicines.N
evertheless,asignificant
amount
ofthis
researchrelies
inm
aking“m
eetoo”
deliverycarriers,w
hilethe
most
creativeactivity
stillneedsto
confrontgreathurdlesforitstranslation
tothe
clinic.
Ourgroup,being
comm
ittedw
iththe
translationofideasfrom
theuniversity
throughnovelpharm
aceuticaltechnology,hasdesigned
novelnanostructuredm
aterialsintended
totransport
drugsand
antigensacross
biologicalbarriersand
todeliver
themto
thetarget
tissue.During
my
presentationI
would
liketo
focuson
thedifferent
applicationsof
thenanocarriers
we
havedesigned.
Theseapplications
includecancer
therapy,nanovaccines
andoraldelivery
ofcom
plexm
acromolecules.M
oreinform
ationabout
theseapplications
andthe
literatureassociated
tothem
canbe
foundat:
http://webspersoais.usc.es/m
ariaj.alonso
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17
PolymerTherapeuticsasN
anomedicines:N
owand
FutureRuth
DuncanCardiff,U
Kand
PolymerTherapeuticsLab,
CIPF,Valencia,Spainhttp://w
ww
.ruthduncan.co.uk,profruthduncan@
btinternet.com
Over
recentdecades
agrow
ingnum
ber(>
40)nanomedicines
haveentered
routineclinical
useas
nanopharmaceuticals
andim
agingagents
(reviewed
in[1]).
Toput
intoperspective,this
compares
with
~1,200
NCEs
and>
100biologicals
approvedsince
1950[2].
Itisclearthatthe
21stcenturyw
illseem
anym
orecom
plexnanom
edicineproducts
arrivingto
firstinm
anstudiesand
intoroutine
clinicaluse.Thereare
currently>70
nanomedicinesin
clinicaltrials
asanticancer
therapiesalone.
Nanom
edicineshave
beendesigned
foradm
inistrationby
variousroutes
andthey
includea
diversearray
oftechnologies;e.g.ironoxide
nanoparticles(treatm
entof
anaemia
andas
MRI
imaging
agents),nano
sizeddrug
crystalsforimproved
oralbioavailability,liposomes,nanoparticlesand
polymertherapeutics.
Thepolym
ertherapeutics
aream
ongstthe
most
successfulfirstgeneration
nanomedicines
beingdesigned
asbiologicallyactive
drugs,andasconjugatesfordrug,protein,aptam
erandsiRN
Adelivery
andas
blockcopolym
ermicelles
tow
hichthe
drugis
covalentlybound
[3,4].An
increasingnum
berof"followon"
nanomedicine
productsare
nowem
ergingw
ithothers
(e.g.polym
ericdrugs,
PEGprotein
conjugates)on
thehorizon.
Itis
evidentthat
classicalrequirem
entsapplied
tosm
allm
oleculegeneric
drugs(pharm
aceuticalequivalence
andpharm
acokineticbioequivalence)
will
notbe
adequateto
ensureequivalent
safetyand
efficacyofcom
plex,multicom
ponentnanomedicines.
Polymer
therapeuticsare
amongst
them
ostsuccessful
firstgeneration
nanomedicines
(productslisted/discussed
in[1,3
6])and
thenum
berof
gainingproduct
approvalandentering
clinicaltrialcontinuestogrow
rapidly.Sow
hatisnew
?Em
erging‘hot’
topicshave
recentlybeen
reviewed
in[5,6]
andthey
include;(i)
useof
biodegradablepolym
erssuch
aspolyglutam
icacid
(PGA),dextrin,hydroxyethylstarch(HES),the
polyacetalFlexim
er®and
polysialicacid
togenerate
conjugatesentering
clinicaltrials
(endocyticcapture
onnon
degradablepolym
ersbrings
thepotentialrisk
oflysosom
alaccumulation
'lysosomal
storagedisease'
syndrome
(discussedin
[7,8]),(ii)
designof
bioresponsivepolym
erprotein
conjugatesw
ehave
recentlyw
ereported
anew
approachfor
proteinconjugation
calledpolym
erm
asking–unmasking
proteintherapy
(PUM
PT)and
(iii)the
developmentofpolym
erconjugatesfordeliveryofcom
binationtherapy
andastheranostics.
Thelatter
areboth
reviewed
in[6].Finally,it
isim
portantto
notethat
>2
decadeshave
passedsince
we
beganfirst
PhaseI
clinicaltrialsw
ithanticancer
syntheticpolym
erdrug
conjugatesand
theirrelated
gamm
acam
eraim
agingagents
(theranostics).Grow
ingunderstanding
ofthe
preclinicaland
clinicalm
echanisms
controllingw
holebody
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pharmacokinetics
andbody
distribution,tumour
targetingby
theEPR
effect,drugrelease
rateand
oftheendocytic
andintracellular
traffickingpathw
aysin
healthand
disease[7]is
bringingim
portantnew
opportunitiesfor
improved
preclinicalm
odelsand
theuse
ofpatient
specificbiom
arkersto
aidselection
ofthe
most
appropriatepatients
forpolym
ertherapeutic
therapy(discussed
in[1]).
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andIntracellular
Traffickingas
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edicine(s)andtheir
Regulation:AnO
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assessment
ofnanom
aterials:im
plicationsfor
nanomedicine”,
Ed.Fadeel,
B.,Pan
Stanfo rdPublishing,
inpress
XICongresode
laSociedad
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19
Novedadesen
bioequivalencia
Dr.AlfredoGarcía
Arieta.Jefe
deServicio
deFarm
acocinéticay
GenéricosDivisión
deFarm
acologíay
EvaluaciónClínica
AgenciaEspañola
deM
edicamentosy
ProductosSanitarios.
Ladem
ostraciónde
equivalenciaen
losproductosdeaplicación
localyefecto
localhaestado
limitada
porla
exigenciade
realizarcostosos
estudioscon
variablesclínicas.A
pesarde
quedichas
variablesson
insensiblespara
detectardiferencias
entreproductos
condistinta
biodisponibilidaddebido
aque
lacurva
dosis–respuesta,en
lam
ayoríade
estosproductos,
esbastante
planaen
elrango
terapéutico.Esta
presentacióndescribe
loscam
biosquese
hanproducido
eneste
campo
enlosúltim
osaños,entrelosque
destacanlas
nuevasaproxim
acionessim
plificadaspara
ladem
ostraciónde
equivalenciaen
losproductos
deinhalación,nasales,cutáneosy
gastrointestinales.
Recientemente,se
haadoptado
laGuía
sobrevalidación
dem
étodosbioanalíticos
dela
AgenciaEuropea
delM
edicamento
(EMA).
Enesta
presentaciónse
comentarán
brevemente
lasnovedadesexistentescon
respectoalestado
delarteque
sevenía
aplicandohasta
elmom
ento,basadasen
laactualguía
dela
Foodand
DrugAdm
inistrationde
EstadosU
nidos(US
FDA).
Próximam
entesaldrá
aconsulta
lanueva
revisiónde
laguía
sobreproductosde
liberaciónm
odificadade
laEM
A.
XICongresode
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20
TerapiaPersonalizada
enla
InfecciónporelVIH:Aplicación
deCriterios
Farmacocinéticosy
Farmacogenéticos.
MªJosé
GarcíaSánchez
Catedrática.Departamento
Farmacia
yTecnología
Farmacéutica.
Facultadde
Farmacia
Universidad
deSalam
anca.
Desdela
introducciónde
laterapia
antirretrovirallaeficacia
virológicaen
pacientesinfectados
deVIH
seha
incrementado
deform
asignificativa
yha
cambiado
lahistoria
deesta
patología,transform
ándolaen
unaenferm
edadcrónica
querequiere
tratamiento
alargo
plazo.Sinem
bargola
toxicidadfarm
acológicaconstituye
elprincipalobstáculopara
eléxito
deltratamiento,observándose
además
unaim
portantevariabilidad
interindividualen
elgrado
deexposición
yconsecuentem
enteen
larespuesta.
Secree
quevariaciones
genéticasentre
lospacientes
podríanjustificar
unafracción
significativade
lavariabilidad
farmacocinética
observada.
Lainform
aciónfarm
acocinéticaobtenida
mediante
lapráctica
dela
monitorización
(TDM)
puedeser
unaherram
ientam
uyútil
parala
optimización
deltratamiento
antirretroviral.Aunque
aúnpresenta
ciertaslim
itaciones,la
medida
rutinariade
lasconcentraciones
plasmáticas
puedeproteger
alospacientes
dela
apariciónde
efectosadversos
yprevenir
elfracasovirológico.
Lavariabilidad
farmacocinética
observadaen
losfárm
acosantirretrovirales
dependede
lasalteraciones
quese
producenen
losprocesos
delLADME,
especialmente
enla
biodisponibilidady
elmetabolism
o.En
consecuencia,la
existenciade
polimorfism
osgenéticos
paraciertasproteínas
implicadas
eneltransporte
ym
etabolismo
deestos
fármacos
puedenexplicar
deform
aim
portanteesta
variabilidadfarm
acocinéticainterindividualque
condicionasu
respuesta;laintegración
dela
información
farmacogenética
yfarm
acocinéticapodría
permitir
ungran
avanceen
laoptim
izaciónde
laposología
deltratamiento
antirretroviral.
EnFarm
acogenéticalas
variantesgenéticas
más
frecuentemente
estudiadasson
lospolim
orfismos
deun
úniconucleótidos
oSN
Ps(single
nucleotidepolim
orphisms)en
genesinvolucrados
enel
trasporte,m
etabolismo
otoxicidad
delos
fármacos.
Lasisoenzim
asCYP3A4,CYP3A5,CYP2C19,CYP2D6,CYP2A6
yCYP2B6
sonlas
dem
ayorparticipación
enel
metabolism
ode
losfárm
acosantirretrovirales
porello,son
lospolimorfism
osrelacionados
conestasisoenzim
aslosmás
ampliam
enteestudiadosen
losúltimosaños.
Apesar
delos
numerosos
estudiosrealizados
sobrela
influenciade
factoresgenéticos
delhuésped
enpacientes
infectadoscon
VIH,cuya
información
actualizadase
puedeencontrar
enla
web
ww
w.hiv
pharmacogenom
ics.org,sonpocos
losbiom
arcadoresgenéticos
convenientemente
validadosque
laFDA
recomienda
utilizarenla
prácticaclínica.
Enelm
omento
actualelmejorejem
plode
aplicaciónclínica
eneltratam
ientodelVIH
esla
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21
asociaciónencontrada
entreel
antígenode
histocompatibilidad
delalelo
B5701
(HLAB*5701)y
elriesgode
reaccionesde
hipersensibilidadpara
abacavir.Dehecho
eltestpara
detectareste
polimorfism
ose
haintroducido
recientemente
como
prácticaclínica
estándarprevia
ala
prescripciónde
estefárm
aco.Otra
asociaciónbien
establecidaes
laobservada
entrealgunos
delos
alelosdelgen
quecodifica
elCYP2B6con
lafarm
acocinéticay
latoxicidad
deefavirenz,
porlo
quesu
caracterizacióntam
biénha
sidopropuesta
parala
individualizaciónde
ladosis
deeste
fármaco
enun
intentode
reducirsus
efectosadversos
sobreel
SNC.
Otras
asociacionessignificativas
incluyenlos
polimorfism
osde
UGT1A1
yM
DR1yla
hiperbilirrubinemia
observadaen
lostratam
ientoscon
atazanaviry
lapresencia
delHLADRB*0101
relacionadacon
unaum
entodelriesgo
dehepatotoxicidad
denevirapina.
También
sehan
descritoasociaciones
genéticaspara
laneuropatía
periférica,la
lipodistrofia,lahiperlipidem
ia,lapancreatitis
yla
tubulopatiaproxim
alrenal,perotodavía
noexisten
resultadosconcluyentes
queperm
itansu
aplicaciónclínica.
No
obstante,la
información
genómica
presentaun
granpotencialen
laindividualización
delos
tratamientos
farmacológicosdelVIH,pero
seprecisan
superarproblemaslogísticosy
realizarmásestudios
decoste
efectividadpara
poderincorporar
laFarm
acogenéticaa
lapráctica
asistencialdeesta
patología.Nuestro
grupoha
incorporadola
farmacocinética
yla
farmacogenética
enel
seguimiento
terapéuticode
lospacientesdentrode
unprogram
aintegraldeltratam
ientode
lainfección
porVIH.
XICongresode
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ComunicacionesO
rales
NU
EVA
GEN
ERA
CIÓ
N D
E NA
NO
PAR
TÍCU
LAS ELA
BO
RA
DA
S A B
ASE D
E ÉSTERES D
E SO
RB
ITÁN
(SPAN
® 80):POTEN
CIA
L APLIC
AC
IÓN
EN TER
APIA
GÉN
ICA
A. Pensado
1,G.K
. Zorzi 3, E.S. Carvalho
4, A. Sánchez
1,2 , B. Seijo
1,2
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica,Universidad de Santiago de C
ompostela.
2Grupo de Im
agen Molecular. ID
IS. Com
plejo Hospitalario U
niversitario de Santiago.3Institut für B
iologie und Biotechnologie der Pflanzen
Westfälische W
ilhelms U
niverstät - Münster
4Universidade Federal do R
io de Janeiro - Cam
pus UFR
J - Macaé.
INT
RO
DU
CC
IÓN
La búsqueda
de nuevos
sistemas
para la
vehiculización de fármacos, supone un reto constante
en el ámbito de la investigación farm
acéutica. En este m
arco, la nanotecnología se ha situado como una
alternativa prometedora, sin duda por las m
últiples ventajas que ofrece (1). H
asta el mom
ento se han desarrollado m
uchos tipos de nanosistemas (p.ej.
micelas, em
ulsiones,nanopartículas
y liposomas),
utilizando diferentes
tipos de
biomateriales.
Sin em
bargo la búsqueda de nuevos componentes, a ser
posible, seguros y de bajo precio, así como m
étodos de preparación cada vez m
ás sencillos, no cesa.
En esta línea, el objetivo de este trabajo ha sido el desarrollo una nueva generación de nanopartículas a partir de m
ateriales biocompatibles, biodegradables,
y de bajo coste y que, además, se utilizan desde hace
tiempo en Tecnología Farm
acéutica (por ejemplo
como tensoactivos) que son los ésteres de sorbitán,
conocidos con el nombre com
ercial de Span, por un
procedimiento de preparación sencillo y escalable y,
en la medida de lo posible, versátil con el que sea
posible obtener
nanopartículas de
características fácilm
ente modulables y, por tanto, con capacidad
para incorporar moléculas bioactivas m
uy diversas.
Más concretam
ente, en este trabajo se ha utilizado el m
onooleato de
sorbitán(SP80)
como
material
formador de las nanopartículas, solo o com
binado con la am
ina grasa oleilamina (O
A), y un plásm
ido m
odelo(pEG
FP),con
el objetivo
de evaluar
la posible aplicación de estas nuevas nanopartículas en terapia génica.
MA
TE
RIA
LE
S Y M
ÉT
OD
OS
Preparación :Para
la elaboración
de las
nanopartículas se parte dela disolución de SP80 o
SP80 + OA
en etanol (fase orgánica) la cual seadiciona
bajo agitación
magnética
suave a
una solución acuosa,de m
anera quelas nanopartículas se
forman de m
anera espontánea.A
continuación, el etanol se elim
ina apresión
reducida en un rotavapor(2) obteniéndose
la suspensión
de nanopartículas
blancas.En una fase posterior, es posible asociar a
estas partículasm
oléculas bioactivas en disolución (p.ej.
el plásm
ido m
odelo pEG
FP) m
ediante su
incubación con los nanosistemas en una proporción
1:1 (v/v), bajo agitación.C
aracterísticas fisico-químicas: El tam
año medio de
las partículas se determinó
por espectroscopía de correlación
fotónica y
su carga
superficialen
términos del potencial
, por anemom
etría de Láser D
oppler. Para estudiarsu m
orfología se ha recurrido a
la microscopía electrónica de transm
isión (TEM) y
la asociación del plásmido m
odelo (pEGFP) a los
sistemas se determ
inó mediante electroforesis en gel
de agarosa al 1%.
Cultivos celulares: La línea celular H
EK 293 (H
uman
Embryonic K
idney 293 cells), fue cultivada en medio
MEM
(Modified Eagle M
edium), suplem
entado con un
10%
de suero
fetal bovino
y penicilina/
estreptomicina al 1%
. Se mantuvieron a 37ºC
con un 5%
de CO
2 en atmósfera húm
eda.Estudios
de transfección:
Las células
HEK
293
fueron sembradas a una densidad de 250.000 células
por pocillo. El medio de cultivo fue reem
plazado por H
BSS que contiene los nanosistem
as asociando el pEG
FP a diferentes dosis .Las nanopartículasfueron
incubadas con las células durante 4 horas y se evaluó la transfección pasadas 48
y 72 horas m
ediante m
icroscopía de fluorescencia.
RE
SUL
TA
DO
S Y D
ISCU
SIÓN
Mediante esta nueva técnica que ha sido diseñada y
patentada en
nuestro laboratorio,
se han
podido obtener partículas de m
onooleato de sorbitán SP80, con un tam
año nanométrico (117 nm
) y potencial negativo (-33 m
V). A
mbos valores son fácilm
ente m
odulables ya que, cuando se incorpora OA
junto con el SP80,las partículas que se form
an presentan un
tamaño
mayor
(210 nm
) y
carga superficial
positiva (+30 mV
). Estas partículas son a priori idóneas
paraasociar
moléculas
activascargadas
negativamente
mediante interacciones electrostáticas,
como es el caso del plásm
ido modelo pEG
FP. Este plásm
ido ha
sido incorporado
a distintas
concentraciones, sin que afecte significativamente al
tamaño
nanométrico
de las
mism
as en
elrango
estudiado (~290-340 nm),(Tabla 1).
Por el
contrario, la
incorporación del
DN
A
plasmídico sí produce una inversión en el valor de
potencial, el cual se hace cada vez m
ás negativo a m
edida que se aumenta la proporción de pD
NA
.
Tabla 1:
Caracterización
físico-química
de los
nanosistemas asociando D
NA
plasmídico. (PD
I: Índice de polidispersión)
Mediante el análisis de TEM
, (Figura 1), podemos
corroborar el tamaño nanom
étrico y la forma esférica
de las
partículas así
como
la presencia
de una
población homogénea.
Figura 1. Morfología de las nanopartículas SP80O
A+
pEGFP observadas m
ediante TEM a diferentes aum
entos.
Los sistemas desarrollados son
capaces de asociar eficazm
ente pEGFP a las concentraciones estudiadas,
como
se ha
comprobado
en el
estudio de
electroforesis (Figura 2) ya que, a diferencia de lo que ocurre con el pEG
FP libre, no se observa la m
igración del material genético a través del gel de
agarosa.
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 1%, de las
formulaciones SP80O
A con diferentes cargas de plásm
ido. 1) pEG
FP libre 2) pEGFP-
0,15 mg/m
l 3) pEGFP-
0,2 m
g/ml 4) pEG
FP- 0,25m
g/ml 5) pEG
FP-0,3 mg/m
l
Para estudiar la capacidad de transfección de estas nuevas
nanopartículas se
ha seleccionado
la form
ulación preparada con una concentración de 0,2 m
g/ml de plásm
ido, la cual se ha incorporado a las células a distintas dosis (1- Figura 3, se aprecia la expresión celular positiva de la proteína verde fluorescente en la línea celular H
EK
293, transcurridas
72 horas
post-transfección. M
ediante m
icroscopía de
fluorescencia se
ha
comprobado que dicha expresión presenta un perfil
dosis-dependiente hasta alcanzar un máxim
o (3 g),
manteniéndose casi constante a partir de este valor.
Estos resultados nos permiten confirm
ar la elevada eficacia de transfección de esta nueva generación de nanopartículas, incluso a dosis tan bajas del plásm
ido m
odelo como las que se han utilizado en este estudio.
Figura 3. Expresión celular positiva de proteína verde fluorescente
72 post-transfección.
Nanopartículas
SP80OA
+ pEGFP (0,2m
g/ml). A
) 1 g pEG
FP, B) 2
gpEG
FP,C) 3
g pEGFP, D
) 4 g pEG
FP.
CO
NC
LU
SION
ES
Se ha
desarrollado una
nueva generación
de nanosistem
as, usando cono componente principal el
monooleato de sorbitán (Span
®80). El m
étodo de preparación
es sencillo,
rápido, de
bajo coste
y fácilm
ente escalable, lo cual facilitará su producción a
nivel industrial.
Son adem
ás sistem
as m
uy versátiles ya que, gracias a la sim
ple incorporación de com
ponentes adicionales a su estructura (p.ej. OA
), podem
os m
odular am
pliamente
sus propiedades
fisico-químicas y facilitar
por tanto,la incorporación de m
oléculas terapéuticas, como se ha com
probado para
el caso
concreto del
DN
A
plasmídico.
Efectivamente, se ha verificado su gran capacidad
para asociar cantidades elevadas de pDN
A, así com
o tam
bién su eficacia de transfección incluso utilizando dosis bajas de plásm
ido. Por ello consideramos que
estas nanopartículas
son sistem
as potencialm
ente interesantes para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, com
o por ejemplo en el cam
po de la terapia génica.
RE
FER
EN
CIA
S1. D
uncan, R. and R
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anomedicine(s)
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AG
RA
DE
CIM
IEN
TO
SM
ATER
A/B
BM
-1856 10TMT203011PR
MA
T2010-20452-C03-02
Formulación
pDN
A(m
g/ml)
Tamaño
(nm)
PdIPotencial
(mV
)SP80
----116,9±5,3
0,10- 33,2±2,5
SP80OA
----200,5±10,2
0,08+ 30,3±5,5
0,15340,3±15,3
0,13- 11,1±0,4
SP80OA
+pEG
FP0,2
287,1±5,10,12
- 19,5±1,5
0,25295,2±8,3
0,14- 20,5±0,3
0,3317,6±3,2
0,13- 22,2±0,4
AB
CD
B
1 2 3 4 5
D
The effectiveness of edelfosine lipid nanoparticles in enhancing the drug cytotoxicity in breast cancer cells
Ángela A
znar Góm
ez, Beatriz Lasa-Saracíbar, A
nder Estella-Herm
oso de Mendoza, M
aría J. Blanco-Prieto
Pharmacy and Pharm
aceutical Technology Departm
ent, University of N
avarra, Spain.
Introduction
Breast
cancer is
the fifth
most
comm
on cancer
worldw
ide after
lung cancer,
the second
most
comm
on cause of cancer death, and the leading cause of cancer death in w
omen (1). The global burden of
breast cancer
exceeds all
other cancers
and the
incidence rates
of breast
cancer are
increasing.Treatm
ent approaches
for breast
cancer include
surgery, chem
o and
radiotherapy and
hormone-
therapy and depend on the stage and targeted therapy. H
owever, the survival rates for patients in advanced
stages of the disease remain low
(1). Consequently,
new treatm
ent options have to be studied to improve
these rates.
The antitumor ether lipid edelfosine (ET-18-O
CH
3) is the prototype of a novel generation of prom
ising anticancer
drugs that,
in contrast
to m
ost chem
otherapeuticagents currently in use, does not
target the
DN
A
of the
cells (2).
This alkyl-
lysophospholipid is
incorporated into
biological m
embranes
as a
natural lipid
compound
of the
cellular bilayers (3). Edelfosine selectively induces apoptosis in tum
or cells, acting through lipid rafts (4,5). The fact of encapsulating this drug into lipid nanoparticles (LN
) increases its oral bioavailability and decreases toxicity (6). B
esides, LN m
ay modify
the entrance mechanism
of the ether lipid into breast cancer cells and this m
ight overcome the resistance
that some cell lines show
to the free drug (7). They are also able to m
odify the drug distribution profile in order
to im
prove drug
bioavailability through
controlled release (6).
Objectives
The aim of this study w
as to develop LN loaded w
ith edelfosine to enhance its therapeutic activity against breast cancer cells.
Material and M
ethods
Preparation of lipid nanoparticlesLN
w
ere prepared
by the
hot hom
ogenization m
ethod, consisting of high shear homogenization and
ultrasonication (8,
9). The
drug (30
mg
per form
ulation) was m
elted in Precirol ®lipid at 70ºC
. A
Tween
®80 aqueous
solution heated
at the
same
temperature w
as added onto the molten lipid and
dispersed with the help of high shear hom
ogenization and ultrasonication. The em
ulsion that was obtained
was left to cool dow
n at room tem
perature in order for the nanodrolets to solidify into LN
, and these
were concentrated by ultra-filtration using A
micon
®
Ultra 10,000 M
WC
O filters at 4,500 x
gfor 30
minutes and w
ashed twice w
ith distilled water. The
resulting suspension was frozen at -80ºC
for at least 3 hours, freeze-dried and stored at 4ºC
.
Nanoparticle characterization
Nanoparticle
size and
polydispersity index
were
determined
in triplicate
by photon
correlation spectroscopy and zeta potential by laser doppler anem
ometry, using a Zetasizer N
ano (Malvern, U
K).
The am
ount of
edelfosine nanoencapsulated
was
determined using an ultra-high perform
ance liquid chrom
atography-tandem m
ass spectrometry m
ethod (6). C
ell cultureM
CF7
breast cancer
cell line
was
grown
in D
ulbecco's m
odified Eagle's
medium
(D
MEM
) supplem
ented w
ith 50
U/m
l penicillin,
50 U
/ml
streptomycin and 10%
calf serum (H
yclone) at 37in a hum
idified incubator supplemented w
ith 5%
carbon dioxide
In vitro proliferation assay: MTT assay
The M
TT assay
is a
colorimetric
method
for determ
ining the
number
of viable
cells in
proliferation (10). This assay is based on the cleavage of
yellow-colored
tetrazolium
salt, (3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyl tetrazolium
brom
ide) to
a blue-colored
formazan
by the
mitochondrial
enzyme
succinate-dehydrogenase of
the living cells (11). The absorbance of this colored solution can be quantified by m
easurement w
ith a spectrophotom
eter. The
amount
of form
azan produced during a given exposure period is directlyproportional to the num
ber of viable cells per well.
MTT solution w
as added directly to the culture media
at a final concentration of 0.5 mg/m
L and then incubated for 3 hours. A
fterwards, M
TT containing m
edium
was
removed
from
all w
ells and
the rem
ainingcells containing form
azan crystals were
dissolved in DM
SO. O
ptical density was determ
ined w
ith a 96-well plate reader by using an absorption
spectrum of 540 nm
against the blank wells in the
standard curve.
Results and discussion
Nanoparticle characterization
Nanoparticles w
ere characterized in terms of size,
zeta potential,
encapsulation efficiency
and drug
loading. All the form
ulations showed a sim
ilar size, w
ith a mean diam
eter of 164 (8) nm
. Zeta potential w
as -26 mV
, which is an acceptable value to obtain
good physical stability and to avoid cell mem
brane
instability. Drug loading w
as 31.42 (±3.72) g/m
g. The
polydispersity index
was
0.27 (±0.01),
suggesting hom
ogenous dispersion.
The encapsulation efficiency (%
EE) was 64.85 (±6.85) %
.
In vitroassays
The optimized LN
containing edelfosine (ET-LN)
were effective in inhibiting proliferation of M
CF7
breast cancer cell line at an IC50
concentration of 12.9
g/mL after 72 hours of incubation (Fig 1). The
IC50
values of
free edelfosine
(ET) and
blank (unloaded) nanoparticles (B
-LN) w
ere 17.8 and 28.7 g/m
L respectively.
Morphological changes
Optical
inspection of
the cell
cultures revealed
morphological changes in M
CF7 cells 48 hours after
the treatment either w
ith ET or ET-LN. C
ompared
with untreated cells and cells incubated w
ith B-LN
, treated cells show
ed expression of small vesicles
(apoptotic bodies, see arrows in Fig. 2) in som
e cells. In addition, treated groups show
ed unattached and distorted cells, w
hich is indicative of cell death.
Conclusion
The edelfosine loaded LN developed display higher
efficacy in treating MC
F7 breast cancer cells than the free drug. Presently, the cytotoxicity m
echanism of
action of ET-LN is under evaluation by assessm
ent of cell cycle and apoptosis using flow
cytometry.
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"Ortiz
de Landázuri" fellow
ship) and the Spanish Ministry of
Science and Innovation (SAF2007-61261, SA
F2010- 15547)
Fig 1 Inhibitory effect ofET, B-LN andET-LN in MCF7
breast cancer cells. Cell viability was determined by MTT assa y after 72 hours of treatment.
Fig 2Morphological changes of MCF7 cells after 48 hours
incubation. Cells grown in medium containing either ET or ET-LN show hints of cell damage and production of apoptotic bodies (arrows).
In vivoadm
inistration of VE
GF-releasing biodegradable nanospheres in a m
ouse model(A
PP/Ps1)of Alzheim
er’s disease
E. H
errán1,2,R
. Perez- Gonzalez
3,4,M. Igartua
1,2, J.L. Pedraz
1, 2,E. C
arro 3,4,R.M
. Hernández
1, 2
1NanoBioC
el Group, Laboratory of Pharm
aceutics, University of the B
asque Country (U
PV/EH
U), School of Pharm
acy, Vitoria, Spain ; 2B
iomedical
Research N
etworking C
enter in Bioengineering, B
iomaterials and N
anomedicine (C
IBER
-BB
N), V
itoria, Spain.3N
euroscience Laboratory, Research
Center,
Hospital
12 de
Octubre,
Madrid,
Spain; 4N
eurodegenerative D
iseases B
iomedical
Research
Center (C
IBER
NED
), M
adrid, Spain.
Introduction:A
lzheimer’s disease (A
D) is the m
ost com
mon neurodegenerative disorder characterized by a
progressivecognitive decline. The pathological signs of
the disease are high levels of amyloid beta-peptide
, presence of neurofibrillary tangles, neuronal lossand
cerebrovascular pathologies.
These regional
microvasculature
alterations establish
an im
portant abnorm
alityin
clearance, resulting in an increasingto
the brain.
This perception suggests that this vascular alteration m
ay have a significant role in A
D1.
VEG
F is a mayor
regulator of angiogenesis into the brain. It is also involved in neuroprotection and B
BB
integrity. For these reasonscurrent research efforts are
focusedin new
V
EGF delivery system
sto obtain
a continuous and direct drug release into the brain
2. In this w
ork we propose a novelstrategy
based onthe
encapsulation of
VEG
F in
PLGA
biodegradable
nanospheres(N
S) w
hich can
be adm
inistered by
craniotomy directly into the brain. The in vivo
and in vitro
studies were carried out in order to evaluate the
capacity of VEG
F-NS to restore the neuronal loss,
cerebrovascular abnorm
alitieclearance.E
xperimental m
ethods:PLG
A (50:50) nanospheres
loaded with V
EGF (V
EGF-N
S)and em
pty-NS
were
preparedby m
odification of a previously described (W
1 /O/W
2 ) double
emulsion
solvent evaporation
technique3.
After
NS
preparation, the
following
parameters
were
characterized: particle
size, m
orphology, zeta
potential, and
encapsulation efficiency.
Moreover,
VEG
F in
vitrorelease
and bioactivity assays in neuronal cultures w
ere conducted.To carry out in vivo
studies24
female 6 m
onth-old am
yloid precursor
protein/presenilin-1 (A
PP/Ps1) double transgenic m
ice(12 m
ice receiving VEG
F-NS
and 12 mice em
pty-NS) w
ere used. The NS
were
dropped directly
into the
cerebral cortex
after craniotom
y and excision of the dura mater(Fig. 1).
Cerebral cortex
PLGA-N
S
Duram
ater
Figure 1.VEG
F-NS
diffusion after the administration into the
brain.
3 m
onthsafter
VEG
F-NS
were
implanted
mice
behavior was evaluated over a
10-day period. Finally, anim
als w
ereperfused
transcardially for
inmunohistochem
ical examination.
Results
and discussion:
All
NS
had a
uniform
morphology
with
a sm
ooth surface
devoid of
irregularities.The mean particle size w
as 235± 0.111
nm for V
EGF-N
S and 267±
0.111nm
for empty-M
S (Fig. 2).
Figure 2. SEM photom
icrographof V
EGF-N
S
Figure 3 representsthe release profile of V
EGF-N
S. The release profile w
as biphasic, with an initial burst in
the first dayand a second constant release rate untilthe
end of the assay.
0 50
100
150
200
250
300
350
05
1015
2025
3035
VEGF (ng/ml)
Time
(days)
Figure 3.In vitroV
EGF-N
S release profile at 37ºC in PBS
buffer (pH 7.4). V
alues are represented as mean ± SD
(n=3).
To confirm the biological activity of the encapsulated
VEG
F, bioactivity assays were perform
ed in neuronal cultures. different V
EGF concentrations released from
V
EGF-M
S were added at the sam
e time of seeding
cells. After 8 days the cell viability w
as statisticallyincreased in V
EGF 10 ng/m
l and 50 ng/ml treated
groups(one w
ay AN
OV
A, **p<0.001and ***p<0.0001
with respect to control and em
pty-MS) (Fig.4).
0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.800
VEGF 1
VEGF 5
VEGF 10
VEGF 50
Control -Em
pty-MS
*****
O.D
Figure 4.Viability evaluation in neuronal cell cultures.
To prove VEG
F protection against lipopolysaccharide (LPS), neuronal cell cultures w
ere treated for 24h with
VEG
F, LPS, VEG
F+LPS and control group (Fig.5).
The addition
of V
EGF
protected neuronal
cultures against
the cytotoxicity
caused by
LPS(one
way
AN
OV
A, **p<0.01and ***p<0.0001
respect to LPS group).
Figure 5.Live/Dead V
iability/Citotoxicity test in neuronal
cultures(green: live cells/yellow: dead cells).
In vivoefficacy
of encapsulated VEG
F was assessed
analyzing behavioral
deficits after
VEG
F-NS
administration. In the T-m
aze, choice trial latencies of V
EGF-N
S group were significantly decrease com
pared w
ith em
pty-NS
group(one
way
AN
OV
A,
***p<0.0001) (Fig. 6).
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Empty-N
SVEGF-N
S
Latency (seconds)
***
Figure 6. T-maze behavior test in A
PP/Ps1 mice.
VEG
F-NS
administration
suggested that
the adm
inistration of VEG
F-NS reduced the percentage of
these depositsin A
PP/Ps1 mice brain
(t-student *p< 0.05 em
ty-NS vs V
EGF-N
S)(Fig. 7).
Figure 7. Adeposits in cerebral cortex of A
PP/PS1 mice.
levelsw
ere measured in cerebral cortex. These data
indicate that animals receiving V
EGF-N
S treatment had
(t-student *p<0.01)w
hen compared w
ith empty-N
S(Fig.8).
0 20 40 60 80
100
120
Empty-N
SVEGF-N
S
**
A 1-42 (% Control)
Figure 8.
Conclusion:PLG
AV
EGF - N
Sm
ay be a potential therapeutic strategy to decrease neuronal loss in vitro
in vivo, as well as able to im
prove behavioral deficits in A
PP/Ps1 mice.
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E. Herran thanks the B
asque Governm
ent for the Fellowship grant.
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IMIZA
CIÓ
N D
E L
A A
CT
IVID
AD
DE
DO
XO
RR
UB
ICIN
A E
N C
ÁN
CE
R D
E M
AM
A
ME
DIA
NT
E U
NA
NA
NO
PLA
TA
FOR
MA
POL
IMÉ
RIC
A B
IOD
EG
RA
DA
BL
EJ.L. A
rias 1,C. M
elguizo2,J. Prados 2,R
. Ortiz
3, L. Cabeza
2, M.A
. Ruiz
1,R. Luque
4, B. G
ónzalez4, V
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allardo1, A
. Aránega
2
1Dpto.de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Granada, España.
2Instituto de Biopatología y M
edicina Regenerativa (IB
IMER
), Dpto. de A
natomía y Em
briología H
umana, U
niversidad de Granada, España.
3Dpto. de C
iencias de la Salud, Universidad de Jaén, España.
4Servicio de Medicina O
ncológica, Hospital V
irgen de las Nieves, G
ranada, España. e-m
ail: jlarias@ugr.es
Introducción: La
necesidad de
encontrar tratam
ientos quimioterápicos eficaces ha hecho
que se incrementen las líneas de investigación
en oncología.
Esto ha
permitido
un m
ayor conocim
iento de los orígenes moleculares del
cáncer, con
el consiguiente
desarrollo de
novedosas estrategias farmacoterapéuticas. Sin
embargo, los
antitumorales
utilizados en clínica suelen exhibir serias
limitaciones que conducen
a unfracaso del tratam
iento, incluso en tipos de cáncer teóricam
ente sensibles (1).Por ejemplo,
a pesar de la notable actividad antitumoral de la
doxorrubicina, suuso se encuentra seriam
ente lim
itado por el desarrollo de resistencias por las células tum
orales y por importantes reacciones
adversas (p. ej., cardiotoxicidad) (2).Para
solventarestos problem
as se han asociado m
oléculas antitumorales con coloides
basados en
nanopartículas biodegradables.
Así,
sepretende aum
entar la acumulación específica
del fárm
aco en la masa
tumoral e increm
entar el tiem
po de exposición de las células cancerosas a éste (1, 3). Las partículas diseñadas con este fin se construyen
principalmente con
polímeros o
materiales de carácter lipídico (1, 3,
4).C
omo
ejemplo, los polím
eros alquilcianoacrilato hanm
ostradograndes posibilidades com
o material
base para el diseño de estos nanosistemas. D
e hecho,
diferentes estudios
preclínicosdem
uestransu
eficacia com
o vehículos
de anticancerosos,
incluso en
células m
alignas resistentes (5). N
uestroobjetivo es desarrollar
una (nano)formulación basada en partículas de
poli(butilcianoacrilato) (PBC
A)
como sistem
a transportador
de doxorrubicina
(DO
X),
y valorar su actividad en cáncer de m
ama.
Materiales y M
étodos: El agua utilizada fuedesionizada
y filtrada
(Milli-Q
, M
illipore, Francia).
Los reactivos
empleados
eran de
calidad analítica (Sigma-A
ldrich, Alem
ania). Elm
onómero butilcianoacrilato fue un regalo de
Henkel Loctite (Irlanda).
La síntesis de nanoesferas de PBC
A (diám
etro m
edio135 nm
) se realizó porpolim
erización en em
ulsión del monóm
ero:éste
(1%, p/v, en
acetona) se
incorporó, bajo
agitación (1200
rpm), a un m
edio acuosocon una concentración
10-4N
de HN
O3
y un 1% (p/v) de pluronic
F-
68. Tras 3 horas deagitación, se neutralizó con
cantidad suficiente de NaO
H para asegurar el
final de la polimerización.
La incorporación deD
OX
en las nanopartículas de PB
CA
se realizó por:i) adsorción superficial del fárm
aco en las partículas preformadas
(t = 24 h.); y, ii) incorporación de D
OX
en la solución de acetona donde el m
onómero está
disuelto antes de polimerizar. En este últim
o caso,
se analizó
la influencia
sobre la
vehiculizaciónde
las concentraciones
de fárm
aco, m
onómero
y tensioactivo.
La incorporación
(y liberación)
de D
OX
se
cuantificó m
ediante un
método
validado de
espectrofotometría
UV
-Vis
(481 nm
). La
liberación de DO
Xse estudió m
ediante diálisis.A
continuación, la actividad antitumoral in vitro
de las partículas cargadas con DO
X (PB
CA
-D
OX
) se investigó en la línea MC
F-7 de cáncer de m
ama, utilizando el test colorim
étrico MTT
(azul de
tetrazolio). Las
células M
CF-7
se incubaron con cantidades
crecientes de PBC
A
(control), D
OX
y PB
CA
-DO
X.
La dosis
La actividad citotóxica se determinó m
ediante el cálculo de la concentración inhibitoria cincuenta(IC
50 ).A
demás, se evaluó cualitativam
ente la captación
intracelular de
DO
X
mediante
microscopía
de fluorescencia (470 y 570 nm).
Finalmente,
se indujeron
tumores
sólidos subcutáneos en ratones C
57BL/6
concélulas
E0771de cáncer de m
ama.
Los grupos de tratam
iento (n
=10)
fueron: suero
salino (control), PB
CA
(placebo), D
OX
(dosis: 10
mg/K
g)y
PBC
A-D
OX
(dosis equivalente a 10m
g/Kg
de D
OX
). El
tratamiento
comenzó
cuando el tamaño de los
tumores era
75m
m3.
Los días 0, 3, 6, 9y 12 se adm
inistraron las form
ulaciones vía i.v., siguiéndose la evolución del tam
año del tumor. El estudio fue aprobado
por el Com
ité Ético de la Facultad de Medicina
(UG
R).
La toxicidad de las formulaciones se
evaluó mediante seguim
iento de la mortalidad,
daño tisular, alteraciones en el comportam
ientoy peso corporal relativo de los anim
ales. Todos
los experim
entos se
realizaron por
triplicadoy su análisis estadístico se realizó
mediante la prueba tde Student.
Resultados y D
iscusión:En com
paración con el m
étodo de adsorción superficial, se lograron unos valores de entrapm
ent efficiency(%
) y drug loading
(%) significativam
ente mejores
mediante el m
étodo de absorción en matriz. Por
ejemplo, si
la concentraciónutilizada de D
OX
era 10
-2M (óptim
a para la vehiculización), estos parám
etros pasaban
de 22.3%
y
3.6%
(adsorción) a 49.3%
y 14.8%
(absorción), respectivam
ente. D
e todas
las variables
que podían afectar a la incorporación de D
OX
en la m
atriz de PBC
A, sólo la concentración de este
fármaco
tuvo una
influencia significativa.
También resultó precisa
una concentración de tensioactivo
del 1%
(m
/v) para
obtener partículas adecuadas para la vía parenteral.La liberación in vitro
de este fármaco (figura 1)
se produce según unproceso bifásico si se
incorpora en la matriz: rápida liberación de la
DO
Xsituada
a nivel superficial (37%
en 1 h.), seguida de una fase lenta consecuencia de la difusión del antitum
oral o de la degradación polim
érica por erosión superficial (completa en
24 h.). Sin embargo,si la D
OX
se incorpora poradsorción, el proceso term
ina en tan sólo 3 h.
Figura 1.Liberación de D
OX
(%), adsorbida
a en PB
CA
,en función del
tiempo de incubación en PB
S (pH 7.4) a 37 ºC
.
La citotoxicidad de PBC
A-D
OX
en la línea M
CF-7 (IC
50significativam
ente superior a la de D
OX
en solución (IC50
= 0.5 p
< 0.001).
Tiempos
de incubación
mayores
(48 y
72 h.)
confirmaron
estos resultados.
El análisis
de m
icroscopía de
fluorescencia puso
de m
anifiesto cóm
o la
asociaciónde
DO
X
con PB
CA
acrecentaba
notablemente la intensidad de la fluorescencia a
nivel citoplasmático y en el núcleo (t = 1, 2 y 4
h.), lo cuál podría ser consecuencia de una m
ayor entradacelular de D
OX
.En cuanto a la actividad antitum
oral de las form
ulaciones en un modelo m
urino (C57B
L/6) de tum
or sólido subcutáneo (células E0771) (figura 2), puede apreciarse cóm
o las partículas PB
CA
-DO
X m
ejoran la actividad antitumoral
de esta molécula quim
ioterápica. La inhibicióndel crecim
iento del tumor, en com
paración con
DO
X, resultó ser significativa los días 21, 24 y
27 (p< 0.05) y m
uy significativa los días 30y
33 (p< 0.001).A
l final del tratamiento (día 12),
el desarrollo de la masa tum
oral fue inhibido en el 90%
de los ratones tratados con PBC
A-D
OX
. Finalm
ente, no se apreció toxicidad alguna en el grupo de anim
ales tratado con PBC
A-D
OX
.
Figura 2.
Actividad
antitumoral
de PB
CA
-D
OX
(equivalente a
10 m
g/Kg)
yde
una solución de D
OX
(10 mg/K
g), comparado con
el grupo
control (suero
salino) y
el grupo
placebo (PBC
A). Figura insertada:
ejemplo de
masas tum
orales de los grupos tratados con PB
CA
-DO
X y D
OX
(t = 33 días).
Conclusiones:
Hem
os desarrollado
un procedim
iento reproducible para la síntesis de nanopartículas PB
CA
-DO
Xadecuadas para la
administración
parenteral. Los
resultados obtenidos en los estudios preclínicos realizadosabren una interesante vía para el
tratamiento
eficaz del cáncer de mam
a.
Referencias:
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Agradecim
ientos:Proyectos FIS 11/02571 y
FIS 11/01862 (Instituto de Salud Carlos III,
España).
SISTE
MA
S SUPR
AM
OL
EC
UL
AR
ES D
E PO
LO
XA
MIN
A-C
ICL
OD
EX
TR
INA
-SIMV
AST
AT
INA
C
OM
O PR
OM
OT
OR
ES D
E D
IFER
EN
CIA
CIÓ
N D
E C
ÉL
UL
AS M
AD
RE
A O
STE
OB
LA
STO
S. S.M
.N. Sim
ões 1,2, F. Veiga
1,2, J.J. Torres-Labandeira3, A
.C.F. R
ibeiro4, A
. Concheiro
3, C. A
lvarez-Lorenzo
3
1Departm
ent of Pharmaceutical Technology and 2C
entre for Pharmaceutical Studies, Faculty of
Pharmacy, U
niversity of Coim
bra, Portugal.3D
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica,
Facultad de Farmacia, U
niversidad de Santiago de Com
postela, España. 4Departm
ent of Chem
istry, Faculty of Sciences and Technology, U
niversity of Coim
bra, Portugal.
Introducción: La
elevada prevalencia
de enferm
edades degenerativas y accidentes obliga a
prestar una
atención creciente
a procedim
ientos de
regeneración de
hueso y
cartílagoque resulten una alternativa eficaz a
los trasplantes.
Adem
ás de
los andam
iajes rígidos
cargados con proteínas morfogénicas, en
el tratam
iento de
defectos críticos
pueden resultar
muy
útileslos sistem
assem
isólidos inyectables
que adquieren
una consistencia
elevada al entrar en contacto con el medio
fisiológico. Estos sistemas se pueden im
plantar por procedim
ientos mínim
amente invasivos, con
lo que la cicatrización es más rápida y el riesgo
para los pacientes es menor. R
ecientemente, se
ha observado quelos copolím
eros de poli(óxido de etileno) (PEO
) y poli(óxido de propileno) (PPO
) de
la fam
ilia de
las poloxam
ina (Tetronic
®) pueden
dar lugar
a sistem
as de
gelificación in
situ[1]
biocompatibles
con osteoblastos
y capaces
de actuar
como
implantes
de cesión
sostenida de
proteínas m
orfogénicas [2]. Adem
ás, algunas variedades de poloxam
ina, como el T908, presentan por sí
mism
as actividad osteoinductora, dandolugar in
vitroa una notable proliferación de células
madre
que, en
unos días,
se diferencian
a osteoblastos y form
an matriz m
ineralizada[2].
Otra alternativa a las
proteínas morfogénicas y
que tam
bién busca
reducir los
costos del
tratamiento,
es el
fármaco
hipolipemiante
simvastatina
que, en un estrechointervalo de
concentraciones,puede inducir la regeneración
ósea [3]; si bien es muy hidrofóbico y difícil de
formular. El objetivo de este trabajo es diseñar
sistemas
inyectables viscoelásticos
que com
binen una elevada retención en eldefecto
crítico conla capacidad osteoinductora de la
poloxamina
T908y
la sim
vastatina. Para
optimizar
la concentración
del copolím
ero bloque,se ensayó el efecto de la incorporación de
-ciclodextrina -C
D),
que puede
engarzarse enlos bloques PEO
y actuar de enlace
entre los
de cadenas
adyacentes, increm
entando de
forma
muy
notable la
viscoelasticidad del entramado [4].
Materiales y M
étodos:Preparación
de los
geles. A
partir
de disoluciones de T908 (B
ASF, A
lemania) y de
-
CD
(Wacker, A
lemania) en tam
pón fosfato se prepararon m
ezclas cubriendo entre 1 y 13% de
T908 y de 0 a 9.7% de
-CD
, y se almacenaron
a 4, 20 y 37ºC.
Reología. Se
registraron los
módulos
de alm
acenamiento (G
’) y de pérdida (G’’) de los
geles a 0.5 Pa en el intervalo de 0.5a
50 rad/s usando una geom
etría cono-plato(6 cm
, 2º) a 10, 25 y 37 ºC
en unR
heolyst AR
-1000N (TA
Instrum
ents, UK
).H
ET-CAM
test.La biocompatibilidad se evaluó
depositando 0.3 ml de gel en la m
embrana
corioalantoidea de huevos incubados siguiendo el protocolo IC
CV
AM
[5]. Solubilización de
simvastatina.
Se incorporó
fármaco en exceso a 5 m
l de gel y los sistemas
se mantuvieron a 25
ºC y 50 rpm
durante 5 días. A
continuación, los sistemas se filtraron, la
concentración total de simvastatina disuelta se
cuantificó espectrofotométricam
ente a 239 nm
(Agilent
8453, A
lemania)
y su
estabilidad quím
ica se valoró mediante H
PLC a 238 nm
utilizando una colum
naLiC
hroCA
RT R
P-C18
(3.9 x 150 mm
, 5 M
) a 25 ºC, y
acetonitrilo:28 m
M tam
pón fosfatopH
4 (65:35, 1 mL/m
in) com
o fase
móvil isocrática Los tiem
pos de retención de las form
as hidroxiácida y lactona fueron 3
y6 m
in, respectivamente.
Cesión de sim
vastatina. Se depositaron 2 ml de
gel en el compartim
ento dador de células Franz-C
hien y 6 ml de tam
pón fosfato pH 7.4 en el
receptor.C
omo
separador se
utilizó una
mem
brana de acetato de celulosa (0.45 m
, 0.785 cm
2). A intervalos de tiem
po, se retiraron
por HPLC
. Actividad
fosfatasa alcalina
(ALP).Se
sembraron
células m
adre m
esenquimales
derivadas de tejido adiposo humano (Stem
Pro, Invitrogen, U
SA) en placas de 6 pocillos (3x10
4
células/pocillo, 2.5
mL)
y sobre
soportes Transw
ell se añadieron de T908 (4 y
8%)/
-CD
(0 y 5%) geles conteniendo o no
simvastatina (0.08 y 8.5
M). C
omo controles
negativo y positivo se utilizaron las células en m
edio de
cultivo y
en m
edio osteogénico,
respectivamente.
Tras 3,
7 y
12 días
de incubación,
se determ
inó la
ALP
[2].La
proliferación celular se determinó m
ediante un ensayo M
TT [2].
Resultados y D
iscusión: Preparación
de los
gelesy
caracterización reológica.
La poloxam
ina T908
da lugar
a sistem
as de gelificación in situa 37ºC
cuando su concentración es del 20%
. La incorporación de -C
Dal
5-7%
permitió
obtener geles
viscoelásticos con tan sólo el 1% de T908
(Figura 1). Los geles se formaron en pocas
horas a 4 ó 20ºC
, resultando estables durante al m
enos un mes. Proporciones m
ás bajas de -C
Do incubación a 37
ºC dio lugar a fenóm
enos de separación de fases.Todos los geles presentaron una elevada citocom
patibilidad en el test HET-
CA
M.1
10100
10-3
10-2
10-1
100
101
102
103
104
105
106
G' y G'' (Pa)
Frecuencia angular (rad/s)
G' 1% T+ 0%
CD G'' 1%
T+ 0% CD
G' 4% T+ 0%
CD G'' 4%
T+ 0% CD
G' 8% T+ 0%
CD G'' 8%
T+ 0% CD
G' 1% T+ 5%
CD G'' 1%
T+ 5% CD
G' 4% T+ 5%
CD G'' 4%
T+ 5% CD
G' 8% T+ 5%
CD G'' 1%
T+ 5% CD
Figura 1.M
ódulos de almacenam
iento (G’) y
de pérdida (G’’) de dispersiones de T908 al 1, 4
y 8% en ausencia y en presencia de
-CD
al 5%.
Solubilización y cesión de simvastatina.
Las dispersiones de
-CD
y T908 presentaron una elevada capacidad para
solubilizar simvastatina,
incrementando su
solubilidad aparente en PBS
entre 3
y 12
veces.A
demás,
los geles
sostuvieron la cesióndurante varios días (Figura
2).
024
4872
96120
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Simvastatina cedida (mg/cm2)
Tiempo (horas)
1% T908 + 0%
CD
2% T908 + 0%
CD
1% T908 + 5%
CD
2% T908 + 5%
CD
Figura 2.Perfiles de difusión de sim
vastatina en PB
S a partir de dispersiones de T908 al 1 y 2%
en ausencia y en presencia de -C
Dal 5%
.
Actividad fosfatasa alcalina(ALP). El estudio
con células madre m
esenquimales se inició
con un screening de concentraciones de sim
vastatina (0.08 a
equivalente a 0.01 a en el
medio de cultivo) con el fin de identificar la que
da lugar a valores de ALP m
ás elevados. Apartir
de los
resultados de
este estudio
se seleccionaron
0.08 y 8.5sim
vastatinapara
incorporarla en los geles. Los estudios con células m
adre mesenquim
ales confirm
aron la elevada citocompatibilidad y el
efecto osteoinductor de las dispersiones de T908 y revelaron que la presencia de sim
vastatina aum
enta aúnm
ás la ALP
(Figura 3).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
Actividad fosfatasa alcalina (nmol/min/mg proteina)
Tiempo (dias)
C -C +
4 T9084 T908 + 0.08 SV
4 T908 + 8.5 SV4 T908+ 5 CD
4 T908+ 5 CD + 0.08 SV4 T908+ 5 CD + 8.5 SV
37
12
Figura 3.A
ctividad ALP de células m
adre m
esenquimales en m
edio de cultivo (control negativo), m
edio osteogénico estándar (control positivo) y m
edio con T908 al 4%, sin y con
-C
Dal 5%
, y sin y con simvastatina a dos
concentraciones diferentes.
Conclusiones: La com
binación de poloxamina
con -C
Dy sim
vastatina da lugar a inyectablesde elevada citocom
patibilidad y con actividad osteogénica, con propiedades reológicas y de cesión fácilm
ente modulables.
Referencias:
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severe irritants.http://iccvam
.niehs.nih.gov/methods/ocut
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Agradecim
ientos:Trabajo financiado por la X
unta de Galicia
(10CSA
203013PR),
FEDER
y
MIC
INN
(SA
F2011-22771). S.M.N
. Simões agradece la
beca Praxis
SFRH
/BD
/48324/2008de
FCT
Portugal.
NA
NO
PAR
TÍC
UL
AS D
E PO
LI-C
APR
OL
AC
TO
NA
CO
MO
SISTE
MA
DE
LIB
ER
AC
IÓN
C
ON
TR
OL
AD
A D
E FÁ
RM
AC
OS PA
RA
APL
ICA
CIÓ
N T
ÓPIC
A.
A.M
elero1,2,A
. Ourique
3,A. Pohlm
ann3,5, S. G
uterres 3,4, R. B
eck3,4,
U
.F. Schaeffer 2
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Universidad de V
alencia, España.2D
epartment of B
iopharmacy and Pharm
aceutical Technology. Saarland University. G
ermany.
3Programa de Pós-G
raduação em N
anotecnologia Farmacêutica, U
niversidade Federal do Rio G
rande do Sul, Porto A
legre, RS, B
razil
4Programa de Pós-G
raduação em C
iências Farmacêuticas, Faculdade de Farm
ácia, Universidade Federal
do Rio G
rande do Sul, Porto Alegre, R
S, Brazil
5Departam
ento de Quím
ica Orgânica, Instituto de Q
uímica, U
niversidade Federal do Rio G
rande do Sul, Porto A
legre, RS, B
razil.
Introducción: C
lásicamente,
la vía
de adm
inistración tópica se ha utilizado para tratarpatologías locales o m
odificar el aspecto de la piel. La piel hum
ana conforma una barrera que
protege de forma m
uy efectiva al organismo
frente a la entrada de xenobióticos, de forma
que la mayoría de los fárm
acos no son capaces de atravesarla
en cantidad suficiente para dar lugar a un efecto sistém
ico. En las últimas
décadas, sin embargo,
se ha demostrado que
determinados fárm
acos pueden difundir a su través hasta generar niveles plasm
áticos de fárm
aco suficientespara dar lugar a un efecto
terapéutico sistémico, e incluso, toxicidad en
algunos casos. Este fenómeno representa un
problema im
portante para el tratamiento local.
Es el
caso de
la tretinoína,
fármaco
muy
efectivo en casos de acné, dermatitis crónica o
psoriasis 1pero
que presenta
una gran
teratogenia, de forma que las pacientes deben
también
recibir terapia
anticonceptivasuplem
entaria, con
sus subsecuentes
efectos indeseados. Si adem
ás la aplicación de este fárm
aco ha de ser crónica, la calidad de vida de los pacientes puede verse m
uy afectada. La m
ometasona
es un
corticoide m
uy utilizado
también en casos de psoriasis o eccem
a, en que las áreas de aplicación pueden ser m
uy extensas y, por tanto, el acceso de fárm
aco a sangre alto. Los
corticoides, a
su vez,
pueden producir
efectos secundarios muy graves que afecten al
metabolism
o y
reduzcan las
defensas del
sistema inm
unitario.En
este trabajo,
se presenta
una form
a farm
acéutica de
liberación controlada
para fárm
acos lipófilos de aplicación tópica, como
son tretinoína
o m
ometasona,
basada en
la encapsulación
de fárm
aco en
partículas polim
éricas de poli-caprolactona y formuladas
como
hidrogel. El objetivo de este tipo de form
ulación es
conseguir la
liberación controlada
de fárm
aco para
aumentar
su perm
anencia en
la piel,
el tejido
diana, y
retardarla
absorción sistém
ica de
grandes cantidades de fárm
acode form
a rápida, con el
fin de
disminuir
los efectos
sistémicos
indeseados 2. M
ateriales y Métodos:
Para cada fármaco, se
formularon
tres lotes
diferentes de
nanopartículasen suspensión por el m
étodo de deposición
interfacial de
Fessi 3.Las
nanocápsulas se caracterizaron en términos de
tamaño, polidispersión, y m
orfología.Para cada fárm
aco se prepararó un hidrogel con el fármaco
en suspensión
y otro
con el
fármaco
encapsulado, conteniendo
ambos
una concentración final de 0.05%
. En el caso de la tretinoína, el gel se preparó utilizando carbopol (0.5%
). Para la mom
etasona, se utilizó hidroxi-etil-celulosa al 2%
. Se realizaron ensayos de perm
eabilidad a través de epidermis hum
ana separada por calor a partir de los hidrogeles, utilizando células de difusión estáticas de tipo Franz. A
demás, se estudió
la permeabilidad de
fármaco a partir de una solución de fárm
aco yuna
suspensión de
nanopartículas, a
título com
parativo.Los
ensayos se
realizaron en
condiciones de dosis infinita, 32ºC, agitación a
500 rpm, utilizando PB
S pH 5.5/etanol (50:50)
como
solución receptora,
para asegurar
las condiciones sink
2,4. Por últim
o, se realizaron estudios de penetración de fárm
aco a partir del gel de mom
etasona y del gel de partículas de m
ometasona, m
ediante las técnicas de tape-stripping y criosección
5. R
esultados y
Discusión:
Las partículas
obtenidas presentaron forma esférica, incluso
después de ser incorporadas al gel (figura 1), un tam
año de
alrededor de
200 nm
, con
una polidispersión
inferior al
0.2, considerada
adecuada para este tipo de nanopartícula2.
Enlos estudios de perm
eabilidad, se puede observar en am
bos casosuna dism
inución de la perm
eabilidad de fármaco form
ulada en forma
de nanocápsula o de hidrogel respecto a la solución (figuras 2
y3). El efecto es m
ucho más
acusado en el caso de la tretinoína (figura 2).A
demás,
en este
caso, la
encapsulación de
fármaco
permite
un control
mayor
de la
permeabilidad
de tretinoína
respecto del
hidrogel, independientem
ente de
si se
incorporan al hidrogel.En el caso de la m
ometasona, este efecto se
reproduce (figura 3). Si bienlas form
ulaciones con las nanocápsulas
en suspensión presentanuna
permeabilidad
ligeramente
superior respecto
al hidrogel,
las diferencias
no son
significativas.Adem
ás, se pudo comprobar por
microscopía
la form
ación de
cristales de
fármaco dentro de la estructura del gel, que
actuarían com
o reservorio
de fárm
aco. Este
efecto, junto con el efecto de la matriz del gel,
controlaría la liberación final de fármaco. Sin
embargo, el efecto de las nanocápsulas en el
control de la liberación de fármaco es m
ayor, independientem
ente de la formulación utilizada.
Figura 1: Imagen de un hidrogel conteniendo nanocápsulas
de mom
etasona [escala = 100 nm (300,000x)].
Figura 2.Perfiles de permeabilidad de tretinoína a partir de
las distintas formulaciones. M
ometasone
Time (h)
05
1015
2025
30
Permeated Cum Amount/area ( g/cm²)
0 1 2 3 4
MF-Solution
MF-H
GM
F-NC
-HG
MF-N
C-Suspension
Figura 3.Perfiles de permeabilidad de m
ometasona a partir
de las distintas formulaciones.
Figura 4:Distribución de m
ometasona en las distintas capas
de la piel.En
la figura
4se
presentan los
resultados obtenidos
por tape-stripping
con la
mom
etasona. Se comprueba que tras
un periodo de incubación de 2 h, el fárm
aco satura el estrato córneo y perm
ite el paso a capas más
profundas de la piel, siendo mayor en el caso
del hidrogel. Estos resultados complem
entan y son
consistentes con
los obtenidos
en los
ensayos de permeabilidad.
Conclusiones:
Los ensayos
realizadosdem
ostraron que
lasnanocápsulas
de poli-
caprolactona preparadas con ambos fárm
acos presentan
características físico-quím
icas adecuadas para su inclusión en form
ulaciones tipo hidrogel y que son efectivas para el control de
la adm
inistración de
fármacos
de form
a tópica sobre la piel, resultando en form
ulaciones que
producen una
mayor
permanencia
de fárm
aco en
el tejido
diana y
una m
enor absorción
sistémica.
Cabe
esperar de
estos resultados pues una m
ayor eficacia y una menos
aparición de efectos sistémicos adversos.
Referencias:
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Barrier: M
ethods and Protocols, Hum
ana Press, N
ew Y
ork (2011), pp. 33–50
Agradecim
ientos:Los
autores desean
agradecer a la fundación CA
PES por la beca de A
.O
urique, los
proyectosIN
CT_if,
CN
Pq/Brazil,
CA
PES/Brazil,
y R
ede N
anocosméticos
MC
T/CN
Pq/Brazil, así com
o el proyecto B
MB
F BR
A 09/017.Tam
bién a P. M
eiers por su asistencia técnica en los ensayos de perm
eabilidad.
Tretinoin Permeation through H
HSE
Time (h)
05
1015
2025
3035
0 5 10 15 20 25
Solution Suspension-ncG
el-ncG
el-no-nc
AC
QU
IRIN
G K
NO
WL
ED
GE
ON
AN
TIB
AC
TE
RIA
L E
FFEC
T O
F BIO
AC
TIV
E G
LA
SS BY
NE
UR
OFU
ZZY
LO
GIC
M.M
. Echezarreta, M. Landin
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia, U
niversidad Santiago de C
ompostela, 15782, Santiago de C
ompostela, A
Coruña
Introduction:B
ioactive glasses
(BG
) are
special systems com
posed by SiO2 , C
aO, P
2 O5 ,
and NaO
that show bioactive behaviour due to
their ability of bonding soft and hard tissues through com
plex reactions(1). B
Gs have been
employed
for clinical
use for
a variety
of m
edical applications,
including surgical
orthopaedics and dentistry. B
acterial colonisation of the used materials is
the most im
portant reason of failure of thesesurgeries.A
ntibacterialproperties of B
Gs have
been studied by different authors(2). The
wide
variety of biomaterials and conditions (bacteria
and antim
icrobial conditions
or glass
pretreatment)
in those studies hinder general conclusions
beingobtained
onthe
specific factors that influence the bactericidal capacity and the best com
bination of characteristics in achieving the m
aximum
antibacterial effect.A
rtificial intelligence tools allow the treatm
ent of historical data and finding general or new
patterns from
a datasetin a process named “data
mining” (3).In particular, the
neurofuzzy logic(N
FL)approach combines the adaptive learning
capabilities from artificial neural netw
orks with
the generality of representation from fuzzy logic
through sim
ple rules.
NFL
has proven
its usefulness
in m
odelling com
plex non-linear
relationships hidden
in data,
giving higher
accuracy in prediction than classical statistics and
helping the
understanding of
thoserelationships betw
een variables (3).The aim of
this study was to establish general conclusions
about BG
antibacterial effect from an extensive
database from literature,
findingthe specific
factors that influence the results of bactericidal capacity
of B
Gs
experiments
using N
FLapproach M
aterials y Methods:
A large database (348
facts) on antimicrobial
properties of
several bioactive
glasses w
as generated from
10 previously published articles from
2000 to 2010.The grow
th index was
modelled
using 21 variables or inputs thatcan
be classified
intothree
groups. B
Gs
characteristics [production
method,
BG
s
composition regarding com
poundconcentration
(SiO2 , C
aO, N
a2 O
, P2 O
5 , MgO
, K2 O
, Al2 O
3 ,B
2 O3 , A
g2 O
, CuO
) (w/w
%), particle size (
m),
morphology as nanoparticles, pow
der, particles and
fibresand
BG
concentration
(mg/m
L)].B
acterial characteristics [microorganism
specie including S. aureus, S. epiderm
idis, E. faecalis, E.
coli, P.
aeruginosa and
S.typhi,
and m
orphology (bacillus
orcoccus)]
and m
icrobiological experim
ental conditions
[bacterial concentration (CFU
/mL), culture tim
e (h) and culture m
edia (buffered solutionsand
nutrient solution)]. The output recorded w
as the growth index
(GI),
measured
as a
function of
the num
ber of
survival bacteria colonies. Absence of grow
th (G
I= 0)
indicates bactericidal
effect. V
ery sparse, sparse and m
oderate values of GI (G
I=1 betw
een 0-5 colonies, G=2 betw
een 5-50 and G
=3 betw
een 50-300
colonies, respectively
indicate moderate grow
th. The growth index of
4 (>300
colonies) indicates
no effect.
Com
mercial N
FLsoftw
are, FormR
ules v3.31 (Intelligensys Ltd, Stokesley, U
K) w
as used. The training process w
as conducted, in the same
way, as reported previously by other authors (4).
Results and D
iscussion: The com
mon factor in the published studies on
antibacterial properties
of B
Gs
is the
great variability in the conditions used w
ith regard to the bacteria types, com
positions and sizes of B
Gs as w
ell as microbiological param
eters used. In this situation to establish general conclusions on
the optim
al B
Gs
properties to
assure antibacterial activity is a com
plex task.The 21 inputs and the corresponding grow
th index reflect the m
ain variables (independent and dependent) included in the articles from
literature. The large database on antibacterial properties of B
Gs m
aterials was successfully
modeled (train set r 2
= 76.31, computed f-
ratio=5.81 w
ith 19
and 348
f.d., <0.01)
allowing the selection of the critical factors or
inputs which accurately explain the variability
of the growth index, selected as output.
Fig.1 presents the four sub-models considered
by NFL to explain the G
I variability and the inputs included by them
. It is interesting to note the reduced num
ber of inputs, five (SiO2
and A
g2 O
concentration, BG
concentration, bacteria specie and bacteria concentration) out of the tw
enty one that NFL
hadselected as the ones
having an important effect on the grow
th index
or, in
other w
ords, enough
to explain
GI
variability. Therefore, the sub-models
generated pointing out a significant input interaction of SiO
2and B
G concentration (in purple) as the
main
effect and
the interaction
of B
G
concentration and bacteriaspecie, the single
effects of
Ag
2 O
and bacteria
concentrations affecting grow
th index (Fig. 1).
Figure 1. Submodels w
ith indication of significant inputs that explain variability of growth index (G
I) and set of IF…
THEN
rules and corresponding confidencelevelsgenerated by N
FL
NFL
technology allows a set of “IF…
.THEN
” rules per sub-m
odel with their corresponding
mem
bership degrees to be generated(3). U
sing those
rules, N
eurofuzzy generates
understandable and reusable knowledge on the
antibacterial activity of BG
s.The
meaning
of Low
, M
edium
and H
igh depends on the range of dataset values for variables
BG
,A
g2 O
,bacteria
and SiO
2concentrations (explanation at reference 3).Surprisingly,
antibacterial effect
cannot be
explained by particle size or production method
as indicated by other authors. BG
bactericidal effect
depends m
ainly on
BG
chemical
composition and its dissolution properties in the
surrounding medium
. Model indicates that B
G
has no effect when its concentration in the
experiment is low
and the silicon concentration is m
edium or high (subm
odel 1, rules 2 and 3) or the B
G concentration is high and the silicon
concentration is also high (submodel 1, rule 6).
Our findings agree w
ith previous authors which
correlate BG
antibacterial properties with the
imm
ediate release
of alkaline
species. The
higher the silicon concentration the lower the
alkaline species
that can
be release
to the
medium
and the lower its bactericidal effect.
From our results, it can also be deduce that
silver is
decisive for
the B
G
antibacterial
activity (subm
odel 2,
rule 8).
Its effect
is confirm
ed w
hen the
Ag
2 O
concentration is
higher than 1.5%.
The significant effect of the interaction, BG
s concentration and the bacterial specie points out differences
in the
susceptibility of
bacteriatreatm
ent with B
Gs, E. faecalis
and S. typhibeing the m
ost resistant species (submodel 3,
rules 9, 10 and 14). Those differences can be explained by variations in the structure and/or association of bacteria.C
onclusions: N
FLw
as able
to m
odel an
extensive database
of historical
results on
bioactive glasses,
to determ
ine the
critical variables that explain their
antibacterial activity and to present conclusions in an explicit form
at. R
eferences : (1)
Hench
et al., J Biom
ed Mater R
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Acknow
ledgements
This w
ork w
as supported
by the
POC
TEP0330IB
ERO
MA
RE1P project, FED
ER
Long-term
controlled brain delivery of microencapsulated G
DN
F induces functional and structuralrecovery
of the dopaminergic nigrostriatal pathw
ay in parkinsonian monkeys
E. Garbayo
1,E. Ansorena
2, H. Lana
1, J.L. Lanciego3, M
.J. Blanco-Prieto
1
1Pharmacy and Pharm
aceutical TechnologyD
epartment, U
niversityofN
avarra, Spain2B
iochemistry &
Molecular B
iologyD
epartment, U
niversity of Navarra, Spain
3Neurosciences D
ivision,CIM
A, U
niversity of Navarra, Spain
Introduction:G
lial cell
line-derived neurotrophic
factor (G
DN
F), a
promising
therapeutic agent for Parkinson’s disease (PD),
is a naturally occurring protein found in the brain
that prom
otes dopam
inergic neurons
growth, regeneration and protection. D
ifferent approaches
comprising
cell grafts,
gene therapies
and direct
delivery m
ethods using
infusion pum
ps have
been attem
pted (1).
Results obtained in PD
animal m
odels were
confirmed by tw
o phase I trials carried out in PD
patients (2-4). These studies consisted on the
intraputaminal
delivery of
the ‘naked’
protein through an infusion pump. H
owever, by
using a similar approach, a double blind phase II
trial did not confirm earlier expectations and
GD
NF w
as withdraw
n from clinical trials due to
lack of efficacy and safety concernssuch as the
appearance of
blocking antibodies
against exogenous unglycosylated G
DN
F (5). Efficient G
DN
F brain
concentrations using
existing delivery m
ethods require repeated injections or pum
p reservoir refilling and are difficult to sustain, due to protein degradation in solution and
to GD
NF low
penetration when injected
intracerebroventricularly.G
DN
F encapsulation in
biodegradable and
biocompatible
microparticles (M
P)could represent a valuable
therapeutic approach. GD
NF-M
P efficacy was
assessed by
our group
in a
PD
rat m
odel show
ing that GD
NF-M
P were
able to achieve long-term
neuroprotection and neurorestoration and dem
onstrating that MP
were an efficient
vehicle for
sustained neurotrophic
factor delivery to the brain (1,6).
Objetive
The main objective of this w
ork was
to elucidateif the controlled release of G
DN
F through M
Pdrug delivery system
s in a primate
PD anim
al model is
a useful strategy for (i) im
proving motor perform
ance and (ii) restoring the
striatum
dopaminergic
reinnervation, w
ithout leading tosafety concerns.
Material and M
ethods:H
uman
recombinant
glycosylated GD
NF expressed and purified by
our group
was
used in
these studies
(7,8). G
DN
F-MP
were prepared and characterized as
previously described (1).B
riefly, GD
NF-M
P w
ere prepared bysolventextraction/evaporation
method using Total R
ecirculating One M
achine
System
(TRO
MS)
technology.G
DN
F encapsulation
efficiency w
as quantified
by W
estern Blot. R
eleased GD
NF bioactivity w
as assessed using the PC
-12 cellline as described (1).
Anim
al handling
was
conducted in
accordance with
the European Council D
irective 86/609/EEC
. The
experimental
design w
as approved by the U
niversity of Navarra Ethical
Com
mittee for
Anim
al Testing (CEEA
/050-11)as w
ellas by the H
ealth Departm
ent from the
Navarra G
overnment (ES/31-2016-000001-U
S).Ten
adult male M
acaca fascicularism
onkeys w
ere used in the study.A
nimal basal m
otor function
was
assessed using
clinical rating
scales (CR
S). Basal dopam
inergic function was
measured
by 11C
-(+)--dihydrotetrabenazine
positron em
ission tom
ography ( 11C
-DTB
ZPET). This radioligand binds specifically to the vesicular m
onoamine transporter and is use as a
dopaminergic
innervationm
arker.B
lood sam
ples were obtained at various point tim
es before and after treatm
ent to evaluate serum IgG
antibody response against G
DN
F. In order to evaluate fine m
otor skills, animals w
ere trained on a hand-reach test. To create the anim
al m
odel, prim
ates w
ere lesioned
with
the dopam
inergic neurotoxin
1-methyl-4-phenyl-
1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). M
PTP was
weekly adm
inistered intravenously (0.5mg/kg)
until each monkey reached a stable parkinsonian
syndrome. The severity of the M
PTP-induce parkinsonism
was evaluated using C
RS
and 11C-
DTB
ZPET.O
nly macaques w
ith parkinsonian syndrom
esstables forat least 2 months after last
MPTP injection
were enrolled in the study.
Macaques
were random
ly assigned to receive unilateral adm
inistration of eitherGD
NF-loaded
MP or non-loaded M
P. Each monkey received
25G
DN
Fdivided in four
implantation
siteswithin
the putamen. A
nimal m
otor function w
as evaluated
weekly
after treatm
ent using
CR
S. In
order to
assess changes
in the
dopaminergic
terminal
integrity, the
dopaminergic function w
as measured
by 11C
-D
TBZ PET every 90 days. N
ine months after
MP
injection anim
als w
ere perfused
transcardiacally w
ith a
fixing solution
containing 4%paraform
aldehyde in 0.125 M
phosphate buffer, pH 7.4. C
oronal sections (40 w
ere used for imm
unohistochemistry
studies.
Results:
Hum
an glycosylated
GD
NF
was
successfully m
icroencapsulated in
MP
using TR
OM
S technology.
The m
ean particle
size m
easured by laserdifractom
etry was 39
mw
hichw
as totally compatible w
ith stereotaxic injection according
with previous studies.
Drug
entrapment efficiency w
as 70%. The in vitro
bioactivity assay with PC
-12 cells showed that
released GD
NF from
MP w
as biologically active.The potential neurorestorative
effect exerted by m
icroencapsulated GD
NF w
as next evaluated in a PD
primate m
odel. GD
NF dose appeared to be
well tolerated and no
apparent safety or toxicity concern after G
DN
F-MP putam
inal deliveryw
as observed. N
oneof the m
acaques showed w
eight loss, a com
mon side effect observed after G
DN
F adm
inistration.M
icroencapsulated G
DN
F im
proved bradycinesia,
rigidity and
postural instability, the m
ain cardinal PD sym
ptoms. C
RS
scores im
proved steadily
after treatm
ent in
GD
NF-treated
animals
compared
to control
animals for m
ost time periods. The perform
ance on the hand-reach task w
as also improved in
GD
NF-treated
animals.
Six-month
PET scan
showed a bilateral increase in 11C
-DTB
Z uptake in G
DN
F-MP
treated monkeys w
hile non-loaded M
P animals did not show
ed a significant change from
baseline
in 11C
-DTB
Z uptake
in either
hemisphere
(Fig1).
Fig 1: 11C-D
TBZ PET im
ages before and after treatment w
ith G
DN
F-MP
and w
ith non-loaded-M
P. G
DN
F-MP
administration
induced a
progresive increase
in the
radioligand uptake in the target areas (striatum; caudate
and putam
en).
The increasein 11C
-DTB
Z uptake was correlated
with
improvem
ents in
the C
RS.
Postmortem
analysis
confirmed
increased dopam
inergic activity
and show
ed enhanced
tyrosine hydroxilase-positive fiber innervation of lesioned putam
en (Fig 2). Further histological studies are currently
being perform
ed in
order to
fully characterize G
DN
F-MP long term
effect and to elucidate the m
echanism by w
hich GD
NF exerts
its neuroprotective/neurorestorative effect.
Fig 2: Coronal section through the prim
ate brain taken at the m
idline decussation of the anterior comm
issurelevel. (A
) Low
-power
photomicrograph
showing
the left
and right
putamen. Square areas indicated by dashed lines show
the places from
which the insets w
ere taken. (B) H
igher-power
photomicrograph
taken from
panel
A
showing
tyrosine hydroxylase-positive (TH
+) fibers density w
ithin the left putam
en following G
DN
F-loaded MP delivery. (C
) Panel illustrating the deposit of G
DN
F-loaded MP. (D
) Higher-
power photom
icrograph showing TH
+fibers density w
ithin the right putam
en. By com
paring B&D
it becomes
evidentthat G
DN
F slow release from
theM
Pinduced an increase on
dopaminergic term
inalsdensity. Such increase is m
aintained in putam
inal territories located far away from
the implanted
site.
Conclusions:
GD
NF-M
Pshow
edlong-term
neuroprotection and neurorestoration in a prim
ate m
odel of PD dem
onstrating that MP
are an efficient vehicle for sustained neurotrophic factor delivery to the brain. G
DN
F-MP m
ight be a viable therapeutic strategy for PD
patients.
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ano-Cebrián,
Luis Granero,Ana Polache y Teodoro Zornoza
Departm
entode Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Valencia, España
Introducción:
En general la comunidad científica acepta que
las drogas
de abuso
generan cam
bios en
determinados sistem
as del cerebro que perduran largo tiem
po después de abandonar su consumo.
La naturaleza duradera de estos cambios sitúa a
los individuos adictos en un estado de elevado riesgo de recaída; de hecho, algunos autores han
estimado que el riesgo de recaída es m
ayor del 60%
en el primer año que sigue al abandono
del consumo (1).
La adicción al alcohol no es una excepción: las recaídas
en el consumo de
alcoholson
uno de
los problem
as m
ás im
portantes con los que se enfrentan tanto el paciente
alcohólico som
etido a
tratamiento
deshabituador como el equipo clínico que lo
trata.
Actualm
ente, sólo
existen tres
moléculas
autorizadas como fárm
acos anti-recaída para el tratam
iento del alcoholismo
y su eficacia clínica puede considerarse m
oderada. En los últimos
años los trabajos realizados por diversos grupos de
investigación sugieren
que el
principal m
etabolito del etanol, el acetaldehído(A
CD
), es el responsable, al m
enos en parte,de ciertos
efectos neuroconductuales que explicarían la adicción al alcohol (2). D
ada la alta reactividad del
AC
D,
la adm
inistración sistém
ica de
sustancias capacesde
reaccionarquím
icamente
con el
AC
D
- en
otras palabras,
“de secuestrarlo”
in vivo- podría, potencialmente,
suprimir
o atenuar
estos efectos
del etanol
abriendo nuevas
posibilidades para
la prevención
de las
recaídas. U
na de
estas sustancias es la D
-penicilamina (D
P): se trata de un fárm
aco ya comercializado para otros fines y
con una elevada capacidad para secuestrar alA
CD
. Nuestro grupo ya ha com
probado en trabajos previos la capacidad de esta m
olécula para suprim
ir de un modo dosis-dependiente
algunos de
los efectos
del etanol
sobre el
sistema
nervioso central.
En este
trabajo pretendem
os analizar
con m
ás detalle
su potencial uso com
o agente anti-recaída y para ello,
perseguimos
alcanzar los
siguientes objetivos:
(1)evaluarla eficacia de la D
P para prevenir las recaídas en el consum
o del alcoholen un
modelo
animal
de consum
o crónico
de etanol a largo plazo.
(2)determ
inarlas concentraciones de fárm
aco en plasm
a y en tejido cerebral que se asociancon la
eficacia farmacológica.
Materiales y M
étodos: Se em
plearon 41 ratas macho de la raza W
istar, que
se som
etieron a
unprotocolo
de alcoholización
a largo
plazoque
facilita la
manifestación de las recaídas en el consum
o (3).La recaída
puede cuantificarsea través de la
medición del conocido com
o fenómeno A
DE
(“Alcohol
Deprivation
Effect”). Todos
los experim
entos se
desarrollaron entre
la finalización del 5º
periodo de abstinenciay el
comienzo
del siguiente
periodo de
re-exposición.
Los anim
ales contaban
en ese
mom
ento con un historial de consum
o de aproxim
adamente 9-10 m
eses.El consum
o de alcohol m
ostrado por cada animal siem
pre se expresa com
o gr de etanol/kg/día
Experimento 1: Efecto de la adm
inistración subcutánea de D
P en el fenómeno AD
E.A
cada animal se le im
plantó quirúrgicamente,
dos días antes de la reintroducción deletanol,
una mini-bom
ba osmótica A
LZET®
2ML1
anivel
subcutáneo. C
ada bom
baliberó
avelocidad constante y durante una sem
ana una de las siguientes soluciones: A
gua (n=8), DP
0.25m
g/h (n=9) oD
P 1 mg/h (n=8).La ingesta
basal se
determinó
a partir
de la
media
aritmética del consum
o de etanol cada 24 horas cuantificado durante los tres días previos al com
ienzo del
quinto periodo
de abstinencia
(valores “B1 ”, “B
2 ” y B3
de la figura 1A). El
consumo de alcohol tras
la re-exposición del anim
al al mism
o, se cuantificó durante 4 días (post-abstinence daysen la
Figura 1A).
Figura 1. (A) Protocolo seguido en el experim
ento 1. (B)
Protocolo seguido en el experimento 2.
Experimento 2: D
eterminación de niveles de D
P en plasm
a y cerebro.Los anim
ales empleados en este experim
ento fueron
sometidos
al m
ismo
protocolo de
alcoholizacióny
quirúrgicoanteriorm
ente descrito.
Un
total de
16anim
ales fueron
utilizados para determinar la concentración de
DP en plasm
a y cerebro tras la administración
subcutánea de DP a las velocidades de 0.25
mg/h
(n=8) y 1mg/h (n=8). Las concentraciones
de DP
se determinaron los días 2 (subgrupo
n=4) y
7(subgrupo
n=4)después
de la
implantación de la bom
ba, correspondiendo a los días 0 y 5 post-abstinencia
del experimento
1 (ver Figura 1B).Las m
uestras de sangre (0.2-0.3
ml)
se recogieron
conjeringuillas
heparinizadas a
las 12:00
a.m.
del día
correspondiente. Tras el muestreo de sangre, las
ratas fueron inmediatam
ente sacrificadas con objeto de m
uestrear dos regiones distintas delcerebro (cerebro
anterior y cerebro medio) que
fueron procesadas
en el
mom
entopara
su análisis. El análisis de las m
uestras empleó un m
étodo crom
atográfico de
HPLC
con
detección electroquím
ica desarrollado
en nuestro
laboratorio a partir de dos protocolos anteriores (4,5).
El límite de detección del m
étodo se estableció en
0.004 g/m
l.Para el análisis de los datos se em
pleó un A
NO
VA
m
ixto seguido
por la
prueba de
Bonferroni
cuando se
detectaron diferencias
significativas.
Resultados y D
iscusión.
Experimento 1: Efecto de la adm
inistración subcutánea de D
P en el fenómeno AD
E.Los cuatro días posteriores a la re-introducción tras
el quinto
periodo de
abstinencia observam
os el típico incremento en el consum
o de alcohol indicativo del fenóm
eno AD
E en el grupo control
(Figura 2A). A
parentemente la
administración de D
P redujo el AD
E de forma
dosis-dependiente. El AN
OV
Am
ixtoconfirm
ó una
interacción significativa
(F(8,88)=2.24;p=0.031). El análisis post-hoc dem
ostró que sólo la adm
inistración subcutánea de DP
1mg/h
fue capaz de suprimirel A
DE durante los cuatro
días post-abstinencia. No ocurrió esto con la
dosis de DP 0.25 m
g/h.La preferencia por el etanol total y el consum
o total de líquido se m
uestra en la Figura 2By 2C
respectivamente. C
omo se puede observar, tras
dos semanas de abstinencia la preferencia se vio
incrementada significativam
ente (F(8,88)=3.74;p=0.02) en los grupos control y D
P 0.25 mg/h
respecto a su basal. Sin embargo, los anim
ales tratados con la dosis grande de D
P no mostraron
cambios significativos en ninguno de los 4 días
post-abstinencia (p=0.877,
p=0.154, p=0.973
and p=0.505).Finalm
ente, la ingesta líquida total (Figura 2C
) no se vio modificada.
Figura 2.R
esultados del experimento 1.
(A)
Ingesta de ettanol, (B
) preferencia de etanol e (C) ingesta total líquida.
Los datos son valores medios
e.e. Los asteriscos reflejan diferencias
significativas respecto
al basal
(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
Las diferentesletras (a,b) indican
diferenciassignificativas
respecto a los grupos en cadadía
post-abstinencia. (p<0.05).
Experimento 2:
Niveles de D
P en plasma y
cerebro.
Los niveles de DP en plasm
a oscilaron entre 0.4-0.5
g/ml en plasm
a en los días 2 y 5 para el grupo D
P 0.25mg/h
y entre 2.8-4.3 g/m
lpara el grupo D
P 1mg/h. Para los dos velocidades de
infusión ensayadas,los nivelesplasmáticosen el
díade m
uestreo 5 tendieron a ser superiores a los
obtenidos en
el día
2, aunque
no se
detectarondiferencias significativas.
Por otro lado, no sedetectó D
P en cerebro de los
animales
del grupo
DP
0.25 m
g/h, independientem
ente de laregión
analizada. Sin em
bargo, en el grupoD
P 1mg/h, los niveles de
DP en cerebro constituyeron alrededor del 2-3%
de los encontrados en plasm
a.
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S BA
SAD
OS E
N R
EG
LA
S Y Q
SPRPA
RA
LA
PRE
DIC
CIÓ
N D
E L
A PE
RM
EA
BIL
IDA
D E
N C
AC
O-2.
M.A
. Cabrera-Pérez
1,2,3, H. Pham
-The
1,M. B
ermejo
2, I. González-Á
lvarez2y T
. Garrigues 3
1Group of M
olecular Simulation &
Drug D
esign, Center of C
hemical B
ioactives. Central U
niversity of Las Villas, C
uba.2D
epartment of Engineering, A
rea of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology, Miguel H
ernández University, Spain.
3Departm
ent of Phamacy and Pharm
aceutical Technology, Faculty of Pharmacy,V
alencia University, Spain.
Introducción:La
permeabilidad
intestinal es
una propiedad farm
acocinética relacionada con el proceso de absorción
y desem
peña un
papel im
portante en
el descubrim
iento y desarrollo de nuevos fármacos y en los
estudios de bioequivalencia de compuestos genéricos.
Las células Caco-2 es un m
étodo in vitro,de bajo costo y con una alta capacidad de cribado, que se utiliza para el estudio de la perm
eabilidad intestinal (1). Por otro lado, los m
étodos in silicohan sido am
pliamente utilizados
para predecir la permeabilidad intestinal y aunque varios
modelos han m
ostrado adecuados valores de exactitud y precisión en la predicción de esta propiedad, su uso práctico ha estado lim
itado debido a la utilización de bases de datos pequeñas, la alta variabilidad de los datos de perm
eabilidad y la pobre validación externa. En este sentido los objetivos del estudio son: 1- D
esarrollar reglas, basadas en propiedades m
oleculares simples, y
modelos de relación cuantitativa estructura-propiedad
(QSPR
) para clasificar la permeabilidad intestinal en
células C
aco-2 y
2- V
alidar las
predicciones com
putacionales utilizando
un set
externo de
compuestos.
Materiales y M
étodos: Se colectó la mayor base de
datos pública
de com
puestos con
valoresde
permeabilidad
en C
aco-2 (
1300 com
puestos) y
se utilizó para el desarrollo de los m
odelos in silico.D
os
valores de corte se utilizaron para dividir la data en com
puestos con ALTA
(H), M
OD
ERA
DA
(M) y B
AJA
(L) perm
eabilidad: Papp20x10
-6cm/s (M
etoprolol,alta perm
eabilidad) y Papp<
0.7x10-6
cm/s (M
anitol,baja
permeabilidad). V
eintidos compuestos fueron utilizados
como un set de predicción externo. U
n total de 265 descriptores m
oleculares (0D-1D
) fueron calculados con los program
as DR
AG
ON
, VolSurf y C
DK
. Un total de
21 propiedades físico-químicas se seleccionaron para
obtener las reglas.Los parám
etros de mayor influencia
sobre los valores de permeabilidad se determ
inaron con el
clasificador O
neR
(Weka).
Cada
clasificador se
obtuvo por un procedimiento de validación cruzada (10
veces) y se compararon los valores de sensibilidad y
especificidad de la curva RO
C. Los parám
etros más
relevantes fueron graficados por pares para una mejor
visualización de las reglas basadas en dos propiedades. El error estándar se utilizó para la selección de las reglas. Las m
ejores clasificaciones basadas en 1 y 2 propiedades fueron ensam
bladas en un regla de 3 propiedades.Para el desarrollo de los m
odelos QSPR
se utilizaron 1006 com
puestos para la serie de entrenamiento y 283
para la de predicción. Se desarrollaron 5 modelos de
árboles
de clasificación,
utilizando 97
descriptores m
oleculares previamente seleccionados y se siguió la
siguiente metodología (Figura 1):
Figura 1. Procedimiento de tres etapas para la clasificación de las diferentes clases de perm
eabilidad en Caco-2, utilizando
modelos consenso.
Resultados y D
iscusión: De las 21 propiedades físico-
químicas evaluadas, el Á
rea Superficial Polar (PSA) es la
que mejor describe las variaciones en la perm
eabilidad (66.4%
de la data), lo que está en correspondencia con su rol en el transporte a través de la m
embrana y en la
absorción de
fármacos
(2, 3).
Otras
propiedades relevantes fueron el peso m
olecular (MW
), el coeficiente de partición (M
LogP) y el coeficiente de distribución (LogD
7.5) con un 60.7%, 61%
y 60.6% de clasificación
de la permeabilidad, respectivam
ente. Para explicar el carácter m
ultifactorial de la permeabilidad, se evaluó la
interacción entre descriptores. A pesar de la excelente
correlación entre
el PSA
y
el coeficiente
de perm
eabilidad, este descriptor tiene una alta correlación con el resto de propiedades físico-quím
icas. En este sentido, para la clasificación basada en dos propiedades, el M
W y el LogD
7.5 mostraron los m
ejores resultados, alcanzando
un 72.1%
de
clasificación para
los com
puestos con alta permeabilidad y un 64.3%
para los de
baja. Sin
embargo,
la com
binación de
las 3
propiedades perm
itió una
mejor
clasificación de
la perm
eabilidad en
Caco-2.
Un
78%
y 70%
de
los com
puestos con
alta y
baja perm
eabilidad fueron
adecuadamente predichos (Figura 2).
Figura 2.Diferentes reglas de clasificación de la perm
eabilidad en Caco-2, basadas en 1, 2 y 3 propiedades físicoquím
icas. Para el desarrollo de los m
odelos QSPR
, se obtuvieron un total de 15 m
odelos de clasificación para las tres clases
seleccionadas (ver
Figura 1).
Tres de
los 5
modelos
en cada
grupo se
utilizaron para
obtener m
odelos consenso y su selección se basó en la capacidad de clasificación del set predicción externa (Figura 3). La predicción final para el sistem
a de modelos consenso
evidenció buenos resultados, siendo la clasificación en la serie de entrenam
iento para los compuestos de H
, M y L
permeabilidad 78.4%
, 76.8 y 79.1%, respectivam
ente. En el caso de la serie de predicción la exactitud en la clasificación
fue de
un 78.6%
para
los de
alta perm
eabilidad, 71.1% para los de m
oderada y de 77.6%
para los de baja permeabilidad.
Los m
odelos desarrollados
por am
bas m
etodologías (reglas y Q
SPR) fueron utilizados para clasificar un set
externo de validación. Los resultados que se muestran en
la Tabla 1 evidencian un 77.3% de buena clasificación.
Figure 3. Selección de los modelos de árboles de clasificación para el voto consenso, basado en la prevalencia de clasificación
del set de predicción externo.
Tabla
1. Resultados de la clasificación del set de validación externa.
Com
puestosPerm
(R-3P)
Perm Q
SPRc
Perm C
aco-2C
ompuestos
Perm (R
-3P)Perm
. QSPR
cPerm
. Caco-2
ASA
ML
MH
Furosemida
LL
LA
moxicilina
LM
MIndom
etacinaM
HH
HA
ntipirinaH
HH
Naproxeno
HH
HA
tenololM
LM
MN
orfloxacinM
LM
MC
afeinaH
HH
Paracetamol
HH
HC
arbamazepina
HH
HPropranolol
HH
HC
eliprololM
HH
LR
anitidinaM
LM
MC
imetidina
ML
MM
TerbutalinaM
LM
MC
olchicinaM
HM
MTeofilina
ML
HH
Cortisol
MH
HH
Verapam
iloM
HN
CH
FexofenadinaM
LL
LV
inblastinaM
LM
M
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orinder, K. Luthm
an, P. Artursson, J. M
ed. C
hem. 2001,44, 1927-37.
Agradecim
ientos: Los
autores agradecen
el apoyo
financiero de
la A
gencia Española
de C
ooperación Iberoam
ericana para el Desarrollo (A
ECID
)al proyecto:
A1/036687/11:
Montaje de un laboratorio de Q
uímica
Com
putacional, con fines académicos y científicos, para el
diseño de
potenciales candidatos
a fárm
acos, en
enfermedades de alto im
pacto socialy a la C
omisión
Europea al proyecto:D
CI-A
LA/19.09.01/10/21526/245-
297/ALFA
111(2010)29:
Red-B
iofarma.
Red para
el desarrollo de m
etodologías biofarmacéuticas racionales
que incrementen la com
petencia y el impacto social de las
Industrias Farmacéuticas Locales.
AN
ÁL
ISIS DE
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MO
DE
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RM
AC
OS E
N M
ON
OC
APA
S DE
CÉ
LU
LA
S C
AC
O-2
M. Llabrés
Dpto. de Ingeniería Q
uímica y Tecnología Farm
acéutica. Facultad de Farmacia. U
niversidad de La Laguna
Introducción.El estudio in vitro de la perm
eabilidad de fármacos utilizando
monocapas cao-2 perm
ite, además de
determinar la perm
eabilidad del fármaco debido
a la difusión pasiva, estudiar la función que desem
peñan diversos sistemas de transporte que
afectan a la absorción y biodistribución de los fárm
acos y el metabolism
o intracelular (1, 2). El parám
etro más utilizado para expresar los
resultados es la permeabilidad aparente o
efectiva (P, )calculada m
ediante la ecuación,0
RcSt
/x
P
(ec. 1)
Donde
t/
xR
es la velocidad media de
entradadel fárm
aco en el compartim
ento receptor (
1T
M); S, la superficie de la
monocapa celular (
2L
); 0
c, la concentración de
fármaco en el com
partimento fuente
que se supone constante durante el experim
ento. La identificación de los m
ecanismos activos de
transporte se basa en comparar las
permeabilidades aparentes en dirección apical –
basolateral (A
BP
) y basolateral – apical (B
AP
), así com
o el efecto que tienen los inhibidores del transporte. La ecuación 1 se deriva de la prim
era ecuación de Fick en
estado estacionario suponiendo adem
ás que se dan las condiciones de sum
idero (concentración de fármaco en el
compartim
ento receptor despreciable). La constatación de que las células caco-2 expresan distintos sistem
as transportadores de fármacos
en los lados apical y basolateral, así como la
posibilidad de metabolización intracelular del
fármaco, ha llevado diversos autores a proponer
el modelo de tres com
partimentos; en
la figura 1 reproduce el publicado por Sun y Pang (1).Es bien conocido que las funciones del tiem
po derivadas de los m
odelos n– com
partimentales
son, en principio, funciones n – exponencialesyla justificación del em
pleo de la ecuación 1 se ha basado en el análisis de sim
ulaciones num
éricas. El objetivo de esta comunicación es
derivar la relación existente entre la ecuación 1 y las funciones del tiem
po derivadas del modelo
de Sun y Pang cuando se da la condición necesaria y suficiente
que el sistema se
encuentre en estado transitorio. Tanto eldesarrollo analítico del m
odelo como las
simulaciones num
éricas se realizaron utilizando el program
a de álgebra simbólica w
xMaxim
a (http://sourceforge.m
axima.net ).
Modelo.La solución general de los sistem
as lineales hom
ogéneos en el dominio de Laplace
es:
0x
KI
x1
s)s
((ec. 2)
Donde x
es el vector de funciones (racionales) en el dom
inio de Laplace; I , la m
atriz unidad de dimensiones n x n; K
, la m
atriz del sistema,
3223
3222
12
2112
kk
0
kk
k
0k
k
K(ec. 3)
La interpretación de las constantes de velocidad se deriva
de la figura 1. El vector de condiciones iniciales
0x
es igual a T
01]0
,0,
x[cando el experim
ento es en dirección basolateral – apical o igual a
T3,
0]
x,0,
0[cuando es el
dirección apical – basolateral.En el problema
que nos ocupa pueden darse dos casos; primero,
si para i = 1…n
n
ij
1j
ijii
kk
el sistema es
cerrado y una de los autovalores de Kes igual a
cero y los n – 1 restantes son reales negativos;
segundo, si para i = 1 … n
n
ij
1j
ijii
kk
el
sistema es abierto y los n autovalores son reales
negativos 1. En el contexto del modelo en
estudio, la primera situación se da cuando
met
Cl=0. Para que la velocidad de entrada en el com
partimento receptor sea constante deben
darse dos condiciones. Primero, la condición de
sumidero,
0c
basoo
0c
ap, según sea el
compartim
ento receptor; la condición de sum
idero puede ajustarse modificando el
volumen del com
partimento receptor o m
ediante el drenaje continuo del fárm
aco. Segundo,debe darse la condición de estado transitorio, es decir,
0td cdcel
(ec. 4)
Obviam
ente la situación de estado transitorio estricta sólo se alcanza para un instante determ
inado, razón por la que hemos relajado su
definición; por lo tanto, si el transporte es, por ejem
plo,en dirección apical – basolateral,ETcell
effluxd
baso
basoc)
Cl
Cl
(V
1t
d cd(ec. 5)
Por otro lado, en condiciones de sumidero,
ap 0
effd
met
absd
ETcellV x
Cl
Cl
2C
lC
lC
lc
(ec. 6)
Las ecuaciones 4 - 6 explican por qué la velocidad de entrada en el com
partimento
receptor es constante durante un cierto tiempo y
proporcional a la concentración inicial en el com
partimento fuente (apical).
Otro punto de interés, el tiem
po necesario para alcanzar el estado transitorio, puede analizarse directam
ente a partir de la matriz del sistem
a. U
na de las propiedades de los autovalores de esta m
atriz es que )
max(
i>
)k
max(
ii; debido
al bajo valor de cell
V(10 – 15
l, referencia 1),
22k
es mucho m
ayor que las restantes constante de velocidad de salida de los com
partimentos y
el estado transitorio en el compartim
ento celularse alcanza en m
enos de un minuto.
Simulación.H
emos com
parado la solución general del m
odelo con la simplificación
introducida a través del estado transitorio sim
ulando el modelo tom
ando valores dentro de los intervalos utilizados por Sun y Pang. C
omo
resumen de los resultados obtenidos se m
uestran las figuras generadas con los valores siguientes; (volúm
enes en ml; aclaram
ientos en ml/m
in):
apV
= 1,50; bas
V= 2;50;
celV
=3
10·56,
11;
dC
l=
0,20; efl
Cl
= 0,50; m
etC
l= 0,20. Las condiciones
iniciales fueronT]
100,0
,0[
0x
. Las constantes de velocidad calculadas fueron 95,23;0,122 y 0,0158
1m
in. La figura 2 m
uestra las curvas predichas por el m
odelo donde se aprecia como
el compartim
ento celular alcanza la concentración m
áxima casi de form
a instantánea.En la figura 3 hem
os incluido los niveles predichos para el com
partimento
receptor (basolateral) y celular, junto con la curva calculada considerando el estado transitorio y la condición de sum
idero (ecuaciones 4 – 6; línea de puntos); hem
os reducido la escala de ordenadas al intervalo 0 – 5 y de tiem
po a 0 – 1 minuto para apreciar con
claridad como el estado transitorio se alcanza
rápidamente.
Conclusiones.H
emos justificado el uso de la
ecuación 1 en el marco del m
odelo de Sun y Pang bajo la hipótesis de que estam
os trabajando en condiciones de sum
idero y en régim
en de estado transitorio. El valor de la perm
eabilidad efectiva, en términos de los
parámetros del m
odelo de Sun y Pang se deduce
inmediatam
ente de las ecuaciones 5 y 6. La determ
inación de los parámetros del m
odelo requeriría el bloqueo selectivo de los procesos de transporte y m
etabolización.
Figura 1. Modelo de tres com
partimentos de
Sun y Pang(1)
Figura 2. Perfiles de concentración – tiempo
simulados
Figura 3. Perfiles de concentración tiempo en el
compartim
ento receptor, compartim
ento celular y valores predichos en estado transitorio y condiciones de sum
idero (línea de puntos)
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20 30
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60
y
t
0 1 2 3 4 5
0.1 0.2
0.3 0.4
0.5 0.6
0.7 0.8
0.9 1
y
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DE
VE
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PBPK
MO
DE
L FO
R T
HE
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AN
CE
R D
RU
G V
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D IT
S M
AIN
ME
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LIT
E A
DM
INIST
ER
ED
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NE
W D
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IVE
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IN R
AT
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ivia009 is a patented new drug
indication that
targets B
cell
population overproliferation in N
on-Hodgkings lym
phoma
(NH
L) patients.NH
L are a heterogeneous group of m
alignacies of the lymphoid system
that includes
any kind
of lym
phoma
except the
Hodgkin’s lym
phoma.
The rapid expansion of nanoparticle research dem
ands new
technologies
that w
ill enable
better interpretation of experimental data
and assistance
in the
rational design
of future
nanoparticles. Recently, great efforts have been
made in the study of the biodistribution, toxicity
and medical applications of nanoparticles (89).
Physiological based
pharmacokinetic
models
(PBPK
) are based on the anatomical structure of
the living systems, w
ith each important organ or
tissue listed as an individual compartm
ent. All
compartm
ents are interconnected through the m
ass transportation among them
. PBPK
help sim
ulate the concentration-time profile of a drug
in a species by integrating the physicochemical
properties of the compound w
ith the physiology of
the species.
The applications
of PB
PK
modeling for nanoparticles have appeared as
early as 2006 (8).
The aim of this project w
as to develop an integrated
PBPK
m
odel capable
to describe
simultaneously the biodistribution of V
ivia009 and its m
ain metabolite, after the free drug’s
administration or M
P.
Materials and M
ethods:Fifty-one rats divided in tw
o groups were treated w
ith 0.75 mg/kg of
either free drug(free009)
or MP given as a
bolus. At tim
e points 0.08, 0.16, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6 and 24 hours, three anim
als were sacrificed.
Samples of plasm
a, axillary lymph node, brain,
spleenand
bone m
arrow
were
collected to
measure
Vivia009
and its
metabolite
concentrations. Data regarding blood flow
s and tissue volum
es were taken from
literature (1-4). M
odelling and simulations w
ere performed w
ith N
ON
MEM
version VII using the naïve pool
data approach.
Results and D
iscussion:M
odel development
took part in threesteps: first, the free009 m
odel w
as developed
consisting of
6 anatom
ical com
partments
(blood, brain,
bone m
arrow,
lymph node and rest) connected to each other in
an anatomical fashion via blood flow
(Figure 1,m
iddle part).
Secondly, the
same
six com
partments w
ere addedfor the m
etabolite, produced in the liver and included in the rest com
partment (Figure 1, right part)and bound to
the free009
model
through the
hepatic clearance (Fm
×C
L). Finally,m
icroparticle m
odel isbound to the free009 m
odel through the in vivo release constant (K
REL ) w
ithin the tissues (Figure 1, left part).
Figure 1.- PBPK m
odel for microparticle (all), or
free009(m
iddle & right part). O
rgans are represented by a rectangular com
partment and connected in an
anatomical m
anner with blood flow
(red, blue) and lym
phatic flow (yellow
).Com
partments are nam
ed as follow
s: the
first letter
N,
D,
Mrepresent
microparticle, free drug and m
etabolite respectively. The second and third letter define the organ: PL, B
R,
BM
, LN, SP, R
T, stand for plasma, brain, bone
marrow
, lymph node, spleen and rest of tissues
respectively. CO
,represents cardiac output.
QB
R ,Q
BM
, QLN , Q
SP
and QR
Trepresent blood flow
to the brain, bone m
arrow, lym
ph node, spleen and rest of
tissues, respectively.
PS
LN ,represents
permeability
surface factor
in the
lymph
nodes.K
IS
P , KO
SP
represents constantsof association
and dissociation
of sertraline
in the
spleen, respectively.
Fm,
represent the fraction of drug m
etabolized by
the liver.
CL,
total sertraline
clearance.C
LR,
renal clearance from sertraline.
CLM
,total N
-Desm
ethyl-Sertraline clearance.
Physiological parameters used for the PB
PKs
model
developments can be found in Table 1.
Due to the fast in vitro release profile of
the m
icroparticle (data
not show
n), at
injection tim
e, part of its dose had been already released (F
1 ).
Table 1.-
Physiological param
eters taken
from
literatureand additional inform
ation used to develop the PBPK
models of V
ivia009.
The final model structure w
as based on visual inspection of the fit to the data, the value of N
egative Log
Likelihood, and
theA
kaike Inform
ation C
riterion. Estim
ated param
eter values for both m
odels can be found in Table 2.PB
PK m
odel results for free009 are shown in
Figure 2and PB
PK m
odel results for the m
icroparticle adm
inistration are
shown
in Figure 3.
Table
2.-Estim
ated param
eter values
for the
microparticle (left), free009 (m
iddle) and metabolite
(right).
. Figure 2.-
Com
parison of PBPK m
odel predictions (lines) and observed concentrations dots) of V
ivia009 and its m
etabolite after administration
of FREE009.
Figure 3.-C
omparison of PBPK
model predictions
(lines) and
observed concentrations
(dots) of
Vivia009 and its m
etabolite after administration of
MIC
RO
PAR
TICLES.
Based on the results of the m
odeling exercise, 45%
(F1)
of the
microparticles’
dose w
as released
before the
bolus adm
inistration, behaving as a free drug. C
L,CLM
and Fm increased 2, 1.3 and 1.3 tim
es respectively, w
hen the drug was adm
inistered as a m
icroparticle Table 2.
Referencias:
[1] Covell D
et al. Cancer R
es 1986;46(8):3969. [2] K
awai et al. J Pharm
acokinet Biopharm
1994 O
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etab Disposition
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avis et al. Pharm R
es 1993;10(7): 1093-1095[5] K
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acokinet Pharm
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J Pharm
acokinet Pharm
acodyn 1991; 19(1):21-50.[8] Y
ang et al. J Nanosci N
anotechnol 2010 (10) 8452-8490
Acknow
legments:
- Vivia B
iotech S.L. for supporting me and the
project.
MO
DIFIC
AC
IÓN
DE
L M
OD
EL
ON
O L
INE
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PAR
A E
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APA
S CE
LU
LA
RE
SV
. Mangas-Sanjuan
1, I. Gonzalez-A
lvarez1,V
G.C
asabó2,
M.B
ermejo
1
1Depto. de Ingeniería. Á
rea Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Universidad M
iguel Hernández, Elche.
2Departm
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de V
alencia, España
Introducción: El cálculo de la permeabilidad
mediante
estudios de
transporte in
vitroen
monocapas celulares es de gran relevancia en
los estudios preclínicos de desarrollo de nuevos fárm
acos. La
correcta estim
ación de
la perm
eabilidad es fundamental, ya que afecta a
la selección de nuevas moléculas durante su
desarrollopreclínico.
El cálculo
de la
permeabilidad deriva de la Ley de Fick o Ley de
difusión de
la m
ateria, cuya
primera
aproximación es una ecuación lineal ya que se
asumen condiciones sink (o sum
idero) y quela
concentraciónen
la cám
ara dadora
no se
modifica[1].
Posteriormente,
Artursson[2]
publicó un modelo lineal para el cálculo de la
permeabilidad en condiciones sink, en el que se
corrige la concentración en la cámara dadora a
cada tiempo de m
uestreo, mediante el cálculo de
las fracciones
transportadas.La
principal ventaja de am
bas aproximaciones es que son
regresiones lineales
de las
cantidades acum
uladas o fracciones transportadas frente al tiem
popero tienen la lim
itación asociada a aquellos casos en los que no se cum
plen los supuestos previos, es decir condiciones sink y cam
bio despreciable en la concentración dadora.Tavelin[2]
propuso utilizar
una ecuación
general, en
lacual
el cálculo
de la
permeabilidad se realiza m
ediante un modelo no
lineal, válido tanto para condiciones sink como
para condiciones
no sink.
Sin em
bargo, el
mism
o autor refleja la incapacidad de su modelo
para estimar correctam
ente la permeabilidad
en situaciones en las cuales se produce
una latenciaal inicio de la difusión
o un mayor paso inicial
de fármaco a través de la m
onocapa. Por ello,el objetivo de este trabajo ha sido
desarrollar un m
odelo no lineal que permitiera el cálculo de la
permeabilidad en cada una de las situaciones
posibles y realizar simulaciones con el fin de
determinar cual es el m
ejor modelo para el
cálculo de la permeabilidad.
Materiales y M
étodos: El trabajo fue realizado en Excel 2010.
El modelo no lineal propuesto
en este trabajo es una modificación del m
odelo no lineal de Tavelin En el nuevo m
odelose
permite
calcular una
permeabilidad
hasta el
primer tiem
po de muestreo y otra diferente o
igual desde el primer hasta el últim
o tiempo de
muestreo. La com
paración de cada uno delos
cuatro m
odelos se
realizógenerando
una población de m
ilexperimentos,con tres pocillos
por experimento, incorporando un m
odelo de error
interindividual exponencial
entre las
permeabilidades individuales y un m
odelo de error residual exponencial. Los datos fueron sim
ulados para cada uno de los tres tipos de perfiles de concentraciones acum
uladas frente al tiem
po, en condiciones sinky
no sinky cuatro
combinaciones para cada uno de ellos de alta
y/o baja variabilidad interindividual y residual(alta=coeficiente de variación del 20%
y baja del 5%
.).El prim
er perfil asume una latencia
inicial en el paso del fármaco a través de la
monocapa. El segundo perfilno presenta
ningún cam
bio en el paso del fármaco a través de la
monocapa. El tercer perfil asum
e un paso inicial de fárm
aco mayor y una dism
inución posterior al
primer
punto de
muestreo.
Bajo
estas condiciones
se sim
ularon los
datos y
se analizaron con cada uno de los m
odelos para el cálculo
de la
permeabilidad,
es decir
la aproxim
ación lineal (LINEA
L), la aproximación
lineal con corrección de la concentración dadora (LIN
EAL-corregida),
la ecuación
no lineal
original (NO
-LINEA
L)y el nuevo modelo (N
O
LINEA
L-modificada).Se calcularon los errores
medios de estim
ación, error intraensayo y error individual. La com
paración de los modelos se
realizó mediante un A
NO
VA
de los errores m
edios de estimación, errores intraensayo y
errores individuales entre los cuatro métodos
para la determinación de la perm
eabilidad por perfil y variabilidad designadosen SPSS 20.0 R
esultados y Discusión: Los resultados
de los A
NO
VA
para
cada uno
de los
perfiles en
condiciones sink y no sink se muestran en las
tablas 1,2 y 3. El modelo propuesto en este
trabajo presenta un error de estimación
inferior en la m
ayoría de casos al modelo no lineal de
Tavelin. Los modelos lineales presentan valores
de errores de estimación
similares al m
odelo no lineal corregido
en los casos en los que se cum
plen condiciones
sink, ya
que la
acumulación de las cantidades frente al tiem
po siguen un com
portamiento lineal. Sin em
bargo, en
condiciones no
sink, el
sesgo en
la estim
aciónes superior en todos los casos para
los modelos lineales frente a los no lineales y
sólo el modelo de Tavelin no lineal presenta
valores similares al m
odelo no lineal de dos pendientes
en el perfil 2, cuando se presenta una
única pendiente
para todos
los puntos
experimentales.
El modelo no lineal m
odificado propuesto por en este
trabajo presenta
un m
enor error
de estim
aciónfrente al m
odelo no lineal deTavelin
de forma significativa en los perfiles 1 y 3, tanto
en condiciones sink como no sink. Los m
odelos lineales
son com
parables en
preciosión y
exactitud al modelo no lineal m
odificado en condiciones sink para cada uno de los perfiles. Por tanto, la estim
ación de la permeabilidad
mediante el m
odelo no lineal de dos pendienteses en la m
ayoría de situaciones más preciso en la
estimación de la perm
eabilidad que el resto de m
odelos analizados. R
eferencias: 1.
Dawson, D., Principles of m
embrane
transport, in Handbook of physiology, R. B, Editor 1991, Am
erican Physiological Society: Bethesda. p. 1-45.
2. Tavelin, S., et al., Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. M
ethods Mol Biol, 2002. 188: p. 233-72.
NO
SINK
SINK
H IIV
H R
SVH
IIV H
RSV
MC
MC
MC
MC
NS
NS
NS
NS
SS
SN
SC
SS
CS
NS
H IIV
L R
SVH
IIV L
RSV
MC
MC
MC
MC
NS
NS
NS
NS
SS
SN
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SS
CS
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L IIV
H R
SVL
IIV H
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MC
MC
MC
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NS
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CS
NS
L IIV
L RSV
L IIV
L RSV
MC
MC
MC
MC
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NS
SS
SS
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S
NO
SINK
SINK
H IIV
H R
SVH
IIV H
RSV
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MC
MC
MC
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SS
SS
SN
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SS
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H IIV
L R
SVH
IIV L
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MC
MC
MC
MC
NS
SN
SS
SS
SS
CS
SC
SN
SL
IIV H
RSV
L IIV
H R
SVM
CM
CM
CM
CN
SS
NS
SS
SS
NS
CS
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SN
SL
IIV L
RSV
L IIV
L R
SVM
CM
CM
CM
CN
SS
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SS
SS
SC
SS
CS
S
NO
SINK
SINK
H IIV
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MC
MC
MC
MC
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SS
SN
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SS
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MC
MC
MC
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SS
SS
SN
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L IIV
H R
SVL
IIV H
RSV
MC
MC
MC
MC
NS
SN
SS
SS
SN
SC
SS
CS
SL
IIV L
RSV
L IIV
L R
SVM
CM
CM
CM
CN
SS
NS
SS
SS
NS
CS
SC
SS
Tabla donde se recogen los resultados del ANO
VA para los pefiles 1, 2 y 3 en condiciones sink y no sink y para cada uno de los escenarios de variabilidad propuestos. S hace referencia a significativo, N
S a no significativo, MC m
odelo no lineal modificado, N
S m
odelo no lineal, S modelo lineal sink y CS m
odelo lineal sink corregido. IIV es variabilidad interindividual y RSV variabilidad residual.
PERFIL 1 PERFIL 2
PERFIL 3
NO
LINEAL M
ODIFICADO
NO
LINEAL
MO
DIFICADO
NO
LINEAL
MO
DIFICADO
TAVELIN
TAVELIN
TAVELIN
Figuras 1-6. Las figuras de la izquierda corresponden al m
odelo no lineal de dos permeabilidades y las de la derecha
al modelo no lineal. Las figuras superiores hacen referencia
al perfil 1, las centrales al perfil 2 y las inferiores al perfil 3.
RIESG
O G
ASTRO
INTESTIN
AL Y CAR
DIO
VASC
ULAR
DE LO
S AINE: N
UEVAS
EVIDEN
CIAS Y SU
REPER
CU
SION
EN EL AB
OR
DAJE D
EL PACIEN
TE.
López-Pintor, E1
1D
epartamento
de Ingeniería.
Area de
Farmacia
y Tecnología
Farmacéutica.
Universidad M
iguel Hernández de Elche.
Introducción
Los Antiinflam
atorios N
oEsteroideos
(AINE)
constituyen un
grupo heterogéneo
de fárm
acos que
comparten
acciones terapéuticas
(analgésica, antiinflam
atoria y
antipirética) y
se diferencian
en su
eficacia y
toxicidad relativas.
Constituyen
uno de
los grupos
terapéuticos más consum
idosa nivel
mundial, tanto por prescripción m
édica com
o por automedicación.
Los efectos adversos más im
portantes de
los AIN
E, por
su frecuencia
y potencial gravedad se localizan a nivel gastrointestinal (G
I).La introducción de los inhibidores selectivos de la enzim
a ciclooxigenasa-2
(CO
X-2) m
ejoró la
tolerancia GI de estos fárm
acos, pero puso de m
anifiesto efectos adversos cardiovasculares
(CV
) no específicos
de los CO
X-2 y que podrían responder a un efecto de clase, com
partido, en m
ayor o menor grado, por todos los
AINE.
El objetivo de este trabajo consiste en revisar el perfil de seguridad C
V y GI
de losAIN
E y establecer las pautas para el adecuado m
anejo del paciente consum
idor de AINE por el profesional
sanitario.
Material y M
étodosSe realizó una búsqueda bibliográfica en
Pubmed.
Las palabras
clave seleccionadas
fueron: risk,
safety, toxity,
cardiovascular, gastrointestinal,
NSAID
, non-steriodal anti-inflamm
atory agents..Se establecieron com
o límites:
1) bibliografía anterior a 10 años,; 2) m
eta-análisis; 3)
ensayos clínicos
aleatorizados, y
4) revisiones
sistemáticas.
Resultados y D
iscusión R
iesgo CV
Se revisaron 33 artículos: siete eran ensayos clínicos, 12 m
eta-análisis y el resto
revisiones sistem
áticas. Los
resultados obtenidos muestran que, en
pacientes de riesgo, todos los AIN
Esalvo
la aspirina,
se asocian
a un
incremento del riesgo C
V,m
anifestado com
o infarto
agudo de
miocardio
(IAM
), accidente
o m
uerte cerebrovascular,
sin que
exista una
relación clara entre la especificidad de los
CO
X-2
como
mecanism
o farm
acológico y
el increm
ento del
riesgo cardiovascular.En com
paración con placebo, N
aproxeno parece ser el fárm
aco con
menor
incremento
del riesgo C
V, seguido de C
elecoxib. El consum
o crónico
de Ibuprofeno
y D
iclofenaco se asocia a un incremento
en más de tres veces del riesgo
CV
. Laasociación entre el
aumento de riesgo
CV
con
otros A
INE
como
indometacina,
meloxicam
, piroxicam
apenas ha sido evaluada.R
iesgo GI
Los factores de riesgo de gastropatía por A
INE y los m
ecanismos de profilaxis
GI del paciente están bien establecidose
incorporados en la mayoría de las guías
clínicas. Son: 1) edad superior a 60 años; 2) historia ulcerosa previa o de com
plicaciones ulcerosas relacionadas con la ingesta de A
INE; 3) consum
o concom
itante de anticoagulantes orales ;4)
consumo
concomitante
de glucocorticoides;
5) enferm
edad concom
itante grave;
6) consum
o de
AIN
E a dosis elevadas y 7) asociación
de varios AIN
E de forma concom
itante.
Repercusiones
en el
manejo
del consum
idor de AIN
ESi
bien son
necesariosm
ás ensayos
clínicos controlados
que evalúen
el perfil de
seguridad CV
de los AIN
Ey
permitan definiral paciente de riesgo, la
información
disponible hasta
el m
omento
debe incorporarse
a los
algoritmos
de m
anejo del
paciente consum
idor de AIN
E. Estos protocolos deberían
integrar no sólo el riesgo GI,
sino tam
bién las
nuevas evidencias
sobre riesgo CV
de los AIN
E. En este contexto, eladecuado m
anejo del paciente consum
idor de AINE por
parte del
profesional sanitario,
toma
especial relevancia.D
ebe garantizarse la
adecuada profilaxis
del paciente
frente a la potencial toxicidad GI y C
V de estos fárm
acos, lo que implica la
identificación en
el paciente
de las
posibles situaciones
de riesgo
y su
prevención o resolución.
Los profesionales
sanitarios deben
realizar una
evaluación previa
a la
prescripción y/o
dispensación,del
riesgoG
Iy
CV
delpaciente
que dem
ande un
AIN
E. A
demás,
lam
agnitud de consumo de estos fárm
acos al m
argen de la prescripción hace que los farm
acéuticos comunitarios deban
tomar constancia de la im
portancia de su
actuación, especialm
ente en
el control
de los
pacientes que
se autom
edican con AIN
E.
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Guidelines
for prevention
of N
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RM
OFA
RM
AC
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N L
A FO
RM
AC
ION
DE
L FA
RM
AC
EU
TIC
O
EN
LA
UN
IVE
RSID
AD
DE
SEV
ILL
A
MJ Lucero
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de Sevilla, España
Introducción: La Derm
ofarmacia está definida
por el Diccionario de la R
eal Academ
ia de la Lengua y por el C
onsejo General de C
olegios O
ficiales de Farmacéuticos
(CG
CO
F)com
o la ram
a de la Farmacia que estudia, fabrica y
expende productos
de cosm
éticano
relacionados con
patologías (1,2).
En la
actualidad, es
una oferta
en la
cartera de
servicios de la Oficina de Farm
acia junto con la nutrición, ortopedia, etc. Este servicio se hace desde
la propia
Farmacia
y en
las m
ás innovadoras desde internet, bien a través de páginas w
eb o de blogs(3-5). Pero en el cam
po de la C
osmética adem
ás hay que competir con
las grandes superficies,grandes alm
acenes y superm
ercados en los que también se venden
estos productos.
Todos los
laboratorios cosm
éticos solicitan a la Agencia Española del
Medicam
ento y
Productos Sanitarios
(6)la
autorización de puesta en el mercado que, si es
conveniente, se
concede. A
demás,
loslaboratorios
que lo
consideran adecuado,
aunque no es obligatorio, solicitan al CG
CO
F un
código nacional
(CN
) que
parece que
garantiza la calidad del producto cosmético.
Entonces ¿cuál
es la
diferencia entre
uncosm
ético vendido en uno o en otro lugar? La diferencia radica en la persona que hace el consejo y venta del producto. En este sentido, el Farm
acéutico por la formación que recibe a los
largo de sus estudios tiene criterios suficientes para hacer un acto profesional con rigor
y ciencia
y diferenciarse
de otros
vendedores form
ados bien por el establecimiento o por la
marca com
ercial en cuestión. Dentro de estos
estudios, existe
una form
ación opcional
en D
ermofarm
acia.El objetivo del presente trabajo es exponer los m
ateriales docentes
que se
utilizan y
los resultados
obtenidos en
la asignatura
de D
ermofarm
acia y Formulación M
agistral delG
rado de Farmacia de la U
niversidad de Sevilla.M
ateriales y
Métodos:
En la
Facultad de
Farmacia
de Sevilla,
la D
ermofarm
acia y
Formulación
Magistral
(DF
y FM
)es
una asignatura optativa que se cursa en el 2ºaño
del G
rado de Farmacia. Tiene 6 créditos que se han
dividido en 3 para teoría, 1.5 para seminarios y
1.5 para prácticas. En la parte teórica se imparte
Derm
ofarmacia, en los sem
inarios Formulación
Magistral y en las prácticas parte son de FM
y parte de D
F.
El programa teórico se im
parte mediante lección
magistral, a excepción delúltim
o tema que trata
sobre los tratamientos derm
ocosméticos que se
estudiaran a través de casos prácticos. El
programa
de Form
ulación M
agistral, im
partido en los seminarios, se realiza m
ediante clases participativas en las que tras la lectura del las
leyes correspondientes
se les
ensaña a
elaborar un Protocolo Norm
alizado de Trabajo. Por últim
o, las prácticas son de laboratorio y en ellas se elaboran 13 fórm
ulas desde geles de baño y crem
as anticelulíticas hasta jarabe y cápsulas de ranitidina.Los casos prácticos se im
parten al modo de
AB
P. Los alumnos se reúnen en grupos de 4 a 6
alumnos para realizar el trabajo. Se desarrollan
4 historietas distintas en las que se plasma
unsupuesto problem
a cosmético relacionado con
un personaje famoso. Estos textos se entregan
al grupo de trabajo al comienzo del curso y
tendrá que
resolverlo en
el correspondiente
cuatrimestre.
Para poder
elaborar su
trabajo tendrá que visitar cualquier O
ficina de Farmacia
y elegir un cosmético o cosm
éticos con el que
tratar a su paciente famoso. El siguiente paso
será elaborar un power pointen el que, adem
ás de señalar
el cosmético y los activos que lleva,
deberá indicar los componentes, la función de
los m
ismos,
el sistem
a físico-quím
ico que
forman y la acción derm
ofarmacéutica que tiene
el preparado base sin activos. A
l final del periodo de docenciase reservan 4
días para que los alumnos hagan la exposición
de sus consejos dermofarm
acéuticos.U
na vez expuestos
todos los
trabajos y
después del
debate que
se establece
entre los
propios alum
nos, se hace una votación entre ellos para seleccionar el que m
ás les ha convencido. Los casos estudiados en el curso 2011-12
han sido:celulitis, envejecim
iento cutáneo: arrugas, pigm
entación cutánea yprotección solar
(Fig. 1). Los casos prácticos se eligen voluntariam
ente por el grupo de alum
nos.La evaluación global de la asignatura se hace sum
ando la nota de teoría (75%), la nota de
prácticas (10%) y la nota de casos prácticos
(15%). Pese a la repercusión
de esta actividad sobre la nota final, hay alum
nos que optan por no hacerlos.
Figura
1. C
aso práctico
sobre celulitis,
pigmentación cutánea, envejecim
iento cutáneo: arrugasy protección solar.
Resultados y D
iscusión: El Espacio Europeo de Educación Superior tiene com
o objetivo, entre
otros, hacer
que nuestros
estudiantes tengan una form
ación más práctica, es decir,
más
profesional. Sin
abandonar la
lección m
agistral como instrum
ento para impartir la
docencia sobre Derm
ofarmacia, creem
os que esta form
ación no es suficiente si el alumno no
la completa con un conocim
iento real de la actuación sobre un
consejo dermofarm
acéutico(resolución de casos prácticos). En cuanto a la Form
ulación Magistral, som
os conscientes que para un alum
no de 2º curso del Grado le resulta
bastante complicado
comprender en 15 h una
materia tan com
pleja, máxim
e cuando aún no ha cursado
lasTecnologías Farm
acéuticas I y II, Farm
acología, Legislacióny ni siquiera han
definido que
es un
medicam
ento. Tras
las clases,
el alum
no tendrá
que elaborar
un Protocolo
Norm
alizado de Trabajo
según el
protocolo elaborado por el Colegio O
ficial de Farm
acéuticos de la provincia de Alicante
(7).En cuanto a las prácticas de laboratorio, el alum
no elaborará
tanto cosm
éticos com
o fórm
ulas magistrales durante 5 días, 3 h/día.
Adem
ás, se le enseñará el manejo de aparatos
frecuentes en un laboratorio de Formulación
Magistral
como:
Ungüator,
magnetoagitador,
encapsulador y emblistador de cápsulas. Por
último, se m
ostrarán las aplicaciones que tienen el D
ermascope M
DS 800 ó derm
oanalizador determ
inando las propiedades de la piel a un alum
no o alumna.
Los grupos de trabajo se han establecido con 4 a 6 alum
nos, dependiendo de cada uno. De los 4
casos expuestos
este año
(celulitis, arrugas,
protección solar
y pigm
entación cutánea):
33,33%han elegido el de celulitis, 27.7%
el de envejecim
iento cutáneo: arrugas, 11.1%el de
pigmentación cutánea y 27.7%
el de protección solar. Se ve claram
ente como relacionarlos con
unpersonaje fam
oso influye en la motivación
para la elección de los casos. Los grupos de trabajo han buscado en las O
ficinas de Farmacia
la información directam
ente del Farmacéutico,
por lo que en muchos casos no han elegido ellos
mism
os el
cosmético.
Dependiendo
de lo
avanzadoque tenga la D
ermofarm
aciaen
ese establecim
iento, la información y el cosm
ético que reciben se ven claram
ente influido con respecto a otras Farm
acias menos desarrolladas.
Otra
información
con la
que trabajan
los alum
nos es con la página web del laboratorio
cosmético del producto
elegido. Adem
ás, cada grupo tiene al m
enos 1 tutoría en el despacho del
Profesor para
ver los
avances y
la elaboración del pow
er point. Por último, todos
los trabajos son corregidos por el Profesor antes de la exposición. Las
evaluaciones finales
se realizan
de la
siguiente manera:
Examen escrito
de teoría: 20 preguntas cortas de contestación breve.Evaluación
continua de
las clases
prácticas.Evaluación de los casos prácticos:
oR
esolución del problema
oD
esarrollo del power point
oD
efensa pública del trabajo.Los resultados finales de la asignatura son:
34.25%aprueban la teoría
100% aprueban las prácticas
100% aprueban los casos prácticos
56.57%aprueban la asignatura
16.67%no se presentan
Conclusiones:1.
Dado el nivel de conocim
ientos de los alum
nos matriculados en
Derm
ofarmacia
y Form
ulación M
agistral es
necesario realizar
actividades dirigidas
por el
profesor para que aprueben y mejoren las
calificaciones obtenidas.2.
El desarrollo de los casos prácticos les lleva
a conocer
la realidad
de la
Derm
ofarmacia en la O
ficina de Farmacia.
Adem
ás, les
permiten
a los
alumnos
integrar los conocimientos teóricos con la
práctica profesionaly mejorar la nota final.
3.A
unque los conocimientos de los alum
nos son
escasos en
Derm
ofarmacia
y Form
ulación Magistral, la m
otivación que tienen
les perm
iten alcanzar
mejores
resultados.
Referencias:
1 .-http://ww
w.rae.es
2.-http://ww
w.portalfarm
a.es 3.-http://w
ww
.a5farmacia.es
4.-http://ww
w.farm
aciacomercialesforjadores.es
5.-http://blog.lafarmaciadem
odesta.com/tag/m
odesta-cassinello/ 6.-http://w
ww
.aemps.es
7.-L. Ruiz,
JL Vidal.
Documentación
y norm
as de
correcta elaboración en Form
ulación Magistral. CO
F de Alicante. 3º edic., 1999.
PRIM
ER
A V
AL
OR
AC
IÓN
DE
L 41ST
ESC
P SYM
POSIU
M O
N C
LIN
ICA
L PH
AR
MA
CY
. B
AR
CE
LO
NA
2012
Eduardo L. Mariño ,PilarM
odamio, C
ecilia Fernández Lastra.
Unidad de Farm
acia Clínica y Farm
acoterapia. D
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica.
Facultad de Farmacia.
Universidad de B
arcelona.
Introducción:La European Society of C
linical Pharm
acy(ESC
P) es una sociedad científica y profesional de larga trayectoria, creada en el año 1979 por profesionales clínicos, investigadores y docentes, que incluye
am
ás de 500 miem
bros de m
ás de 50 países, con el objetivo general de desarrollar
y prom
over el
uso racional
y apropiado
de los
medicam
entos, productos
medicinales y dispositivos,
no sólo para el individuo
sinotam
bién para
la sociedad
(http://ww
w.escpw
eb.org/cms/hom
e).
La ESCP viene realizando cada año su Sim
posio,que ya con antelación tuvo alguna vez lugar en España, pero en la 41 edición fue la prim
era vez que la organización conjunta estuvo a cargo de un
grupo universitario
como
la U
nidad de
Farmacia
Clínica
y Farm
acoterapia del
Departam
ento de
Farmacia
y Tecnología
Farmacéutica
de la Facultad de Farmacia de la
Universidad de B
arcelona
Aunque el C
ongreso tuvo lugar durante los días 28 a 31 de octubre de 2012, prácticam
ente dos años antes habíam
os comenzado los preparativos
para su
realización, previa
aceptación de
la propuesta que nos hizo llegar la ESC
P a tales efectos.
Materiales y m
étodos:Se contó con un amplio
respaldo institucional, que permitió constituir el
siguiente Com
ité de Honor:
Ministra de Sanidad, Servicios Sociales
e Igualdadde España.
Alcalde de B
arcelona. C
onseller de Salut de la Generalitat de
Catalunya.
Rector de la U
niversitat de Barcelona.
Decano de la Facultad de Farm
acia de B
arcelona.Presidenta del C
onsejo General de C
olegios O
ficiales de Farmacéuticos de España.
President del Consell de C
ol.legis de Farm
acéutics de Catalunya.
Presidenta de la Real A
cademia
Nacional de Farm
acia de España.Presidente de la A
cademia
Iberoamericana de Farm
acia.President de la R
eial Acadèm
ia de Farm
àcia de Catalunya.
Por otra parte pretendíamos hacer un C
ongreso integrador, por lo que
invitamos a que se
incluyeran con nuestra Unidad en el C
omité
organizador y aceptarona
formarparte “activa”
del mism
o al Colegio de
Farmacéuticos de
Barcelona, Fundación Pharm
aceutical Care,
Sociedad Española de Farmacia C
omunitaria
(SEFAC
), Sociedad Española de Farmacia
de A
tención Primaria
( SEFAP), Sociedad
Española de Farmacia R
ural (SEFAR
), Sociedad Española de Farm
acia Hospitalaria (SEFH
) y la Societat C
atalana de Farmàcia C
línica (SCFC
).
El program
a resultó
equilibrado para
tratar cuestiones que fueran de interés a la Farm
acia C
omunitaria, a la Farm
acia Hospitalaria, a la
Atención Prim
aria y también para la U
niversidad en las vertientes profesionales y científicas, con tem
áticas de absoluta actualidad presentadas por especialistas de España y del
resto de Europa principalm
ente, aunque
también
del N
orte, C
entro y Sudamérica junto con países Á
rabes y A
siáticos. Se recibió la propuesta para hacer un total de 30 talleres, de los cuales tras su evaluación 28 fueron finalm
ente los ofertados. Los asistentes pudieron participar en 5 talleres
(2 por día (2 horas cada uno)) excepto el últim
o día que sólo hubo una sesión de talleres.
El primer día estuvo dedicado a los tem
as de Efectividad y C
oste-Efectividad,el segundo a Seguridad y
el tercer y último día tuvo com
o lem
a y objetivo prioritario: los Pacientes.
Se contó con la acreditación del Consell C
atalà de Form
ació Continuada de les Professions
Sanitàries de las sesiones plenarias y de los w
orkshops. Para cada sesión plenaria: 0,2 créditos; para cada w
orkshops: 0,3 créditos con validez estatal. Por prim
era vez de todas las realizadas en España, este C
ongreso ha recibido este tipo de acreditación habitual cuando se hace en otros países de Europa.
Por otro lado y además de las sesiones
establecidas para discutir las conferencias plenarias, cada día tuvim
os para darmás la
palabra a los congresistas: 2 horas para com
unicaciones orales y 2 horas para discusión
de poster y así hacer un congreso claramente
participativo.
Todas las comunicaciones presentadas fueron
valoradas mediante un proceso “ciego” de
revisión por pares, aleatorizado.
Fue un Congreso absolutam
ente independiente y libre de cualquier conflicto en el cam
po de la ética y la bioética, y al no estar presente la industria farm
acéutica no hubo lugar a ninguna posible incidencia que pudiera contravenir los códigos de Farm
aindustria ni de la EFPIA .
Resultadosy D
iscusión:Sin pretender hacer una revisión exhaustiva
del Simposio,
señalaremos
sólo algunas cuestiones como que hubo un total
de 700 participantes de más de 30 países de todo
el mundo.
Del total de com
unicaciones presentadas, casi 500,fueron seleccionadas 409.A
demás del libro
del Congreso (por cierto agotado) las
conferencias y comunicaciones (poster
incluidos) presentadas, serán publicadas en la revista International Journal of C
linical Pharm
acy anteriormente conocida com
o Pharm
acy World &
Sciences.
Se hizo notar la presencia decongresistas m
uy jóvenes. La m
ayor parte de los participantes han sido extranjeros m
ientras que españoles eran alrededor de unos 130 y la m
ayoría del ámbito
hospitalario. Teniendo pues en cuenta el número
de integrantes en el colectivo, se observó una baja asistencia de participantes de Farm
acia C
omunitaria.
La presenciade
profesorado y alumnos de las
Universidadesdonde se im
parte los estudios de Farm
acia fue reducidísima, descontado la
de B
arcelona por nuestra Unidad, com
o era deprever, y por una Profesora m
ás. La Decana de
Farmacia de la U
niversidad San Pablo CEU
de M
oncada y profesorado de esta Universidad
estuvieron con nosotros durante los tres días. No
encontramos inscritos ni participantes al m
enos en un núm
ero significativamente alto de los
órganos de gobierno de los demás C
olegios O
ficiales de Farmacéuticos de España, excepto
del de Barcelona.
Tampoco contam
os, salvo honrosas excepciones, con quienes habitualm
entea nivel estatalm
ás suelen opinarsobre las tem
áticasde Farmacia
Clínica y A
tención Farmacéutica, a pesar de que
en esta ocasión si tuvimos la oportunidad de
encontrarnos y debatir con los auténticos líderes sobre estas m
aterias .
Para finalizarsólo agradecer muy sinceram
ente la colaboración de todos los que nos han ayudado en los casi dos añosprevios, para que después de 40 ediciones este C
ongreso CIEN
TÍFICO
Y
PRO
FESION
AL fuera coorganizado, PO
R
PRIM
ERA
VEZ EN
ESPAÑ
A PO
R U
N
GR
UPO
DE LA
UN
IVER
SIDA
D com
o es nuestra U
nidad de Farmacia C
línica y Farm
acoterapia de la UB
.
41st ESCP Sym
posium on Clinical Pharm
acy. Barcelona 2012.
XICongresode
laSociedad
Españolade
Farmacia
IndustrialyGalénica.25
AniversarioSEFIG.Alicante
68
febrero2013
PostersSecciónTecnología
Farmacéutica
55
BIO
SISTE
MA
S BA
SAD
OS E
N H
IDR
OG
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ES PA
RA
EL
TR
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SPOR
TE
Y L
A R
ET
EN
CIÓ
N
DE
CÉ
LU
LA
S MIC
RO
EN
CA
PSUL
AD
AS.
A.A
carregui 1,2, F.J. Blanco
3, G. O
rive1,2, J.L. Pedraz
1,2, R.M
. Hernandez
1,2
1Grupo N
anoBioC
eL, Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad del País V
asco, Facultad de Farm
acia,Paseo de la Universidad 7. 01006 V
itoria, España2C
entro de Investigación Biom
édica en Red en B
ioingeniería, Biom
ateriales y Nanom
edicina (CIB
ER-
BB
N), V
itoria, España3C
IBER
-BB
N B
ioscaff Cartílago, IN
IBIC
-Hospital U
niversitario, 15006, A C
oruña,España
Introducción: La encapsulación de célulasper-
mite trasplantar cualquier tipo célula y
proteger-la
frente a
la respuesta
inmunológica
delhuésped con el fin de recuperar la funcionalidad de tejidos y órganos dañados o
simplem
ente com
o sistema de liberación de productos
tera-péuticos, a largo plazo, sin el requerim
iento de inm
unosupresión farmacológica(1-3). En los
úl-tim
os años, esta tecnología ha sido objeto de un gran interés por parte de la com
unidad científicalo que ha perm
itido su estudioen
numerosas
aplicaciones terapéuticas (4). Sinem
bargo, para llegar a la aplicación clínica quedan todavía una serie de
limitaciones
por solventar, como
con-trolary optim
izar la administración y extracción
de los sistemas bioencapsulados
yreducir la
inflamación
yla
reacción fibrótica
que se
produce.El propósito del presente estudio fue
desarrollarunbiosistem
a basado en un hidrogel de alginato que contenía
célulasm
icroencapsu-ladas y estudiar el
comportam
iento biológico después
de la
administración
in vivo.
Seelaboraron y evaluaron dos tipos diferentes dehidrogeles: hidrogeles preform
ados ehidrogeles
formados in situ.Estos hidrogeles cargadas con
las células microencapsuladas se com
pararon con
lascélulas microencapsuladas libres.
Materiales y M
étodos: Los mioblastos C
2 C12
modificados genéticam
ente para secretareritro-
poyetina (Epo) murina fueron
encapsulados en m
icrocápsulas alginato
poli-L-lisinaalginato
(APA
) a
una densidad
de 5x10
6células/mL
usando un goteador electrostático(5). Para la
elaboración de
los hidrogeles
se añadieron
100L de m
icrocápsulas APA
auna solución
dealginato
y esta mezcla se gelificó ionicam
en-te
mediante
una soluciónde C
aSO4
utilizando para ello un sistem
a de dos jeringas conectadas.
Figura 1.Figura representativa de las microcápsulas
APA
(A). H
idrogel in situ(B
). Hidrogel preform
ado (C
).
Para los ensayos in vitrolas m
ezclas se dejaron gelificar durante 40 m
inutos entre dos placas de vidrio separadas por un espaciador de 1
mm
(hidrogel preform
ado) o
en un
placa de
6 pocillos
(hidrogel in
situ) (Figura
1).La
actividad metabólica de las células encapsuladas
se determinó
mediante un ensayo colorim
étrico (C
CK
-8). La producción de Epo se cuantificó utilizando un kit ELISA
.Para los ensayos
in vivo se emplearon
ratones B
alb/c hembras
y se dividieron en 3 grupos tratados (n=8 por grupo): (1) hidrogel in situ (lagelificación
de la
mezcla
delas
cápsulas A
PA/alginato
se produce
en el
cuerpo del
animal
trasla
administración),
(2)hidrogel
preformado
(con cápsulas
APA
)y
(3)m
icrocápsulas APA
y enotros 2 grupos control
(n=3 porgrupo): (4) control hidrogel in situ (la
gelificación del hidrogel con las cápsulas APA
vacías se produce
en el cuerpo del animal tras
la adm
inistración)y
(5) control
hidrogelpreform
ado (con cápsulas APA
vacías). En los grupos
1,3
y 4
la adm
inistraciónfue
mínim
amente
invasiva y
se hizo
subcutáneamente
conun
catéter. En
losanim
ales de los grupos 2 y 5 fue necesario realizaruna incisión de 2
cm en la zona
dorsalyse
introdujo el
hidrogelpreform
ado en
el espacio subcutáneo suturando posteriorm
ente la incisión.Se realizaron m
uestreos semanales de
sangredurante el
primer m
es y posteriormente
cada quince díasde la zona subm
andibular utilizando capilares heparinizados. Los
niveles de
hematocrito
se determ
inaronusando
un m
étodo estándar(microhem
atocrito). Dos
meses
después de la implantación, algunos
animales
fueron sacrificados y las microcápsulas fueron
explantadas y fijadas para su posterior análisis histológico (H
& E).
Resultados y D
iscusión: Los ensayos in vitrorealizados pusieron de m
anifiesto que tantola
actividad metabólica com
o la producción de Epo de las células se m
antuvieronelevadas y
estables durante el ensayo y nose
observaron diferencias entre las
3 formulaciones (Figura 2).
Estos resultados podrían sugerirque elhidrogel
de alginato no condicionanegativam
ente en la difusión de los nutrientes y O
2hacia el interior
ni de la difusión dela
Epo al exterior.
56
Figura 2.Actividad m
etabólica (A) y producción de
Epo (B).
En cuanto al ensayo in vivo, los nivelesde
he-m
atocrito enlos gruposhidrogel in situ
y micro-
cápsulas APA
(grupos 1 y 3) sem
antuvieron elevados hasta el últim
o día del ensayo y no se observaron diferencias
significativas entre ellos(Figura 3A
).Losanálisis histológicos de las
mi-
crocápsulasexplantadas m
ostraronla form
ación de
capilares alrededor
de las
microcápsulas
(Figura 3B, flechas negras). A
demás, se observó
uncrecim
iento fibrótico alrededor de lasm
icro-cápsulas en
ambos
grupos tratados, que era más
evidente en el grupo de las microcápsulasA
PA.
Figura 3.N
ivelesde hem
atocrito (A) y análisis
histológico (B
) de
las grupos
hidrogel in
situ,m
icrocápsulas APA
y control in situ.
El nivel de hematocrito de los grupos
hidrogel preform
ado y microcápsulas A
PAfue sim
ilardurante las prim
eras 3 semanas.D
esde estepun-
to, el nivel de hematocrito del grupo hidrogel
preformado sufrió una bajada, pero se m
antuvo en niveles superiores al
80% hasta el final del
experimento y no m
ostródiferencias significati-
vas respecto al grupo de microcápsulas A
PA(Figura 4A
). Los resultados de las histologías m
ostraron una
reacción a
cuerpo extraño
alrededor de las microcápsulas, que fue m
ás
pronunciadaen el grupo de m
icrocápsulas APA
. Tam
bién se observaron capilares rodeandolas
microcápsulas en el grupo
de microcápsulas
APA
(Figura 4B, flecha
negra).
Figura 4.N
ivelesde hem
atocrito (A) y análisis
histológico (B) de las grupos hidrogel preform
ado, m
icrocápsulas APA
y control preformado.
La formación de vasos puede
ser debidoa los
efectos angiogénicos reportados para la Epo, lo que lleva a un m
icroambiente m
ás adecuado,m
ejorando así el acceso de oxígeno ynutrientes
a las células encapsuladas.Lacápsula
fibrótica que se observa es m
ás evidente en el grupo las m
icrocápsulas APA
. Esto puede ser debido a que el hidrogel que rodea
las microcápsulas
APA
en los grupos preformado e in situ
evitael
contacto directo
de la
poli-L-lisinacon
las células
de la respuesta inflamatoria,dando lugar
a una menor reacción de cuerpo extraño.
Conclusión:
Se han elaborado y analizado dostipos
de hidrogeles que contienen microcápsulas
APA
,para
mejorar
laadm
inistración y
la retención
y reducir
la inflam
ación post-
trasplante de las célulasm
icroencapsuladas.Enel futuro, estos biosistem
aspueden perm
itir la incorporación y la coencapsulación de factores de crecim
iento u otroscompuestospara elim
inar la hipoxia, m
ejorar el suministro de oxígeno y
promover la angiogénesis.
Referencias:
(1) Orive G
et al. Nat. M
ed. 2003;9, 104-107. (2)
Hernandez
R.M
et al. Drug. D
eliv. Rev.
2010, 62, (7-8), 711-730.(3) C
hang T.M. Science. 1964,146,524-525.
(4)A
carregui A et al. B
iodrugs 2012; 26 (5): 283-301(5)Lim
F, Sun AM
. Science 1980; 210: 908-10
Agradecim
ientos:Este proyecto ha sido parcialm
ente financiado por la U
niversidad del País Vasco (U
PV/EH
U)
(UFI 11/32). A
. Acarregui agradece al G
obierno V
asco (Departam
ento de Educación,U
niversi-des e Investigación) porsu beca predoctoral.
57
INFL
UE
NC
IA D
EL
PHE
N L
A T
RA
NSFE
CC
IÓN
DE
L PL
ÁSM
IDO
PCM
S-EG
FP ME
DIA
DA
PO
R O
LIG
OQ
UIT
OSA
NO
SM
. Agirre, J.Zarate,G
.Puras, J.L. PedrazN
anoBioC
elGroup, D
epartamento de Farm
acia y Ciencias de los A
limentos, U
PV-EH
U, V
itoria-Gasteiz.
Centro de Investigación en
Red-B
ioingeniería, Biom
ateriales y Nanom
edicina (CIB
ER-B
BN
).
Introducción: El
quitosano es
un polím
ero biodegradable
compuesto
por subunidades
repetidas de
D-G
lucosamina
y N
-acetil-D-
Glucosam
ina, con una amina prim
aria en cada unidad deacetilada y un pK
a de 6,5 que lo convierte soluble en m
edios ácidos. Debido a su
inocuidad demostrada
en animales y hum
anosy
sus adecuadascaracterísticas físico-quím
icas, ha sido
propuesto com
o una
alternativa a
los vectores
virales (1).
Entrelos
factores que
afectan ala transfección con quitosanos, el
grado de
deacetilación(G
DA
)y
el peso
molecular
(Pm)
del quitosano
son los
más
importantes,
además
del ratio
de carga
quitosano/DN
A (ratio N
/P), el tipo de célula, el tam
año y el potencial Z de las nanopartículas yla concentración de sales del m
edio(2). En
comparación con los de alto Pm
, losquitosanos
de bajo
Pm(oligoquitosanos)
son de
bajaviscosidad y m
ejoran la liberación del AD
N
unido al
vector, necesaria
para una
mejor
transfección. Adem
ás, los oligoquitosanos dealto G
DA
han demostrado ser los m
ejores para transfectar
in vivo,
evitan el
riesgo de
acumulación en tejidos y
son menos tóxicos (3,
4).Otras de las características de los com
plejos quitosano/D
NA
es su altasensibilidad por el pH
del m
edio. Num
erosos estudios han demostrado
mejores eficiencias de transfección in vitro
apH
s entorno a 6,5 en comparación con pH
s alrededor
de 7,4
(5).Por
lo tanto,
hemos
analizado la influencia del pH del m
edio en la eficiencia de transfección de células H
EK293 y
AR
PE19, con oligoquitosanos de bajo Pm y alto
GD
A (N
OV
AFEC
T O15: 5,7 kD
a eta 99%;
NO
VA
FECT O
25: 7,3 kDa eta 99%
).
Materiales y M
étodos: Para realizar el estudio de la influencia de las variables N
/P, pH y
concentración de sales en el tamaño
y carga de los poliplexos, se ha llevado
a cabo un diseño factorial 2
3. Mediante electroforesis en geles de
agarosa, se ha analizadoa diferentes ratios N
/P la capacidad de los poliplexos para condensar, liberary proteger el plásm
ido.Posteriormente se
ha llevado a cabo el estudio de transfección in vitro
en células HEK
293 y AR
PE19 a pH 7,4
para seleccionar las proporciones N/P que m
ás transfectan.
Finalmente,
con los
poliplexosseleccionados se ha estudiado el efecto del pH
en la transfección del plásm
idopC
MS-EG
FP en
estas dos
líneas celulares.
El análisis
cualitativo de la transfección se ha llevado a cabo m
ediante microscopia de fluorescencia,
mientras
que por
citometría
de flujo
se ha
medido el porcentaje relativo de células que
expresan EGFP.
El análisis estadístico de losdatos de transfección se ha realizado m
ediante la com
paración de medias aplicando el test T de
Student. Valores de p<0,05 se han considerado
significativos.
Resultados y D
iscusión: Los 8experim
entosde caracterización de tam
año y carga (respuestas) han m
ostrado que los efectos de las variables testadas no tienen la m
isma
influencia sobre el tam
año de
partícula en
los dos
tipos de
poliplexos diseñados.
Mientras
que en
los poliplexos O
15 el pH y el N
/P influyen mucho
en el tamaño, en el caso del O
25 sólo seha
podidoapreciar un leve descenso en el tam
año al aum
entarla N
/P (Figura 1A y 1C
). Por otro lado,
se ha visto que, independientemente del
quitosano utilizado, el parámetro lim
itante del potencial Z
esel
pH del m
edio. Adem
ás, cabe destacar que el efecto de cada variable sobre las respuestas obtenidas
no dependede las dem
ásvariables, salvo en el caso del pH
y la N/P en
los poliplexos elaborados con O15 (Figura 1B
).
Figura 1-Valores de las respuestas (tamaño y carga)
obtenidas analizando
cada variable
de form
a independiente
y considerando
las posibles
interacciones entre
variables, en el
caso de
los poliplexos O
15 y O25
(Ay
C, respectivam
ente). G
ráfica de la interacción entre las variables pH y
N/P en los poliplexos O
15 (B).
En cuanto a los geles de agarosa,el O
25 ha m
ostradouna m
ayor capacidad de retención del plásm
ido, aunque en presencia de SDS y enzim
a todas las proporciones N
/P analizadas (5, 10, 20
58
y 30) han sido capaces de liberar y proteger el plásm
ido(Figura 2).
Figura 2- Geles de agarosa para el estudio de la
capacidad de retención, liberación y protección de los oligoquitosanos O
15 (A) y O25 (B). O
C: form
a circular abierta, SC
: forma superenrrollada. Líneas
1-3: ADN
libre; líneas 4-6: N/P =
5; líneas 7-9: N/P
= 10; líneas 10-12: N
/P = 20; líneas 13-15: N
/P =
30. Los poliplexos han sido tratados con SDS
2%(líneas 2, 5, 8, 11 y 14) y D
Nasa I (1U
/2.5)
(líneas3, 6, 9, y 15).
Por otra parte,enlos resultados obtenidos en los
ensayos de transfección a diferentes pHs (7,4 y
6,5), se ha vistoque en las dos líneas celulares,
independientemente
del vector
y de
la N
/P utilizada,
a pH
6,5
se obtienen
valores de
transfección significativam
ente superiores
(Figura 3, barras).R
especto a la viabilidad de las células, se ha observado que
las AR
PE19 son m
ás sensibles a los efectos tóxicos de los poliplexos, m
ás aún a medida que se aum
entala
N/P (Figura 3, líneas).
Figura 3: Influencia del ratio N/P el pH
en la expresión de EG
FP y viabilidad en células HEK
293 (A) y ARPE19 (B). Los datosde transfección han sido norm
alizados respecto a la Lipofectamina TM
(media
± DS; n=
3).
Esto demuestra la gran influencia del pH
del m
edio de transfección cuando se transfectanin
vitrolíneas
celulares de
diferentes características utilizando com
o vector no-viral el quitosano. A
pesar de ello, el descenso del pH
del medio no ha sido suficiente para llegar a
obtener porcentajes de transfección similares a
los obtenidos conlos liposom
as comerciales
(lipofectamina
TM), utilizados
como
control positivo en transfección
(Figura 4).
Figura 4:
Microfotografías
de células
HEK
293 transfectadas
a pH 6,5 (cam
po claro: columna de la
izquierda; fluorescencia:
columna
del centro)
y gráficas (FL1/FL3) de citom
etría de flujo (columna
de la derecha). Imágenes A1, A2 y A3: O
15, N/P 30.
Imágenes B1, B2 y B3: O
25, N/P 30. Im
ágenes C1, C
2 y C3: Lipofectam
inaTM.
Conclusión: El
descenso del pH del m
edio de transfección increm
enta significativamente el %
relativo de células transfectadas con los dos tipos de quitosanos. Estos resultados sugieren que estos oligoquitosanos podrían ser útiles para transfectar in vivo
células que se encuentran en un
ambiente
ligeramente
ácido, tales
como,
células de la retina o células tumorales.
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Methot
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, B
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NA
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, Lavertu M, B
uschmann
MD
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m
olecular w
eight chitosan/D
NA
com
plexes: effect
of pH
and
serum.
Mol
Biotechnol
Oct;46(2):182-196.
Agradecim
ientos:Este proyecto ha sido apoyado
económicam
ente por la UPV
/EHU
(UFI 11/32). Los
autores agradecen el apoyo técnico y humano de los
SGIker (U
PV/EH
U, M
ICIN
N, G
V/EJ, FSE).
59
DISE
ÑO
DE
VE
CT
OR
ES N
O V
IRA
LE
S PAR
A E
L T
RA
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MIE
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O D
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NFE
RM
ED
AD
ES
DE
GE
NE
RA
TIV
AS D
E R
ET
INA
PS. Apaolaza
1, A. del Pozo-Rodríguez
1, AR
Gascón
1, MA
Solinís 1
1Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farm
aceútica, Facultad de Farmacia, U
niversidad del País Vasco U
PV/EH
U, V
itoria, 01006, España.
INT
RO
DU
CC
ION
Laterapia génica a nivel ocular con vectores no
virales basados
en N
anopartículas Sólidas
Lipídicas (SLN
s) ha
obtenido resultados
positivos “in vitro” (1) e “in vivo” (2,3). Con el
fin de obtener nuevos vectores más seguros y
eficaces, se pueden incorporar ligandos en la superficie, com
o el Ácido H
ialurónico (HA
). Este
polisacárido es
biocompatible,
muco-
adhesivo, biodegradable y además se encuentra
de forma fisiológica en el ojo (3). El objetivo de
este trabajo es la evaluación de la capacidadde
transfección de vectores basados en SLNs que
contienen HA
y protamina en células A
RPE-19,
así com
o el
estudio de
sucaptación
y disposición
intracelularen
la m
isma
línea celular. Para ello se utilizó el plásm
idom
odelo pC
MS-EG
FP.
MA
TE
RIA
LE
S Y M
ÉT
OD
OS
Elaboración de
los vectores:
Los vectores
compuestos
por H
A-protam
ina-AD
N-SLN
se obtuvieron
tras adición
delcom
plejo H
A-
protamina-A
DN
en solución con la suspensión acuosa de SLN
s elaboradas por el método de
emulsificación
y evaporación
del solvente
descrito por del Pozo-Rodríguez
et al (4). Se utilizó
HA
con
tres pesos
moleculares
diferentes: 150 kDa; 500 kD
a y 1630kD
a. La proporción H
A:protam
ina:AD
N:SLN
fue fijado en 0.5:2:1:5.
Caracterización: El tam
año de partícula y la carga
superficial se
determinaron
por espectroscopía de correlación fotónica (PC
S) y por velocim
etría láser doppler, respectivamente
(LDV
). La capacidad del vector de unir el AD
N,
protegerlo de la acción de la DN
Asa I y la
liberación del vector, inducida por SDS, se
estudiaron mediante
electroforesis en gel de agarosa.
Ensayos en cultivos celulares: La eficacia de transfección
“in vitro”
encélulas
de retina
AR
PE-19se determ
inóm
ediante citometría de
flujo, cuantificando
el porcentaje
de células
EGFP
positivas a
diferentes tiem
pos. La
viabilidad celular se determinó em
pleando el kit A
potox-Glo™
. La
captación celular
de los
vectores 2 horas post-administración se observó
mediante citom
etría de flujo, empleando SLN
s m
arcadas con Nile R
ed.
Mecanism
o de
entrada y
disposiciónintracelular:
El m
ecanismo
de endocitosis
empleado en la internalización de los vectores
se determinó cualitativam
ente por microscopía
confocal(C
LSM).
Para ello
las células
se incubaron
durante 2
horas con
vectores m
arcadas con
Nile
Red
(rojo)junto
a los
marcadores para la endocitosis
mediada por
caveola/lipid rafts (AlexaFluor488-Toxina del cólera)
y clatrinas
(AlexaFluor488-Transferrina).
La coincidencia
de am
bos m
arcadores en un mism
o plano es indicativa de colocalización (am
arillo).
RE
SUL
TA
DO
S Y D
ISCU
SIÓN
En la tabla 1 se recoge el tamaño y carga
superficial de los vectores preparados con elH
A.C
omo
puede observarse, el peso molecular
delHA
no produjo cambios significativos ni en
el tamaño de partícula ni en la
carga superficial.
Vector
Tam
año (nm)
Potencialm
V
HA
150kDa
292.10 ± 51.36+33.00 ± 1.18
HA
500kDa
259.13 ± 16.51+36.77 ± 0.35
HA
1630kDa
271.93 ± 17.11+30.73 ± 1.2
Tabla 1. Tamaño y Potencial Z de los vectores H
A-protamina-AD
N-
SLNform
ados con HA de 150kD
a; 500 kDa y 1630 kD
a. El ratio p/p/p/p se fijo en 0.5:2:1:5.
Com
o se puede observar en la figura 1, todos los vectores fueron capaces
de unir el AD
N,
protegerlo de la acción enzimática y liberarlo
(figura 1).
Figura 1. Electroforesis
en gel de agarosa. Carriles: 1 =
ADN
; 2-4=
Unión
vectores H
A150kDa;
500kDa
y 1630kD
a; 5=
AD
N+
DN
Asa; 6-8= Protección vector H
A150kDa; 500kD
a y 1630kD
a; 9-11=
Liberación vector
HA150kD
a; 500kD
a y
1630kDa.
En la
figura 2
se recoge
la eficacia
de transfección
de los
vectores a
lo largo
del tiem
po. Se puede observar un aumento de la
transfección con los tres vectores desde las 24 horas hasta los 7 días, alcanzándose el valor m
áximo a las 96 horas.
(60-70%de células
transfectadas). Esteaum
ento puede deberse por un lado a la incorporación de protam
ina, péptido capaz
de condensar
el D
NA
y
por ello
protegerlo; adem
ás posee
secuencias de
60
localización nuclear (NLS) (5)
en su estructura capaces
de facilitar
el acceso
del D
NA
al
núcleo. No obstante, la presencia de H
A en el
vector produjo un aumento en la eficacia de
transfección respecto a los resultados obtenidos en estudios previos (1) con vectores elaborados únicam
ente con protamina-A
DN
-SLN.
Figura 2.Eficacia de transfección a lo largo del tiem
po en células ARPE-19.Las barras de error representan D
.E.(n=3).* p<
0.05 con respecto a H
A150kDa-Prot-AD
N-SLN
.
En la
figura 3
se puede
observar que
laviabilidad celular fue siem
pre superior al 70%.
Figura 3.
Viabilidad celular en células ARPE-19. Lasbarras de
error representan D.E.(n=
3).* p<0.05 con respecto a H
A150kDa-
Prot-ADN
-SLN.
La captación celular de los vectores se confirmó
cuantitativamente por citom
etría de flujo. Com
o se observa en la figura 4, el desplazam
iento de los
histogramas
con respecto
al control
de células sin tratar, indica que todas las células fueron capaces de captar los vectores.
Figura 4. Análisis por citom
etría de flujo de la captación celular de vectores H
A-Prot-ADN
-SLN preparados con SLN
s marcadas con
Nile Red.
No se observaron diferencias en la captación
entre los
vectores elaborados
con H
A
de diferente peso m
olecular. No se encontraron
diferencias entre la captación de estos vectores y el vector preparado con protam
ina pero sin HA
y estudiado en un trabajo previo (2), por lo que el increm
ento en la transfecciónde los vectores
que tienen
HA
no
está relacionado
con la
internalización celular.
En la
figura 5
se m
uestran las
imágenes
obtenidas por
CLSM
. Se
observa que
los
vectores elaborados con SLNs m
arcadas con N
ile Red colocalizaban con el m
arcador de la vía endocítica m
ediada por caveola/lipid rafts. Sin em
bargo, no se observó colocalización con el m
arcador de la vía endocítica mediada por
clatrinas. Estudios anteriores han mostrado que
el vector
protamina-A
DN
-SLN
emplea
la endocitosis
mediada
porclatrinas
(1). Este
hecho nos indica que la incorporación de HA
al vector fue capaz de m
odificar su mecanism
o de entrada en las células A
RPE-19, pasando
de la vía clatrina a la vía caveola/lipid rafts. Este cam
bio en
el m
ecanismo
de internalización
puede ser la causa del aumento observado en los
niveles de transfección con las formulaciones
que contienen HA
, ya que la vía caveolar evita la fusión con los lisosom
as y por tanto, la degradación lisosom
al.
Figura
5 C
LSM
imágenes
en ARPE-19.
A)SLN
-Nile
Red y
AlexaFluor488-Toxina del
cólera y
B)SLN
-Nile
Red y
AlexaFluor488-Transferrina.
CO
NC
LU
SION
Los vectores no virales compuestos por H
A,
protamina
y SLN
s perm
iten obtener
altos niveles de transfección en células A
RPE-19. La
alta eficacia
de transfección
obtenida se
relaciona con la capacidad de la protamina de
proteger e internalizar el AD
N en el núcleo, por
su contenido en NLS, y a la presencia de H
A en
la superficie del vector, que dirige el mecanism
o de
internalización celular
hacia la
ruta caveola/lipid rafts.
AG
RA
DE
CIM
IEN
TO
S
Este trabajo fue realizado gracias al Gobierno
Vasco (IT-341-10). PS
Apaolaza agradece a la
Universidad del País V
asco UPV
/EHU
por su beca.
RE
FER
EN
CIA
S
1.D
elgado D, et al. Eur. J. Pharm
. Biopharm
. 2011; 495:502-79.
2.D
elgado D, et al. Int. J. Pharm
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61
EST
UD
IO PR
EL
IMIN
AR
DE
NA
NO
CO
MPU
EST
OS M
AG
NE
TIT
A/PO
LI(
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ICA
DE
IMA
GE
ND
E
CÁ
NC
ER
DE
CO
LO
N A
VA
NZA
DO
J. Prados 1,J.L. Arias 2,A
. Alberich-B
ayarri 3,E. Sáez-Fernández2,C
. Melguizo
1, R. O
rtiz4, G
. Perazzoli 1,M
.A. R
uiz2,A
. Aránega
1
1Instituto de Biopatología y M
edicina Regenerativa (IB
IMER
), Dpto. de A
natomía y Em
briología H
umana, U
niversidad de Granada, España.
2Dpto. de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Granada, España.
3Hospital Q
uirón, Valencia, España
4Dpto. de C
iencias de la Salud, Universidad de Jaén, España.
e-mail: jlarias@
ugr.es
Introducción:La
resonancia m
agnética de
imagen (R
MI) es una técnica no invasiva que
permite obtener im
ágenes anatómicas de alta
resolución. Éste
es un
método
ampliam
ente em
pleado para el diagnóstico de patologías de tejidos blandos o cartílagos, ya que perm
ite diferenciar tejidos enferm
os (p. ej., cancerosos). A
ctualmente, uno de los agentes de contraste de
RM
I más prom
etedores son las nanopartículas de
óxido de
hierro superparam
agnético. Su
utilidad se debe a lacapacidad de relajación T
2 * que tienen, con una excelente sensibilidad en im
ágenes T2
yT
2 * en comparación con otros
agentes de RM
I como los quelatos de iones
paramagnéticos
(p. ej.,
Gd
3+ –
DTPA
). La
relajación T
2que
inducen estas
partículas superparam
agnéticasse
traduceen
una atenuación
de la señal deim
ágenes T2 . D
e esta m
anera, generanun contraste negativo o negro
en RM
I al provocar una fuerte susceptibilidad m
agnética en las moléculas de agua vecinas (1).
Este trabajo
se centra
en el
diseño y
caracterización de nanocompuestos constituidos
por núcleos superparamagnéticos de m
agnetita (Fe
3 O4 ) em
bebidos en una matriz de poli(
-caprolactona)
(PCL).
La selección
deeste
polímero sem
icristalinose debe a su naturaleza
biodegradable y biocompatible, lo que ha hecho
que sea ampliam
ente utilizado en la formulación
de micro-(nano-)partículas e im
plantes (2).M
ateriales y Métodos: Los productos quím
icos eran
de calidad
analítica (Sigm
a-Aldrich,
Alem
ania). El agua fue desionizada y filtrada (M
illi-Q, M
illipore, Francia). Los núcleosde
Fe3 O
4se obtuvieron m
ediante co-precipitación quím
ica en solución (1).La síntesis de las partículas Fe
3 O4 /PC
L se basa en
el m
étodo de
disposición interfacial
del polím
ero ampliam
ente utilizado en la síntesis de nanoesferas
de PCL (2). B
revemente, la síntesis
comenzó con la adición bajo agitación de 10 m
L de una solución de polím
ero en diclorometano
(0.3%, p/v) sobre una suspensión acuosa de
Fe3 O
4(0.3%
, p/v) con una concentración de pluronic
F-68
del 2%
(p/v).
La agitación
mecánica fue m
antenida durante 1 hora, para a continuación realizar la lim
pieza magnética de
los nanocompuestos.
Para optimizar las condiciones de síntesis, se
obtuvieron nanocom
puestos con
diferentesproporciones de Fe
3 O4 :PC
L (desde 1:4 a 4:1), determ
inándose el rendimiento de la reacción.
La geometría de las
partículasfue estudiada
mediante H
RTEM
y PCS.
A continuación, se investigó
la citotoxicidad de las
partículas Fe
3 O4 /PC
L utilizando
el test
colorimétrico M
TT (azul de tetrazolio), y un rango de concentraciones de 10 a 200 m
M. Para
ello, se seleccionó la línea SW480 de células de
adenocarcinoma de colon hum
ano.Finalm
ente, la caracterización de las partículas Fe
3 O4 /PC
L como agentes de contraste en R
MI
se realizó mediante el estudio de los tiem
pos de relajación T
2 . La figura 1 muestra la disposición
de los
tubos de
las diferentes
suspensiones acuosas de nanocom
puestos en el fantoma. Se
adquirieron secuencias multieco con tiem
pos de eco de 16, 32, 48,64, 80, 96, 112 y 128 m
s.
Figura 1.C
olocación en el fantoma de las
suspensiones de
diferente concentración
de nanocom
puestos Fe3 O
4 :PCL 1:4 (1p4p) y 2:4
(2p4p).
Los experimentos se realizaron por triplicado.
El análisis
estadístico de
los resultados
serealizó m
ediante la prueba tde Student.
Resultados y D
iscusión:La figura 2 recoge las m
icrofotografías H
RTEM
de
laspartículas
Fe3 O
4 /PCL obtenidas según las variantes del
procedimiento de síntesis. Las diferencias m
ás im
portantesse
observaron entre
los nanocom
puestos de relación 1:4 y 4:1. Si la relación
inicial entre
las m
asas es
4:1, el
recubrimiento
polimérico
de los
núcleos de
Fe3 O
4 era
prácticamente
inexistente. C
omo
62
mucho llegó a apreciarse ocasionalm
ente en las zonas de contacto entre los núcleos m
agnéticos (figura 2a). En el caso contrario, cuando la relación es 1:4, las partículas de Fe
3 O4 quedaban
totalmente englobadas por una enorm
e matriz
de polímero. Incluso se apreció la form
ación de una excesiva cantidad de partículas de polím
ero puro (figura 2b). Por otro lado, el análisis de la influencia de esta relación Fe
3 O4 :PC
L sobre el rendim
iento de la síntesis, permitió com
probar que éste era m
áximo para una proporción 2:4
90%).
En estas
condiciones de
formulación
(figura 2c), se obtuvieron nanocompuestos
en los
que el
recubrimiento
polimérico
de los
núcleos de Fe3 O
4era
completo y patente. El
análisis PCS de las partículas preparadas según
esta proporción
2:4 perm
itió confirm
ar su
pequeño tamaño (86 ± 12 nm
), muy adecuado
para la vía de administración parenteral.
Figura 2.
Microfotografías
HR
TEM
de las
nanopartículas Fe3 O
4 /PCL obtenidas partiendo
de una relación de masas inicial Fe
3 O4 :PC
L de 4:1 (a), 1:4 (b) y 2:4 (c).
El ensayo MTT puso de m
anifiesto que ninguna de las nanopartículas Fe
3 O4 /PC
L desarrolladas ejercía
citotoxicidad alguna
en las
células SW
480 en
el rango
de concentraciones
investigado. D
e hecho,
no se
apreciaron diferencias significativas entre los valores de absorbancia del control negativo y los de
los diferentes
nanocompuestos
tras 72
horasde
incubación (p> 0.05).
En relación a la utilidad de las nanopartículas Fe
3 O4 /PC
L como agentes de contraste de R
MI,
la figura 3 muestra cóm
o éstas reducen de forma
progresiva (y dependiente de la concentración)el
valor m
edio del
T2
del aceite
mineral
contenido enel fantom
a (92 ms). Teniendo en
cuenta los resultados obtenidos y los valores típicos
para el
T2
en diferentes
regiones anatóm
icas como el colon (3), el hígado (4) y el
cerebro (5), la suspensión de nanocompuestos
2:4 de concentración 13.4 mg/m
L (T2 : 98 m
s) sería adecuada para utilizarse com
o contraste en estas regiones. D
e igual forma, la suspensión de
nanocompuestos
1:4 de
concentración 31.5
mg/m
L también
sería adecuada aunque presente un
T2 un poco m
ás largo.
Figura 3.Mapa T
2 de las suspensiones acuosas de diferente concentración de nanocom
puestos form
ulados según las proporciones Fe3 O
4 :PCL
1:4 (1p4p) y 2:4 (2p4p).
Conclusiones:
La m
etodología de
síntesis desarrollada
permite
obtener nanopartículas
Fe3 O
4 /PCL
con unas
propiedades adecuadas
como agente de contraste en R
MI: pequeño
tamaño, ausencia de toxicidad y dism
inución del T
2 . Se encuentran en desarrollo ensayos in vitroe
in vivoque perm
itan clarificar este uso en el diagnóstico precoz de cáncer de colon.
Referencias:
(1)R
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onsen S et al. Age-dependent norm
al values of T2* and T2´ in brain parenchym
a. A
JNR
Am
. J. Neuroradiol.2008;29:950-5.
Agradecim
iento:Proyectos
FIS 11/02571
yFIS 11/01862 (Instituto de Salud C
arlos III, España).
63
DIFU
SION
DE
LE
VO
DO
PA E
N D
ISOL
UC
ION
ES A
CU
OSA
S C
ON
DIFE
RE
NT
ES V
AL
OR
ES D
E pH
Marisa C
. F. Barros 1, M
iguel A. E
steso1,V
íctor M.M
. Lobo
2 y Ana C
.F. Ribeiro
2
1Departam
ento de Quím
ica Física, Universidad
deA
lcalá, 28871. Alcalá de H
enares, Madrid, España
2Departm
ent of Chem
istry, University of C
oimbra, 3004-535 C
oimbra, Portugal
Introdución: La levodopa (L-3,4-dihihroxifenilalanina) es un am
inoacidoque en el organism
o se transforma
en dopamina
ycuya deficiencia provoca la
enfermedad
de Parkinson.
Esta propriedad
transforma
la levodopa
en el
farmaco
más
utilizado en el tratamiento de
esta enfermedad
1.La levodopa se
administra por vía oral
y se absorbe
rápidamente.
Figura 1 – Fórmula y
estrutura de la levodopa
Laabsorción de un fárm
acoen el organism
ohum
anoim
plica su tránsito a través de una m
embrana celular. Para que este tránsito se
produzca, el fármaco debe penetrar en el interior
de la mem
brana, para locual éste tiene que ser
soluble en la fase lipídica de la mism
a y para que tenga lugar su salida
es necessario queel
fármaco
sea tam
bién soluble
en la
fase fisiológica acuosa de las inm
ediaciones de la m
embrana. Sin em
bargo, laextensión
dela
absorcióny de su
respuesta clínicadepende de
múltiples
factores, incluyendo
el pH
del
estómago e
intestino.
La levodopa presenta distintos valores de pKa,
lo que
significa que
su com
portamiento
estrutural va a depender del pH del m
edio en el que ésta se
encuentra.
Com
o la
absorcion de
lalevodopa
ocurre fundam
entalmente en el tracto gastrointestinal,
por medio de un proceso de difusión pasiva, ello
hace que la magnitud de tal absorción
se vea afectada por los valores del pH
local 2.
Figura 2- Disociacion de la m
olecula de levodopa
3
En esta
comunicación
presentamos
los coeficientes de difusion m
utua de lalevodopa a
pH=1,8
y pH
=3,en
disolució acuosa,
a tem
peraturas am
biente y
fisiologica. D
ichos valores
de pH
se
ajustaron con
ácido clorhídrico.
Variando
el pH
se
ha buscado
obtener información acerca de la cuantía y tipo
de las
especies protonadas
presentes en
la disolución, así com
o de su difusión, en un intento de com
prender mejor el com
portamiento
de este fármaco en el proceso de absorcion
mediante difusión pasiva.
Referencias
1. Carlsson A
.,J Neural Transm
2002,109, 777.2.
P. A
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rodie,and
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Hogben, J. Pcol. Exp. Therap., 957, 119, 361
3. Xiaofeng C
hen et all, J. Sep. Sci. 2004, 27, 1005
Agradecim
ientos:M
arisa.C.F.B
arrosagradece
ala
"Fundação para a C
iência e Tecnologia" la beca recibida SFR
H/B
D/72305/2010.
64
MIC
RO
ESFE
RA
S BIO
DE
GR
AD
AB
LES C
AR
GA
DA
S CO
N K
ETO
RO
LA
CO
PAR
A
AD
MIN
ISTR
AC
IÓN
INT
RA
OC
UL
AR
E. Rodríguez V
illagra, A. Juan Puñales, I.T. M
olina-Martínez, R
. Herrero-V
anrell, I. Bravo-O
suna
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia, U
niversidad Com
plutense de Madrid,
28040 Madrid.
INT
RO
DU
CC
IÓN
D
entrode
las patologías
que afectan
al segm
ento posterior del ojo se encuentranla
degeneración m
acular asociada
a la
edad (D
MA
E) ylas retinopatías diabéticas. A
mbas
cursan con inflamación. Sin em
bargo,dadoslos
importantes
efectos adversos
que presentan
(aumento de presión intraocular y form
ación de cataratas, entre otros), se está
estudiando la utilización de
antiinflamatorios no esteroideos
(AIN
Es) (1).
De
entre estos,
el ketorolaco
resulta de gran interés(2)como alternativa a los
corticoesteroides en
el tratam
iento post-
operatorio de la inflamación ocular, prevención
o alivio del edema m
acular cistoide, del edema
macular
diabético, de
la uveítis
y de
la degeneración m
acular asociada a laedad (3).La
administración
intravítrea de
sistemas
microparticulares biodegradables de liberación
controlada que
fueran capaces
de m
antener concentraciones terapéuticas de ketorolaco
en el vítreo
durante periodos prolongados de tiempo
supondría una
importante
herramienta
terapéutica para el tratamiento de inflam
aciónintraocular. La utilización de estos sistem
as dism
inuiríade form
a importante el núm
ero de adm
inistraciones.El objetivo de este trabajo ha sido
la evaluación
de la
relación fárm
aco:polímero
en la
preparación de
microesferas (M
Ps) de ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLA
GA
) cargadas con ketorolaco, por el m
étodo de emulsión-evaporación del
disolvente (O
/A),
como
pasoinicial
en la
optimización de la form
ulación.
MA
TE
RIA
LE
S Y M
ÉTO
DO
S Elaboración de m
icroesferas Para
la preparación
de las
microesferas
se preparó com
o fase interna de la emulsión una
dispersión de ketorolaco en una solución de PLA
GA
85:15
en C
H2 C
l2 : A
CN
(3:1)
(volumen=1,4 m
l). Las proporciones fármaco:
polímeros
estudiadosfueron
0,5:10, 1:10
y1,5:10. U
na vez homogenizada la dispersión se
formó
una emulsión m
ediante la adición de 5 ml
de una disolución de acuosa de PVA
(1% m
/v) y
agitación a 9500 rpm durante 2 m
in. A
continuación, se
añadieron10
ml
de una
disolución acuosa diluida de PVA
(0,1% m
/v) y se hom
ogenizó mediante agitación m
ecánica
(9500 rpm, 1 m
in). Tras3h de m
aduración en 100
ml de PV
A 0.1%
p/v, las MPs fueron
recogidas, lavadas y se seleccionó la fracción 20-40
m
para su
posterior estudio.
Las m
icroesferas fueron
liofilizadas y
se conservaron refrigeradas a 4ºC
protegidas de la hum
edad en un desecador a vacío.C
aracterización de microesferas:
Lam
orfología de las microesferas se evaluó por
microscopía electrónica de barrido (SEM
; Jeol, JSM
-6335F, Tokio, Japón). Se determ
inó la distribución del tramaño
de las partículas utilizando un equipo M
icrotrac S-3500 (M
icrotrac, Pensilvania, EEUU
) que mide
la dispersión de la luz laser al incidir sobre las m
icroesferas.El
Contenido y eficacia de encapsulación se
determinó m
ediante disolución inicial de las m
icroesferas en
diclorometano
y posterior
precipitación del
polímero
con etanol.
Lacantidad
de ketorolaco
en la
mezcla
diclorometano + etanol (5+12 m
l) se determinó
por un método espectrofotom
étrico (=314 nm
) previam
ente validado. Los estudios de liberación in vitro se realizaron con
dos replicados de una muestra de M
Ps (10 m
g) que fueron suspendidos en 1.5 ml de PBS
pH
7.4. El
ensayo se
realizó a
37 ºC
en
agitación constante (100oscilaciones/m
in) (4).La tom
a de muestras se realizó a intervalos de
tiempo pre-establecidos (1h, 24h y una vez por
semana hasta el final del estudio), m
ediante extracción del volum
en de medio de cesión y
posterior reposición del mism
ocon tam
pón recién
preparado.La
cuantificación del
principio activo
se llevó
a cabo
por espectrofotom
etría.
RE
SUL
TA
DO
S Y D
ISCU
SIÓN
Se ha calculado el valor de rendim
iento del proceso de elaboración de M
Ps para cada una de
las proporciones
fármaco:
polímero
empleadas, obteniendo los resultados recogidos
en la Figura 1.
65
45,5%52,7%
40,6%
0 10 20 30 40 50 60
0,5:101:10
1,5:10
Rendimiento (%)
Figura 1: Rendimientos m
edios del proceso de elaboración de M
Ps obtenido para cada una de las formulaciones
ensayadas. La eficacia de encapsulación obtenida en las form
ulaciones ensayadas
se encontró
comprendida entre 55 y 60%
para todas las proporciones fárm
aco: polímero. Sin em
bargo en
la observación realizada en el microscopio
electrónico,se
observaron cristales
de ketorolaco
fuera de
las m
icroesferas en
laform
ulación elaborada
con una
proporción fárm
aco:polímero 1,5:10
(Figura 2).En todos
los casos las microesferas resultaron esféricas y
con una
superficie lisa.
Junto a
las m
icrofotografíasse
muestran
las gráficas
obtenidas en el análisis granulométrico de cada
formulación,
Lostam
añosm
edios(M
v)obtenidos fueron
de 22,05± 1,36
men la
formulación 0,5:10, 49,28 ± 0,28
men la
formulación 1:10 y 26,99
± 13,46 m
en la form
ulación 1,5:10.
0 5 10 15
010
% Volumen
Size (m
)
0 5 10 15
050
% Volumen
Size (m
)
0 5 10 15
050
% Volumen
Size (m
)
Figura 2.Microfotografía de las M
Ps de PLAGA 85:15
cargadas con Ketorolaco y distribución granulométrica.
En la Figura 3 serecoge la representación
gráfica de los perfiles de cesión para las tres form
ulaciones ensayadas junto aldiagram
a de
barras de la cesión inicial (burst) a las 24 horas del ensayo. C
omo se puede observar,a m
edida que dism
inuye la relación fármaco : polím
ero, dism
inuye la cesión inicial de ketorolaco.Para
todas las formulaciones se observa una cesión
controlada de
ketorolaco durante
aproximadam
ente 2 meses.
0 20 40 60 80
100
120
020
4060
80
g de K/mg MP
Días
0,5:10
1:10
1,5:10
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0,5:101:10
1,5:10
g de K/mg MP
Figura 3.(a) Representación gráfica de los perfiles de
cesión (±DE) obtenidos para las tres form
ulaciones ensayadas. (b) Representación gráfica de la cesión inicial
(Burst) a las 24 h de ensayo.
CO
NC
LU
SION
ES
El m
étodo desarrollado
permite
obtener form
ulaciones con eficacias de encapsulación de entre 55-60%
con un tamaño m
edio de partícula
idóneo para
la adm
inistración intraocular
y una
cesión m
antenida de
ketorolaco durante dos meses.
AG
RA
DE
CIM
IEN
TOS
RETICS net (RD
07/0062/2002). UC
M 920415.
Ministerio de Educación (M
AT-2010-18242).
RE
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EN
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The Q
uantitative Effect
of 0.5%
K
etorolac Trom
ethamine
Solution and
0.1%
Dexam
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0,5:10
1:10
1,5:10
(a)(b)
66
EST
UD
IO D
E E
STA
BIL
IDA
D D
E FÓ
RM
UL
AS L
ÍQU
IDA
S OR
AL
ES D
E M
ET
AD
ON
A.
M. M
allandrich1,N
. Provenza1,B
. Clares 2,L.H
albaut 1, F. Fernández1,A
. Flo1, A
.C. C
alpena1
1Departm
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de B
arcelona. Barcelona, España
2Departm
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de G
ranada. Granada, España.
Introducción:
En España, las formulaciones líquidas orales de
Metadona
están únicam
ente com
ercializadas para adultos. Los neonatos expuestos durante la gestación
a ciertas
sustancias, pueden
desarrollar una
dependencia física
(1,2). La
Metadona es el fárm
aco más prescrito para
tratar este síndrome. N
o obstante, considerar al niño com
o si fuera una adulto pequeño puede llevar
a grandes
errores de
dosificación de
fármacos.
La falta
de disponibilidad
en el
mercado
farmacéutico
de productos
adaptados a
las necesidades de la población pediátrica, y en especial,
a las
del neonato,
conduce a
la elaboración
de fórm
ulas m
agistrales y
éstas presentan una gran variabilidad en
el diseño.
En nuestro entorno, son pocos los estudios que han
valorado la
utilización de
fórmulas
magistrales para el uso en pediatría. Es decir,
que el mayor inconveniente para difundir estos
fármacos es la falta de investigación no sólo a
nivel clínico sino a nivel tecnológico.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la estabilidad de 2 soluciones orales de M
etadona 0.2 m
g/ml, una de ellas apta para diabéticos en 3
condiciones de almacenam
iento (4, 25 y 40ºC)
durante30
días.
Materiales y M
étodos:
Materiales
La M
etadona fue
adquirida a
través de
la A
gencia Española del Medicam
ento de acuerdo con la norm
ativa vigente.
El resto de excipientes fueron proporcionadospor A
cofarma S.A
.
La composición de las soluciones orales de
Metadona estudiadas se m
uestra en la tabla 1.
Solution 1Solution 2
Metadona hidrocloruro
0.2 mg/m
L0.2 m
g/mL
Agua
50%
50%
Excipiente 150
%-
Excipiente 2 *-
50 %
Tabla 1.C
omposición de las fórm
ulas líquidas orales de M
etadona. * Excipiente 2: apto para diabéticos.
Método analítico
El método analítico fue validado a partir de 6
rectas de
calibración, preparadas
en días
diferentes (validación interdía). Com
o criterios fundam
entales de validación se utilizaron la linealidad, precisión, exactitud y los lím
ites de detección y de cuantificación (3).
La cuantificación de principio activo se llevó a cabo m
ediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC
): cromatógrafo W
aters 600C
acoplado A
utosampler
Waters
717 plus.
Detector Photodiode W
aters 2996 ajustado a 220nm
, columna M
editerranea Sea18, 5m
m 25
x 0.46 mm
, flujo de 1ml/m
in, la fase móvil
estaba compuesta por una m
ezcla de Acetato de
amonio 0.025M
: Acetonitrilo (20:80).
Estudio de estabilidad
Alícuotas
de 20
ml
de cada
una de
las form
ulaciones fueron almacenadas en
frascos de vidrio topacio a las diferentes condiciones de tem
peratura, 4, 25 y 40ºC. El periodo de estudio
comprendió
1 m
es. Los
ensayos fueron
realizados a 0, 7, 15 y 30 días. Se monitorizaron
los siguientes parámetros:
Características organolépticas: aspecto,
color y olor.C
uantificación de principio activo: de am
bas fórmulas.
pH: se realizó un seguim
iento de pH
mediante el pH
metro C
rison micropH
200.D
eterminación
de la
viscosidad:m
ediante H
aake R
heometer
Rheo
Stress 1, usando una geometría plato-
plato.
Análisis estadístico:
El número de determ
inaciones efectuadas por fórm
ula, tiempo y tem
peratura fueron 6. Se calcularon los valores m
edios y la desviación estándar. C
on objeto de comprobar si existen
diferencias significativas
entre las
medias
comparadas, todos los resultados se som
etieron a un tratam
iento estadístico AN
OV
A para un
nivel de confianza del 95 %.
Resultados y D
iscusión:
Método analítico:
Validación:
El m
étodo analítico
desarrollado resultó
ser lineal,
preciso y
exacto en
el rango
de
67
concentraciones deM
etadona de1.76-20
g/ml.
Los límites de detección y cuantificación fueron
0.46 y 1.38 g/m
l respectivamente.
Estudio de Estabilidad:
Características O
rganolépticas:
Al
inicio del
estudio, todas
las soluciones
resultaron transparentes, de color rosado y olor a fresa. Estas características se m
antuvieron hasta el día 30.
Cuantificación del principio activo:
En las gráficas 1y 2
se muestran
la evolución de la concentración de M
etadona determinada
para cada una de las fórmulas ensayadas
en función del tiem
po y de la tem
peratura de alm
acenamiento.
Solución 1
010
2030
4080 90
100
11042540
Tiempo (D
ías)
Conc (%)
Figura 1. C
oncentración de Metadona en la Solución
1 expresado en porcentaje respecto a la concentración inicial de día 0.
Solución 2
010
2030
4080 90
100
11042540
Tiempo (D
ías)
Conc (%)
Figura 2. C
oncentración de Metadona en la Solución
2 expresado en porcentaje respecto a la concentración inicial de día 0.
En am
bas soluciones
la concentración
de M
etadona se
mantuvo
dentro del
intervalo ±10%
durante 30 días en todas las condiciones de alm
acenamiento.
Estudio de pH:
El pH
de
ambas
soluciones no
mostró
diferencias significativas a lo largo del tiempo
en ninguna de las condiciones de temperatura de
conservación.
Estudio reológico:
En la figura 3 se muestran las curvas de flujo y
curvas de
viscosidad para
cada una
de las
formulaciones estudiadas. La gráfica m
uestra un com
portamiento N
ewtoniano para la Solución 1;
frente a un comportam
iento pseudoplástico para la
solución 2.
Desde
el punto
de vista
tecnológico este último sería m
ás adecuado para la adm
inistración deun jarabe pediátrico. Se ha
comprobado com
o un aumento de la viscosidad
tras la
adición de
modificadores
reológicos com
o gomas o carbohidratos puede reducir la
difusión de sustancias amargas de la saiva a las
papilas gustativas (4).
Los valores
de viscosidad
hallados para
la Solución 1 fueron de 7.99±0.11 a día 0 y de 7.84±0.05 a día 30. La Solución 2, a día 0 el valor de viscosidad fue de 15.12±0.02 y de 14.94±0.05 a día 30.
Figura 3. Gráficas de
viscosidad. Izquierda, Solución 1. D
erecha,Solución 2.
Conclusiones:
Los resultados
obtenidos indican
que las
soluciones de
Metadona
objeto de
estudio fueron estables durante 30 días sin cam
bios significativos por causa de la tem
peratura. Así
mism
o m
ostraron valores
constantes y
adecuados de pH y viscosidad en función del
tiempo.
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RH
EO
LO
GIC
AL
CH
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AC
TE
RIZA
TIO
N O
F SEV
ER
AL
SEM
ISOL
ID FO
RM
UL
AT
ION
S C
ON
TA
ININ
G D
IFFER
EN
T E
NH
AN
CE
RS FO
R B
UC
CA
L T
OPIC
AL
AD
MIN
ISTR
AT
ION
OF
DR
UG
S R
. Sanz1, A
. Flo1, N
. Provenza1, M
. Ronzadilla
1, L. Halbaut 1, M
. Mallandrich
1, B. C
lares 2,AC
Calpena
1. 1D
epartment ofPharm
acy and Pharmaceutical Technology, Faculty of Pharm
acy, University of B
arcelona, Barcelona, Spain.
2Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology, Faculty of Pharmacy, U
niversity of Granada, G
ranada, Spain.,
Introduction:
Oral m
ucosal drug delivery is an alternative m
ethod of systemic drug delivery that offers
several advantages
over both
injectable and
enteral methods. A
s the oral mucosa is highly
vascularised, drugs absorbed through the oral m
ucosa directly enter the systemic circulation,
bypassing the gastrointestinal tract and first-pass m
etabolism in the liver (1).
Oral m
ucosa is, in general, a somew
hat leaky epithelia betw
een that of the epidermis and that
of the intestinal mucosa. It is estim
ated that the perm
eability of the buccal mucosa is 4-4000
times greater than that of the skin (2).
How
ever, one
of the
major
disadvantages associated w
ith buccal drug delivery is the low
flux which results in low
drug bioavailability.
Orabase
®has been chosen as the base for the
tested formulations due to its safety profile and
the fact that it is well reported in the literature as
a comm
on vehicle for buccal formulations.
Various com
pounds have been investigated for their use as buccal penetration enhancers in order to increase the flux of drugs through the m
ucosa. Since the buccal epithelium is sim
ilar in structure to other stratified epithelia of the body,
enhancers used
to im
prove drug
permeation in other absorptive m
ucosa have been show
n to also work in im
proving buccal drug penetration (3).Perm
eation enhancers should be safe and non-toxic, pharm
acologically and chemically inert,
non-irritant, and
non-allergenic (4).
After
a literature search, m
yristylic alcohol, menthol,
N-m
ethylpyrrolidone and
trascutol w
ere selected as candidates to help perm
eate drugs.
Different
physical properties
in sem
isolid form
ulations m
ay affect
drug release
and transm
ucosa permeation. A
lso, they are likely to result in a different feel w
hen administered (5).
As w
ell as viscosity plays an important role for
transmucosa
formulations,
viscoelasticity is
reported to be a way to assess the physical
properties of semisolids (5).
Therefore, the aim of this study is to assess,
from a rheological point of view
, the influence of
different enhancers
in a
semisolid
formulation w
hich could be used as a vehicle for topical buccal application of drugs.
Material and M
ethods:
The different
semisolid
formulations
were
prepared using
Orabase
®as
the m
ain com
ponent. One of the form
ulations did only contain O
rabase®
and was, therefore, used as
reference (O).
For the
other form
ulations, 5%
of
either m
enthol (M) or m
yristyl alcohol (A) or N
-m
ethylpyrrolidone (N
) w
as added
to the
Orabase
®. Besides, another set of sam
ples were
prepared by adding 10% transcutol (T) to the
previous formulations.
The rheological analysis was perform
ed with
the HA
AK
E rheometer R
heo Stress 1, using a plate-plate geom
etry (6 cm in diam
eter and 0.2 m
m gap betw
een plates for the rotational test).R
otational viscosimetry m
easurements at 25 ºC
were carried out at three different shear rates
(25, 50 and 100 s -1) and recorded during 60 s after the corresponding three ram
p-up periods of 60 s (from
0 to 25 s -1, 25 to 50 s -1and 50 to 100 s -1).O
scillatory tests
firstly included
a stress
amplitude
sweep
test w
hich w
as perform
ed from
0.01 to 10 Pa at a constant frequency of 1 H
z to determine the linear viscoeslastic range.
Three different gaps between plates w
ere tested (0.2, 0.5 and 1 m
m).
After
this, a
frequency sw
eep test
was
performed from
0.1 to 10 Hz at a constant shear
stress within the linear viscoelastic region in
order to determine the related variation of the
storage modulus (G
’) and loss modulus (G
’’) at 25 ºC
. Both viscoelastic m
oduli are defined as follow
s:
and (w
here 0 and
0 are the amplitude of stress and
of strain, respectively, and is the phase shift
between them
).
Rotational
viscosity m
easurements
and oscillatory tests w
ere performed by triplicate.
Results and D
iscussion:
Rotational viscosim
etry tests showed that the
different form
ulations have
a pseudoplastic
behaviour, as in all cases the viscosity decreased w
ith the increase of share stress rate (Table 1). M
oreover, the
addition of
an enhancer
to O
rabase®
significantly decreased the viscosity of the adhesive excipient. Even m
ore effect on
69
the viscosity level was observed by the addition
of transcutol
alone or
in com
bination w
ith another enhancer.
Sample
VISC
OSIT
Y at 25 ºC
(Pa.s)25 s -1
50 s -1100 s -1
O8.27 ± 0.084
6.93 ± 0.103.96 ± 0.31
OT
2.78 ± 0.0431.50 ± 0.13
0.84 ± 0.089O
M6.36 ± 1.18
4.16 ± 0.192.91 ± 0.26
OM
T1.80 ± 0.13
0.97 ± 0.0500.90 ± 0.082
OA
4.83 ± 0.204.05 ± 0.70
2.59 ± 0.32O
AT
1.63 ± 0.0050.93 ± 0.012
0.78 ± 0.012O
NT
3.09 ± 0.0541.48 ± 0.060
0.82 ± 0.013T
able 1. Results of rotational viscosim
etry (O: O
rabase ®
cream; O
T: 10%
Transcutol in Orabase ®; O
M: 5%
M
enthol in
Orabase ®;
OM
T:
5%
Menthol
+ 10%
T
ranscutol in Orabase ®; O
A: 5%
Myristyl alcohol in
Orabase ®; O
AT
: 5% M
yristyl alcohol + 10% T
ranscutol in O
rabase ®; ON
T: 5%
N-M
ethylpyrrolidone + 10%
Transcutol in O
rabase ®)
According to the results of the oscillatory stress
sweeps, a plate gap of 0.5 m
m and a constant
shear stress of 1 Pa (16.7% of the critical value
of 6 Pa) were selected to perform
the frequency sw
eep test.
Results of the oscillatory test for tw
o of the studied form
ulations are shown in Figures 1 and
2 as examples.
O
100
1000
10000
100000
0.11
10F in H
z
G' in Pa and G'' in Pa
10 100
1000
10000
100000
n in Pas
G' in Pa
G" in Pa
Fig. 1. Dynam
ic oscillatory test (plain Orabase ®)
A-T
100
1000
10000
100000
0.11
10
F in Hz
G' in Pa and G'' in Pa
10 100
1000
10000
100000
n in Pas
G' in Pa
G" in Pa
Fig. 2. Dynam
ic oscillatory test (myristyl alcohol +
transcutol in Orabase ®)
In the
whole
frequency range
studied, the
storage modulus G
’ was alw
ays greater than the loss m
odulus G’’. That indicates prevalence of
the elastic over the viscous behaviour.
Significant differences were detected betw
een the different form
ulations:V
iscosity levels decreased for all formulations
containing at least one permeation enhancer.
Neither transcutol alone or com
bined with N
-m
ethylpyrrolidone did
significatively change
the viscoelastic behaviour of the formulation
when com
pared to the reference one (plain O
rabase®). H
owever, both m
yristyl alcohol and m
enthol did show a decrease on both the elastic
and viscous behaviour of the formulations. Such
decrease being
more
pronounced w
hen com
bined with transcutol. Finally, there w
ere no relevant
differences on
the viscoelastic
behaviour observed between the form
ulations containing m
enthol and myristyl alcohol.
Conclusions:
The addition of permeation enhancers to an
adhesive excipient
for buccal
topical adm
inistration as
Orabase
®does
modify
its physical properties.
Viscosity
of the
tested form
ulations drops
whenever at least one perm
eation enhancer is used.
As
regards their
viscoelastic behaviour,
transcutol alone
and com
bined w
ith N
-m
ethylpyrrolidone failed to modify the viscosity
component of the form
ulations suggesting same
adhesiveness as Orabase
®on its ow
n. All other
semisolid
formulations
tested did
present a
different viscoelastic
behaviour w
hich could
imply different drug perm
eation and treatment
compliance by the patient.
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70
Diseño de em
ulsiones mucoadhesivasA
/S conteniendociprofloxacino
para su empleo en el tratam
iento de la enferm
edad pélvica inflamatoria
Cam
paña SeoaneM
. J., Pérez Gago A
., Otero EspinarF.J.
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica,Facultad de Farm
acia, Universidad de Santiago de C
ompostela
INT
RO
DU
CC
ION
La enfermedad pélvica inflam
atoria es una patologíade
transmisión sexual que consiste en la infección de la
zona alta del aparato reproductor femenino (útero,
trompas de Falopio, ovarios y tejidos circundantes)
causada principalm
ente por
clamidia,
cándida o
gonococo y en menor m
edida por estafilococos y estreptococos. Es frecuente que aparezca com
o una com
plicación grave de enfermedades de transm
isión sexual
y su tratamiento consiste en la adm
inistración com
binadade antibióticos por vía oral o parenteral,
quirúrgicoen aquellos casos m
ás graves. U
no de los problem
as en
sutratam
iento es
la dificultad
para identificar a los m
icroorganismos que infectan los
órganos genitales
internos y
que para
alcanzar concentraciones eficaces en estos lugares a veces es necesario m
antener altas concentraciones plasmáticas
durante tiempos prolongados.
La vía vaginalpresenta
un interesante potencial como ruta de adm
inistración de
fármacos
a nivel
sistémico
debido a
la gran
superficie disponible
para la
absorción, alta
permeabilidad
y abundante
vascularización(1).
Adem
ás es especialmente interesantes para la fárm
acos que actúen a nivel de los órganos genitales internos
ya que se ha descrito un efecto de prim
er paso preferente hacia el útero, dando lugar a una elevada concentración a estos niveles (2). En un trabajo previo
(3)hem
os puesto de m
anifiesto el interés de las emulsiones A
/S bioadhesivas com
o sistemas de adm
inistración vaginal,estas em
ulsiones presentan gran extensibilidad, buena adherencia y perm
anenciay baja toxicidad
en las m
ucosas (4).N
uestroobjetivo es la elaboración de em
ulsiones A/S
bioadhesivosconteniendo ciprofloxacino, insensibles al aclaram
inento del
flujo vaginal.
Las em
ulsiones seleccionadas se em
plearán en un futuro trabajo paraevaluación com
o posible tratamiento de la enferm
edad pélvica inflam
atoria.
MA
TERIA
LES Y M
ETOD
OS
Elaboración de emulsiones
Las emulsiones se elaboraron m
ediante emulsificación
directa em
pleando un
homogeneizador
Unguator
2 (M
icrocaya)(3). La com
posición de las emulsiones
elaboradas figura en la tabla 1.
Tabla
1. C
omposición
de las
emulsiones
A/O
elaboradas en este trabajo.
Jeringabilidad (estudios de extrusión)
Se determina el trabajo necesario para la
descarga de las m
uestrasa través de una jeringa
de 1 ml.La jeringa
cargada se
sitúa en
eltexturóm
etro TA
.XT.plus
desplazando el émbolo 2 cm
a 2 mm
/seg, registrando la fuerza vs distancia
Efecto del fluido vaginal sobre la bioadhesion
Se determina la fuerza m
áxima y el trabajo de adhesión
requerido para separar dos discosde cuero curtidoentre
los que
se encuentra
la m
uestra, em
pleando un
texturómetro TA
-XT
(5).Se fija un disco de cuero en el punzón superior y otro sobre una placa que se fija al soporte inferior. Se
depositan 0.2 ml de m
uestra en eldisco
inferior y se adiciona fluido vaginal simulado
(FVS) a 37ºC
. Se hace descender el punzón superior a 1 m
m/seg hasta el disco entra en contacto con la
muestra y ejerce una fuerza de 0.5 N
. El punzón sem
antiene 60 seg. y se hace retornar a una velocidad de 1 m
m/seg hasta una altura de 2 cm
. Pasado 1 min se
reiniciael ciclo com
presión-extensión en las mism
as condicionesy se repite 10
veces.
El efecto de arrastre de la crema por efecto del fluido
se estudia empleando viales de fondo plano en los que
se deposita 1 g de emulsión que se cubre con 5 m
l de FV
S. A
intervalos
de tiem
po predeterm
inados se
retiran todo el FVS, se pesa para determ
inar la crema
arrastrada y se repone FVS de nuevo. Se calcula
además
la concentración de CFX
en las muestra de
FVS retiradas para estudiar su liberación. El ensayo se
realiza a 37º y con agitaciónorbital (100 rpm
).
Liberación de ciprofloxacino
Para completar la liberación se
realizóun estudio
empleando
células de
Franzverticales,
usandom
embrana
de diálisis
entrelos
compartim
entos y
tampón fosfato
como m
edioaceptor.
El ensayo se realizo
a 37º
determinando
el contenido
de
pentámeratetramera
Ciclometicona
1515
ClNa2
2Abil W
E 095
5Glicerol
33
ciprofloxacino2
2Agua
6767
71
progesterona en el aceptor espectrofotométricam
ente a 234nm
.
RESU
LTAD
OS Y
DISC
USIO
N
Todas las
emulsiones
A/S
presentaron valores
de jeringabilidad
comprendidos entres 160 y 260
N·m
m,
inferiores a los 380 N.m
m , lím
itepara form
ulaciones inyectables cuando se em
plean para su administración
agujas hipodérmicas(3).
02
46
810
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
D5
D4
Crinone
KY
JellyZidoval
Ciclo
Trabajo de adhesión N.mm
Figura 1.
Influencia del
fluido vaginal
sobre la
capacidad bioadhesiva de las formulaciones vaginales.
Las dos emulsiones O
/S de ciprofloxacino presentan valores de bioadhesión superiores a los obtenidos para tres form
ulaciones bioadhesivasvaginales com
erciales. A
demás tal com
o se observa en la figura 1 las tres
formulaciones
de referencia,
elaboradas em
pleando polím
eros derivados del ácido poliacrílico,pierdensu
capacidad bioadhesiva a medida que transcurren los
ciclos de compresión/extensión, com
o consecuencia de su
dilución conel fluido vaginal. A
partir de sexto ciclo presentan ya valores m
uy bajosreflejo de la total
pérdida de su capacidad bioadhesiva. Por el contrario las em
ulsiones A/S m
antienen los niveles de adhesión prácticam
ente constantes durante todo el experimento,
indicando que no sufren efectos negativos porarrastre
o dilucióncon
losfluidos biológicos.
Adem
ás de
la capacidad
de bioadherencia
es im
portante que las formulaciones resistan el continuo
aclaramiento al que son som
etidas por efecto del fluido vaginal. Los resultados de pérdida de m
asa causado por el arrastre del FV
S se muestran en la figura 2 y se
observa quetras 8 horas de agitación continua en
presencia del fluido no se observa una pérdida aparente de peso
enninguna de las
emulsiones, apreciándose
incluso una
pequeña ganancia
enel
tiempo
probablemente
causada por incorporación de medio
en el seno de las em
ulsiones provocando elaumento de
su peso.
La determinación del ciprofloxacino liberado durante
estos estudios se muestran en la figura 3.
060
120180
240300
360420
4800.0
0.1
0.2
0.3D
4D
5
Tiempo (m
in)
mg emulsión
Figura 2. Variación de peso de las em
ulsiones en presencia de FV
S.
Se observa una lenta liberación del CPF a partir de las
emulsiones
independientemente
del tipo
de cilom
eticona empleada en su elaboración. El perfil de
liberación se ajusta a una cinética de Higuchi con unos
coeficientes de
determinación
del 99.4
y 99.2%
indicando
que es
un proceso
controlado preferentem
ente por la difusión del fármaco.
060
120180
240300
360420
4800 20 40 60 80
100D
4D
5
Tiempo (m
in)
g CPX liberado
Figura 3. Resultados de los ensayos de liberación in
vitro
CO
NC
LUSIO
NES
Debido a sus buenas propiedades bioadhesivas, la
resistencia al aclaramiento y control de liberación
lasem
ulsiones A
/S propuestas
pueden una
buena alternativa para la adm
inistración vaginal de CPX
.
REFER
ENC
IAS.
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laudia Valenta. T. A
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NU
EV
AS E
VID
EN
CIA
S EX
PER
IME
NT
AL
ES D
EL
EFE
CT
O D
E L
A PO
RO
SIDA
D D
E
MA
TR
ICE
S INE
RT
ES E
N L
A L
IBE
RA
CIÓ
NÁ
. Aguilar-de-Leyva
1,C. C
ifuentes 1, A.R
. Rajabi-Siahboom
i 2,I. Caraballo
1
1Departm
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Universidad de Sevilla. C
/Profesor García
González, 2. 41012. Sevilla. España.
2Colorcon Inc. G
lobal Headquarters, 275 R
uth Road, H
arleysville, PA 19438, EEU
U.
Introducción: Las matrices inertes son sistem
as que consisten en una red sólida polim
érica y porosa que es insoluble e indigerible en el tracto gastrointestinal
(1). La liberación del principio activo
desde estas formas farm
acéuticas ocurre por difusión del fárm
aco a través de los poros de las m
atrices, incluyendo los poros iniciales y los poros que aparecen cuando el fárm
aco olos
excipientes solubles se han disuelto(2).
La etilcelulosa es un polímero insoluble usado
en la
fabricación de
diferentes form
as farm
acéuticas sólidas
orales, entre
ellas las
matrices
inertes de
liberación prolongada,
pudiendo actuar como excipiente form
adorde
matrices m
ediante compresión directa (3).
La teoría
de la
percolación es
una teoría
derivada de la física estadística que estudia sistem
as caóticos o desordenados. Esta teoría ha sido
ampliam
ente aplicada
al cam
po farm
acéutico desde
1987, em
pezándose a
aplicar al estudio de sistemas m
atriciales inertes de liberación prolongada (4).La teoría de la percolación estudia la existencia de
puntos críticos
que en
los com
primidos
corresponden con concentraciones críticas de uno o m
ás componentes del sistem
a, incluyendo la porosidad.
En el umbral de percolación,
un com
ponente del
sistema
experimenta
una transición geom
étrica de fases, empezando a
formar una red que recorre
todo el comprim
ido y teniendo una influencia m
ucho mayor en las
propiedades del mism
o. Por tanto es de esperar que cuando un com
ponente alcanza su umbral
de percolación, ocurran cambios repentinos en
las propiedades
del sistem
a que
estén relacionadas
con este
componente.
Nos
encontraríamos
en este
caso ante
un punto
crítico del sistema.
Enla
formulación
de m
atrices inertes
de liberación prolongada lo ideal es que am
bos, fárm
aco y excipiente se encuentren por encima
de su umbral de percolación. D
e esta forma nos
aseguramos que el fárm
aco se va a liberar por com
pleto y que el excipiente formador de m
atriz va a actuar controlando la liberación (5).El
objetivo de
este trabajo
es estim
ar la
influencia de
la porosidad
de com
primidos
matriciales
inertes m
ulticomponentes
de liberación
controlada, elaborados
conetilcelulosa com
o polímero form
ador de matriz,
en la liberación de carbamazepina.
Materiales
y M
étodos: Los
materiales
empleados
fueron: C
arbamazepina
(Fagron, España), ETH
OC
EL 7 FPy
ETHO
CEL 10 FP
(Colorcon
Ltd., U
K)
como
polímeros
formadores de m
atrices inertes, lactosa fast flow
(Foremost, EEU
U)
como diluyente y
estearato de m
agnesio (Fagron, España) y AER
OSIL 200
(Evonik, A
lemania)
como
lubrificante y
deslizante, respectivamente.
Se elaboraron
10lotes
de 60
comprim
idos m
atriciales de
300 m
g de
peso(5
lotes conteniendo
ETHO
CEL
7 FP
y 5
lotes conteniendo
ETHO
CEL
10 FP)
con un
contenido en carbamazepina del 30%
p/p, 40%
p/p de
etilcelulosa7
FP y
10 FP,
respectivamente
y 5 niveles de porosidad inicial, variando desde el 0 al 25 %
v/v mediante
compresión
directa, en
una m
áquina de
comprim
ir excéntrica (Bonals A
-300, España). La tabla 1 m
uestra la composición y los niveles
de porosidad de estos lotes.
aPorosidad inicial entre0%
y 5% v/v.
bPorosidad inicial entre5%
y 10% v/v.
cPorosidad inicial entre 10% y 15%
v/v.dPorosidad inicial entre 15%
y 20% v/v
ePorosidad inicial entre 20% y 25%
v/v
Tabla
1: C
omposición
de las
diferentes form
ulaciones preparadas.
Se realizaron estudios de disolución del fármaco
en un aparato USP Sotax A
T7 smart (Suiza). El
porcentaje de
carbamazepina
liberada en
función del
tiempo
fue m
edida en
un espectrofotóm
etro de
UV
/VIS
Agilent
8453 (EEU
U)
a una longitud de onda de 284 nm. El
análisis de los datos obtenidos se llevó a cabo utilizando los principales m
odelos cinéticos.
Resultados y D
iscusión:Independientem
ente del tipo de polím
ero empleado puede observarse
que los
perfiles de
liberación m
uestran 3
comportam
ientos diferentes
que pueden
ser relacionados con el um
bral de percolación del
CB
ZE
thocel
7 FP
Ethocel
10 FP
Lactose
SiO2
Mg
stearate
7FP CA
a30.0
40.029.0
0.50.5
7FP CB
b30.0
40.029.0
0.50.5
7FP CC
c30.0
40.029.0
0.50.5
7FP CD
d30.0
40.029.0
0.50.5
7FP CE
e30.0
40.029.0
0.50.5
10FP CA
a30.0
40.029.0
0.50.5
10FP CB
b30.0
40.029.0
0.50.5
10FP CC
c30.0
40.029.0
0.50.5
10FP CD
d30.0
40.029.0
0.50.5
10FP CE
e30.0
40.029.0
0.50.5
73
diluyente más la porosidad inicial (Figuras 1 y
2). Los lotes CA
, con menor porosidad inicial
(0-5%
v/v), m
uestran una
velocidad de
liberación del fármaco claram
ente menor que
puede atribuirse
a que
estas m
atrices se
encuentran por
debajo del
umbral
de percolación
del diluyente
soluble m
ás la
porosidad inicial (por debajo del 30% v/v en
ambos
casos). En
el extrem
o opuesto
se encuentran los lotes C
D y C
E que muestran la
mayor
velocidad de
liberación. Estos
lotes presentan una porosidad inicial superior al 15%
v/v
por lo que se espera que estén por encima
del umbral de percolación del diluyente soluble
más la porosidad inicial.Por últim
o los lotes CB
y C
C, con una porosidad inicial com
prendida entre
el 5
y el
15%
v/v, m
uestran un
comportam
iento intermedio entre los expuestos
previamente.
Basándose
en la
teoría de
la percolación,
estos lotes
muestran
un com
portamiento típico de un cluster incipiente,
que indica que estos lotes estánm
uy próximos
al umbral de percolación del diluyente soluble
más la porosidad inicial.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
030
6090
120150
180210
240270
300330
360390
420450
480
% Fármaco liberado
Tiempo (m
inutos)Lote 7FP_CA 0%
-5% Porosidad
Lote 7FP_CB 5%-10%
Porosidad
Lote 7FP_CC 10%-15%
PorosidadLote 7FP_CD 15%
-20% Porosidad
Lote 7FP_CE 20%-25%
Porosidad
Figura 1. Perfiles de liberación de los lotes que contienen
carbamazepina
y 40%
w
/w
de ETH
OC
EL 7 FP.
0 10 20 30 40 50 60 70
030
6090
120150
180210
240270
300330
360390
420450
480
% Fármaco liberado
Tiempo (minutos)Lote 10FP CA 0%-5% Porosidad
Lote 10FP CB 5%-10% PorosidadLote 10FP CC 10%-15% Porosidad
Lote 10FP CD 15%-20% PorosidadLote 10FP CE 20%-25% Porosidad
Figura 2.Perfiles de liberación de los lotes que contienen
carbamazepina
y 40%
w
/w
de ETH
OC
EL 10 FP.
Asim
ismo, el efecto de la porosidad se puede
observar como factor individual. Las Figuras 3
y 4 muestran un aum
ento en la velocidad de liberación del fárm
aco entre el 12.5 y el 17.5%
de porosidad
inicial. Estos
resultados concuerdan con las predicciones de la teoría de
la percolación. Es bien conocido que el umbral
de percolación de los poros en un sistema sólido
se encuentra en torno al 16%(6).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
05
10
15
20
25
% Fármaco liberado
% P
oro
sidad
inicial
60 m
inuto
s
180 m
inuto
s
360 m
inuto
s
Figura 3.Porcentaje de fármaco liberado frente
a la porosidad inicial en lotesque contienen
carbamazepina y ETH
OC
EL7 FP.
0
10
20
30
40
50
60
05
10
15
20
25
% Fármaco liberado
% P
oro
sidad
inicial
60 m
inuto
s
180 m
inuto
s
360 m
inuto
s
Figura 4.Porcentaje de fármaco liberado frente
a la porosidad inicial en lotes que contienen carbam
azepina y ETHO
CEL
10FP.
Referencias:
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Agradecim
ientos:Los
autores quieren
expresar su
gratituda
Colorcon por
financiar este estudio y por el sum
inistro de ETHO
CEL™
.
74
PRO
PIED
AD
ES R
EO
LÓ
GIC
AS
DE
GE
LE
S DE
CH
ITO
SAN
MO
DIFIC
AD
O
M.C
asas 1,C. Ferris 2, M
.J.Lucero1, V
. de Paz2,M
.R.Jim
énez-Castellanos 1
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de Sevilla, España
2Departam
entode Q
uímica O
rgánica y Farmacéutica, U
niversidad de Sevilla, España
Introducción: El chitosan es un polisacárido natural,
biocompatible
y biodegradable
que procede de la hidrólisis de la quitina. Es una base débil que form
a hidrogeles en presencia de aniones m
ultivalentes gracias ala carga positiva
de sus grupos amino. Se utiliza am
pliamente en
el cam
po biom
édico y
farmacéutico
con m
últiples aplicaciones.
Adem
ás, el
chitosan posee
buenaspropiedades
mucoadhesivas,
considerándose un
polímero
bioadhesivo “natural” que puede adherirse
a tejidos duros y blandos. Es por ello que se ha utilizado en sistem
as de liberación de fármacos a nivel de las
mucosas. Ensayos clínicos usando biom
ateriales basados en chitosan no m
uestran reacciones inflam
atorias o alérgicas tras la implantación,
inyección, aplicación tópica o ingestión en el cuerpo hum
ano (1). Sin embargo, posee ciertas
limitaciones, com
o su naturaleza hidrofílica o su insolubilidad en algunos m
edios fisiológicos, que pueden solventarse con la m
odificación quím
ica(2).
En los
últimos
años nuestro
grupo de
investigación viene
desarrollando nuevos
hidrogeles debido
a su
gran utilidad
como
sistemas
semisólidos
tópicos de
liberación m
odificada(3-5). Teniendo en cuenta que
los geles de chitosan m
odificado han cobrado una gran im
portancia por su biocompatibilidad, baja
toxicidady degradación por enzim
as humanas,
el objetivo del presente trabajo se centra en el estudio de las propiedades reológicas de nuevos hidrogeles de chitosan m
odificado.
Materiales y M
étodos: Chitosan
(CTS)
(75%
desacetilado) fue
suministrado
por A
ldrich C
hemical C
o. Todos los reactivos utilizados para la síntesis fueron de grado analítico.La m
odificación química del chitosan se llevó a
cabo con el fin de incorporar grupos tioles al polisacárido.
A
continuación, se
generó el
sistema disperso
por contacto con un agente oxidante. C
aracterización reológicaLos
sistemas
dispersos se
mantuvieron
a tem
peratura ambiente durante 24 horas después
de su
preparación para
asegurar la
mism
a historia
mecánica
recientepara
todas las
muestras.
Los estudios se realizaron en un reómetro A
R-
2000 (TA Instrum
ents, USA
) para determinar
las propiedades
mecánicas
dinámicas
de las
muestras.
Primero,
se determ
inó la
región viscoelástica lineal a través de un barrido de
esfuerzo a
una frecuencia
de 1
Hz.
Posteriormente, se aplicó
unesfuerzo oscilatorio
de 1 Pa en un intervalode frecuencia de 0.01 a
100 rad/s. El análisis de los resultados se centró en
la determ
inación de
losm
ódulos de
almacenam
iento (G’) y de pérdida (G
’’)que
determinarán el com
portamiento m
ecánico de las m
uestras. Por otro lado y mediante cizalla
rotacional, se determinó el com
portamiento de
flujo de
los preparados.
El protocolo
experimental consistió en aplicar una velocidad
decizalla
hasta la
aproximación
al estado
estacionario o hasta un tiempo m
áximo de 300
segundos por punto. Las curvas de flujo se determ
inaron con una geometría lisa plana de 60
mm
de
diámetro.
Las determ
inaciones se
hicierona
una temperatura de 25 ºC
. Por últim
o, las distintas curvas de flujo se ajustaron a los m
odelos reológicos establecidos.
Resultados
y D
iscusión:D
e los
distintos preparados
de C
TSm
odificado, se
seleccionaron dos concentraciones, 1 y 4%, para
su estudio reológico.A
partir debarridos
de esfuerzo (figura no m
ostrada) sedeterm
inó laregión viscoeslástica lineal. A
sí, lasdispersionesacuosas al 1%
muestran un com
portamiento
independiente hasta 2 Pa, punto a partir del cual em
pieza a fluir la muestra, esfuerzo crítico. Por
el contrario, en las muestras al 4%
no se detecta un
esfuerzocrítico
en todo
el intervalo
estudiado (0-100 Pa). En la Figura 1 se muestra
el barrido de frecuencia de las dispersionesal 1
y 4%
recogiéndose
losm
ódulos de
almacenam
iento(G
’) y pérdida (G’’).
Figura 1.
Barrido
de frecuencia
paralos
sistemas
dispersos al
1 y
4%
de chitosan
modificado.
En ella
se observa
queel
aumento
de concentración
de C
TSm
odificadoen
la
75
dispersión,provoca
un cam
bio reológico
importante.
Así,
en el
preparado al
1%
predomina G
’’ sobre G’, lo que significa que
tiene un
comportam
iento m
ás viscoso
que elástico,
y presenta
un posible
punto de
reticulacióna 71 rad/s y 12 Pa. Por su parte, en
el preparado al4%
de CTS
se da la situación inversa, con predom
inio del módulo elástico
(G’) respecto al
viscoso (G’’),
indicando la presencia
de una
estructura tridim
ensional gelificada. Por
otro lado,
se aprecia
un im
portante increm
ento en las viscosidades aparentesdel
preparadoal 4%
con respecto al 1% (Figura 2),
aproximadam
ente 105veces m
ayor,lógicamente
debido a la mayor concentración de
polímero.
Figura 2.Curva de viscosidad
de los sistemas
dispersos con 1 y 4% de chitosan m
odificado.
La dispersión
al 1%
muestra
un flujo
no new
toniano concom
portamiento pseudoplástico
(shear-thinning),debido a
que la viscosidad aparente dism
inuye al aumentar la velocidad de
cizalla. Sin
embargo,
la dispersión
al 4%
m
uestra un comportam
iento característico de fluidos estructurales en los que se recoge un com
portamiento
newtoniano,
la viscosidad
aparente se
mantiene
independiente de
la velocidad de cizalla
(zona plateau), ya partir de
240 Pa
comienza
a fluir
con flujo
pseudoplástico. Finalm
ente, los datos se ajustaron a modelos
reológicos m
atemáticos,
corroborando así
lo observado en las gráficas. El m
ejor ajuste parala dispersión al 1%
correspondióal m
odelo de C
ross (6),
cuyos parám
etros obtenidos
serecogen
en la Tabla 1.
Tabla 1.Parám
etros del modelo de C
rosspara
la dispersión
acuosa al
1%
de chitosan
modificado.
0 (Pa.s)(Pa.s)
k (s)n
Cross
0.6896.328x10
-80.02864
0.4349
Enella
se refleja
la baja
viscosidad del
preparado (0 y
), así como un tiem
po de relajación m
uy pequeño (k). Adem
ás, el valor de “n” m
enor que 1 refleja su comportam
iento pseudoplástico (shear-thinning). Por su parte, la dispersión al 4%
se ajustó al m
odelo de Ostw
ald-De W
aele para velocidades de cizalla inferiores a 0.002 s -1
y 240 Pade
esfuerzoy
al modelo de C
arreau para valores superiores a éstos
(Tabla 2).A
sí, se puede observar
como
el sistem
a disperso
presenta inicialm
ente un
comportam
iento new
toniano (n
1)con
altos valores
de viscosidades
aparentesque se confirm
an con el modelo de
Carreau, ya que
0 ,viscosidad a velocidad de
cizalla 0, es del orden de 105. C
uando empieza
a fluir y dado su flujo pseudoplástico (n=0.967),va dism
inuyendo la viscosidad hasta alcanzar valores de 0.286 Pa.s (
).
Tabla
2.Parám
etros de
losm
odelos de
Ostw
ald-De W
aeley C
arreau para los sistemas
dispersosal 4% de chitosan m
odificado.
K(Pa.s)
n
Ostw
ald-De
Waele
6.58x105
1.16
0 (Pa.s)(Pa.s)
k(s)n
Carreau
1.61x105
0.2860421.2
0.967
Conclusiones:
Mediante la m
odificación química del chitosan
se consiguen dispersiones acuosas de hasta 4%
de chitosan modificado. Los fluidos obtenidos
son viscoelásticos con flujo pseudoplástico, para los m
enos concentrados, yestructurados, para
los de mayor concentración, con el consiguiente
interés en aplicaciones cosméticas,
biomédicas
yfarm
acéuticas.
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RIM
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RIC
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E SIST
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AS B
UC
OA
DH
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OS
H. C
astán1, M
.E. Morales 1, B
. Clares 1, A
.C. C
alpena2, M
.A. R
uíz1
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Universidad de G
ranada. España.2D
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica.U
niversidad de Barcelona. España.
IntroducciónEn la actualidad, uno de los problem
as que causan una m
ayor demanda analgésica es el
dolor odontológico.
Sin em
bargo, el
uso continuado de analgésicos presentan num
erosas reacciones
adversas, las
cuales podrían
ser evitadas con el uso de form
as farmacéuticas de
administración
transbucal. En
diferentes estudios (1) se ha com
probado que algunos antidepresivos tricíclicos pueden tener efecto analgésico
gracias a
su acción
bioquímica
molecular ya que son capaces de
aumentar la
cantidad de noradrenalina y serotonina en el espacio
sináptico.En
este sentido
la adm
inistración transbucal
de clorhidrato
de doxepina
podría proveer
de una
potente actividad analgésica em
pleando bajas dosis y por
tanto evitando
los efectos
adversos asociados
a la
administración
sistémica
de dichas sustancias. Por ello, el objetivo principal de
este trabajo
es el
diseño de
un parche
bucoadhesivo para la administración transbucal
de clorhidrato de doxepina utilizando diferentes polím
eros (2) así como la caracterización de
dichos sistem
as en
cuanto al
análisis calorim
étrico y la capacidad de hinchamiento.
Materiales y m
étodosM
aterialesC
lorhidrato de doxepina fue suministrado por
Fagron Iberica S.A.U
. (Barcelona, España). Las
películas fueron
preparadas utilizando
tres polím
eros:chitosan (Sigm
a-Aldrich, V
alencia, España),
hidroxipropilmetilcelulosa
(HPM
C)
(Methocel K
15M EP, Palex S.A
., Jaén, España) y
carboximetilcelulosa
sódica (SC
MC
) (G
uinama, V
alencia, España). El plastificante ha sido glicerol (Fagron, B
arcelona, España). Polivinilpirrolidona (PV
P) fue suministrado por
Basf (B
arcelona, España) y el ácido acético por Panreac (B
arcelona, España).
Análisis calorim
étricoLa C
alorimetría D
iferencial de Barrido (D
SC)
se ha realizado en un dispositivo Mettler FP 85,
tomando m
edidas a intervalos de 5º C/ m
inuto. El
peso de
las m
uestras se
encuentra com
prendido entre 5-7 mg.
Capacidad de hincham
ientoD
espués de
la determ
inación del
peso y
diámetro
del parche
original, las
muestras
fueron som
etidasa
hinchamiento
en la
superficie de una placa de agar preparado al 2%
(m/m
) y
mantenida
en estufa
a 37º
C.
El aum
ento de peso y diámetro de los parches se
determinó
en intervalos
de tiem
po predeterm
inados. El porcentaje de hinchamiento
fue calculado utilizando la siguiente ecuación:
% de hidratación = (W
2 – W1 ) W
2 x 100
Donde W
2es el peso del parche después de
permanecer en la estufa un tiem
po determinado
y W1 es el peso del parche inicial.
Resultados y discusión
Los sistemas bucoadhesivos estudiados (tabla 1)
son sistemas m
atriciales en una sola lámina
elaborada a partir de un hidrogel, donde el m
aterial polimérico, adem
ás de constituir el reservorio del fárm
aco, también es responsable
de la fijación del sistema a la m
ucosa oral.
SCM
C
4% (p/v)
HPM
C
3% (p/v)
Chitosan
2% (p/v)
PVP 5%
(p/v)PV
P 5% (p/v)
PVP 5%
(p/v)G
licerol 5%G
licerol 5%G
licerol 5%
Agua
destiladaA
gua destilada
Solución acuosa de
ácido acético 1,5%
(v/v)C
lorhidrato de doxepina
0,05%
Clorhidrato
de doxepina 0,05%
Clorhidrato
de doxepina 0,05%
Tabla
1.C
omposición
de los
parches bucoadhesivos propuestos.
Es preciso hacer notar que los termogram
as(figuras 1-3) están evaluados tom
ando como
criterio las
transiciones exotérm
icas y
endotérmicas.
El hidrocloruro
de doxepina
(figura 2) mostró un solo pico endotérm
ico correspondiente al punto de fusión a 191,1º C
, así com
o un pico exotérmico correspondiente a
su descomposición.
Según se muestra en la figura 1, en los tres
sistemas estudiados se da una transición de tipo
endotérmico, en el intervalo de tem
peraturas entre 30 y 120º C
, lo cual se atribuye a la deshidratación por la pérdida de las uniones con las m
oléculas de agua. Al final de la curva
calorimétrica, se evidencia otro proceso térm
icoa
partir de
los 140º
C,
debido a
la descom
posición de los biopolímeros.
77
Se observan
entalpías de
deshidratación sim
ilares para
los polím
eros de
carboximetilcelulosa sódica (281 J/g) y chitosan
(281 J/g).
Sin em
bargo, la
película de
hidroxipropilmetilcelulosa
presenta una
tendencia menorrespecto a la entalpía (251 J/g),
lo que indica que se suministró una energía
menor para elim
inar el agua del sistema. Este
hecho confirm
a com
o los
soportes de
carboximetilcelulosa sódica y chitosan poseen
una m
ayor capacidad
de absorción
de la
molécula de agua en su estructura, observando
esta m
isma
tendencia en
el análisis
de hincham
iento ya que los porcentajes de la tabla 3 m
uestran que los parches elaborados con
hidroxipropilmetilcelulosa
presentan m
enor tendencia a captar agua y que esta da lugar a la disolución del sistem
a en un tiempo m
áximo de
3 m
inutos. En
cambio,
en los
sistemas
de carboxim
etilcelulosa sódica y chitosan no hay una diferencia significativa (p> 0,05) en cuanto al porcentaje de hidratación.
Figura 1.
Termogram
as de
los parches
bucoadhesivos.
Formulación
% hidratación ± D
ESC
MC
67,04 ± 2,03H
PMC
55,91 ± 2,26C
hitosan67,30 ± 2,45
Tabla 3.Porcentaje de hidratación.
De m
anera similar las m
ezclas físicas con las m
ismas
proporciones que
los parches
no m
uestran el pico característico del principio activo (figura 2), debido m
uy probablemente a
su escasa relación con el resto de excipientes.En las m
ezclas binarias del principio activo con los
excipientes evaluados
no se
detectaron desplazam
ientos significativos
de las
transiciones, ni formación de picos adicionales,
así como tam
poco se observó la desaparición de las transiciones características de cada sustancia estudiada, lo que indica que las transiciones físicas
características de
cada uno
de los
excipientes empleados no fueron m
odificadaspor la presencia del principio activo (figura 3). Sin
embargo,
la com
binación con
chitosan m
uestra un desplazamiento considerable de la
temperatura de fusión del activo lo que podría
indicar cierta interacción. No obstante, todas
estas hipótesis se deberían contrastar con otras técnicas.
Figura 2.
Termogram
as de
las m
ezclas de
polímero, polivinilpirrolidona y doxepina en las
proporciones en las que se encuentran en el parche.
Figura 3.Term
ogramas de las m
ezclas físicasde la doxepina y cada polím
ero.
Conclusión
Los análisis
calorimétricos
tanto de
los m
ateriales em
pleados com
o de
las form
ulaciones propuestas
coinciden con
los datos existentes en la bibliografía consultada, observando com
patibilidad manifiesta entre los
polímeros
seleccionados y
el clorhidrato
de doxepina, así com
o temperaturas de transición
vítrea aptas para proporcionar la flexibilidad adecuada tras su adm
inistración bucal. Adem
ás, los datos de entalpía de las diferentes películas se correlacionan con los resultados obtenidos en el ensayo de hincham
iento, mostrando al parche
de hidroxipropilmetilcelulosa com
o el soporte con m
enor capacidad de hinchamiento.
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: UN
A
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TR
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AM
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Introducción:Dentro de los diferentes tipos de
nanoplataformas diseñadas para el transporte
específico de fármacos
hasta el tejido o célula diana
destacan los
coloides m
agnéticos. Se
postula que las principalesventajas de estos
nanosistemas com
o sistemas transportadores de
sustancias activas frente a la farmacoterapia
convencional son
principalmente:
i)la
disminución de reacciones adversas derivadas
de una extensa biodistribucióndel fárm
aco, la cual
no existe
porque toda
la dosis
quedaacum
uladaen el lugar de acción; y, ii) una
intensa exposición del tejido y células diana a las m
oléculas de sustancia activa transportadas m
agnéticamente (1). En este sentido, el presente
trabajo de investigación pretende el desarrollode una form
ulación de magnetoliposom
as como
nanoplataformas para el transporte selectivo de
5-fluorouracilo (5-FU
) en
el tratam
iento de
cáncer de colon avanzado.
Materiales y M
étodos:Todos los reactivos
químicos
usados tenían
calidad analítica
(Panreac, España),
excepto la
L--
fosfatidilcolina y
el 5-FU
(Sigm
a-Aldrich,
Alem
ania). El
agua utilizada
en todos
los experim
entos fue
desionizada y
filtrada previam
ente (Milli-Q
,Millipore, Francia).
Los núcleos de magnetita (Fe
3 O4 )se sintetizaron
mediante
un m
étodo de
co-precipitaciónquím
ica (2, 3). Los liposomas
fueron preparados utilizando el m
étodo de hidratación del film(thin
layer evaporation
technique) (4).
La preparación de los m
agnetoliposomas se basó en
esta mism
a metodología con la única excepción
de la inclusión de los núcleos deFe
3 O4
en la fase acuosa utilizada para la rehidratación de la fina capa lipídica.La
caracterización fisicoquím
ica de
los m
agnetoliposomas com
enzó con el estudio de su
geometría
mediante
análisis de
microfotografías
electrónicas de
transmisión
(TEM)
y m
ediante espectroscopía
de correlación
de fotones
(PCS).
Estas determ
inacionesse realizaron
por triplicado a 25.0
0.5 ºC
. Las
nanopartículas fueron
caracterizadas tam
bién m
ediante análisis
electrocinético (electroforesis) y caracterización term
odinámica
superficial (balance
hidrofilia/hidrofobia, a
partir del
tratamiento
termodinám
ico de
las determ
inaciones de
ángulo de contacto con agua, formam
ida y -
bromonaftaleno).
En el primer caso, se determ
inóla evolución de
los valores
de potencial
zeta (
) de
las nanopartículas en función de la fuerza iónica del m
edio de dispersión (concentración de KN
O3 ).
La 0.1 %
(p/v). Por otro lado, y con el objetivo de analizar cualitativam
ente la degradación de los m
agnetoliposomas, se determ
inó la evolución tem
poral de
los valores
de m
ovilidad electroforética (u
e ) de éstos y de nanopartículasde
Fe3 O
4 . Estas
medidas
se realizaron
reproduciendo in
vitrolas
siguientes condiciones fisiológicas: 37.0
0.5 ºC y pH
7.4 0.1 (tam
pón NaO
H-K
H2 PO
4 ). En
la realización
de los
ensayos de
incorporación de
5-FU
en los
magnetoliposom
as, la fase acuosa contenía una concentración de este fárm
acode 3 m
g/mL.La
eficacia de atrapamiento (EE, %
) y carga de fárm
aco (DL, %
) del 5-FU, junto con el perfil de
liberación in
vitro(pH
7.4,
37 ºC
) se
caracterizaronm
ediante un método validado de
espectrofotometría
UV
-Vis
(266 nm
). Los
ensayos de liberación se realizaron mediante
diálisis.
Resultados y D
iscusión:Los núcleos de Fe
3 O4
presentaron una morfología cúbica y un tam
año m
edio de partícula de 12 2 nm
,mientras que
los liposom
as se
caracterizaron por
una m
orfología esférica y un tamaño m
edio de635
393 nm(elevada heterogeneidad de tam
año). Por
el contrario,
los m
agnetoliposomas
presentaron una
morfología
esférica y
un tam
año de partícula adecuado para la vía de adm
inistración intravenosa (12024
nm).
Laterm
odinámica
superficialy
el análisis
electrocinéticode
los diferentes
tipos de
nanopartículas pusieron de manifiesto que la
naturaleza hidrófila de las nanopartículas deFe
3 O4 (figura 1) y su
correspondiente carga eléctrica positiva (figura 2) desaparecen al ser em
bebidas en la matriz liposom
al hidrófobay
de carga
eléctrica negativa.
Am
bas caracterizaciones
fisicoquímicas
constituyen una
clara evidencia
de la
eficacia de
la m
etodología desarrollada
para la
síntesis de
magnetoliposom
as.
79
Figura 1.V
alores de incremento de energía
libre superficial
en m
edio acuoso
(G
SLS ,m
J/m2) y carácter hidrófilo/hidrófobo de los tres
tipos de nanomateriales.
Figura 2.Potencial zeta () de Fe
3 O4 , liposom
as y
magnetoliposom
as en
función de
la concentración m
olar de KN
O3 , y a pH
natural .
La degradación de los magnetoliposom
as parece transcurrir rápidam
ente, siendo completa en 12
horas. De hecho, este com
portamiento es
claro si consideram
osel ensayo electrocinético de
degradación realizado (figura 3). Los valores de u
ede
los m
agnetoliposomas
se hacen
más
negativos conform
e transcurre
el tiem
po, llegando a ser sim
ilares a los de los núcleos de Fe
3 O4
transcurridas sólo 12 horas. Otro hecho
destacable es que la evolución más acusada de
estos valores se produce durante las primeras 2
horas. Así, la degradación debe transcurrir
más
acusadamente durante este periodo de tiem
po.
Figura3.
Movilidad
electroforética (u
e )de
magnetita (Fe
3 O4
y magnetolipo
en función del tiempo (horas) (37 ºC
y pH 7.4).
En cuanto a la vehiculización de 5-FU, la
EE(%
) yla D
L (%) de los m
agnetoliposomas fue
del %
, respectivamente. C
omo
puede apreciarse en la figura 4 la liberación in vitro
del 5-FU transcurre m
ediante un proceso rápido, ya que el 70%
del fármaco vehiculizado
es liberado en 1
h. Este fenómeno podría
apoyarse en la rápida degradación descrita para la m
atriz liposomal (figura 3).
Figura 4.Liberación de 5-FU
(%)
desde los m
agnetoliposomas
en función
del tiem
po (horas) (37 ºC
y pH 7.4).
Conclusiones:
Se ha
puesto a
punto un
procedimiento reproducible para la síntesis de
magnetoliposom
as com
o sistem
as transportadores del agente quim
ioterápico 5-FU.
La caracterización
fisicoquímica
realizada refleja la eficacia de esta m
etodología. Si bien por sus características esta form
ulación tendría interés si se adm
inistra por vía intratumoral o
intraarterial, en
la actualidad
se están
desarrollando modificaciones en la form
ulación que
mejoren
la capacidad
de los
magnetoliposom
as como nanovehículos
de este agente quim
ioterápico.
Referencias:
(1)D
urán JDG
et al.Magnetic colloids as drug
vehicles.2008;97(8):2948-83.(2)
Massart
R.
Preparation of
aqueous m
agnetic liquids
in alkaline
and acidic
media.1981;17(2):1247-8.
(3)A
rias JL
et al.
Magnetoresponsive
squalenoyl gem
citabine com
posite nanoparticles for cancer
active targeting.2008;24(14):7512-9.
(4)C
lares B et al. M
ultilamellar liposom
es of triam
cinolone acetonide:
preparation, stability
and characterization.
2009;19(3):197-206.
Agradecim
ientos:Proyecto
FIS 11/02571
(Instituto de Salud Carlos III, España).
80
POT
EN
CIA
L D
E M
AG
NE
TO
LIPO
SOM
AS C
OM
O A
GE
NT
ES D
E H
IPER
TE
RM
IA E
N E
L
TR
AT
AM
IEN
TO
DE
CÁ
NC
ER
DE
CO
LO
N A
VA
NZA
DO
R. B
iedma-O
rtiz, B.C
lares, E.Sáez-Fernández, V. G
allardo, M.A
. Ruiz, J.L. A
riasD
pto. de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de G
ranada, España. e-m
ail: beatrizclares@ugr.es
Introducción:En
la actualidad,
numerosos
ensayos preclínicos han puesto de manifiesto la
excelente capacidad
que tienen
los coloides
magnéticos com
o sistemas transportadores de
fármacos
antitumorales,
ya que
mejoran
notablemente la eficacia y seguridad del agente
quimioterápico (1). M
ás recientemente, diversas
investigaciones han
postulado su
potencial utilidad
como
agentes de
contraste en
resonancia magnética de im
agen(R
MI)
y como
agentes de hipertermia. Ésta últim
a cualidad tiene un enorm
e interés en la lucha contra el cáncer. En concreto, se indica que los coloides m
agnéticos podrían serguiados magnéticam
ente hasta
la m
asa tum
oral y
allí generarían
selectivamente un calor que m
ataría las células m
alignas(hiperterm
ia).El
fenómeno
de hiperterm
ia es consecuencia de la vibración de los m
omentos m
agnéticos de estas partículas, al encontrarse bajo la acción de un gradiente de cam
po electromagnético alterno (2).
El objetivo de esta investigación es el análisis de la
capacidad como agente de hiperterm
ia que tiene
una form
ulación de
magnetoliposom
as constituida
por núcleos
de óxido
de hierro
superparamagnético
(magnetita,
Fe3 O
4 )em
bebidos en una matriz liposom
al basada en fosfatidilcolina. Este estudio prelim
inar in vitropretende
constituir un
paso previo
en la
valoración de la aplicabilidad de esta (nano)-form
ulación en el tratamiento de cáncer de
colon avanzado.
Materiales y M
étodos: Los productos químicos
utilizados tenían
calidad analítica
(Panreac, España), incluida la
L--fosfatidilcolina (Sigm
a-A
ldrich, A
lemania).
El agua
utilizada fue
previamente
desionizada y
filtrada(M
illi-Q,
Millipore, Francia).
Los magnetoliposom
as que se estudiarán en este trabajo de investigación tienen una m
orfología esférica y un tam
año medio de 120 ±
25 nm
(figura 1).
Su síntesis
se ha
basado en
la m
odificación de una metodología am
pliamente
empleada para la form
ulación de liposomas: el
método
de hidratación
del film
(thin
layer evaporation
technique) (3).
La principal
variante a
esta m
etodología consiste
en la
inclusión de núcleos de Fe3 O
4 (tamaño m
edio 10 nm
, a priorisuperparamagnéticos)en la fase
acuosa empleada en la rehidratación de la fina
capa lipídica.
Figura 1.
Microfotografía
electrónica de
transmisión de un m
agnetoliposoma. Longitud
de barra: 100 nm.
La estructura
cristalina de
estos nanocom
puestos m
agnéticosse
caracterizó m
ediante la
obtención del
difractograma
de rayos X
(método de D
ebye-Scherrer). La masa
de magnetoliposom
as empleada para ello fue
0.5 g,
habiéndose desecado
previamente
la m
uestra a
35.0 ±
0.5 ºC
en un
horno de
convección.Las
propiedades m
agnéticas de
los m
agnetoliposomas se caracterizaron m
ediante un m
agnetómetro-susceptibilím
etro a 25.0± 0.5
ºC.
Finalmente, se caracterizó la capacidad de
estos nanocompuestos m
agnéticos como agentes
de hiperterm
ia. Para
ello, se
preparó una
suspensión acuosa de m
agnetoliposomas (10
mg/m
L, 5 mL) y se determ
inó su capacidad para generar calor cuando ésta es
sometida a un
gradiente de campo electrom
agnético alterno (frecuencia e intensidad: 250 kH
z y 4 kA/m
, respectivam
ente). El registrode la tem
peratura se
realizó con
una sonda
termom
étrica conectada a un ordenador.
Resultados y D
iscusión:La figura 2 recoge el
difractograma
de rayos
X
de los
magnetoliposom
as. Es
interesante observar
cómo todos los picos característicos de la Fe
3 O4
permanecen inalterados en el difractogram
a de los
liposomas
magnéticos.
De
esta m
anera, puede afirm
arse que la estructura de los núcleos de óxido de hierro perm
anece inalterada tras su inclusión en la m
atrizdel liposom
a, siendo éste un
requisito indispensable
para que
los nanocom
puestos tengan
una adecuada
81
capacidad de respuesta a gradientes de campo
magnético.
Figura 2.D
ifractograma de rayos X
de los m
agnetoliposomas.
Figura insertada:
patrón ASTM
de difracción de rayos X de la Fe
3 O4 . La
intensidad se expresaen unidades arbitrarias (u.
a.).
El análisis de las propiedades magnéticas de los
magnetoliposom
as puso
de m
anifiesto su
adecuada capacidad de respuesta a gradientes m
agnéticos. Los
datos de
susceptibilidad m
agnética inicial
y de
magnetización
de saturación
de las
partículasconfirm
an esta
afirmación (25.0 ± 0.2 y
206 ±12 kA
/m,
respectivamente). D
e esta forma, es de esperar
que los
magnetoliposom
as sean
fácilmente
guiados al lugar de acción con la ayuda de un im
án.Finalm
ente, la
exposición de
la suspensión
acuosa de nanocompuestos a un gradiente de
campo
electromagnético
alterno parece
convertir a los magnetoliposom
asen adecuados
agentes de hipertermia (figura 3). D
e hecho, puede apreciarse en la figura cóm
o en tan sólo 22 m
inutosse alcanza la tem
peratura mínim
a de 4).A
demás, se observa
quela tem
peratura de la suspensión continúasubiendo hasta alcanzar un valor m
áximo de 45
ºC, el cual se m
antiene estable durante todo el experim
ento.
Figura 3.
Curva
de calentam
iento de
una suspensión
acuosa de m
agnetoliposomas (10
mg/m
L) bajo la influencia de un gradiente de cam
po electromagnético alterno.
Esto dem
uestra un
óptimo
control de
la tem
peratura y flujo de calor (requisito básico para
su aplicación
en hiperterm
iacontra
el cáncer).D
e hecho, debe tenerse en cuenta que si
minutos,
está puede
destruirse. A
simism
o,pueden inducirse daños en el tejido sano que rodea al tum
or si la temperatura supera los 48
ºC(5, 6).
Conclusiones:
El m
étodo de
síntesis desarrollado perm
ite obtener magnetoliposom
as con
una geom
etría adecuada
para su
administración
por vía
parenteral. Las
excelentes propiedades
magnéticas
de estos
nanocompuestos perm
itenpostular
un futuro prom
etedor en Biom
edicina parasu aplicación
en el tratamiento de tum
ores por medio de la
hipertermia.
Actualm
ente, se
encuentran en
desarrollo estudios
para valorar
la eficacia
antitumoral
de esta
(nano)-formulación
parahiperterm
ia en modelos in vitro
ein vivo
de cáncer de colon avanzado.
Referencias:
(1)D
urán JDG
et al. Magnetic colloids as drug
vehicles.2008;97(8):2948-83.(2)
Wang SY
et al. Magnetic nanoparticles and
thermally responsive polym
er for targeted hypertherm
ia and
sustained anti-cancer
drug delivery.
Adv.
Exp. M
ed. B
iol. 2013;765:315-21.
(3)C
lares B et al. M
ultilamellar liposom
es of triam
cinolone acetonide:
preparation, stability
and characterization.
2009;19(3):197-206.(4)
Johannsen M et al. C
linical hyperthermia of
prostate cancer
using m
agnetic nanoparticles:
presentation of
a new
interstitial technique. Int. J. H
yperthermia.
2005;21(7):637-47.(5)
Gonzales M
, Krishnan K
M. Synthesis of
magnetoliposom
es with m
onodisperse iron oxide nanocrystal cores for hypertherm
ia. J. M
agn. Magn. M
ater. 2005;293:265-70.(6)
Lao LL, R
amanujan
RV
. M
agnetic and hydrogel
composite
materials
for hypertherm
ia applications. J. Mater. Sci.
Mater. M
ed. 2004;15:1061-4.
Agradecim
ientos:Proyecto
FIS 11/02571
(Instituto de Salud Carlos III, España).
82
SOL
UB
ILID
AD
DE
LA
LID
OC
AÍN
A B
ASE
EN
EX
CIPIE
NT
ES E
MO
LIE
NT
ES
E. Blanca Eliche, M
. D. C
ontreras Claram
onteD
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Granada, España
Introducción: La
lidocaína se
presenta en
forma de derivado salino (C
lH) y en form
a de base.
El derivado
salino es
habitual en
preparaciones tópicas. Este trabajo exploralas
posibilidades de
formulaciones
tópicas con
lidocaína base. De esta m
olécula se conocesu
carácter básico débil, su lipofília y la escasa solubilidad en agua a pH
compatible con la piel
(5 -7). El objetivo del trabajo es determinar la
solubilidad de la Lidocaína base en excipienteslipofílicos, líquidos a tem
peratura ambiente y
adecuados para preparaciones dermatológicas.
Laselección de los excipientes,
se realiza en base a su probable solubilidad. Para ello, se utiliza
la Teoría de las Soluciones Regulares y
los parámetros de solubilidad de H
ansen. Los conceptos generales de am
bas,son de carácter
práctico y permiten conocer a-priori la bondad
de los
disolventes. Están
basados en
los parám
etros de solubilidad total (t ) y parám
etros de cohesión (
d ,p
yh)
del soluto y de los disolventes.
Materiales y M
étodos: 1.- Selección de los excipientes. Para aplicar los conceptos anteriores, es
necesarioconocer el
valor de t y
de d ,
p yh ,de
la lidocaína y delos excipientes.
El valor de t de la lidocaína
(Tabla 1), fue determinado por Lin y N
ash (1), el resto de los parám
etrosson determ
inados por m
étodos de contribución de grupos de Fedors (2), V
an Krevelen y H
oftyzer y Hansen y
Beerbow
er (3)Se seleccionan disolventes (Tabla 1).cuyo
tvarían de 17,44 a
20,2 MPa, cum
pliendo la prim
era prem
isa: diferencia
en t
entre la
lidocaína y disolvente menor de 5,11 M
Pa1/2.
2.- Análisis cualitativo de la solubilidad. Para
una estimación inicial de
la solubilidad dela
lidocaína en los disolventes se ha seguido la m
etodología propuesta por Teas(4)
aplicada a diagram
as triangulares y esfera de solubilidad.C
omo referencia se ha utilizado la solubilidad
de la lidocaína en etanol.
Diagram
a T
riangularde
solubilidad..Se
obtiene empleando
losparám
etros de cohesión norm
alizados (fd ): 100*
fh
pd
dd
100*
fh
pd
pp
100*
fh
pd
hh
En el diagrama triangular (Fig. 1): La distancia
entre los excipientesy la lidocaína es m
enor que la distancia entre la lidocaína y el etanol.
Es previsible que la lidocaína sea soluble en los disolventes.
Figura 1.
Diagram
a triangular
de Teas,
predicción de la solubilidad de la lidocaína en los disolventes. E
sfera de
solubilidad de
la lidocaína:
El centro de la esfera (Fig. 2) tiene los valores de
d ,p y
h de la lidocaína. El radio de la esfera (radio de interacción R
0 ) es determinado desde
los valores de d ,
p yh
del etanol.Los límites
de esta
esfera caracterizan
los “buenos“
disolventes (5). Estos deben tener una distancia desde
el centro
de la
esfera“distancia
del parám
etro de solubilidad” (Ra) m
enor que Ro.
Figura 2.Esfera de solubilidad de la lidocaína.
Es previsible
una buena
solubilidad, R
a es
menor que R
0 .
3. Estim
ación teórivade la solubilidad. La
Teoría de las Soluciones Regulares perm
ite una estim
ación cuantitativa de la solubilidadde la
lidocaínaen los disolventes
(Fig. 4), aplicandola ecuación deducida por H
ildebrand y Scott:21
2
212
22
lnln
RTV
XX
ideal
Ecuación 1
Donde: V
21 =
fracción de
volumen
del disolvente;
R:
constante de los gases; T: temperatura absoluta
0,000,25
0,500,75
1,00 0,00
0,25
0,50
0,75
1,000,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Y Axis Title
fhidrogeno
Z Axis Title
X Axis Title
Lidocaína
Etanol9
83
de la1
2= parám
etros de solubilidad,
total (o
de H
ildebrand) del
disolvente y del soluto respectivamente.
Solubilidadexperim
ental.Se
obtiene soluciones saturadas a 25
ºC . Se valoraron
por espectrofotom
etría alícuotas del sobrenadante.C
ada valor
es la
media
de dos
ensayos independientes.
Resultadosy discusión.
Los resultados obtenidos (Figura 4) demuestran
la elevada solubilidad de la lidocaína en los disolventes.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
1719
2123
2527
MPa
1/2
% (m/m)
% (m
/m) Teórico
% (m
/m) experim
ental
Figura 4.Solubilidad de la lidocaína.En todos los casos los valores de solubilidad experim
ental es superior a la estimada por la
ecuación 1, siendo esta diferencia más elevada
en los disolventes de parámetros de solubilidad
más bajos (aceite de oliva al A
dipato de di (tri polietilenglicol
éter
mirístico)
donde la
diferencia es hasta de 20 veces superior. En estos disolventes, inicialm
ente, era previsible que en función de sus parám
etros, la lidocaína form
ara soluciones
regulares, donde
solo existieran
fuerzas de
dispersióny
ambos
valores, teórico y experimental, se aproxim
aran. Estas
diferencias pueden
ser atribuidas
ainteracciones de tipo polar o de puentes de hidrógeno
entre los grupos funcionales de la lidocaína (am
ido, amino y carboxilo) y de los
disolventes(alcohol, éter, ester). A
todo ello hay que añadir que la lidocaína en solución y debido a la conform
ación espacial del grupo am
ido, puede adoptar configuración cis, trans o sim
ultáneamente am
bas (cis/trans) en equilibrio (6). Lum
ley-Jones (7)puso en
evidencia la formación de puentes de hidrógeno
intramoleculares en la lidocaína cuando esta se
encuentra en
solución en
disolventes poco
polares, originando configuración cis, estables, m
ás lipofílicas
que cuando
la lidocaína
se encuentra en disolventes de m
ayor polaridad, donde predom
ina la configuración trans (8)y
asociaciones interm
oleculares (6).
Todos los
disolventes estudiados son poco polares, su p
varíaentre 1,2 y 2,53 M
Pa1/2. Es probable que al
menos en los prim
eros disolventes de la serie, la lidocaína se encuentre en form
a cis y contribuya a explicar, al m
enos en parte, las discrepancias observadas.
Tabla 1.-D
isolventes seleccionados y parámetros de solubilidad y V
olumen M
olar
Nom
bre com
ercialT
(MPa
1/2)d(M
Pa1/2)
p(MPa
1/2h(M
Pa1/2)
V m
olar(cm
3mol)
Aceite de oliva
Aceite de oliva
17,86*15,9*
1,20*5,40*
900,000
Cetiol SN
Isononanoate de cetilo/esteárico
17,8615,16
1,069,36
482,1C
etiol LC
Coco C
aprilato/caprato17,98
16,641,10
6,72465,8
Miristato de isopropilo
18,0316,01
1,598,12
321,2C
etiol AL
aurato de hexilo18,15
16,251,51
7,94337
Eutanol G
2-octil dodecanol18,33
16,911,45
6,93352,7
Crom
oll. DP3A
Adipato de di (tri
polietilenglicol éter mirístico)
18,3816,85
2,896,73
921,4C
romadol D
OA
Adipato di(2 etil hexilo
19,0215,97
2,4610,04
414,4C
etiol BA
dipato de dibutilo19,99
15,623,57
11,96285
Croda. G
TC
CT
riglicéridos caprílicos/cápricos
20,0716,41
2,5311,27
603,6C
rodamol LL
Lactato de laurilo20,24
16,362,53
11,64284,6
Etanol
26,4212,60
11,2020,00
58,5lidocaina
22,90*20,32
4,699,48
208,500*
Bibliografía
1-.H
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84
GL
UT
AT
HIO
NE
-RE
SPON
SIVE
MIC
RO
PAR
TIC
LE
S FOR
DR
UG
DE
LIV
ER
YM
. Curcio
1, C. A
lvarez-Lorenzo2, B
. Blanco-Fernandez
2, F. Puoci 1, N. Picci 1, A
. Concheiro
2
1Dipartim
ento di Scienze Farmaceutiche, Edificio Polifunzionale, U
niversità della Calabria, 87036
Rende (C
S), Italy.2D
epartmento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Santiago de Com
postela, 15782 Santiago de C
ompostela, Spain.
Introduction: Stim
uli-responsive hydrogels
constitute a
fast-growing
area of
polymer
science because of the ability to rapidly respond to environm
ental stimuli[1,2]. A
mong polym
ers that can form
hydrogels, natural polymers are
often preferred to synthetic materials because of
their non-toxicity, low cost, ready availability,
and biocompatibility.
Chitosan (C
S),a natural
polysaccharide obtained
by deacetylation
of chitin,
has been
used extensively
as a
component
of a
varietyof
pharmaceutical
preparations.The aim
of this w
ork w
as to prepare
chitosan-based glutathione-responsive
particles containing
disulfide bonds
by an
emulsion/separation m
ethod. Glutathione (G
SH)
isan
antioxidantthat
prevents dam
age to
important
cellular com
ponents caused
by reactive oxygen species such as free radicals and peroxides. G
SHhas been show
n suitable for reduction
ofdisulfide
bonds of
polymer
nanocarriers and
polymer-drug
conjugates, enabling intracellular-specific drug release [3].G
SHis present in high concentrations in the
hypoxic regions, such as the tumor cells. The
cellsgenerally contain m
ajority ofG
SHin the
cytosol at concentrations ranging from 1 to 11
mM
, while the extracellular concentration is
about 1000-fold less [4,5]. On the basis of the
differences in the intracellular and extracellular G
SH concentrations, the chitosan m
icroparticles containing disulfide bonds can be suitable for the
development
of drug
deliverysystem
sresponsive
to GSH
levels.
Materials and M
ethods: Synthesis of C
S-SH conjugate. ED
AC
(1-ethyl-3-(3-dim
ethylaminopropyl)
carbodiimide
hydrochloride) reacted with carboxyl groups of
thiolactic acid
to form
active
ester interm
ediates, which reacted w
ith free amine
groups of chitosan (MW
250000-350000)to
form am
ide bonds[6].
Lyophilizedthiolated
chitosan (CS-SH
) appears as a white fibrous
powder easily soluble in w
ater. The structure of
CS-SH
was
confirmed by 1H
NM
R in D
MSO
-d6 and FTIR
spectroscopy. Preparation
of chitosan
microparticles
by em
ulsion-suspension polym
erization. C
S-SH
conjugate (0.2
g)dissolved
in N
aBrO
3aq.
solution (0.1M, 10 m
l) was added to sunflow
er seed oil (150 m
l) containing Span 80(3 g)under
Ultraturrax
®stirring (25000 rpm
).The emulsion
was
kept at
60°C
for 2
hours.Then,
them
icroparticlesw
ere w
ashed w
ith petroleum
ether,
ethanol and
water,
and dried
under vacuum
for 24 h at 25ºC. Scanning electron
microscopy (SEM
)im
ages were recorded in
FESEM U
LTRA
Plus(Zeiss, USA
). Sw
elling. Microparticles (20 m
g) were placed in
5-ml syringe fitted w
ith a sintered glass filter, w
eighed,and left to sw
ell by imm
ersion in phosphate buffer w
ith GSH
(0, 0.1 and 5 mM
) of G
SH. A
t a predetermined tim
e(1, 5, 8 and 24
h), the
excess of
water
was
removed
by filtration
at atmospheric pressure
andthe filter
centrifuged at 3500 rpm for 5 m
in and weighted.
The filter
tare w
as determ
ined after
centrifugation with only w
ater. The weights
recorded at the different time intervals
and the w
ater content percent was estim
ated as:
where W
s and Wd are the w
eights of swollen
and dried microparticles, respectively.
Incorporation of methotrexate (M
TX)into the
microparticles.
Microparticles (200 m
g)w
ere placed in
2 ml of drug solution (5
mg/m
l,C0 ) in
phosphate buffer pH 7.4, for 3 days under
stirring at
room
temperature.
Then, the
microparticles w
ere filtered and dried underreduced
pressure to
constant w
eight. M
TXrem
aining in the medium
(Ci ) w
as quantified by H
PLC at 302
nm. The loading efficiency
(LE)w
as estimated as:
In vitro MTX release. Loaded m
icroparticles w
ere dispersedin phosphate buffer w
ith GSH
at0, 0.1 and 5 m
M(10 m
l,37°C
). At various
times, 0.150 m
l were w
ithdrawn, analyzed by
85
HPLC
and replaced with fresh
medium
. Theexperim
ents were
donein triplicate.
Results and D
iscussion: Synthesis
of C
S-SH
conjugate. C
S–SHconjugate
was
achieved by
the covalent
attachment
of thiolactic
acidto
the am
ine groups of C
S. Com
pared with the
1H N
MR
spectrum
of CS (the N
-acetyl methyl proton
of C
S was at 1.95
ppm), a new
resonance peak at 2.93
ppm
was
assigned to
the side-chain
methylene (C
H2 SH
). FTIR spectra show
edthat
the absorption peaks of CH
-SHat 1660
cm1
(amide I band), 1570
cm1
(amide II band)
and 1386
cm1
(amide III band) w
erestronger than
those of CS, w
hich can be attributed to the additionalam
ide group of thiolactic acid. Preparation
of chitosan
microparticles.
Chitosan m
icroparticles were obtained from
anem
ulsion constituted
by a
CS-SH
oxidizing
solution (dispersed phase)in an
oily phase. N
a2 B
rO3
in the dispersed phase promoted the
oxidation of the thiolic groups to disulphide bonds.
SEMm
icrographs show
edspherical
particles (10
m) w
ith rough surface (Figure 1).
Figure 1.
SEM
micrographs
of the
CS
microparticles.
Swelling. M
icroparticles swelled the sam
e in phosphate buffer w
ithout and with G
SH 0.1m
M
(164%
).B
y contrast, a relevantincrem
ent in the sw
elling percentage was verified
in GSH
5m
Msolution (
273%). These findings suggest
that the disulfide bondsin the structure of the
microparticles can be broken w
hen the GSH
concentration is above a certain threshold. In vitro M
TX loading and release.M
TXw
as loaded in the
microparticles
with a loading
efficiency of 73.6 %. R
elease experiments w
ere conducted in
phoshate buffer at pH 7.4 w
ithout and
with
GSH
at
0.1 and
5 m
M.
These concentrations w
ere chosen to mim
ic the GSH
concentration in the extra- and intra-cellular spaces, respectively. M
TX release rate resulted
to be GSH
concentration-dependent(Figure 2). In the first 30 m
in,the amount of M
TX released
was
much higher in phosphate buffercontaining
GSH
5 mM
than that recorded in phosphate buffersolely or containing G
SH 0.1 m
M.
Figure 2.M
TX release profiles in phosphate
buffer pH
7.4
prepared w
ith different
concentrations of the reducing agent GSH
.
Conclusions:
Microparticles of chitosan w
ith disulfide bonds w
ere readily
obtained by
means
of an
emulsion/crosslinking
method
that rendered
spherical particles of homogeneous size (
10 m
) and that exhibit drug release dependent on the G
SH concentration. Further research w
ill be devoted to reduce the size of the particles in order
to achieve
intracellular-specific drug
release.
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egional O
perative Program
(R
OP)
Calabria
ESF 2007/2013-IV
Axis H
uman C
apital-Operative
Objective M
2-Action D
.5. Work supported by
POC
TEP (EU
IB
ERO
MA
RE),
MIC
INN
(SA
F2011-22771) and FEDER
.
86
Adipose-derived stem
cells combined w
ith biodegradable scaffoldsfor heart tissue engineering
P. Díaz-H
erráez1,E. G
arbayo1, B
. Pelacho2, F. Prosper 2, M
.J. Blanco-Prieto
1
1Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology, University
ofNavarra, Spain
2Hem
atology, Cardiology and C
ell Therapy, Clinica U
niversidad de Navarra and Foundation for A
pplied M
edical Research,U
niversityofN
avarra, Spain
Introduction:C
ardiovascular diseases
constitutes now a days
the greatest health risk. O
ne of the causesis the absence of an effective
myocardial regeneration
after ischemia. D
espite pharm
acological advances
made
in the
last years, the only real option in severe cases is transplantation.
A
therapy that
has show
nprom
ising results in myocardial regeneration is
stem cell (SC
) implantation, principally due to
the paracrine
action of
the cells
[1]. This
mechanism
consists
on the
secretionof
angiogenic and
anti-apoptotic cytokines
that favors
the form
ation of
new
vessels and
cardiomyocytes, together w
ith factors involved in progenitor recruitm
entby the cells.
Am
ong SC
, adipose tissue derived SC (A
DSC
)have
received great interestfor their easy obtention
from the strom
al vascular fraction and because they have dem
onstrated an angiogenic potential [2, 3]. H
owever, problem
s such as the low rate
of SC survival after im
plantation have limited
their effectiveness. It is generally accepted that this problem
could be solved administering the
cells into a three-dimensional structure, also
known as scaffold, that provide support to the
cells. Microparticles (M
P) made of polilactic-
co-glicolic acid (PLGA
), thatis a biocompatible
and biodegradable polymer approved by the
FDA
for human use, could be used as carriers
for cell transplantion.
Objective:
Theobjective of the present w
ork w
as todevelop PLG
A M
Pand engineered them
w
ith hA
DSC
sin
order to
facilitate cell
engraftment,
paracrine secretion
and differentiation into the required tissues.
Material and M
ethods:
MP
Formulation:
PLGA
MP
were prepared by
solvent evaporation
method
usingthe
Total R
ecirculation One-M
achine System (TR
OM
S) [4, 5]. Several device settings w
ere adjusted to obtain m
icroparticles of a certain size (10 m
). The
following
TRO
MS
parameters
were
adjusted during
microparticle
preparation: pum
ping flow, recirculation tim
es to form W
1 /O
and W1 /O
/W2 em
ulsions, and the inner diameter
of the needle used to prepare the W1 /O
/W2
emulsion. M
Psize w
ascharacterized
by laser diffractrom
etry using a Mastersizer.
hAD
SCs C
ulture:hAD
SC cells w
ere cultured incom
plete medium
containing-M
EM w
ith 10%
of fetal bovine serum and 1ng/m
L of bFGF at a
confluence of 80-90%.
Attachm
ent of AD
SCs
to particles:PLG
A M
P w
ere coated with three different am
ounts of collagen:
2. To achieve a hom
ogenous coating, MP w
ere re-suspended under agitation at 37ºC
for 2 h in the collagen solution.Finally, M
Pw
ith a biomim
etic surface of collagen
were seeded
with
two different
densitiesof
hAD
SCs
(200,000 and
100,000 cells) for the form
ation of thecom
plexes.
Results and
Discussion:
Microparticle Form
ulation:PLG
A M
P ranging from
0.9 to 24 m
were successfully prepared
usingTR
OM
S(Table 1). Particle size rem
ained unchanged
after lyophilisation.
Am
ong all
formulations, M
P with a size of 10
were
selected as scaffolds for the cells. This selection w
as made based on previous w
orks of our groupconsidering a balance betw
een having sufficient surface
for cells
adhesionand
not causing
damage to the heart tissue
[6, 7].The best
device settingsto obtain 10
-MP
were:flow
of 24 m
l/min, needles w
ith an average diameter
of 0,17m
m and recirculation tim
es of 90s and
60 s (Table 1).
Table 1: Sum
mary of form
ulations prepared using T
RO
MS.The table show
s the influence of TR
OM
S conditions on the final MP size. The
highlighted form
ulation corresponds
to the
formulation
selected for
the cell
attachment
experiments.
Needles:
N
has an
average diam
eter of 0.17m
m and A
0.5m
m.
87
The inner diameter of the needles is a critical
factor determ
ining the
final size
of m
icroparticles prepared by TRO
MS
(Table 1). A
reduction in particle size was observed using
the needle with the
smaller diam
eter.
Attachm
ent of hAD
SCsto PLG
A particles:
The concentration
of collagen
needed an
homogenous
coating was selected considering
the total
surface of
the particles
and the
adhesive properties of the cells. 0.5 mg of
collagencoated PLG
A M
Pw
ere mixed w
ith tw
o densities
of hA
DSC
cells
in com
plete m
edium.
The attached
cells w
ere observed
under the microscope after 1, 2, 3 and 4 h.The
best complex w
ere obtained seeding 200,000 2
of collagen
(Figure 1).
Figure 1: PLG
A M
P scaffold carrying AD
SCs.
Bright field m
icroscopy image of A
DSC
adhered to PLG
A-M
Ps coated with collagen after 2 hours
of adhesion.
Presently, cytokines influenced in heart tissue regeneration (i.e. neureguline), are being loaded into the developed M
P to combine the three
elements of the tissue engineering triad in the
same therapeutic approach.
Conclusion: A
biodegrable and biocompatible
PLGA
MP scaffold able to carry A
DSC
cells to the site of injury has been prepared
confirming
that PLG
A
MP
may
be exploited
in cardiovascular regenerative m
edical applications.
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, Juan de la C
ierva Program.
88
05
1015
2025
300 2 4 6 8 10
-Lap liberada (%)
tiempo (h)
-Lapliberada (%
) =0.18+0.26* tiempo (h)
r 2=0.9960, 1 and 39 f.d., F=4763.2,<0.01
LA
AD
MIN
ISTR
AC
ION
INT
RA
TU
MO
RA
L D
E B
ET
A L
APA
CH
ON
AD
IMIN
UY
E E
L
TA
MA
ÑO
TU
MO
RA
L Y
EL
IMIN
A L
A T
OX
ICID
AD
SISTE
MIC
A
P. Díaz-R
odríguez1,S. Seoane
2, J. Sendon-Lago2, R
. Gallego
3, R.
Pérez-Fernández2, M
. Landin1
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica,Universidad de Santiago de
Com
postela, España.2D
pto de Fisiología-Centro de Investigación en M
edicina Molecular y
Enfermedades C
rónicas (CIM
US), U
niversidad de Santiago de Com
postela,España. 3D
pto de Ciencias M
orfológicas, Universidad de Santiago de C
ompostela, España.
Introducción: La limitada efectividad de la
administración
quimioterápica
sistémica
conduce al empleo de dosiselevadasdurante los
tratamientos, ya
que solo una pequeña fracción del fárm
aco alcanza el tumor y realiza su
efecto terapéutico. A
demás, una im
portantecantidad
de fármaco
se distribuye a otros órganos y tejidos sanos generando efectos no deseados(1). La adm
inistración local en forma de sistem
as intratum
orales se
presenta pues
como
una atractiva alternativa a la hora de favorecer el éxito terapéutico y dism
inuir la toxicidad. La beta-lapachona
(Lap)
es una
naftoquinona natural
cuya actividad
antitumoral
ha sido
ampliam
ente demostrada. Sin em
bargo, no es una excepción en cuanto a la elevada toxicidad sistém
ica que se produce tras su administración
(2)por lo que el desarrollo de form
ulaciones intratum
orales que incluyan estefárm
aco está justificado.
Enun
trabajoprevio
hemos
estudiado la interacción entre los componentes
deform
ulacionesternarias
inyectables y
termosensibles
(Pluronic-Lap-R
MC
D)
capaces de generarsistemas depot en elinterior
del tumor
con perfiles de cesión de fármaco
controlados.La m
odelización mediante redes
neurales artificiales de la composición de estos
sistemas,
junto a
la optim
ización m
ediante algoritm
os genéticos ha permitido seleccionar
una formulación con las propiedades in vitro
adecuadas para administración intratum
oral (3).En este estudio hem
os evaluadola capacidad del
sistema ternario optim
izado para disminuir el
tamaño tum
oral in vivoen tum
ores de mam
a inducidos por inyección de células M
CF-7, así
como la
posible toxicidad sistémica tras
su im
plantación. M
ateriales y Métodos: La com
posición de la form
ulaciónse
obtuvo m
ediantela
modelización y posterior optim
ización de los parám
etros: tem
peratura de
gelificación,capacidad
de solubilización
defárm
acoy
constante de
liberación en
función de
la com
posición ternaria
del sistem
a utilizando
redes neuronales
artificialesy
algoritmos
genéticos (3).
El sistem
a optim
izado de
composición (19.2%
PF127 y 7% R
MC
D)
cargado y sin cargar con fármaco se caracterizó
en cuanto a capacidad de solubilización de -
Lap, propiedades reológicas y perfil de cesión
de fármaco
en PBS usando células de difusión
horizontales. La
actividadantitum
oral de
la form
ulación, así
como
el posible
efecto sinérgico
del Pluronic fueronevaluados frente a
la línea celular de cáncer de mam
a MC
F-7. Para ello se ha estudiado la proliferación celular m
ediante un kit comercial (M
TT),a los 2 y 4
días después
del tratam
iento. La
apoptosis celular
se estudióm
ediante citometría de flujo
usando el kit de detección de apoptosis Annexin
V-FITC
(BD
Biosciences)
yW
estern blot. La efectividad antitum
oral del sistema fue evaluada
in vivousando ratones hom
ocigotos para la m
utación com
binada severa
de deficiencia
inmune espontánea (SC
ID) a los que se le ha
inducido un
tumor
mam
ario m
ediante la
inyección subcutánea
de células
MC
F-7transfectadas con el vector luciferasa-pcD
NA
3, con el fin de estudiar la evolución del tam
año tum
oral por luminiscencia. Q
uincedías
después de la inducción del tum
or se administraron dosis
(14.17 Lap (
g)/peso ratón (g)) del sistema
intratumoral cada 5 días.La toxicidad hepática
y renal,
así com
o la
apoptosistum
oral se
evaluaron mediante inm
unohistoquímica.
Figura 1. Perfil de cesiónde
-Lap in vitroa
partir del sistema optim
izado
Resultados y
discusión: La formulación óptim
a es líquida a tem
peratura ambiente, presenta una
temperatura de gelificación de 29ºC
y solubiliza 1.90 ± 0.05 m
gde
-Lappor m
l, que a 37ºC se
cede de
forma
controlada(Figura
1). Estas
propiedades la hacen adecuada para una posible adm
inistración intratumoral. N
i el Pluronic ni la ciclodextrina m
odifican su actividad antitumoral
como
lo dem
uestran los
resultados de
proliferación celular y apoptosis.
89
Caspasa-3
activa(Tum
or)
PF127+
CD
-Lap+PF127+
CD
x10x10
x40x40
Figura 2.Detección inm
unohistoquímica de la expresión de caspasa-3 activa en tum
ores representativos de los ratones tratados con la form
ulación no cargada (izquierda)ycargada con fárm
aco (derecha).
La elevada hidrofobicidad del fármaco favorece
su transporte pasivo a través de la mem
brana celular lo que explica que no se observe ningún efecto
del Pluronic
sobre la
actividad antitum
oral.A
sí m
ismo,
la form
ulación optim
izada cargada
con -Lap
muestra
un elevado
nivel de
apoptosis celular,
incrementándose los valores de caspasa-3 activa
y disminuyendo los de pro-caspasa-3, m
ientras que con
el sistema sin cargar no se observa la
presencia del
factor apoptótico,
caspasa-3activa.Las
diferencias en
el tam
año tum
oral entre
tumores tratados con el sistem
a cargadode
fármaco
y el no cargado fueron estadísticamente
significativas a partir del día 15 de tratamiento.
Com
o se desprende de los cortes histoquímicos
de los
tumores
extraídospara
ambos
casos(Figura
2), la
actividad proapoptótica
del fárm
aco se mantiene in vivo
mostrándose un
marcado
incremento
de la
muerte
celular (células
teñidas de
marrón)
en los
tumores
tratados con la formulación optim
izadacargada.
Figure 3.
Tinciones hem
atoxilina y
eosina (H
&E) de tejido hepático de ratones tratados
con la formulación no cargada (izquierda) y
cargada con fármaco (derecha).
La figura
3 m
uestra los
cortes histológicos
correspondientes al
tejido hepático
de los
ratones tratadoscon la formulación no cargada y
cargada confárm
aco. Com
o puedeapreciarse,
no se
observan diferencias
en cuanto
a la
estructura del tejido, lo que implica ausencia
de toxicidad.
De
lam
isma
manera
los cortes
correspondientes al
tejido renal
tampoco
mostraron anom
alías, de lo que se deduce que la actividad del fárm
aco se realiza de forma local y
la formulación no presenta toxicidad sistém
ica.La form
ulación de -Lap diseñada y optim
izada m
ediante redes neurales artificiales y algoritmos
genéticos se
presenta com
o una
alternativa interesante
para el
tratamiento
de tum
ores sólidos ya que, es fácilm
ente inyectable, gelifica a tem
peratura corporal y es capaz de liberar una elevada dosis de fárm
aco localmente y por un
período de tiempo prolongado. Este sistem
a presenta
actividad antitum
oral in
vitro,increm
entando significativamente la m
uerte de células de cáncer de m
ama M
CF-7. Su actividad
se mantiene in vivo
disminuyendo de m
anera significativa
el tamaño tum
oral y promoviendo
la apoptosis tumoralsin que se observe síntom
as de toxicidad sistém
ica.R
eferencias:(1) E.P. G
oldberg et al. Intratumoral cancer
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munotherapy:
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Artificial N
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F. W
ang,et al..
Modulating
-lapachona release
from
polymer
millrods
through cyclodextrin
complextion.
J. Pharm
. Sci.
2006;95(10): 2309-2319.A
gradecimientos:
Este estudio ha sido financiado por la Xunta de
Galicia
(PGID
IT04BTF203011PR
)y
el M
inisterio de Economía y C
ompetitividad (SA
F 2012-
39878-C02-01)
P.D-R
(A
P2010-1913) agradece al M
inisterio de Educación, Cultura y
Deporte su financiación m
ediante la becaFPU
.
H&
E(H
ígado)
PF127+CD
90
SISTE
MA
S CE
RA
MIC
OS PA
RA
LA
LIB
ER
AC
IÓN
CO
NT
RO
LA
DA
DE
VE
GF:
INFL
AM
AC
IÓN
Y D
IFER
EN
CIA
CIÓ
N C
EL
UL
AR
P. Díaz-R
odríguez1,P. G
onzález2, J. Serra
2, M. Landin
1
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de Santiago de
Com
postela, España.2D
epartamento de
Física Aplicada. E.T.S.E. Industriales. U
niversidad deV
igo, España.
Introducción: La vascularización es un proceso clave en la osteointegración de las prótesis
ya que facilita la llegada de nutrientes, oxígeno, factores solubles y
células al
tejido en
formación
(1). La
incorporación de
factores de
crecimiento,
adhesión y
transcripción en
sistemas
implantables y su posterior liberación de form
a controlada debe facilitar
la recuperación de la función ósea (2). U
na de las alternativas más
prometedoras a la hora de desarrolla una nueva
prótesis es
la de
incorporar factores
de crecim
iento angiogénicos
que favorezcan
la form
ación de
nuevos vasos
yfaciliten
la recuperación de un tejido funcional. Entre ellos, el factor de crecim
iento de endotelio vascular (V
EGF)
es de
los m
ás utilizados
(3). El
mecanism
o de señalización intercelular de los receptores
de V
EGF
promueve,
además,
un increm
ento de
la m
asa ósea
y facilita
la restauración de la función del tejido
debido a la correlación
existente entre
osteogénesis y
angiogénesis (4). Las cerámicas de carburo de
silicio biom
órfico(bioSiC
s)se
fabricanm
ediante un sencillo procedimiento a partir de
recursos naturales,
manteniendo
la m
icroestructura jerárquica
biológicadel
material de origen.
Presentan una porosidad y tam
año de poro dependientes de la madera de
partida yun m
ódulo de Young sim
ilar al del hueso. En este trabajo se evaluó la carga y cesión de diferentes
bioSiCs
conV
EGF.
La biocom
patibilidad y la actividad biológica de estos
sistemas se
evaluó utilizando cultivos decélulas
madre
mesenquim
aleshum
anas obtenidas a partir de m
édula ósea. M
ateriales y
Métodos:
Los bioSiC
s se
fabricaron a partir de madera de pino (Pinus
pinnaster), roble
(Quecus
robur) y
sapelli (Entandrophagm
a cylindricum). La carga de los
sistemas con 380ng de rhV
EGF (PrepoTech) se
llevo a cabo mediante la adicción volum
étrica de una solución de
proteína en PBS y 0.1%
de seroalbúm
ina bovina (BSA
).Los perfiles de
cesión de VEG
F se obtuvieron en PBS (pH
7.4) con agitación constante y en m
edio de cultivo a 37ºC
en presencia de células. La cuantificación de
VEG
Fse
realizó m
ediante ELISA
(R
ayBiotech).
Las células
madre
mesenquim
ales se
obtuvieron generando
un gradiente con Ficoll(5), a partir de m
édula ósea donada
por el
servicio de
Ortopedia
del
Com
plejo H
ospitalario U
niversitario de
Santiago de Com
postela.La respuesta celular a los bioSiC
seestudió m
ediante el análisis de laproliferación
celular (M
TT) y
apoptosis (caspasa-3). Se evaluó la inflam
ación producida y
la posible
diferenciación celular
mediante
PCR
cuantitativa en tiempo real de los genes
que codifican para el TNF-
, el receptor 1 de V
EGF,la A
LP y el GA
PDH
. R
esultados y Discusión: La figura 1 m
uestra el perfil de liberación
de VEG
F en PBS con 0.1%
de B
SAcon el fin de evitar la degradación del
factor de crecimiento. C
omo se desprende de los
resultados experim
entales, se
consigueuna
cesión prolongada del factor de crecimiento
durante los cinco primeros días de ensayo sin
que se observe una brusca liberación inicial.Tras
este tiem
po la
cantidad de
proteína cuantificada por ELISA
se reduceposiblem
ente debido
a la
degradación del
factor de
crecimiento.
Este fenóm
eno no
se observa
cuando la liberación se realiza en el medio de
cultivoen el que probablem
ente, la estabilidad de la proteína se vea favorecida.
01
23
4060
80100
0 20 40 60 80
100
VEGF liberado (%)
tiempo (h)
Pino Roble Sapelli
Figura 1.Perfil de liberación de VEG
F en PBS pH
7.4 con agitación oscilante.
Los resultados
de proliferación
celular no
muestran
diferencias significativas
entre los
BioSiC
s cargados con VEG
F y los no cargados.Lo m
ismo ocurre cuando se com
paran cultivos de células m
adre mesenquim
ales en medios con
VEG
F y
sin V
EGF,
lo que
indica que
la presencia
del factor
VEG
F no
favorece la
proliferación celular
de las
células m
adre m
esenquimales,
ni cuando
se encuentra
adsorbido en la superficie cerámica ni cuando se
incorporaen form
a de solución. La evaluación de la apoptosis se ya ha llevado a cabo cuantificando los niveles de caspasa-3, una enzim
a proteolítica,
clave en
fase final
del proceso
de apoptosis
(4). C
omo
se puede
91
observar en la figura 2, los niveles de apoptosis en las m
uestras no son significativamente m
ás elevados que los del control negativo (células cultivadas
sobre pocillo)
y control
positivo (células en presencia de la m
isma dosis de
VEG
F pero en el medio de cultivo).
Control -Control +
PinoRoble
Sapelli0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
caspasa-3 (ng/ml)
Figura 2.
Niveles de caspasa-3 obtenidos tras 48
horas de cultivo El control negativo se corresponde a células cultivadas con m
edio de cultivo solo y el control positivo a células cultivadas con m
edio de cultivo enriquecido con V
EGF.
Lapotencial diferenciación de las células m
adre a células endoteliales vasculares y su efecto sobre
una posterior
diferenciación hacia
osteoblastos se llevó a cabo mediante la técnica
de PC
R
cuantitativa en
tiempo
real. Se
seleccionó como gen control el G
AD
PH (6). La
expresión de uno de los receptores de VEG
F específicos de células endoteliales sanguíneas (receptor1
de V
EGF;
VEG
FR-1)
(4)se
cuantificó en
función del
control positivo
(expresión de VEG
FR-1 de células con 380ng
de VEG
Fen el m
edio de cultivo)a los 5 días de acuerdo con el m
étodo C
t (6). Los
resultados experim
entales (Figura
3)indican que la liberación sostenida de V
EGF a
partir de
los bioSiC
s prom
ueve de
manera
satisfactoria la
diferenciación hacia
células endoteliales. A
demás, la adicción del factor de
crecimiento en form
a de solución no favorece la diferenciación (nivel de expresión 1) m
ostrando niveles de expresión sim
ilares a los del control negativo. Los resultados de expresión de TN
F-,
cuya presencia al igual que la IL-1
favorece la resorción ósea e induce la diferenciación hacia osteoclastos,
no m
uestranvalores
estadísticamente
diferentes a
los del
control negativo, lo que indica que los discos de carburo de silicio cargados no inducen una respuesta inflam
atoria en
las células
madre
mesenquim
ales. La
inducción hacia
osteoblastos se
evaluó m
ediante la cuantificación de la expresión de un gen asociado a osteoblastos, la fosfatasa alcalina (A
LP). De acuerdo con los resultados obtenidos
la expresión de ALP tras 10 días de cultivo tanto
en las células cultivadas con VEG
F en el medio
como las cultivadas en presencia de bioSiC
presenta el mism
o nivel de expresión que el control negativo, lo que indica que no se induce la diferenciación a osteoblastos.
PinoRoble
SapelliControl -
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0
VEGFR1( Ct)
Control +
Figura 3.
Niveles
de expresión
de V
EGFR
1 norm
alizados en función de la expresión del control positivo.
Todos los
bioSiCs
producidos incorporan
y liberan
de m
anera controlada
VEG
F, con
adecuada respuesta
celular y
sin diferencias
significativas entre
ellos. Estos
materiales
cargados inducen la diferenciación de células m
adre mesenquim
ales a células vasculares, no provocan
alteración significativa
en los
marcadores
de inflam
ación pero
tampoco
facilitan su diferenciación a osteoblastos.R
eferencias:(1) E. W
ernike et al. VEG
F incorporated into calcium
phosphate ceram
ics prom
otes vascularisation
and bone form
ation in vivo, European Cells and M
aterials 19: 30-40 (2010).(2) J.R
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edia in the isolation of marrow
derived
human
mesenchym
al stem
cells
with
osteogenic potential, Chang G
ung Med J 32: 264-275
(2009).(6) H
.D. V
anGuilder et al., Tw
enty-five years of quantitative
PCR
for
gene expression
analysis, B
ioTechniques 44 (5): 619-626 (2008).A
gradecimientos:
Este trabajo
ha sido
financiado por
el proyecto
FEDER
PO
CTEP0330IB
EROM
AR
E1. P.D
-R(A
P2010-1913) agradece al Ministerio de
Educación, C
ultura y Deporte su financiación m
ediante la beca FPU
. Agradecem
os la colaboración deR
. Couceiro
en el suministro y m
anipulación de las células madre
mesenquim
ales.
92
APL
ICA
CIÓ
N D
E L
A IC
H Q
8 A L
A V
AL
IDA
CIÓ
N D
E L
IMPIE
ZA: E
SPAC
IO D
E D
ISEÑ
O.
W. R
ezquellah1,E. G
arcía-Montoya
1-2,P. Pérez-Lozano1,2, A
.Fàbregas 1,2,C. C
arrillo2, J.M
. Suñé -N
egre1-2, J.R
. Ticó1-2, M
. Miñarro
1-2
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de B
arcelona, España2Servicio de D
esarrollo del Medicam
ento, Facultad de Farmacia, U
niversidad de Barcelona, España
Introducción: La validación de la lim
pieza es un tema de
cumplim
iento im
prescindible en
el entorno
GM
P de fabricación de medicam
entosy m
ás aún en una planta piloto donde se desarrollan productos en investigación (PEI) que pudieran llegar a form
ar parte de un ensayo clínico. Los factores
particulares de
la producción
de m
edicamentos en una planta piloto (equipos
multiproducto, diferentes
principios activos con distintas
propiedades físico-quím
icas o
toxicológicas o de seguridad, fórmulas nuevas
no repetitivas, lead time de desarrollo, etc.)
hacen que la operación de limpieza en la planta
piloto se
haya tom
ado com
o una
consigna fundam
ental a cumplir para poder asegurar la
calidad de los productos elaborados, la ausencia de contam
inación cruzaday
una demostración
de la consistencia del proceso de limpieza y por
ende de fabricación (Ref. 1-3).
Materiales y M
étodos: Con el
fin de determinar el m
étodo óptimo de
limpieza
de losequipos de fabricación en la
planta piloto
SDM
, se
ensayaron varios
procedimientos
de lim
pieza utilizando
diferentes condiciones
basadas en
cuatro factores
principales: la
temperatura,
la concentración
del detergente,
tiempo
de contacto del detergente sobre la superficie y laacción m
ecánica o el frotado (tabla 1).Estos
factores se dedujeron a partir de los métodos de
limpieza utilizados en
la planta piloto. Para determ
inar las condiciones se llevó a cabo un diseño de experim
entos (DoE) para deducir las
interacciones y
factores principales
que pudieran resultar significativos en la operación.
FactorN
ivelInferior
Nivel
Su periorD
etergente (%)
0,010,0
Tiempo de contacto
(min)
0,010,0
Temperatura
(ºC)
34,070,0
Acción m
ecánica (min)
0,01,0
Tabla 1.Factores principales del procedim
iento de lim
pieza bajo estudio.
El equipo utilizado para la validación se dedujo a partir del análisis de riesgos previo realizado con
todos los
equipos de
la planta
piloto: m
áquina de compresión R
IVA
(8 punzones).
Para el análisis del equipo se escogieron 8 puntos que se consideraron críticos, incluyendo 3
accesiblesy
5 de acceso difícil. Para ello se utilizó una plantilla de 25 cm
2, para aquellos puntos
que tenían
un tam
año y
forma
adecuados, para
el resto
se m
uestreó por
completo la superficie (figuras 1 y 2).
Figura 1.
Pieza de
Figura 2.
Placa de
apertura (5,5 cm2)
protección (25 cm2)
Para cada muestreo, se utilizaron 2 sw
abstipo
Texwipe75, el prim
ero mojado
en solución y el segundo
seco, siguiendo
el patrón
que se
muestra en figura 3.
Figura 3.
Esquema
del procedim
iento de
muestreo
de residuos.
La respuesta estudiada fue el nivel de residuos del A
PI indicador que se calculó previamente
(4). La especificación se calculó utilizando el criterio del um
bral de preocupación toxicológica (5)y el resto de m
étodos habituales (6-8), con lo cual el lím
ite a cumplir fue 0,4
g/cm2.
Elanálisis se realizó porH
PLC (4).
InicioFin
Inicio
Fin
Darle la vuelta al sw
ab
93
Resultados y D
iscusión: El
grafico de
Pareto (Figura
4) obtenido
mediante el program
a estadístico Statgraphicsm
ostró que
ningún factor
afectabasignificativam
ente a
la cantidad
deresiduos
remanentes, aun así el factor m
ás importante
para retirar los residuos fuela com
binación (C
D) de tem
peratura (C) y acción m
ecánica (D)
y de los factores individuales el (B) tiem
po de contacto. Figura 4.Efectos estandarizados.
Concretam
ente el
tiempo
de contacto
(B)
influye positivamente en el resultado, es decir a
mayor
tiempo
de contacto,
más
residuo se
detecta lo cual es lógico, al resecarse el residuo resulto m
ás difícil de retirar. En el caso de tem
peratura y acción mecánica la situación es
opuesta: combinando los dos factores en su
nivel alto podemos obtener m
enos residuos.
En la Figura 5 se relacionan los dos factores, tiem
po de
contacto y
concentración del
detergente: vemos que la m
enor cantidad de residuos
se encuentra
cuando m
enor concentración de detergente y m
enor tiempo de
contacto, es decir si se limpia inm
ediatamente.
Figura 5.R
esiduo según la variación de dosfactores: la concentración del detergente y la acción m
ecánica.
Com
o conclusión, puede decirse que, aunque no haya
ningún factor
que influya
significativamente en el nivel de residuo, según
el programa de tratam
iento estadístico de datos Statgraphics, se ha podido optim
izar el método
de limpieza, y el
método óptim
o recomendado
es el mostrado a continuación:
Factor
Nivel
Detergente (%
)5,0
Tiem
po de contacto (min)
0,0
Tem
peratura (ºC)
67,0
Acción m
ecánica (min)
1,0
Estas condiciones se han probado sobre tres equipos diferentes y se han m
uestreado sus puntos críticos para los A
PI con los que se estaban
trabajando, y
se ha
obtenido un
resultadode
aptopara todos ellos. C
on lo cual queda establecido el procedim
iento general para la lim
pieza de los equipos del SDM
.
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94
EFE
CT
O D
E L
OS C
OM
PON
EN
TE
S DE
LA
FOR
MU
LA
CIÓ
N E
N E
L T
AM
AÑ
O D
E
NA
NO
PAR
TÍC
UL
AS L
IPÍDIC
AS SÓ
LID
AS (SL
N™
) A
. Fàbregas 1,2,M. M
iñarro1,2, J.M
. Suñé-Negre
1,2, J.R. Ticó
1,2, E. García-M
ontoya1,2, P. Pérez-Lozano
1,2,R
. Sarrate2, N
. Sánchez2, C
. Carrillo
2
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de B
arcelona, España2Servicio de D
esarrollo del Medicam
ento, Facultad de Farmacia, U
niversidad de Barcelona, España
Introducción: Las
SLN™
constituyen
unsistem
a coloidal de tipo emulsión o/w
para uso com
o vectores no virales en vehiculización defárm
acos y/o
ácidos nucleicos.
Están com
puestas de
lípidos en
estado sólido
a tem
peratura fisiológica, los cuales debentener
el estatus
de lípidos
G.R
.A.S.
(Generally
Recognized As Safe).El tamaño m
áximo
para su endocitosis por células diana está alrededor de los 150 nanóm
etros de diámetro. En el caso de
vehiculización de
ácidos nucleicos,
estos pueden
quedar insertados
en el
interior del
lípido o
lípidos m
atriciales, o
unidos en
superfície, por lo que es necesario escoger el lípido
adecuado que
permita,
o bien
su liberación controlada en la célula diana
en el prim
er caso,
o evitar
la opsonización,
degradaciónenzim
ática o unión inespecífica a proteínas
plasmáticas,
en el
segundo. En
cualquier caso, es necesarioun lípido catiónico,
es decir, con carga positiva, que permita la
unión de DN
A o R
NA
, de carga negativa,m
ediante interacción electrostática. En el caso que se presenta, las SLN
™ se proponen com
o eventuales transportadores
de ácidos nucleicos. Se com
para el tamaño de partícula obtenido
usando como m
atriz lipídicaC
ompritol®
888A
TO (glicerol behenato) y Á
cido Esteárico. Se ha utilizado el
método de la m
icroemulsión en
caliente para
su obtención.
La estructura
einteracción entre
los diferentes lípidos debe evaluarse para conocer en qué grado pueden ser determ
inantes para
el tam
año de
partícula obtenido,
y por
lo tanto
en su
eventualcapacidad
para transfectar
eficientemente
células diana.
Materiales y M
étodos: C
ompritol®
888
ATO
(G
attefossé), Á
cido Esteárico
de origen
vegetal(M
erck), O
ctadecilamina
(Acros),
Lutrol®
68 (B
asf), A
gua ultrapura (Millipore).
Las SLN™
se obtienen por medio del m
étodo de
la m
icroemulsión
en caliente.
La com
posición en lípidos constituyeun 4%
del producto final.
El componente de la m
atriz lipídica
(Com
pritol®
888 A
TOo
Ácido
Esteárico)se calientaunos 10 ºC
por encima de
su punto de fusión. Se procede de forma análoga
para el
lípido catiónico
(Octadecilam
ina), m
ezclándolo con
Lutrol®
F68 (óxido
de polipropileno) com
o tensiactivono iónico,y
el
agua ultrapura.
El C
ompritol®
888
ATO
oÁ
cido Esteárico, según el caso,sevierten, una
vez fundidos,sobre el resto de componentes, y
la mezcla se agita m
ecánicamente
para formar
una emulsión. Posteriorm
ente,se vierte en agua fría (2-3ºC
) yse agita de form
a mecánica,
formándose las SLN
™.
Estasse concentran y
purifican m
ediante centrifugación
y filtrado,
respectivamente.
El tamaño de partícula
se analiza por triplicadopara
cada lote,
mediante
difracciónláser
(Mastersizer 2000, M
alvern Instruments), y se
expresacom
o diámetro
medio (D
[3,2]) en nanóm
etros (nm).
Resultados
y D
iscusión: Los
resultados de
determinación del tam
año de partícula para lasSLN
™ fabricadas con
Com
pritol® 888 A
TOy
Ácido
Esteáricocom
o m
atrices lipídicas
se m
uestran en la tabla 1.
LÍPIDOCompritol® 888 ATO
122Ácido esteárico
129
TAMAÑO DE PARTÍCULA (nm)D[3, 2]
Tabla 1. D
iámetro m
edio delas nanopartículas
obtenidas con los diferentes lípidos.
El valor de diámetro m
edio obtenido indica un m
ayor tamaño de partícula en el caso delÁ
cido Esteárico. Si se desglosa el intervalo entre 50 y 300
nm
en diferentes
tramos
se obtiene
el porcentaje de nanopartículas en cada uno de ellos, tal com
o se muestra en la tabla 2.
Su representación gráfica se m
uestra en la Figura 1.
Distribución según tam
año Com
pritol® ATO 888
Ác. Esteárico
50-100 nm27%
26%100-150 nm
26%24%
150-200 nm15%
14%200-300 nm
15%13%
T
abla 2.R
esultados para el tamaño de partícula
para los dos lípidos, representados como el
porcentaje para cada tramo respecto del total de
producto obtenido.
95
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9%
10%
Compritol® 888
Ácido esteárico
Figura 1.
Porcentajede
SLN™
fabricadas
utilizando C
ompritol®
888
ATO
y Á
cido Esteárico,
para intervalos
de tam
año de
partícula.
Para las
nanopartículas obtenidas
en cada
intervalo de tamaño, el m
ayor porcentaje lo form
an aquellas comprendidas entre 50 y 100
nm, ligeram
ente por encima del porcentaje de
nanopartículas entre 100 y 150 nm, tanto para el
Com
pritol® 888 com
o para el Ácido Esteárico.
El resultado es compatible con la necesidad de
conseguirSLN
™ no m
ayores de 150nm
, pues la m
ayor proporción de SLN™
se encuentra en el
rango adecuado.
Si se
representanlos
resultados de nanopartículas obtenidas entre 50-300 nm
tal como se m
uestran en la figura 2, aparece un perfil acam
panado y simétrico, a
modo de distribución gaussiana. El intervalo
que comprende nanopartículas entre 120 y 138
nm incluye
el porcentaje más elevado para los
dos lípidos(8,73%
), aunque el Com
pritol® 888
ATO
se ve ligeramente favorecido en cuanto al
porcentaje obtenido
respecto del
total de
producto.
Figura 2.Distribución del tam
año de partícula en porcentaje, dentro del intervalo de 50-300 nm
de
diámetro.
Las líneas
discontinuas
incluyen el tramo de tam
año con el mayor
porcentaje en nanopartículas.
Para com
probarsi
la diferencia
en tam
año m
edio de partícula es significativa entre ambos
lotes, se
realiza un
contraste de
hipótesis partiendo de los datos de la tabla 1.Puesto que el valor-P para la prueba (0,0128) es m
enor que el nivel de significación (0,05), se concluye que existe diferencia estadísticam
ente significativa entre un lote y
otro con un 95,0%
de nivel de confianza. A
sí, en
función de
los resultados,
es m
ás favorable
la utilización
de C
ompritol®
888
ATO
como m
atriz lipídica para la fabricación de SLN
™
en cuanto
a la
obtención de
nanopartículas de menor tam
año, puesto que posteriorm
ente se deberá tener en cuenta que el diám
etro medio aum
entará por la adición de la m
olécula de
DN
A/R
NA
, aunque
este increm
entodependerá básicam
ente del número
de bases de lasecuencia nucleotídica.
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er-based siR
NA
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er-based
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lipid nanoparticles (SLNs) freeze-dried w
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Pharmaceutics
and B
iopharmaceutics.
2007:67:320-328.
0%
10%
20%
30%
50-100 nm100-150 nm
150-200 nm200-300 nm
Compritol® ATO 888
Ácido esteárico
96
CARACTERÍSTICAS FARMACÉUTICAS DEEMULSIONES TÓPICAS DE
ROMERO
Beatriz C
onde Valentín
1,3,Am
alia Mª R
odríguez Bayón
1,2,Carm
ina Rodríguez Fernández
3,Mª Elvira Franco G
il 1
1. Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica.2. Grupo de B
iotransformaciones.
3. Departam
ento de Microbiología II.
Universidad C
omplutense
de Madrid.Plaza R
amón y C
ajal s/n. 28040-Madrid (España)
beatrizconde@pdi.ucm
.es; amalia@
farm.ucm
.es;carmina@
farm.ucm
.es;elvirafg@farm
.ucm.es
IntroducciónA
ctualmente, existe un interés creciente sobre el
uso de
compuestos
naturales que
muestran
actividad antioxidante
y conservante.
Los polifenoles obtenidos de diferentes plantas se encuentran entre estos com
puestos de origen natural, y m
uestran unas excelentes propiedades antioxidantes y antim
icrobianas [1]. Entre esas plantas, una de las que m
uestranm
ayor interés debido, a su elevado contenido en polifenoles, es el Rosm
arinus officinalis L.[2- 4].La
oxidación lipídica
y el
crecimiento
microbiano, en los productos farm
acéuticos y cosm
éticos, puede conllevar: a) alteraciones de sus características organolépticas, b) cam
bios en la estabilidad de los preparados, y c) pérdida de su actividad farm
acológicao cosm
ética, debido aalteraciones de
sus componentes activos.
Objetivos
1) Incorporar un extracto acuoso liofilizado de Rosm
arinus officinalis L.endos em
ulsionesO
/A
de aplicación
tópica. 2)
Com
parar las
características organolépticas
de am
bas em
ulsiones. 3) Estudiar la liberación de dicho extracto desde las dosem
ulsiones.
Materiales y
Métodos
Extracto
liofilizadode R
osmarinus officinalis
L.El extractoacuoso de Rosm
arinus officinalis L.liofilizado utilizado en este trabajo es un polvo am
arillo-anaranjado de baja densidady elevada
solubilidad acuosa, que debe protegersede la luz
debido a su carácter fotosensible. D
icho extracto de romero (ER
) fue obtenido a partir de las
hojas de Rosmarinus officinalis L.
por secado, pulverización,suspensión en agua
miliQ
estéril, calefaccióny filtración
[5]. Tras su liofilización
fuealm
acenadoa
-20ºC.,
resguardadode la luz, hasta su uso.
Form
ulaciones que contienenel extracto
de R
osmarinus officinalis L. liofilizado
El ER se form
ulóen
dos emulsiones O
/A(F1 y
F2) de aplicación tópica. La composición de la
formulación 1 (F1) es: V
aselina filante (40%),
Tefosé 1500(10%
), Tween 80
(5%), ER
(1%)
y agua destilada (c.s.p.100%). La form
ulación 2 (F2) está com
puesta por: Vaselina líquida (8%
), Labrafil 1944 cs
(3%), Tefosé 63
(15%), ER
(1%) y agua destilada (c.s.p.100%
).El extracto liofilizado (ER
), previamente reconstituido en
agua destiladahasta una concentración de 300
mg/m
L, fue incorporado enla fase acuosa de
cadaem
ulsión. Las emulsiones se elaboraron
siguiendo un
procedimiento
estandarizado de
temperatura y agitación [6].
Estudios “in vitro” de liberación del extracto de
Rosm
arinus officinalis L.Se investigó la liberación “in vitro” del extracto de rom
ero desde cada una de las emulsiones
O/A
. Para cada formulación se realizó un ensayo
a37ºC
, utilizando
tres celdas
de difusión
(superficie =
10,75 cm
2). En
cada celda
se colocaron 10 g de em
ulsión, como fase dadora.
Separando esta fase de la aceptora (150 mL de
solución amortiguadora fosfato-citrato pH
5,5) se colocó
una m
embrana
de celofán.
Sem
antuvieron las
condiciones “sink”
mediante
agitación constantea 100 rpm
. Se tomaron 18
muestras no repuestas (1
mL/m
uestra) de la solución aceptora a lo largo de
las 3 horasde
duración del ensayo. El ER liberado se cuantificó
por espectrofotometría
UV
(=279 nm
).
Resultados y D
iscusión E
studio de las características organolépticasSe estudiaron las características organolépticas de las dos form
ulaciones y se procedió a su com
paración. Form
ulación 1: La emulsión presenta un ligero
color amarillento, olor dulzón, tipo “cam
pestre”. Es bastante fluida, de fácil extensión, con cierta textura oleosa y, al aplicarla,deja
una sensación algo pegajosa. Su
aspecto es homogéneo.
Formulación
2: Ésta,
presenta ligero
color am
arillento, algo
más
brillante que
la form
ulación 1.
Mism
o olor
dulzón, tipo
“campestre”. Es ligeram
ente fluida, aunque más
consistente que la formulación 1. Se extiende
fácilmente, pero tarda bastante tiem
po en dejar de apreciarse en el lugar de aplicación, dejando un
ligero residuoblanquecino. Tam
bién presenta un aspecto hom
ogéneo.
Estudios de liberación “in vitro”
Formulación
1:El
porcentaje de
extracto liberado
desde cada
formulación,
frente al
tiempo de ensayo
(minutos) se representa en la
figura 1. Puede observarse que, al final del
97
ensayo, la formulación 1
ha liberadoel 4,57%
del ER
en ella contenido.
Figura 1:Porcentaje de liberación “in vitro”del
ERdesde am
bas formulaciones (F1 y F2)
y = 0,0227x + 0,5235 r = 0,9954
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
020
4060
80100
120140
160180
Tiempo de ensayo (m
inutos)
Liberación ER (%)
F1F2
Las ecuaciones obtenidas al ajustarlos datos de
liberación a las cinéticas de orden cero, Peppas e H
iguchi se muestran en la tabla 1. C
omo puede
apreciarse, el
mejor
ajuste corresponde
a la
cinética de orden cero(r = 0,9954)
liberándose el extracto a una velocidad constante de 23
g/min.
Tabla 1:C
inéticas de liberación del ER desde la form
ulación 1.
C
inética de orden cero(m
in; %)
Cinética de Peppas
(min; m
g)
Cinética de H
iguchi(m
in1/2;
mg/cm
2)
Ecuación
y = 0,0227x + 0,5235
y = 0,0020x0,5659
y = 0,0315x –
0,0355C
oeficiente de correlación
(r)0,9954
0,98720,9888
Formulación 2:Perm
itió la liberación de 2,35%
del extracto incorporado en la emulsión (figura
1).Los datos de liberación del extracto ER
se ajustaron a las cinéticas de orden cero, Peppas e H
iguchi.Las
ecuaciones de
estos ajustes
se m
uestran en la tabla 2. Com
o se puede observar, la cinética de Peppas perm
ite el mejor ajuste (r =
0,9951).Al cabo de las tres horas de duración del
ensayo, la
cantidad liberada
acumulada
normalizada por la cantidad inicial fue de 0,024
mg (figura 2).
Figura 2:Liberación “in vitro” del ERdesde la
formulación 2. C
inética de Peppas.
y = 0,0006x0,7070
r = 0,9951
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
030
6090
120150
180Tiem
po de difusión (minutos)
Cantidad acumulada a tiempo t/cantidad en emulsión a t=0 (mg)
Tabla 2: Cinéticas de liberación del ER desde la
formulación 2.
C
inética de orden
cero(m
in; %)
Cinética de Peppas
(min; m
g)
Cinética de H
iguchi(m
in1/2;
mg/cm
2)
Ecuación
y = 0,0126x + 0,2035
y = 0,0006x0,7070
y = 0,0190x–
0,0309C
oeficiente de correlación
(r)0,9912
0,99510,9948
Conclusiones
1. Las formulaciones y el proceso de elaboración
propuesto permiten la incorporación del extracto
acuoso liofilizado de Rosmarinus officinalis
L. en
dos em
ulsiones O
/A
de adm
inistración epicutánea. 2. El extracto dota
a la emulsión de particulares
características organolépticas,
especialmente
color (am
arillo parduzco)
y olor
(“dulzón, cam
pestre”).La form
ulación 2tarda m
ás en desaparecer del lugar de aplicación que la form
ulación 1y deja
unligero
residuoblanquecino,
pese a
tener m
enor contenido oleoso yla m
isma facilidad de
extensión que la formulación 1.
3. En
condiciones epicutáneas
de pH
y
temperatura las dos em
ulsiones muestran distinta
capacidad de liberación “in vitro” del extracto acuoso de rom
ero. La formulación 1 llega a
liberar el 4,57% del extracto en ella incorporado,
siguiendo una cinética de orden cero (velocidad de liberación = 23
g/min).
La form
ulación 2,
más
consistente que
laform
ulación 1, libera tan sólo el 2,35% del
extracto contenidoen ella siguiendo
una cinética de Peppas.
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B.,
Franco G
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Rodríguez Fernández, C
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Bayón, A
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SPLC-C
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ayón, A.M
.; Franco Gil, M
.E., Paños Pérez, I.M
. V SPLC
-CR
S-Local Chapter
Meeting (2002) Sevilla.
Agradecim
ientosB
.C.V
. agradece
al M
inisterio de
Educación, cultura y deporte por
la concesión de la beca FPU
2011(A
P2010-0818).
98
HIDROG
ELES PARA LA LIBERACIÓN
COLÓ
NICA DE ACETO
NIDO
DE TRIAMCIN
OLO
NA: ESTU
DIO
IN VIVO
EN M
ODELO
DE ENFERM
EDAD INFLAM
ATORIA CO
LÓN
ICA EN RATAS
M. Gago-Guillan1, V. Merino Sanjuan
2, F. J. Otero Espinar 1. 1Departmento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Santiago de Compostela, España.
2Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Valencia, España.
Introducción:Son
muchas las
patologías que
afectan a laúltima porción del tracto gastrointestinal,
entre las que podemos destacar enfermedades inflamatorias, del tipo de la colitis ulcerosa o la Enfermedad de Crohn
por su creciente incidencia en la población (1). En los últimos años, con el fin de mejorar su tratamiento, se ha avanzado en los conocimientos relacionados con la liberación selectiva de fármacos en
el colon.
Se han
desarrollado diferentes
formulaciones persiguiendo
principalmente dos
objetivos: conseguir una mayor concentración del fármaco en la zona dañada, con el consiguiente aumento del efecto, y la disminución de la absorción sistémica del fármaco en las primeras porciones del tracto digestivo, reduciendo de esta manera un gran número
de efectos
secundarios. Una
posible alternativa terapéutica para conseguir estos objetivosson las formulaciones basadas en la degradación enzimática
colónica. Entre
estos sistemas
se encuentran los hidrogeles de polisacáridos naturalescomo la goma Garrofina y la goma Xantana.Estos polímeros presentan una biocompatibilidad
elevada y en presencia de los fluidos corporales forman una red polimérica con la capacidad de retener al fármaco en su
interior, consiguiendo que apenas se libere fármaco en los primeros tramos del sistema digestivo. Una vez que el hidrogel alcanza el colon, la acción de las enzimas de la flora degrada la red polimérica, liberando la totalidad del fármaco retenido en el lugar de acción, con el consiguiente aumento del efecto
(2). El fármaco ensayado es el Acetónido de
Triamcinolona, un
corticoide con
efecto antiinflamatorio que presenta los efectos adversos a nivel sistémico típicos de este grupo farmacológico.Materiales y Métodos:M
ateriales :goma Xantana y Garrofina (Inagarbe),Acetónido de Triamcinolona (Fagron), TNBS (Sigma-Aldrich), etanol y propilenglicol (Merck).M
étodos:Elaboración de los com
primidos:Para la elaboración
de los comprimidos se han mezclado la Goma Xantana y la Goma Garrofina al 50%
. Aesta mezcla
se le
ha añadido
un 1%
de
Acetónido de
Triamcinolona. Sobre porciones de 500 mg del polvo obtenido se ha aplicado una fuerza de 7,5 toneladas durante 10 minutos en un punzón de infrarrojos de 1,3 mm de diámetro y con la ayuda de una prensa hidráulica Mega B20. Los comprimidos obtenidos fueron torneados utilizando una Dremel 3000
para darle forma capsular y ajustar el peso a los 30 ± 0,3 mg.Para los comprimidos placebo se ha seguido el mismo procedimiento sin la adición del fármaco.
Inducción de la inflamación colónica:Para el estudio
se han empleado ratas Wistar de 250 - 320 g de
peso.Para la inducción de la inflamación colónica se adormecen las ratas con isofluorano. Se introduce 8 cm de
una cánula adecuada por vía rectal y a través de ella,se administran 0,5 ml de una disolución de TNBS 0,13 M
disuelto en etanol al 50% (v/v). Tras la
administración las
ratas se
separan en
jaulas individuales. La dosificación del tratamiento ha sido de una administración diaria los días 3, 4 y 5 contados a partir de la inducción del proceso inflamatorio.A los 9 días se sacrifican
los animalespor sobredosis de pentobarbitaly se procede a la evaluación del daño. Diseño del experim
ento y evaluación de la actividad:El experimento se ajusta a un modelo multifactorial aleatorizado
con 5 factores que se corresponden con el
tratamiento recibido:
comprimido placebo,
comprimido con Acetónido de Triamcinolona, 30 mg de
espuma rectal Proctosteroid®
como formulación de referencia, 0,5 ml de una disolución de Acetónido de
Triamcinolona al
0,6%
en una
mezcla de
propilenglicol y suero salinoen proporción 80:20, y
0,5 ml de una disolución placebode la misma
composición que la anterior pero sin fármaco.Se han hecho 5 replicados para cada grupo de tratamiento.La actividad deltratamiento se evaluó
respecto al edema colónico
(relación peso colon/peso corporal el día
9), a la actividad mieloperoxidasa del tejido colónico
tras el
sacrificio y
a una
puntuacióncalculada
a partir del control diario de los animales teniendo en cuenta la perdida de peso, presencia de heces y su aspecto, y presencia de sangrado.
CONTROLRANGO
PUNTOS
% PESO
PERDIDO
<1%0
1-5%1
5-10%2
10-20%3
>20%4
ASPECTO HECES
Heces abundantes y formes0
Heces blandas2
Heces líquidas o ausencia4
PRESENCIA SANGRE
Ausencia0
Sangre en heces2
Sangre abundante en heces4
Tabla 1:Correspondendia de valor de
puntuacióncon las observaciones diarias.La actividad mieloperoxidasa se ha medido por elmétodo descrito en el trabajo de C. Mura (3) con alguna modificación: la reacción se detuvo con la adición de 15
l de H2 SO
4 2N y la longitud de onda de lectura en el lector de placas ha sido de 450 nm.Para el calculo de
puntuaciónse ha tenido en cuenta
tres parámetros: el porcentaje de pérdida de peso
99
con respecto al día 0, prensencia de heces y aspecto de las mismas en la jaula, y presencia o ausencia de sangre. Se ha preestablecido unos rangos para para cada uno de los parámetros control (Tabla 1) para asignarles un valor
numérico, así se obtiee una puntuación
entre 0 y 12, indicativa del grado de la enfermedad,
correspondiendo el
valor 0
a la
ausencia de la misma y el 12 al mayor grado de inflamación.Resultados y Discusión: Tal como se observa en la figura 1 se ha obtenido una gran variabilidad en la respuesta para las diferentes formulaciones estudiadas, probablemente causado por una respuesta muy variable obtenida para
la inducción
de la
inflamación entre
los diferentes animales.
PUN
TUAC
IÓN
comp pla
comp ta
espuma
sol ta
sol pla
0 2 4 6 8 10
EDEM
A CO
LON
ICO
comp pla
comp ta
espuma
sol ta
sol pla
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
colon/peso corporal (mg/g)
MIELO
PERO
XIDASA
comp pla
comp ta
espuma
sol ta
sol pla
0
200
400
600
actividad MPO (ng/ml)/g de tejido
Figura 1.Valores de puntuación, edema colónico y de
actividad mieloperoxidasa
para los
distintos grupos de tratamiento al noveno día
de la inducción de la inflamación.
Ello no
ha permitido
obtener diferencias
estadísticamente significativas entre grupos, si bien se han observado ciertas tendencias que será necesario corroborar. Atendiendo a los resultados obtenidos para la puntuación,que se muestran en la Figura 1, podemos observar que con los hidrogeles de Xantana/Garrofina conteniendo Triamcinolona se obtiene
el valor
mas bajo,
lo que
indica una
sintomatologíamas leve en comparación con los
tratamientosespuma rectal y solución. Ocurre lo
mismo para la evaluación del edema colónico, los hidrogeles
con Acetónido de Triamcinolona son los que tienen el valormas bajo
para la relación peso de colon/peso corporal, lo que indica que la agresión de la inflamación sobre los tejidos ha sido la menor de todos
los tratamientos
ensayados. La
actividad mieloperoxidasaobtenida para todos los tratamientos ha sido reducida y
en todos los casos se han obtenido valores muy próximos al obtenido en tejido sano.Los resultado obtenidos con los hidrogeles, en los parámetros
evaluados, son
similares a
los encontrados por C. Mura et al. (3)en la evaluación de la actividad de micropartículas conteniendo 5-ASAe inferiores a los que obtiene en los animales sin tratar. Aunque es necesario analizar los resultados con cierta cautela, dada las diferencias en el tiempo de ayuno empleado durante la etapa de inducción del edema en ambos estudios, la comparación puede se
orientativa. Llama
la atención
los valores
obtenidos para
los factores
con los
hidrogeles placebo, en todos los casos bastante similara los hidrogeles con TA. Una de las causas puede ser la propia degradación de los polisacáridos naturales a nivel colónico dando lugar a derivados del ácido araquidónico que ha demostrado poseer propiedades protectoras
de la
mucosa del
colon. Estos
polisacáridos se encuentran en el grupo denominado fibra saludable.Sin embargo, para a poder confirmar y compararla actividad antiinflamatoria de estas formulaciones sería necesario ampliar el número de la población de animales empleado en el estudio.
Referencias:1. Armada, P.C., García-Mayor, R.V., Larrañaga, A., Seguín, P. “Prevalence and incidence of Crohn's disease in Galicia, Spain”. Medicina Clinica, 130 (18), pp. 715 (2008).2. Gago Guillan, M. et al. “Evaluación de hidrogeles a base de polisacáridos naturales como sistemas de liberación de fármacos”. X Congreso de la SEFIG 2011, Madrid3. C Mura et al. “N-Succinyl-chitosan systems for 5-aminosalicylic acid colon delivery: In vivo study with TNBS-induced colitis model in rats”.
International Journal of Pharmaceutics 416 (2011) 145-154.
Agradecimientos:
Programa Isabel Barreto de la Xunta de Galicia y Ayudas de movilidad del MEC para programas de Doctorado con Mención hacia la excelencia. Al Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Valencia.
100
MIC
RO
PAR
TÍC
UL
AS D
E N
EV
IRA
PINA
Y A
LG
INA
TO
CÁ
LC
ICO
:E
LA
BO
RA
CIÓ
N Y
EST
UD
IOS
IN V
ITRO
. P.G
andía, I. Usach, V
. Melis, J.E.Peris.
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de V
alencia, España.
Introducción:La infección causada por el VIH
no
tiene cura,
pero algunos
medicam
entos retrasan
o frenan
la progresión
de la
enfermedad,
siendo el
cumplim
iento del
paciente decisivo para mantener la carga viral
plasmática
indetectable. El
tratamiento
de elección en el m
omento actual consiste en una
combinación de, al m
enos, tres fármacos, por lo
queun factor im
portante en la adherencia al tratam
iento es
la com
odidad en
la adm
inistración.La
nevirapina (N
VP)
es un
fármaco
antirretroviral empleado
en el tratamiento de la
infección por VIH
en combinación con otros
antirretrovirales. La
pauta habitual
de adm
inistración de NV
P en adultos es de un com
primido
2 veces
al día,
por lo
que la
obtención de
un preparado
de liberación
sostenida podría reducir la pauta a 1tom
a diaria y facilitar el cum
plimiento de los pacientes.
El objetivo de este trabajo ha sido la obtención, m
ediante gelificación iónica, de micropartículas
poliméricas
conteniendo N
VP,
capaces de
suministrar
una liberación
sostenida del
antirretroviral tras suadm
inistración oralcon el fin de dism
inuir la frecuencia de dosificación y favorecerla adherencia al tratam
iento.
Material y m
étodosElaboración
de las
micropartículas:
Se elaboraron diferentes lotes de m
icropartículas conteniendo N
VP m
ediante gelificación iónica de
alginato sódico concalcio, según el siguiente
esquema:
Figura 1. Esquema de elaboración de las
micropartículas.
Análisis m
orfológico y
determinación
del tam
año de
partícula:Se
observaron las
micropartículas m
ediante microscopía
óptica y electrónica, y
se determinó su tam
año mediante
unm
icrómetro.
Contenido
en nevirapina
y porcentaje
encapsulado:Se
extrajo la
NV
P de
las m
icropartículas con HC
l 0,1 N y se determ
inó su absorbancia a 315 nm
.
Perfil de liberación in vitro:Los ensayos de
liberación in vitro se efectuaron en un aparato tipo II (paletas) según U
SP, a 37 °C ± 0,5 °C
,con una
velocidad de rotación de 50 rpmy 200
mL de m
edio de disolución. Se ensayaron 35 m
g de micropartículas en 6 m
edios: pH 1,2;
tampón
de fosfatos 50m
MpH
6,8; tampón de
fosfatos 10m
MpH
6,8; tampón
TRIS
50 mM
con 0,9% de
NaC
l pH6,8;
medio de H
ank´s (H
BB
S) pH 7,4
y agua destilada.La cantidad de
NV
Pdisuelta a los tiem
pos de m
uestreo se determinó m
ediante medición de la
absorbancia a 315 nm (m
edio con pH 1,2) y 282
nm (m
edioscon pH
6,8 y 7,4).A partir de las
curvas de
disolución se
determinaron
los siguientes
parámetros:
tiempo
de disolución
50%(TD
50%),
tiempo
de disolución
70%(TD
70%)y tiem
po medio de disolución
(MD
T).M
étodos estadísticos:
Se em
pleó el
test A
NO
VA
de un factorseguido de la prueba de
Tukey. Se
consideró una
diferencia estadísticam
ente significativa cuándo el nivel de significación fue inferior a 0,05.
Resultados y discusión
Micropartículas
de alginato
cálcico y
Nevirapina:
Las m
icropartículas presentaron
una form
a ovalada,
de superficie
rugosa y
coloración blanco-amarillenta
(Figura 2).
Figuras 2a y 2b.Imágenesde las m
icropartículas obtenidas m
ediante microscopia óptica
(izqda.) y electrónica (dcha.).
El tamaño m
edio delas m
icropartículas fue698
±27
m (Figura 3).
Figura 3.Histogram
a del tamaño de 100
micropartículas.
101
En la tabla 1 se recogen los resultados de encapsulación
obtenidos para
6 lotes
representativos. Las micropartículas obtenidas
presentaron una
riqueza del
7,99%
y perm
itieron la encapsulación de una elevada proporción de la N
VP inicial, con un valor
superior al 85%. A
síde los 10 mg iniciales de
NV
P, solo 1,45 mg quedaron
sin encapsular, encontrándose una parte (0,89 m
g) en el medio
acuoso utilizado para la gelificación y el resto adherido al m
aterial empleado en la elaboración.
Tabla 1.R
esultados de los ensayos de encapsulación de N
VP en
micropartículas de alginato cálcico.
M
icropartículas
Lote M
asa Total (m
g) Riqueza (%
) N
VP encapsulada
(mg)
NVP respecto inicial (%
)
1 94,6
8,47 8,01
80,1 2
107,07,69
8,23 82,3
3116,2
7,718,96
89,64
118,17,94
9,38 93,8
5 109,1
7,58 8,27
82,7 6
98,9 8,57
8,48 84,8
Media 107,3 ±
9,3 7,99 ± 0,43
8,55 ± 0,52 85,53 ± 5,15
Ensayos de liberación in vitro:la N
VP
se disuelve rápidam
ente en los distintos medios de
disoluciónutilizados, encontrándose el 100%
disuelto antes de los 5 m
inutos. Sin embargo,
las micropartículas de N
VP presentan diferentes
velocidades de disolución según el medio de
disolución ensayado (Figura 4).
Figura 4.Curvas de disolución correspondientes a
las micropartículas de N
VP
para cada medio de
disolución ensayado.
En la tabla 2 se recogen los valores de TD50%
, TD
70% y M
DT. A
pH 1,2, la disolución fue
muy rápida, con un valor TD
70% = 0,7 h, y
también fue rápida la liberación al em
pleartam
pón fosfato 50 mM
a pH 6,8 (TD
70% = 1,9
h). Sin embargo, la liberación en agua destilada
fue muy lenta (TD
70% > 30 h). La liberación
rápida a
pH
1,2 puede
atribuirse a
la protonación
de los
grupos carboxílicos
del alginato, con lo que se im
pide la interacción iónica con los iones calcio y se favorece la desestructuración
de las
micropartículas.
Sin
embargo, a pH
6,8 el alginato se halla ionizado, por lo que debería m
antenerse la estructura de las
micropartículas
durante un
tiempo
prolongado por acción de los iones calcio. La relativam
ente rápida disolución de NV
P a partir de las m
icropartículas al emplear
tampón de
fosfatos 50
mM
puede
atribuirse al
efecto secuestrante del ion
fosfato sobre los iones calcio, que se traduce en una desestructuración de las m
icropartículas y una rápida disolución de N
VP. D
e hecho, el empleo de tam
pón de fosfatos con una m
enor concentración (10 mM
) enlentece
significativamente
la liberación
de N
VP (TD
70% = 5,4 h), obteniéndose perfiles de
liberación sem
ejantes cuando
se em
plean m
edios de disoluciónlibres de fosfato, com
o el tam
pón TRIS o H
BSS.
Tabla 2.Tiem
pos de disolución 50%
, 70%
y tiempo
medio de disolución (m
edia ± d.e., n = 4). En la últim
a columna se indica el resultado de la
comparación estadística.
Parám
etros M
edios de Disolución
TD50% (h)
TD70% (h)
MDT (h)
pH 1,2 0,4 ± 0,1
a 0,7 ± 0,2
a 0,56 ± 0,12
a pH 6,8 50m
M
Fosfatos 1,4 ± 0,2
b 1,9 ± 0,4
b 1,46 ± 0,30
b
pH 6,8 10mM
Fosfatos
3,9 ± 0,3c
5,4 ± 0,3c
4,54 ± 0,24c
pH 6,8 50mM
TRIS + N
aCl 2,6 ± 0,1
d 4,6 ± 0,3
d 3,67 ± 0,13
d
HBSS 3,1 ± 0,2
e 5,6 ± 0,3
c 4,30 ± 0,16
c AGU
A 20,7 ± 1,5
f > 30
--- Sig. estadística
p < 0,001 p < 0,001
p < 0,001
---: No se pudo determ
inar. a,b,c,d,e,f: Los valores con distinto superíndice son estadísticam
ente diferentes.
Conclusiones
Se han elaborado micropartículas de alginato
y nevirapina,con un tamaño m
edio de 698 m
y una riqueza media en nevirapina del
7,99 %, em
pleandouna m
etodología simple
y reproducible. Las
micropartículas
liberan la
nevirapina m
ás rápidamente a un pH
fuertemente ácido
(pH 1,2) que a valores de pH
próximos a 7.
No obstante, la com
posición del tampón
empleado en los ensayos de disolución in
vitrocondiciona
en gran
medida
la liberación del fárm
aco, favoreciéndose la liberación en presencia de concentraciones relativam
ente elevadas de fosfatos.
Bibliografía
Panel on antiretroviral guidelines for adult and adolescent.
Guidelines
for the
use of
antiretroviral agents in HIV
-infected adults and adolescents. D
epartment of H
ealth and Hum
an Services. M
arch27, 2012.
102
Microcápsulas E
laboradas Con A
lginato Modificado C
on RG
D: D
esarrollo D
e Materiales B
iomim
éticos Para La M
ejora Del C
omportam
iento Celular.
A.G
arate1,2,E. Santos 1,2 , G
Orive
1,2, R.M
. Hernández
1,2 , J.L. Pedraz1,2
1Grupo N
anoBioC
el, Laboratorio de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia,
Universidad del País V
asco (UPV
/EHU
), Vitoria, 01006, España.
2CIB
ER-B
BN
, Centro de
Investigación B
iomédica en R
ed.Bioingeniería, B
iomateriales y N
anomedicina, V
itoria, 01006, España.
Introducción:D
urante muchos años, se han
utilizado polím
eros y
biomateriales
para la
encapsulación celular,
siendo el
objetivo principal generar una m
atriz con capacidad para transportar las células de una form
a segura y eficaz
(1). Sin embargo, con el uso de estos
biomateriales inertes la viabilidad de las células
encapsuladas podría estar comprom
etida debido a la falta de interacción entre
el polímero y la
célula.El alginato es un polímero m
uy utilizado en esta tecnología y en estudios anteriores se ha com
probado que
la inclusión
del tripéptido
arginina-glicina-aspartato (RG
D), derivado de la
fibronectina, en las cadenas de alginato,puede increm
entar la
viabilidad, proliferación
y diferenciación por m
edio de la adhesión celular, m
ejorando así la funcionalidad del sistema.
Apesar de que se han realizado diferentes estudios para evaluar la eficacia del R
GD
en la mejora de
la funcionalidad de las células encapsuladas(2),
se han obtenido resultados diferentes en función del
tipo de
célula que
se encapsula
y la
proporción de
RG
D
que se
incorpora al
alginato.El
objetivo de
este estudio
es determ
inar el efecto de la incorporación de distintos porcentajes de residuos R
GD
en la m
atriz de
alginato utilizada
para la
encapsulación de
dos líneas
celulares, m
ioblastos C
2C12
secretores de
EPO
y fibroblastos B
HK
secretores de VEG
F. De esta
manera se pretende am
pliar el conocimiento del
comportam
iento celular
en m
icrocápsulas elaboradas con alginato m
odificado y ver los beneficios que se pueden obtener m
ediante la elaboración de este tipo de m
icrocápsulas.
Materiales y m
étodos:El alginato de baja
viscosidad y alto contenido en ácido gulurónico (U
PLVG
) fue
modificado
químicam
ente m
ediante la química de carbodiim
ida(3).
El núm
ero total deresiduos R
GD
por cada cadena de alginato, definido com
o grado de sustitución (D
S), fue modificado variando la concentración
del péptido RG
D en la reacción.Se prepararon
tres tipos de alginatom
odificado con diferentes grados de sustitución:D
S1 (0.112 mM
),D
S5 (0.56
mM
) y
DS10
(1.12 m
M).
Los m
ioblastos C
2C12
y los
fibroblastos B
HK
m
odificados genéticamente para secretar EPO
y
VEG
F respectivamente fueron encapsulados por
separado en
microcápsulas
elaboradas con
alginatosin m
odificar (RG
D D
S0) y alginato m
odificado con RG
D D
S1, DS5 y D
S10. Para la elaboración de las m
icrocápsulas se utilizóun
generador electrostático
y se
siguióel
procedimiento
descrito por
Lim
y Sun
con algunas m
odificaciones.
Figura 1.Imágenes de M
ioblastos (A) y Fibroblastos
(B) en m
icrocápsulas elaboradas con distintos tiposde alginato m
odificado con RGD
.Las im
ágenes fueron obtenidas con el m
icroscopio ópticolos días 0
y 30 .
La viabilidad celular se determinó de form
a cualitativa
mediante
la tinción
LIVE/D
EAD
(Figura1). El núm
eroexacto
de células vivas por cápsula fue analizado m
ediante citometría
de flujo,
utilizando “Trucount
tubes” para
determinar la cantidad exacta de células vivas y
empleando
el kitLIV
E/DEA
D para diferenciar
lascélulas vivas y muertas.La determ
inación de la cantidad de EPO
o VEG
F secretada se realizó utilizando los kits de ELISA
correspondientes.Para determ
inar la proliferación celular se llevó a cabo el estudio de la B
rdU (B
romoxiuridina),
análogo de
la Tim
idina.Para
analizar la
interacción célula-m
atriz se
examinó
el citoesqueleto
de las
células encapsuladas
mediante la tinción con F-actina.
103
Resultados y D
iscusión:En el caso de los
mioblastos
(Figura2A
)se observa un descenso
de la viabilidadcon el paso del tiem
po en todos los
tiposde
microcápsulas,
siendo aquellas
elaboradas con alginato modificado con R
GD
D
S1 las que presentan mayor núm
erode células
vivas el día 30 (p<0.001). En el caso de los fibroblastos (Figura 2B
), el grupo DS5 es el que
presenta una
mayor
viabilidad a
día 30
comparándolo
con los
gruposrestantes
(p<0.001).Los
estudios de
secreción del
producto terapéutico pusieron dem
anifiesto que en el caso de los m
ioblastos
Figura 2.Núm
ero de células vivas por cápsula en el caso de los m
ioblastos(A
) y en el caso de los fibroblastos (B
).
Figura 3.(A) Producción de EPO
(B) Producción de
VEG
F.
(Figura 3A
), las
microcápsulas
con m
ayor secreción
deEPO
son
las elaboradas
con alginato m
odificado con RG
D D
S1(p<0.05).En
el caso de los fibroblastos(Figura 3B
), las m
icrocápsulascon secreción m
ás elevada de V
EGF
son las
elaboradas con
alginato m
odificado con RG
D D
S5. Los resultados del ensayo de proliferación (datos no m
ostrados) corroboran
los obtenidos
en los
ensayos anteriores.
Figura 4.Tinción F-actina de las m
icrocápsulas elaboradas
con diferentes
tipos de
alginatos inm
ovilizando mioblastos
(A) y fibroblastos (B
). Las fotos fueron realizadas con el m
icroscopio confocal el día 30.
La tinción
de F-actina
permite
detectarla
presencia de elongaciones de los filamentos
celulares de los mioblastos, siendo éstas m
ás num
erosas al incrementar los niveles de R
GD
(Figura 4A
). En los fibroblastos (Figura 4B),los
resultados no fueron tan claros, probablemente
debido a los agregados celulares.
Conclusiones:
La densidad óptima
del péptido de adhesión ha resultado ser diferente en los dos tipos celulares, obteniendo la m
ayor viabilidad y producción del factor terapéutico
con el grupo R
GD
DS1 en el caso de los m
ioblastosy el
grupo RG
D D
S5 en el caso de los fibroblastos. Estos resultados ponen de m
anifiesto que la densidad óptim
a del ligando de adhesión RG
D
varía en función del tipo de célula, por lo que se requiere una evaluación individualizada con el fin de determ
inar la densidad óptima de R
GD
a incorporar en el alginato.
Referencias:
(1) de Vos
et al., Biomaterials
18:273-278, 1997. (2) O
rive Get al., J.C
ontrol.Release135: 203-
210, 2009. (3)R
owley et al.,Biom
aterials20:45-53, 1999.
Agradecim
ientos:Este proyecto ha sido parcialm
ente financiado por la U
niversidad del País Vasco (U
PV/EH
U)
(UFI 11/32). A
. Garate agradece al “G
obierno V
asco (D
epartamento
de Educación,
Universidades e Investigación)” por su beca
predoctoral.
104
Controlled delivery of N
euregulin-1 and Fibroblast growth factor-1 from
polymeric m
icroparticles in sm
all and large animal m
odels of myocardial infarction
E. Garbayo
1,F. Rocha
1,B. Pelacho
2, P. Diaz-H
erraez1,Sim
ón-Yarza T
1,J.J.Gavira
2,G. A
bizanda2,F.
Prósper 2, M.J. B
lanco-Prieto1
1Pharmacy and Pharm
aceutical TechnologyD
epartment, U
niversityofN
avarra, Spain2H
ematology, C
ardiology and Cell Therapy, C
linica Universidad de N
avarra and Foundation for Applied
Medical R
esearch, University of N
avarra, Spain.
Introduction:M
yocardial infarction (MI) is a
major health concern w
orldwide, and therefore,
extensive research has been performed to find
new
treatments.
Neuregulin-1
(NR
G-1)
and acidic-fibroblast
growth factor (FG
F-1) have been identified as factors involved in cardiac repair after M
I(1,2). H
owever, their in vivo
therapeutic value is limited due to their short
half-life and
high instability
after system
ic adm
inistration. An alternative strategy based on
the use
of biocom
patible and
biodegradable m
icroparticles (M
P), able
to release
the cytokines in a sustained and controlled m
anner could represent a valuable therapeutic approach.O
ur group
had explored
newtherapeutic
strategies for MI treatm
ent based on the use of M
P that will release different com
binations of cytokines
and factors involved in cardiac stem
cell activation(3,4). O
ne of these strategies is the
use of
NR
G-1-M
P and
FGF-1-M
P to
promote cardiac repair. The
efficacy of NR
G-1-
MP and FG
F-1-MP in a rat M
I model has been
recently assessed
demonstrating
that M
P prom
oted cardiac repair and improved cardiac
performance (4).
Objetive
The objectives of this work w
ere (1) To
characterize the
mechanism
sby
which
NR
G-1-M
Pand FG
F-1-MP im
proved cardiac perform
ance in
a rat
myocardial
infarction m
odel (2) To test the beneficial effect of NR
G-
1-MP and FG
F-1-MP
ina preclinical large
animal m
odel of ischemia-reperfusion.
Material and M
ethods:A
ll experiments w
ere perform
ed in accordance with the guidelines
established by the Research Ethical C
omm
ittee of
the U
niversity of
Navarra.
Preparation, characterization
and efficacy
assessment
of N
RG
-1-MP
and FG
F-1-MP
were
done as
previously described (4). To analyze the effect of grow
th factor loaded MP on resident cells as
well
as on
cardiac progenitor
cells im
munofluorescence
studies w
ere done.
Cardiom
iocytes in replication 1 week and 3
months
after treatm
ent w
ere identified
with
antibodies against the proliferation marker ki67
and cardiac troponine (cTnT). Six serial sections from
each animal w
ere analyzed for thenum
ber of cells ki67+ cTnT+ cells present in the infart
and peri-infart
zone.To
identify cardiac
progenitor cells 1 w
eek and 3 m
onth after treatm
ent, heart
sections w
ere stained
with
antibodies against the stem cell antigen c-kit and
CD
45 a blood-cell lineage marker. Six serial
sections from each anim
al were analyzed for the
number
of cells
C-kit+
CD
45- and
C-kit+
CD
45+ present in the infart and peri-infart zone.
To confirm the beneficial effect of grow
th factor loaded M
P in a large animal m
odel of MI, a
scale up of the MP preparation process w
as done.
Various
MP
formulation
parameters
(polymer
quantity, drug
loading…)
were
adjustedto preserve M
P size andto m
aintain or im
prove encapsulation efficiencies. Particle size w
as m
easured by
laser difractom
etry.Encapsulation efficiencies w
ere quantified by W
estern blot. Released cytokine bioactivity
was
evaluated in vitroby determ
ining the induction of H
9C2 cellproliferation.Efficacy of N
RG
-1-M
P and
FGF-1-M
P w
ere investigated
in a
preclinical model of chronic
MI. A
total of 24 m
inipigs were enrolled in the study. M
yocardial infarction w
as created by temporary balloon
occlusion of the LAD
coronary artery followed
by reperfusion.
One
week
after infarction,
animals
were random
ized divided into3 groups:
NR
G-1-M
P,FG
F-1-MP and N
on loaded-MP.
The NO
GA
®X
P Cardiac N
avigation System
was used to im
plant the MP in the infarcted
heart. Three months later pigs w
ere sacrificed to perform
histological analysis. Cardiac function
wasassessed by echocardiography and M
RI.
Results: To characterize the m
echanisms
by w
hich the
cytokine loaded
MP
exerted its
action, tissue cardiomyocyte proliferation w
as exam
ined by double imm
unostaining for cTnT and
Ki-67+.
Asignificant
increase in
the num
ber of adult cardiomiocytes K
i-67+
was
detected in the hearts treated with N
RG
-1, 3 m
onths post-treatment (Fig. 1).The num
ber of adult cardiom
iocytes in replication 1 week after
treatment w
ith NR
G-1 M
P is currently being evaluated.
105
Fig 1:
NR
G-1-M
P treatm
ent induces
cardiomyocytes proliferation.R
epresentative image
of a proliferating Ki-67+ adult cardiom
yocyte in the N
RG
1-MP group (cTnT: green; K
i-67: pink; Nuclei:
blue) and quantification of total double positive cells in the infarcted area of the four-treated groups, 3 m
onths post-injection.A significant highernum
ber of proliferative
cardiomyocytes
was
detected in
the N
RG
-1 group.
Furthermore, c-K
it +CD
45-progenitor cells w
ere also
detected in
the m
yocardium,
although tissue quantification did not show
significant differences
among
groups, 3
months
post-injection. H
owever, a significant increase w
as detected 1 w
eek post-implantation in the N
RG
-1-M
P group in comparison w
ith the NL-M
P control group (Fig. 2). A
ntibody staining of m
yocardium revealed that these progenitor cells
could be identified as isolated or clustered cells that
were
probably recruited
towards
the ischem
ic myocardium
.
Fig 2: NR
G-1-M
P treatment induces stem
cell hom
ing.c-Kit+C
D45-progenitor cells w
ere detected in the heart tissue (cK
it: red; CD45: green; N
uclei: blue) along the infarcted area, 1 w
eek after MP-
treatment. A
significant greater number of progenitor
cells was detected in the N
RG
1-MP group than in the
NL-M
P control
group. D
ata is
represented as
mean±SEM
, *P<0.05
and **P<0.01
vs. N
L-MP
control group.
The proposedgrow
th factor loaded MP strategy
tested in asm
all animal m
odelof M
Iw
as next tried in a large M
I animal m
odel. Regarding the
scale up of the MP preparation process,M
Pw
ereprepared
by TRO
MS w
ith a compatible size for
heart injection
of 5
m.
Concerning
to the
entrapment
efficiency, grow
th factors
were
efficiently encapsulated,
reaching values
of 77.6±12.3%
for FGF-1 and 92 ±8%
for NR
G.
Variations on the M
P parameters during the
scaling up process show
ed no effect on the particle
size.The
bioactivity of
the released
cytokines was evaluated in vitro
by determining
the induction of H9C
2proliferation. A
1.3 and 2.1-fold
increase in cell density was observed
when
stimulated
with
FGF-1
and N
RG
-1, respectively. Proliferation rates of cells treated w
ith the free-cytokines were sim
ilar to the ones released by m
icroparticles, indicating that both cytokines retained its biological activity after m
icroencapsulation.
NR
G-1-M
P, FG
F-1-MP
and non-loaded
MP
were
injected into
the infarcted
myocardium
using NO
GA
®X
P Cardiac N
avigation System1
week after the infarct.The long-term
functional efficacy of grow
th factor-loaded MP
treatment is
currently being
evaluated.N
ext, histological
studies will be perform
ed to fully characterize the effectiveness of the treatm
ent with
NR
G-1-M
P and FG
F-1-MP
Conclusions:
-C
ontrolled delivery of NR
G-1 and FG
F-1 from
MP prom
oted cardiac repair through activation of endogenous regeneration in a rat m
yocardial infarction m
odel.
-G
rowth
factor loaded
MP
have been
successfully scaled-up
to be
tested in
preclinical large animal m
odel of ischemia-
reperfusion.
References:
(1) Liu Xet al., N
euregulin-1/erbB-activation
improves
cardiac function
and survival
in m
odels of
ischemic,
dilated, and
viral cardiom
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Am
C
oll C
ardiol. 2006,
48:1439-1447.(2) Palm
en Met al., Fibroblast grow
th factor-1im
proves cardiac
functional recovery
and enhances
cell survival
after ischem
ia and
reperfusion. J Am
Coll C
ardiol. 2004, 44:1113-1123.(3) Form
iga FRet al., Sustained release of
VEG
F through PLGA
microparticles im
proves vasculogenesis
and tissue
remodeling
in an
acute myocardial ischem
ia-reperfusion model. J
Control R
elease. 2010,147:30-37.(4) Form
iga FRet al., C
ontrolled delivery of fibroblast
growth
factor-1 and
neuregulin-1from
biodegradable
microparticles
promotes
cardiac repair in a rat myocardial infarction
model
through activation
of endogeneous
regeneration. Submitted to JA
CC
.
Acknow
ledgments: Juan de la C
ierva Program,
CA
N, FU
N.
106
EM
PLE
O D
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AN
OSU
SPEN
SION
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IÓN
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EN
TE
S DE
CO
NT
AC
TO
ME
DIC
AD
AS
García M
illán E.,Quintans C
arballo M., C
abanasMontenegro S., O
tero Espinar F.J.
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Facultad de Farmacia. U
niversidad de Santiago de Com
postela.
Introducción
Las lentes de contacto han demostrado un interesante potencial
como sistemas
de liberación
controlada de
medicamentos, sobre todo para tratar afecciones oftálmicas de la zona anterior. Desde el punto de vista de los sistemas de liberación, las lentes blandas de contacto son hidrogeles y
se consideran
como insertos
oftálmicos insolubles
especiales.Habitualmente para incluir el fármaco en las lentes se incuban en una disolución acuosa de fármaco durante un período de tiempo suficiente para que se incorpore
la dosis
necesaria. Sin
embargo, dada
la naturaleza hidrofílica de los hidrogeles y de las soluciones de carga, los fármacos poco hidrosolublessólo pueden accederen dosis muy reducidas. El acetónido de triamcinolona (TA)es
un glucocorticoide
sintético con
elevada potencia
antiinflamatoria y efecto prolongadoque se emplea habitua-
menteen el tratamiento de patologías
oculares (1). Poseereducida hidrosolubilidad por lo que plantea problemas para ser incluido en lentes en dosis adecuadas. Para incrementar la
dosis y mejorarel control deliberación
de TAproponemos
el uso como medio de carga de nanosuspensiones de TA estabilizadas. Éstas permiten incrementar la solubilidad acuosa del fármaco y dado el reducido tamaño
desus
partícula puedenfacilitar su difusión a través de los poros del
hidrogelmanteniendo sus propiedades ópticas.
Materiales y métodos
Materiales
Lentes blandas de contacto desechables (Hilafilcon B, Bauch & Lomb). 2-hidroxietilmetacrilato (HEM
A, Merck), ácido metacrílico (AM, Merck), etilenglicoldimetacrilato (EGDM
A, Sigma-Aldrich). Irgacure® 2959 (CIBA), Poloxamer 407 (Pluronic F127 ®; 9.840 – 14.600 Da, Sigma-Aldrich),alcohol polivinílico (PVA; 30.000 – 70.000 Da. Sigma-Aldrich),TA (Fagron), acetona, (Panreac).
Elaboración de las lentes blandas de contacto de TA
Las lentes
blandas se
elaboraron mediante
foto-polimerización. Para ello se mezclaron los monómeros HEMA y AM con el agente reticulante EGDMA y el iniciador Irgacure 2959
en las proporciones indicadas La disolución resultante se inyectó en un molde. Los hidrogeles se forman por fotopolimerización al irradiar la disolución con luz ultravioleta durante 30 minutos. La lámina formada se introduce en agua hirviendo durante 15 min, se troquela en pequeños cilindros y se mantienen en agua limpia hasta la completa eliminación de los monómeros residuales.
Elaboración de nanosuspensionesde TA
Nos basamos en un método de precipitación controlada descrito en trabajo previo
(2)en el que se emplea se unamezcla Pluronic F127
®y PVA al 10% (p/v)como fase acuosa
y como fase organica una disolución del fármaco en acetonaal 0.1%
(p/v). Para obtener las nanosuspensiones con
diferentes contenidos en TA, se procedió a diluir las convenientemente. El contenido de principio activo
en las nanosuspensiones
se determino
mediante espectrofotometría
a 242
nm en
las muestras
convenientemente diluidas y filtradas (membranas de 0,45 m Sartorius®. El tamaño medio de partículas se determinó
utilizando el equipo Zetasizer Malvern (Nano ZS 6.0, Malvern Instruments).
Caracterización de SCLs
Transparencia óptica
Se determinó en las lentes después de ser cargadas con el principio activo. Para ello
las lentes de contacto se fijaron en la cara interna de una cubeta de cuarzo conteniendo agua milliQ
y se midió la transmitancia a una longitud de onda de 600 nm
(Espectrofotómetro UV-Visible de red de diodos Agilent 8453).
Determinación de la carga de TA en SCLs
Laslentes de contacto
fabricadas y lascomerciales se
sumergieron en las nanosuspensiones de TA durante 4 días. Pasado este tiempo, la cantidad de TA cargado por cada lente de contacto, se calculó por diferencia entre la cantidad inicial y la cantidad final de la solución de carga, determinada por espectrofotometría
UV a 242 nm. Los resultados se expresaron como la cantidad de
TA (mg) en cada SCLs entre el peso (g) de cada SCLs en su estado inicial.Cada ensayo se ha realizado por triplicado.
Ensayos de liberación de TA de SCLs cargadas
Las lentes de contacto cargadas con TA se introdujeron en un vial en el que previamente se añadieron 5 ml de fluido lacrimal simulado (6.7 g/l NaCl, 2.18 g/l NaHCO3, 1.38 g/l KCl, 0.084 g/l CaCl2•2H2O, pH 8). Los viales se colocaron en el incubador (VW
R Incubating Mini Shaker, pais) con una agitación orbital de 100 r.p.m. y una temperatura de 37°C .Se
tomaron muestras,
a intervalos
de tiempo
determinándose la
concentración de
TA mediante
espectrofotometría a 242 nm.Cada ensayo se realizó por triplicado.
Tabla 1. Composición de las lentes blandas fabricadas.
0%H20
20%H20
40%H20
HEMA6,218g
4,974g2,218g
EGDMA
0,095g0,076g
0,038gMA
0,103g0,082g
0,0412Agua
0g1,2mL
2,4mLIrgacure
0,0110,011g
0,011g
107
Resultados y discusión
050
100150
200250
0 5 10 15nanosuspensión
Disolucion
Nanosuspension
Disolución
Hilaficom
B
MA
200
g/ml
Ta mg/g lentilla
Figura 1. Cantidad de TA cargada por las lentes en función de la cantidad de fárm
aco contenido enel m
edio de carga
Enla figura 1 se muestra la capacidad de incorporación de
fármaco en las lentes de contacto en función de la cantidad presente en el líquido de carga. Los datos de carga de concentraciones menores de 20
g/ml corresponden a sistemas constituidos por disoluciones de TA, mientras que las superiores son las nanosuspensiones. Como se observa el
empleo de
nanosuspensionesmejora
de manera
significativa el fármaco incorporado en las lentes comerciales y
en las
fabricadas por
nosotros observándose
un incremento prácticamente lineal de la carga en función de la cantidad de fármaco en las soluciones/suspensiones.No se observan diferencias
en el TA cargado entre las lentes comerciales y las fabricadas por nosotros
Figura 1. Perfiles de liberación del TA a partir de las lentes com
erciales(superior)
y fabricadas
(inferior) con
las diferentes cargas.
Por otra parte todas las lentes cargadas con las disoluciones y
nanosuspensiones preservaron su transparencia óptica obteniéndose valores de trasmitancia a 600 nm para todas ellas superiores al 90%
.
En lafigura 2 se observan los perfiles de liberación
obtenidos con las diferentes lentes y cargas. La liberación a partir de las lentes comerciales se produce en su práctica totalidad en menos de 12 horas observándose diferencias significativas en función de la solución empleada para su carga, siendo mayor la liberación de las lentes cargadas a partir de nanosuspensiones de200
g/ml.
Las lentes MA 200 elaboradas son capaces de controlar la liberación de manera más efectiva y gradual observándose una liberación a las 12 muy inferior a las comerciales. En este caso a los 6 días las lentes continúan liberando principio activo.
En este
caso existe
también una
influencia significativa de la concentración empleada en el proceso de carga sobre la cantidad liberada, siendo nuevamente la cargada con nanosupensiones de
200 g/ml con la que se
consigue una mayor liberación, como consecuencia del incremento en la carga
Conclusiones
A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que el empleo de nanosuspensiones estabilizadas de TA como medio de carga permite incrementar de manera considerable la dosis de fármaco incorporado tanto
por las lentes comerciales como por las elaboradas para el estudio. Además las lentes cagadas con las nanosuspensiones dan lugar a mayores niveles de fármaco liberado durante tiempos más prolongados.
Es posible utilizar ambas lentes, las comerciales o las elaboradas como soporte para la liberación ocular de TA, siendo las comerciales más adecuadas si se necesita una liberación más rápida y las elaboradas más prolongada.
Agradecimientos:
El trabajo fue financiado por Ministerio de Ciencia e Innovación (MAT2009-14609-C02-02).
Referencias[1]
Jermak CM, Dellacroce JT, Heffez J, Peyman GA. Triamcinolone acetonide in Ocular Therapeutics. Survey of Ophthalmology. 2007; 52 (5): 503-522.[2]García Millán, E., Blanco Méndez, J., Otero Espinar, F.J. Elaboración
de nanosuspensiones
de acetónido
de triamcinolona mediante técnicas de precipitación controlada. X Congreso SEFIG, Madrid 2011.
024
4872
96120
144168
192216
240264
288312
336360
0 50
100
150
20050100200
(Saturado) 19
tiempo (h)
g TA
024
4872
96120
1440 50
100
150
20050100200
saturado (19)
tiempo (h)
g TA
108
OPTIMIZACIÓN DE LA CARGA Y LIBERACIÓN DE CORTICOIDES A PARTIR DELENTES BLANDAS DE CONTACTO DE
pHEMA MEDIATE MODIFICACIONESEN SU
COMPOSICIÓN
García Millán E., Koprivnik S., Otero Espinar F.J.
Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Universidad de Santiago de Compostela
IntroducciónLos avances en el desarrollo de las lentes
blandas de contacto han permitido
la carga defármacos en dosis
terapéuticas y controlar y mantener su liberación en el tiempo con el objetivo de mejorar la eficacia del tratamiento ocular por medio de una mayor biodisponibilidad, menor absorción sistémica y un mejor cumplimiento del régimen de dosificación.
Las lentes de contacto blandas son hidrogeles, una red reticulada
de monómeros
solubles en
agua. La base de muchos tipos de lentes de contacto blandas es el polihidroxietilmetacrilato
(pHEMA) reticulado
con etilenglicoldimetacrilato (EGDMA). Los hidrogeles pHEMA se caracterizan por un contenido
relativamente alto de agua, estabilidad
térmica y
química, propiedades
mecánicas moldeables y
permeabilidad al oxígeno, muy importantespara un uso seguro diario [1, 2].
En los hidrogeles, el fármaco se
incorpora a la red polimérica por un mecanismo de absorción, pero la falta de interacciones específicas limita tanto la cantidad de fármaco cargada como la capacidad de controlar la liberación [3].
El fármaco seleccionado para su estudio ha sidoacetónido
de triamcinolona(TA),
uncorticosteroide utilizado por su
acción antiinflamatoria endiversas patologías oculares como
alergias, uveítis o inflamaciones postoperatorias.
El objetivo de este trabajo ha sidola síntesis y optimización
dehidrogeles
de pHEM
A con
el fin
de mejorar
la propiedades de carga yliberación ocular de TA por medio de la
incorporación de
diferentes proporciones
de dos
comonómeros, ácido metacrílico (AM) y N-vinil-2-pirrolidona (NVP).
Materiales y métodos
Materiales
2-hidroxietil metacrilato (pHEMA), ácido metacrílico (AM) y
N-vinil-2-pirrolidona (NVP) (Merck, Alemania); etilenglicol dimetacrilato (EGDMA), 2,2’-azo-bis(isobutironitrilo) (AIBN) (Sigma-Aldrich,
España) y
Acetónido de
Triamcinolona (Fagron, España).
Métodos
Síntesis de
hidrogeles m
ediante polim
erización term
oinducida
El agente reticulante EGDMA (80 Mm, 1%) y diferentes
cantidades de los monómeros funcionales AM y VN(0, 100 y
200 mM; 0 – 2.5%) fueron disueltos en HEM
A (6 ml; 96,5% -
99%) bajo agitación magnética constante durante 45 minutos
(Tabla 1). Se incorporó el agente iniciador AIBN (10 mM) durante 15 minutos más. Cada solución de monómero resultante fue inyectada en un molde constituido por dos placas de vidrio (10x10cm) cubiertas internamente por una lámina de propileno y separados por un marco de silicona de
1mm de ancho.Los moldes se colocaron en una estufa a 50ºC durante 12 horas seguido de 24 horas a 70ºC. Tras la polimerización,
cada hidrogel
fue sumergido
en agua
hirviendo durante 15 minutos con el objetivo de eliminar los monómeros no reaccionantes y facilitar el corte de los hidrogeles en discos de 10 mm de diámetro. Parala limpieza de estos discos se sumergieron en una solución de NaCl 10 mM durante una semana, posteriormente en HCl 10 mM durante un día y en agua un día más[3].
Tabla 1. Composición de diferentes hidrogeles sintetizados variando el tipo y proporción de monómero funcional
Estudios de carga de TA en los hidrogeles
Los estudios de carga de TA en los diferentes hidrogeles sintetizados se llevó a cabo por inmersión de los mismos en disoluciones de diferente concentración de fármaco (8 – 19
g/ml) en NaCl al 0,9%o PBS
(10 ml) durante cuatro días. El contenido en TA se determinó por espectrofotometría UV a
= 242 nm tras ser filtradas por filtros de membrana (0,45 m Sartorius ®, Alemania). Cada ensayo ha sido realizado
por triplicado [3].
Estudios de liberación de TA de los hidrogeles
Los hidrogeles cargados fueron sumergidos en un vial conteniendo 5 ml de fluido lacrimal simulado (FLS; 6.7 g/l NaCl, 2.18 g/l NaHCO
3 , 1.38 g/l KCl, 0.084 g/l CaCl2 ·2H2 O,
pH 8) bajo agitación orbital a 100 rpm y 37ºC. A intervalos de tiempo predeterminados, se tom
aron muestras de 1 ml que era reemplazado con la misma cantidad de FLS. La determinación de la concentración de TA se realizó mediante espectrofotometría a
= 242 nm. Cada ensayo ha sido realizado por triplicado [3].
Resultados y discusión A efectos de incorporación de fármacos, los hidrogeles se comportan normalmente como adsorbentes microporosos dando lugar a isotermas de clase C
(4), caracterizadaspor
untramo lineal inicial en el que el coeficiente de reparto
entre soluto y adsorbente se mantiene constante. Estas isotermas aparecen cuando el soluto penetra en el interior del adsorbentey desaparece de la superficie y, en este caso,la concentración crítica
,representa la saturación de los lugares internos y se caracteriza por la aparición de una meseta.
HidrogelMonóm
erofuncional
HEMA:EGDMA:Func.monom
ero(Volum
e ratio)0
----5910:90:0
MA100AM-100mM
5860:90:50MA200
AM-200mM5810:90:100
NVP100NVP-100mM
5845:90:75NVP200
NVP-200mM5780:90:150
109
0
810
1214
1618
200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
R2=0,96
loading solution c (g/m
L)
QTA in lens (mg/g)
MA
100
810
1214
1618
200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
R2=0,98
loading solution c (g/m
L)
QTA in lens (mg/g)
MA
200
810
1214
1618
200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
R2=0,90
loading solution c (g/m
L)
QTA in lens (mg/g)
NV
P100
810
1214
1618
200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
R2=0,87
loading solution c (g/m
L)
QTA in lens (mg/g)
NV
P200
810
1214
1618
200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
loading solution c (g/m
L)
QTA in lens (mg/g)
R2=0,92
Fig.1. Isotermas de adsorción de TA a partir de disoluciones de NaCl 0.9%.
Soluciónde carga
HidrogelesCantidad cargada
(mg/g)
media± SD
Kpm
edia± SD
0,9% NaCl
00,449 ± 0,026
22,9 ± 0,8MA100
0,557 ± 0,03127,3 ± 2,0
MA2000,536 ± 0,042
26,0± 3,4NVP100
0,491 ± 0,04023,4 ± 2,5
NVP2000,506 ± 0,072
24,5 ± 3,0
PBS pH 7,4
00,465 ± 0,020
23,8 ± 2,5MA100
0,585 ± 0,04424,9 ± 3,1
MA2000,667 ± 0,038
27,2 ± 1,7NVP100
0,501 ± 0,06825,2 ± 4,0
NVP2000,583 ± 0,035
27,8 ± 3,5Tabla 2. Diferentes hidrogeles sintetizados con sus respectivos valores de cantidad de TA cargada y coeficientes de reparto.
Como podemos ver en la figura 1, las isotermas de adsorción obtenidas
se ajustan bien a una línea recta indicando que nos encontramos en el tramo inicial de una isoterma
tipo Cy que nos encontramos aún en la zona en la
que no existe saturación de los lugares de adsorción.Isotermas similares se obtuvieron empleando PBS comomedio de carga.Los menores valores de TA cargado se obtienen con los hidrogeles que no incluyen co-monómeros obteniéndose diferencias significativas con los elaborados con MA (
<0,05). Sin embargo, no existen diferencias de carga entre NVP yM
A por lo que podemos asumir que no se producen interacciones especiales entre TA y los co-monómeros y que la mayor carga con respecto a los que no los
incorporan pueden
deberse a
diferencias en
la hidratación de las lentes.
La tendencia del TA por la red polimérica se determinó a través del coeficiente de partición
que hemos calculado a partir de la pendiente de las isotermas y se muestran en la tabla
2. Los resultados mostrados en la tabla 2indican que
existe una elevada fracción de TA unida a la red polimérica,siendo ligeramente superior en las que incorporan M
A.Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos para otros corticoides como la dexametasona en hidrogeles de pHEM
A [5]. Por ello podemos concluir que el fármaco posee una gran afinidad por el polímero.
010
2030
4050
6070
800 20 40 60 80
100
0ma100
ma200
nvp100nvp200
tiempo (h)
% TA liberada
Fig 2. Perfiles de liberación de TA a partir de los hidrogeles cargados
Todos los hidrogeles han mostrado un perfil de liberación similar en las horas iniciales del ensayo
dondeempiezan a
liberar el fármaco de manerainmediata en cuanto se
sumergen en FLS, sin observarse efecto burst ni periodo de latencia. Sí se observan diferencias significativas
a partir de las 5 horas, donde
los hidrogeles de AM presentan mayores tasas
de liberación, siendo MA200 son los que mayorcantidad de TA liberan.Esto es debido a que a pH 8, más del 99%
de los grupos funcionales de AM se encuentran ionizados generando fuerzas de repulsión en el interior del hidrogel dando como resultado una mayor relajación e hinchamiento de la red polimérica, lo que facilita la liberación de TA.
ConclusionesLas lentes de pHEMA
se comportan como adsorbentes porosos en los procesos de carga, sin alcanzarse la saturación del proceso para las concentraciones estudiadas.Ello significa que si se consiguen concentraciones de carga superiores a la máxima empleada (saturación a 20ºC) puede favorecerse
la entrada
de dosis
mayores. Las
lentes incorporan cantidades significativas del corticoide TA en los procesos de carga, existiendo un reparto favorable hacia la red polimérica. La inclusión de los co-monómeros MA y NVP mejoran la carga de TA e incrementan ligeramente la afinidad de la red polimérica por el fármaco, sobre todo el MA. Estas lentes poseen un efectivo control de la
liberación que puede modularse en función del tipo y proporción de co-monómero empleado.
Bibliografía[1] J.-F. Rosa dos Santos, R. Couceiro, A. Concheiro, J.-J. Torres-Labandeira, C. Alvarez-Lorenzo, Poly(hydroxyethyl methacrylate-co-methacrylated-
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110
UT
ILIZA
CIÓ
N
DE
LSIST
EM
ASE
DE
M
PAR
A
OPT
IMIZA
RL
A
EL
AB
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AC
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S FAR
MA
CÉ
UT
ICA
S OR
AL
ES PO
R C
OM
PRE
SIÓN
DIR
EC
TA
D
. PuñalPeces 1, E.García
Montoya
2,JM Suñé N
egre, P Pérez Lozano, R. Sarrate, N
Sánchez,JR Ticó,
M M
iñarro
1Desarrollo Industrial, Laboratorios R
OV
I, España/ Doctorando Program
a de Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia, U
niversidad de Barcelona, España
2SDM
. Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de B
arcelona, España.
Introducción: El sistem
a SEDEM
es una herramienta que ha
demostrado su utilidad para desarrollar fórm
ulasde elaboración por com
presión, obteniéndose fórm
ulas que pueden ser elaboradas mediante
compresión por vía directa
y para caracterizar excipientes [1-6].
En este trabajo seha partido
de una fórmula de
comprim
idos elaboradospor granulación
vía húm
edaactualm
ente comercializada. El objetivo
es rediseñar el proceso de elaboraciónde la
fórmula,
manteniendo
la dosis
de principio
activo,de tal forma que pueda ser elaborado por
compresión
directa, con
laconsiguiente
reducción de
costes directos
(horas de
elaboración) e indirectos (consumo de energía o
limpieza de equipos de producción).
Materiales y M
étodos: Para este estudio se ha partido de un producto existente
en el
mercado
actualmente
cuyoprincipio activo es una m
olécula perteneciente a la fam
ilia de los “agonistas de serotonina”, cuya indicación principal es el tratam
iento del dolor de cabeza en los ataques de m
igraña.
Para la caracterización del API
y de los 19 excipientescandidatos a em
plear, se ha utilizado elsistem
a de experto SEDEM
.
El sistema SED
EM se basa en la evaluación
experimental y en la cuantificación de una serie
de parámetros
relacionados con las propiedades físicas
de las
sustancias pulverulentas.
Losparám
etros y
propiedades, se
encuentran detallados en diferentes publicaciones [1-6]. Tras la cuantificación, se elaboran una serie de prom
edios, a partir de los cuales se elabora un cálculo
final: el
IGC
oÍndice
de B
uena C
ompresibilidad, que cuantifica
la idoneidad de la m
ateria para ser comprim
ida(en escala de 1 a
10).
Tras la evaluación del principio activo estudiado se pretende seleccionar, desde un punto de vista teórico, el excipiente(s) que m
ejor corrige las carencias del principio activo a fin de diseñar el m
ejor comprim
ido posible mediante com
presión directa.
Resultados y D
iscusión:
Primeram
ente se ha caracterizado el API. Tras
el estudio
se com
prueba que
presenta propiedades
deficientes para
la com
presión directa. El valor de IG
C obtenido es 4.30, lo
cual indica claramente que no es una m
ateria apta
para su
compresión
directa de
forma
natural. En la tabla 1 se muestran los resultados
de dicha evaluación y en la figura 1 se muestra
la representación
gráfica de
los parám
etros SED
EM.
PAR
AM
ETRO
PRO
PIEDA
D
FÍSICA
VA
LOR
PRO
-M
EDIO
Dim
ensionalD
a5.80
7.25D
c8.70
Com
presibilidadIe
4.796.79
Ic6.67
Icd8.93
Deslizam
iento / Fluidez
IH
5.001.89
0.67t”
0.00
Lubrificación / Estabilidad
HR
0.905.43
H
9.96
Lubrificación / D
osificaciónPf
0.001.38
2.75Índice de Buena C
ompresión (IG
C)
4.30
Tabla
1:R
esultados de
los parám
etros y
promedios del A
PI.
Figura 1.
Representación
gráfica de
las propiedades físicas evaluadasdel A
PI.
111
Tras la evaluación del API, se observa que
presenta unas propiedades deficientes(m
enor a 5)
para los
parámetros
de “D
eslizamiento/Fluidez”
y “Lubrificación
/ D
osificación”.
Paracada
excipiente incluidoen el estudio, se
desarrolla una fórmula com
pleta (Alm
otriptán + Excipiente
+ Lubricantes)usando el sistem
a de experto.Todas las fórm
ulas con un IGC
mayor
a 5,
serían viables
(8) D
e las
que se
seleccionaron tres fórmulas y se hicieron lotes
piloto. Posteriormente se llevaron a cabo las
determinaciones
analíticas necesarias
para evaluar
si se
satisfacen las
mism
as especificaciones que el producto original. En la tabla
2 se
muestran
las fórm
ulas probadas
experimentalm
ente. En la figura 2 se muestra el
perfil de
disolución de
las fórm
ulas seleccionadas y elaboradas por com
presión vía directa.
MA
TERIA
FUN
CIÓ
NC
AN
TIDA
D
FÓRMULA A
API
API
37.4 %
Primogel
Lubrificante/D
eslizante5.0 %
Pruv1.0 %
Emcom
pressExcipiente de com
presión56.6%
FÓRMULA B
API
API
31.9 %
Primogel
Lubrificante/D
eslizante5.0 %
Pruv1.0 %
Lactosa Fast Flow
Excipiente de com
presión62.1 %
FÓRMULA C
API
API
30.7 %
Primogel
Lubrificante/D
eslizante5.0 %
Pruv1.0 %
Spherolac 100Excipiente de com
presión63.3 %
Tabla 2.Fórm
ulas propuestas por el diagrama
Sedem
que han
sido probadas
experimentalm
ente en este estudio.
% A
PI DISU
ELTO
0 20 40 60 80
100
120
05
1015
2025
30TIEM
PO (M
IN)
Fórmula A
-Emcom
press
Fórmula B
-Lactosa Fast Flow
Fórmula C
-Spherlac 100
Figura 2.
Perfil de
liberación de
lastres
fórmulas elaboradas
Conclusión
Com
o se ha evidenciadolas 3 fórm
ulas fueron viables,con los beneficios que ello supondría a la com
pañía
Referencias:
[1] J.M. Suñé N
egre, M. R
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García
Montoya,
M.
Miñarro
Carm
ona, P. Pérez Lozano, J.R. Ticó G
rau,N
ueva metodología de preform
ulación galénica para la caracterización de
sustancias en relación a su viabilidad para la com
presión: diagrama
SeDeM
,C
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oserFuster,
Encarna García-M
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en Hernández,
Ram
ón Ruhí, Josep R
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new expert
systems (SeD
eM diagram
) for control batch pow
der formulation and preform
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iñarro Carm
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uhí, E. García
Montoya, J.R
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SeDeM
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iagram
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m
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eM diagram
expert system
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egre, P.
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Miñarro C
armona, M
. Roig C
arreras, R.Fuster
García, C
. Hernández Pérez, R
. Ruhí, E. G
arcía M
ontoya, J.R
. Ticó
Grau,
Optim
ization of
parameters
of the
SeDeM
diagram
expert
system:
Hausner
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relative hum
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RH
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ontoya E, Suñé-N
egre J M, Pérez-Lozano P, M
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orally disintegrating
tablets form
ulations of
ibuprophen tablets.
An
application of
the new
SeD
eM-O
DT
expert system
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648
112
SOL
UB
ILIZA
CIÓ
N D
E E
TO
XZO
LA
MID
A C
ON
POL
ÍME
RO
S DE
CIC
LO
DE
XT
RIN
A PA
RA
L
IBE
RA
CIÓ
N C
ON
TR
OL
AD
AE
N A
DM
INIST
RA
CIÓ
N O
CU
LA
RM
.J. García-Fernández
1,N. Tabary
2, B. M
artel 2,A. C
oncheiro1, C
.Alvarez-Lorenzo
1
1Departm
entoD
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farm
acia, Universidad
de Santiago de Com
postela, 15782-Santiago de Com
postela, España2U
nité Matériaux Et Transform
ation (UM
ET), Ingénierie des Systèmes Polym
ères, Université de Lille 1,
F-59655 Villeneuve D
’Ascq, France
Introducción: El glaucom
aes una enferm
edad progresiva que, alcursar con una elevación de la presión intraocular, provoca com
presión y daño de las fibras del nervio óptico.
El tratamiento de
elección consiste en administrar
fármacos que
reducen la
presión intraocular.
La adm
inistraciónpor vía sistém
ica requieredosis
altas paraalcanzarconcentraciones eficaces en
las estructuras oculares,lo que puede
causarefectos secundarios graves. Este es el caso de los inhibidores
de la anhidrasa carbónica, un enzim
a ampliam
ente distribuidoen diversos
órganos y tejidos del cuerpo humano, por lo
que los efectos secundarios del tratamiento por
vía oral son numerosos
(1). Por otra parte, la aplicación
tópica ocular
cuenta con
importantes
limitaciones
por la
reducida biodisponibilidad oculary
la corta duración de efectos. A
demás, en el caso de los fárm
acos de elevada
permeabilidad
corneal, se
hace necesario
aplicar procedim
ientos de
hidrosolubilización adecuados. En estetrabajo
se evalúan las posibilidades que ofrecen los polím
eros de
ciclodextrina (C
D)
como
transportadores capaces de formar com
plejos de inclusión con el inhibidor de la anhidrasa carbónica etoxzolam
ida (EtOX
; solubilidad en agua 21.38 m
g/L; LogP= 2.01). Para preparar los polím
eros, se partió de -
-CD
, -C
D,
metil-
-CD
, e hidroxipropil--C
D y se utilizó
como
agente reticulante
ácido cítrico,
siguiendo un procedimiento de quím
ica verde previam
ente desarrollado (2). Com
o control, para
evaluar la
eficacia del
proceso de
complejación,
se preparó
un polím
ero de
maltrodextrina.
Una
vez sintetizados
los polím
eros, se
evaluó su
capacidad para
solubilizar EtOX
en medio salino y para ceder
de forma controlada el fárm
aco, utilizando com
o referencia las CD
s de partida.
Materiales y M
étodos: Polim
erización.Se prepararon disoluciones en agua (200 m
L) de cada una de las CD
s y de m
altrodextrina(Laisa R
oquette, France; 20 g)con ácido cítrico (Sigm
a Aldrich, Francia; 20
g)e hipofosfito sódico dihidrógeno (Sigm
a A
ldrich, Francia; 6 g).El agua se evaporó en un
rotavapor a 60ºC-80ºC
hasta obtener un
film en las paredes del balón. A
continuación se llevó a cabo la polim
erización, sumergiendo
el balón en un baño de aceitea 140ºC
y aplicando
vacío durante
30 m
inutos.El
polímero resultante (Figura 1) se redispersó en
agua (200 mL) y
el sistema se filtró a vacio
para elim
inar la
fracción insoluble.
La disolución resultante se concentró en rotavapory se dializó frente a agua (2 L) utilizando una m
embrana
de M
WC
O
6000-8000 D
a(Spectra/Por D
ialysis ®,France). El m
edio se cam
bió cada 12h. Transcurridos tres días,
la disolución se concentró de nuevo en rotavapory
se liofilizó.
Figura 1:Esquem
a de la estructura deun
polímero de C
D en el que se utilizó ácido
cítrico como reticulante (2).
HET-C
AM
test.La
biocompatibilidad
se evaluó
depositando 0.3 ml de una disolución al
10%
de los
polímeros
en la
mem
brana corioalantoidea de huevos incubados siguiendo el protocolo IC
CV
AM
(3).Solubilización.
Se prepararon disoluciones de C
D,
maltrodextrina,
polímero
de C
D
ypolím
ero de maltrodextrina en N
aCl 0.9%
,cubriendo
un am
plio intervalo
de concentraciones, y a las que se añadió EtO
X
en exceso
(1 m
g/mL).
Los sistem
as se
mantuvieron 48
hbajo agitación m
agnética,se filtraron (m
embrana de 0.45
m) y se diluyeron
con mezcla etanol:N
aCl 0.9%
(0.7:0.3) para cuantificar la cantidad de EtO
X disuelta por
espectrofotometría U
V (303nm
;Shimadzu U
V
1800, Japón).Ensayos
de difusión.
Se prepararon
disoluciones de EtOX
con cada una de las CD
(0.75 y 1.5%
) ylos polím
eros sintetizados (1.5%
y
3%)
siguiendo el
procedimiento
113
descrito en
el apartado
anterior. A
continuación, se llevaron a cabo ensayos de difusión utilizando tubos células de difusión Franz-C
hiez utilizando
unam
embrana
de diálisis de M
WC
O 500-1000 D
a (Spectra/Por ®
Cellullose Ester, Spectrum
lab, Francia)com
o separador entre los com
partimentos dador (3
ml de disolución) y receptor (7
ml de N
aCl
0.9% con SD
S 0.3%).
Resultados y D
iscusión: Polim
erización. Los
polímeros
de C
D
presentaron un contenido en CD
próximo al
50% en peso.
HET-C
AM test.
Todos los polímeros de C
D
superaron el test in vitrode referencia para
evaluar la compatibilidad con tejidos oculares
sin causar
daño en
la m
embrana
corioalantoidea.Solubilización. Las C
Ds libres en disolución
incrementaron
de m
anera m
uy notable
la solubilidad
de ETO
X
en N
aCl
0.9%,
en particular la
-CD
y la hidroxipropil--C
D(Figura 2). La m
altodextrina también m
ejoró la solubilidad,
lo que
indica que
el fárm
aco puede interaccionar hidrofóbicam
ente con los anillos de glucopiranosa.
Conc. C
D (g/l)
020
4060
80
Conc EtOX (g/l)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
CD
CDCD
MaltoC
D
Crism
eb H
PC
D
Figura 2: D
iagrama de solubilidad de EtO
X en
NaC
l 0.9% en presencia de distintas C
Ds y
maltodextrina.
La polim
erización aum
entó la
capacidad solubilizante,
principalmente
la de
(Figura 3).
Conc. C
D (g/l) en P
olímeros
020
4060
80
Conc. EtOX(g/l)0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006C
TR-bC
D
CTR
-gCD
C
TR-aC
D
CTR
-Malto
CTR
-Crysm
eb C
TR-H
PbC
D
Figura 3: D
iagrama de solubilidad de EtO
X
en NaC
l 0.9% en presencia de polím
eros dediferentes C
Ds y m
altodextrina.
Ensayos de difusión.La formulación de EtO
X
en dispersiones de CD
s y de sus polímeros
proporcionó perfiles
de cesión
sostenida durante al m
enos 24 h (Figura 4).
Tiempo (h)
05
1015
2025
30
EtOX cedido (mg/cm2)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CTR
bCD
1.5%
CTR
bCD
3%
bCD
0.75%
bCD
1.5%
Tiempo (h)
05
1015
2025
30
EtOX cedido (mg/cm2)
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
CTR
gCD
1.5%
CTR
gCD
3%
gCD
0.75%
gCD
1.5%
Figura 4: Perfiles de cesión de EtOX
a partir de
formulaciones
conteniendo C
Ds
y sus
polímeros.
Conclusiones:
Las C
Ds
y sus
polímeros
obtenidos por
condensacióncon ácido cítrico m
ostraron una elevada capacidad para hidrosolubilizar EtO
X
y para
regular el
proceso de difusión
del fárm
aco.
Referencias:
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ientosTrabajo financiado por la X
unta de Galicia
(10CSA
203013PR),
MIC
INN
(SA
F2011-22771)
y FED
ER.
M.J.G
.F. agradece
al M
inisterio de Educación, Cultura y D
eporte de España una beca para
movilidad de estudiantes
de programas de doctorado con M
ención hacia la Excelencia.
114
-CY
CL
OD
EX
TR
IN-C
ON
JUG
AT
ED
HY
DR
OG
EL
SFO
R O
CU
LA
RR
EL
EA
SE O
F A N
OV
EL
A
NT
IBA
CT
ER
IAL
N-A
LL
YL
TH
IOSE
MIC
AR
BA
ZON
E
R.J. G
lisoni 1,2, M.J. G
arcía-Fernández3, M
. Pino4, G
. Gutkind
2,4, A.G
. Moglioni 2,5,C
. Alvarez-Lorenzo
3, A.
Concheiro
3, A. Sosnik
1,2
1BIO
NIM
ED,D
epartment of Pharm
aceutical Technology,Faculty of Pharmacy and B
iochemistry,U
niversity of B
uenos Aires, A
rgentina. 2CO
NIC
ET, Argentina. 3D
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica,
Facultad de Farmacia, U
niversidad de Santiago de Com
postela, Spain.4D
epartment of M
icrobiologyand
5Departm
ent of Pharmacology, Faculty of Pharm
acy and Biochem
istry, University of B
uenos Aires, B
uenos A
ires, Argentina.
Introduction: In the last decades, soft contact lenses (SC
Ls)have
been thoroughly
investigated as
a technology platform
for the localized sustained release of drugs in the treatm
ent of ocular pathologies
[1]. SC
Ls can
improve
the bioavailability
and prolong
the half
life of
ophtalmic drugs in the ocular m
ucosa. On the
other hand, the search for new antim
icrobial agents for the treatm
ent of ocular pathologies is under
constant developm
ent.This
work
investigated the
synthesis of
two
types of
hydrophilic networks
functionalizedw
ith -C
D
for thelocalized release of a novel antim
icrobial 5,6-dim
ethoxy-1-indanone N
4-allyl thiosem
icarbazone [2,3]; namely: i) netw
orks of pH
EMA
-co--C
D
prepared through
conventional free radical polymerization using a
polymerizable
-CD
derivative(m
ono-MA
--
CD
) [4]; and ii) networks prepared by direct
cross-linking of HP-
-CD
and HP-
-CD
/HPM
C
(1.0% w
/v) with EG
DE [5].
Materials and M
ethods: M
aterials.2-H
ydroxyethyl m
ethacrylate (H
EMA
was supplied by M
erck (Darm
stadt, G
ermany). M
ethacrylic acid anhydride (MA
A),
2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol
(BH
T), 2,2’-
azo-bis(isobutyronitrile) (A
IBN
), ethylene
glycol dim
ethacrylate (EG
DM
A,
98%),
ethylene glycol diglycidyl ether (EGD
E, 50%),
hydroxypropylmethyl cellulose K
4M (H
PMC
K
4M)
were
purchased from
Sigm
a-Aldrich
Chem
icals (Madrid, Spain). B
eta-cyclodextrin (
-CD
) and
hydroxypropyl--C
D
(HP-
-CD
) w
ere supplied
by R
oquette-Laisa (V
alencia, Spain).
5,6-Dim
ethoxy-1-indanone N
4-allyl thiosem
icarbazone (TSC) w
as synthesized and purified as reported in our previous w
ork [2].
Synthesis of
crosslinked pH
EMA-co-
-CD
networks.
Mono-M
A-
-CD
previously
synthesized (0.0, 0.6 and 1.2 g) was solubilized
in HEM
A (constant volum
e of 6.0 mL; final
concentration of mono-M
A-
-CD
was 0%
, 10%
and 20% w
/v, respectively). Two m
ethods were
employed
to incorporate
TSC:
(i) during-
copolymerization loading (D
P) and (ii) post-copolym
erization loading (PP). In the case of D
P system
s, TSC
(6.0
mg)
was
firstly solubilized in H
EMA
(6.0 mL)
and mono-M
A-
-CD
, yielding a final TSC concentration of 1.0
mg/m
L in the mixture.
Then, EGD
MA
(8.0 m
M) and A
IBN
(10.0 mM
) were added and the
mixture
injected into
a m
oldof
0.4 m
m
thickness. Then, the molds w
ere dried heated at (i) 50 ºC
(12 h) and (ii) 70 ºC (24 h). In the case
of PP systems, the sam
e production procedure w
as followed, though w
ithout the addition of TSC
. A
fter polym
erization, pH
EMA
sheets
were w
eighed and imm
ersed in boiling water (1
L) for 15 min to rem
ove unreacted monom
ers and to facilitate the cutting of 10-m
mdisks.
Synthesis of
super-hydrophilic hydrogels
(SHH
s) of HP-
-CD
and HP-
-CD
/HPM
C.H
P--C
D(4.8 g), N
aOH
solution (0.2M, 16 m
L) and
EGD
E (crosslinker
agent, 8
mL)
were
thoroughly mixed. The final reaction m
ixture (24 m
L) was divided into aliquots A
and B (12
mL each). H
PMC
K4M
(0.12 g) was added
exclusively to aliquot B (12 m
L), yielding a final concentration of 1%
w/v. Then, aliquots A
and B
were stirred (15 m
in), poured into thin-glass tubes (diam
eter of 5 mm
) and heated at 50 °C
(12 h). SHH
s were obtained by breaking
down the tubes and w
ashing the crosslinked netw
orksw
ith (i) water (12 h), (ii) 10 m
M H
Cl
(12 h) and (iii) water (24 h). Finally, SH
Hs w
ere cut into 5 m
m diam
eter disks with a scalpel and
dried in an oven at 40 °C (24 h).
In vitro release in artificial lacrimal fluid.D
isksw
ere loaded with TSC
by soakinginto a TSC
suspension in water (250
g/mL, 10 m
L), stirred at 25 ºC
for 24 hor 96 h, and then
imm
ersed into artificial lacrim
al fluid (10 mL) at 25 ºC
and the TSC
released was m
onitored by UV
-Vis
Antibacterial activity of TSC-loaded hydrogels.
The agar diffusion method of M
üller-Hinton
(pH 7.2-7.4, 25 ºC
; 4 mm
of agar height) was
used to evaluate the antimicrobial activity of (i)
free TSC (200
g of TSC in a paper disk), (ii)
TSC-free SC
Ls and SHH
s and (iii) TSC-loaded
SCLs
and SH
Hs,
against Pseudom
ona aeruginosa
(strain 9027) and Staphylococcus aureus
(strain 6538P). The turbidity standard of 0.5 in the M
cFarland scale is used to adjust the turbidity
of the
inoculum.
The incubation
temperature w
as between 35 and 37 ºC
for 24 h.
115
Results and D
iscussion:The netw
orks resultant of the application of the tw
o synthetic procedures were transparent and
showed
high affinity for water. Im
mersion
in artificial lachrym
alfluid resulted in a 93 to 43%
degree of swelling for pH
EMA
networks of low
to
high content
in m
ono-MA
--C
D.
The sw
elling of SHH
s reached 400%.
Regardless of the m
ethod used forthe drug
loading (DP or PP), pH
EMA
networks
slowly
released TSC (Figure 1A
-C).SH
Hs show
ed the sm
allest TSC loading capacity (Figure 1D
). This result w
as expected owing to the extrem
ely low
aqueous solubility of the drug and the high hydrophilicity of these hydrogels. O
n the other hand, it is im
portant to stress that pHEM
A-co-
-C
D and SH
Hs system
s sustained the release of the loaded TSC
for at least two w
eeks (Figure 1) and m
aintainedconcentrations w
ithin the antim
icrobial therapeutic window
.
Figure 1. (A-C
) TSC release kinetics from
pH
EMA
-based SCLs prepared w
ith different percentage of m
ono-MA
--C
D and (D
)SH
Hs
based on HP-
-CD
and HP-
-CD
/HPM
C. (A
) D
P method, (B
) PP method w
ith stirring of 24 h in TSC
suspension, (C)PP m
ethod with stirring
of 96 h in TSC suspension
and (D)
PP method
with stirring of 24 h in TSC
suspension. Figure insets show
the release during the first 24 h.
Finally, the microbiological evaluation show
ed the
inhibition of bacterial growth, although the
inhibition zones were not large surface at 24 h
of incubation (Figure 2).These results suggest that TSC
levels were w
ithin the therapeutic w
indow
and could
be evaluated
in anim
al m
odels with prom
ising results.
Figure 2.
Antibacterial
activity in
(A,B
)Staphylococcus aureus
and (C,D
)Pseudom
ona aeruginosa
culturesafter 24 h of incubation on
agar Müller-H
inton. (a)Paper disk loaded w
ith 200
g of
TSC
(positive control),
(b)SC
L w
ithout TSC (negative control), (c)TSC
-loaded SC
L obtained by the PP method and (d)
TSC-
loaded SCL obtained by the D
P method.
Conclusions.
Incorporation of
the safe
pharmaceutical
excipient C
D
to hydrophilic
networks
can open
novel possibilities
of developm
ent netw
orks suitable
as ocular
bandages or SCLs that can host therapeutic
amounts of a novel TSC
that displays a broad antibiotic
spectrum.
The system
s engineered
provided a well-controlled sustained release for
at least two w
eeks. Moreover, they inhibited the
growth of tw
o prominent bacteria associated
with ocular infections.
References
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., et al. J. Drug D
el. Sci. Tech., 20, 237–248
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Acknow
ledgments:
R.
Glisoni
thanks the
doctoral scholarship
of C
ON
ICET.
Work
supported by
the Iberoam
erican Them
atic N
etwork
“Red
iberoamericana
de nuevos
materiales para el diseño de sistem
as avanzados de liberación de fárm
acos en enfermedades de
alto impacto socioeconóm
ico (RIM
AD
EL)” of the C
YTED
Program, and by FED
ER, X
unta de G
alicia (10C
SA203013PR
) and
MIC
INN
(SA
F2011-22771), Spain. B
ab
cd
ACD
ac
bd
bb
AB
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
040
80120
160200
240280
320360
Time (h)
TSC released (mg/g dry hydrogel)
0% w/v10% w/v
20% w/v
0
200
400
600
800
05
1015
2025
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
040
80120
160200
240280
320360
Time (h)
TSC released (mg/g dry hydrogel)
0% w/v10% w/v
20% w/v
D C0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
040
80120
160200
240280
320360
Time (h)
TSC released ( g/g hydrogel)
0% w/v10% w/v
20% w/v
0200400600800
1000
05
1015
2025
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000040
80120
160200
240280
320360
Time (h)
TSC released (mg/g dry hydrogel)
HPbeta-CD/HPMC HPbeta-CD
0 501001502002503003500
510
1520
25
116
PEL
ET
S DE
LIB
ER
AC
IÓN
CO
NT
RO
LA
DA
DE
PRO
PRA
NO
LO
L A
BA
SE D
E
CO
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CIPIT
AD
OS D
EL
FÁR
MA
CO
CO
N E
UD
RA
GIT
L100 O
S100L.C
.L. Sá-Barreto
1, R. M
artínez-Pacheco1,2,J.L. G
ómez-A
moza
1,2
1Departm
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de Santiago de C
ompostela, España
2Instituto de Farmacia Industrial. U
niversidad de Santiago de Com
postela, España
Introducción: Las
formas
orales m
ultiparticulares de
liberación controlada cuentan con numerosas e
importantes
ventajas sobre
las de
tipo m
onolítico (1). Sinem
bargo, para conseguir un control eficaz y duradero del proceso de cesión requieren, en especial si contienen fárm
acos hidrosolubles, el recubrim
iento con materiales
adecuados de las pequeñas unidades que las com
ponen, lo que supone un claro incremento
de complejidad tecnológica en su elaboración
(2). Partiendo de estos hechos, el objetivo de este estudio es evaluar la utilidad de pelets de estructura m
atricial elaborados por extrusión-esferonización, en los que un fárm
aco catiónico de m
arcada hidrosolubilidad (propranolol) se incorpora
coprecipitado con
un copolím
ero aniónico
(Eudragit L100
o Eudragit
S100), com
o sistemas de liberación controlada.
Materiales y M
étodos: M
ateriales:Eudragit
L100 y Eudragit
S100 (cedidos
por Evonik),
Trietilcitrato (M
erck),Propranolol C
lH (R
oig Farm
a S.A.),
Avicel
PH101 (G
uinama).
Preparación y
caracterización de
los coprecipitados:
Disolución
secuencial del
copolímero, el agente plastificante (trietilcitrato)
y el
fármaco
en m
ezcla de
2-propanol:acetona:agua
73:24:3a
50ºC
con agitación m
ecánica. Eliminación del disolvente
en estufa con circulación forzada de aire a 40ºC durante 4 días. Pulverización del coprecipitado form
ado y
selección de
la fracción
granulométrica 50-140
m. La com
posición de los coprecipitados objeto de estudio se presenta en
la Tabla
1. La
caracterización de
los coprecipitados se llevó a cabo por calorim
etría diferencial de barrido (D
SC) (TA
Instruments
Q100, m
uestras de 3-4 mg, cápsulas cerradas en
atmósfera de nitrógeno con flujo 50 m
L min
-1yvelocidad de calefacción 10ºC
min
-1) y por
difracción de
rayos X
(Siem
ens D
5005, m
onocromador
de grafito
y ánodo
de C
u, intervalo 3-60º2
, velocidad de barrido 0.01º2s -1).Preparación y caracterización de los pelets:Para la preparación de las form
ulaciones, cuya com
posición se detalla en la Tabla 1, se aplicó el siguiente procedim
iento: mezclado de los
componentes sólidos (Turbula T2C
, 30 rpm, 10
min), hum
ectación de las mezclas con agua
(malaxadora K
enwood, 10 m
in), extrusión de las m
asas humectadas (C
aleva 25, malla 1 m
m,
60 rpm), esferonización de los pelets (C
aleva
120, plato de 12 cm con hendiduras de 1 m
m,
10 min a 1200 rpm
) y desecación en estufa con circulación forzada de aire (40ºC
, 24 h). La caracterización de los pelets incluyó tam
año y form
a (Microscopía óptica, O
lympus SZ-C
TV,
625 pelets, diámetro de Feret y circularidad),
friabilidad (Friabilómetro U
SP, 25 rpm 15 m
in, 100 perlas de vidrio de 4 m
m de diám
etro), m
icroestructura (porosimetría de intrusión de
mercurio, M
icromeritics A
utopore II 9215) yvelocidad de disolución de propranolol (Turu G
rau USP29, tam
pón pH 1.2 0-1.5 h y tam
pón pH
6.8 1.5-12 h, 900 mL, 50 rpm
).
Código
Com
ponentes de los coprecipitadosA
vicel PH
101(%
)
Agua
(mL/
100g) Prop.
ClH
(%)
TEC
(%
)L100 (%
)S100(%
)
L6P35,0
0,930
-64,1
72L9P3
3,30,9
30-
65,874
L12P32,5
0,930
-66,6
75S6P3
5,00,9
-30
64,167
S9P33,3
0,9-
3065,8
67S12P3
2,50,9
-30
66,668
Tabla 1.Com
posición de las formulaciones en
pelets objeto de estudio.
Resultados
y D
iscusión: Los
termogram
as D
SC obtenidos con los coprecipitados (Figura
1) m
uestran la
desaparición del
pico endotérm
ico de fusión del fármaco, claram
ente visible
para las
mezclas
físicas copolím
ero-fárm
aco de igual composición, que sugiere que
el propranolol
en los
coprecipitados se
encuentra predominantem
ente en estado amorfo.
Los resultados de los estudios de difracción de rayos X
ratifican esta afirmación. Para todas las
formulaciones objeto de estudio, se obtuvieron
pelets de
características m
orfológicas y
de resistencia
mecánica
adecuadas, sin
que se
observasen fenóm
enos de
erosión o
aglomeración significativos (Tabla 2).
Las curvas acumuladas de intrusión de m
ercurio (Figura 2) m
uestran aspectos comunes para las
distintas formulaciones evaluadas, con un fuerte
predominio de poros de tam
año comprendido
entre1 y 0,1
m. N
o obstante, hay que destacar que la porosidad de los pelets elaborados con la variedad
Eudragit S100
resulta claram
ente m
ayor quela de sus equivalentes obtenidos con
la variedad L100.
117
Figura 1.-
Termogram
asD
SC
de los
coprecipitados (C) y de las m
ezclas físicas (M).
(A) Eudragit L100; (B
) Eudragit S100.
Tabla 2.-
Características
granulométricas,
morfológicas y de resistencia m
ecánica de las form
ulaciones objeto de estudio.
0.0010.01
0.11
10100
10000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25L6P3L9P3L12P3S6P3S9P3S12P3
Diám
etro poro,m
Volumen, cm3 g-1
Figura 2.- C
urvas acumuladas de intrusión de
mercurio correspondientes a las form
ulaciones objeto de estudio.
En la Figura 3 se han condensado las curvas m
edias acum
uladas de
disolución de
propranolol. En
medio
ácido, todas
las form
ulaciones muestran un claro efecto burst
cuya magnitud es fuertem
ente dependiente de la variedad polim
érica y, en menor m
edida, de la proporción
de fárm
aco incorporado.
La diferente
intensidad de
las interacciones
fármaco-polím
ero (derivada
de la
distinta proporción de grupos carboxilo/ester de las dos variedades de Eudragit) podría justificar este com
portamiento.
En medio de disolución pH
6.8, se observan diferencias m
uy marcadas en los perfiles de
disolución de
propranolol en
función de
la variedad polim
érica incorporada a los pelets. A
sí, las formulaciones elaboradas con Eudragit
L100 ceden el fármaco de acuerdo con una
cinética de orden 1, sin que existan diferencias im
portantes atribuibles
a
la proporción
fármaco/polím
ero. En cambio, con la variedad
S100 se
obtienen cinéticas
orden 0
con velocidades de disolución com
prendidas entre 2.5 y 4.5%
de la dosis de propranolol/hora. Estas diferencias en el com
portamiento de los
dos Eudragit
deben atribuirse
a un
efecto com
binado del diferente perfil pH-solubilidad y
de la diferente capacidad viscosizante de las dos variedades (3) y de la, ya com
entada, diferente porosidad de los pelets que originan.La form
ulación que contiene Eudragit S100 con la m
enor proporción fármaco/polím
ero permite
minim
izar el efecto burst(<10%
) y mantener,
durante períodos
de tiem
po sucientem
ente prolongados, una liberación de propranolol a velocidad constante.
0.000.75
1.500.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
36
912
L6P3L9P3L12P3S6P3S9P3S12P3
Tiempo, h
Propranolol disuelto
Figura
3.- C
urvas m
edias acum
uladas de
disolución de propranolol de las formulaciones
objeto de estudio.
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ctober 2011).
Agradecim
ientos:- A
Evonik por el suministro desinteresado de
las muestras de Eudragit.
- Este estudio se ha desarrollado dentro del proyecto 07C
SA006203PR
(Xunta de G
alicia).
Código
Diám
etro deF
eret (m
)C
ircularidadF
riabilidad (%
)
L6P3
893,45 (110,87)0,97(0,02)
0,09L
9P3865,34 (87,96)
0,98(0,02)0
L12P3
710,57 (199,48)0,97(0,03)
0S6P3
645,60 (152,00)0,97(0,04)
0,06S9P3
670,45 (130,64)0,95(0,04)
0,02S12P3
560,95 (164,83)0,88(0,07)
0,08
118
NA
NO
PAR
TÍC
UL
AS D
E SÍL
ICE
ME
SOPO
RO
SA PA
RA
MO
DU
LA
R E
L PA
SO D
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RA
VÉ
S DE
LA
BA
RR
ER
A H
EM
AT
OE
NC
EFÁ
LIC
A
M. G
onzález-Alvarez
1, I. Gonzalez-A
lvarez1,C
. Coll 2, E. A
znar 2, F. Sancenón2, R
. Martínez-M
áñez2,
M.B
ermejo
1
1Depto. de Ingeniería. Á
rea Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Universidad M
iguel Hernández, Elche.
2Centro de R
econocimiento M
olecular y Desarrollo Tecnológico (ID
M), U
niversitat Politècnica de V
alència3C
IBER
en Biotecnología, B
iomateriales y N
anomedicina (C
IBER
_BB
N)
Introducción: Las
nanopartículas de
sílice m
esoporosahan dem
ostrado desde hace unos años un gran potencial com
o componentes de
formas
farmacéuticas por su capacidad para
albergar en su interior gran cantidad de fármaco,
versatilidady
su biocom
patibilidad.En
un sistem
abásico, el fárm
aco se almacena en los
poros y la liberación de la especie encapsulada se produce por difusión. A
este sistema
se le puede añadir una
funcionalización externa con distintas m
oléculas que actúan como puertas
moleculares
lo cual
permite
una liberación
controlada de la cargaen respuesta a diferentes
estímulos
externos. En este sentido, el objetivo de este trabajo es la obtención de dispositivos nanoscópicos
con función de puerta molecular
que sean capaces de internalizarse en la célula y cuya apertura esté controlada por un proceso enzim
ático. Estos materiales híbridos
deben ser capaces de incluir la carga en el interior de los m
esoporos hasta que estén en presencia de las enzim
as en el interior de la célula. De esta
manera se pretende conseguir m
odular el paso de
sustancias a
través de
la barrera
hematoencefálica que está m
uy limitado para
gran núm
ero de
fármacos
entre los
que se
incluyen fárm
acos hidrófilos
y fárm
acos sustrato
de transportadores
efflux com
o la
glicoproteína P
Materiales y M
étodos: Para la preparación de estos m
ateriales se selecciona como soporte las
nanopartículas de sílice mesoporosa M
CM
-41por sus características de porosidad hom
ogénea, biocom
patibilidad y
facilidad de
funcionalización. Este
material
se sintetiza
mediante
la polim
erización del
tetraetil ortosilicate
sobre m
oléculas de
bromuro
de hexadeciltrim
etilamonio que
es un surfactante que actúa com
o agente director de la estructura. Posteriorm
ente, se
elimina
el tensioactivo
mediante calcinación en aire a tem
peraturasde
550ºC lo cual da lugar a la form
ación de los poros del sólido. En esas cavidades se introduce el colorante control (Safranina) o los fárm
acos elegidos
(Metoprolol,
Atenolol,
Celiprolol
oC
ortisol). La carga del material se lleva a cabo
realizando una suspensión de nanopartículas en una
disolución acuosa
del com
puesto a
introducir. Esta mezcla se m
antiene en agitación
a temperatura am
biente durante 24 horas. De
esta manera el fárm
aco difunde hacia el interior de
los poros.
El últim
o paso
consiste en
funcionalizar la superficie externa del material
con las moléculas orgánicas seleccionadas para
que actúen como puertas m
oleculares. En este caso se ha elegido el G
lucidex® 47 que es un
hidrolizado de
almidón
disponible com
ercialmente que contiene 5%
glucosa50%
m
altosa, 45% oligosacáridos y polisacáridos.
Estos derivados
de alm
idón se
hidrolizan específicam
ente con
amilasas
que están
presentes, entre otros sitios, en los lisosomas
celulares. C
omo
técnica de
anclaje de
los derivados
de alm
idón se
ha em
pleado la
sililación.
La caracterización
de los
materiales
se ha
llevado a cabo mediante técnicas estandard en la
química del estado sólido: difracción de R
ayos-X
de
polvo y
microscopia
electrónica de
transmisión (TEM
)
Figura 1. Mecanism
o de liberación del fármaco
en presencia de amilasas
Los ensayos de liberación in vitrose realizaron
resuspendiendo 5 mg de sólido en 12.5 m
L de H
2O y 5 m
L de sólido en una disolución de -am
ilasa. Se determina el perfil de
liberación recogiendo
alícuotasde
las suspensiones
a los
tiempos
prefijados, filtrándolas con filtros de teflón y determ
inando la
cantidad de
fármaco
mediante
la técnica
analítica necesaria.
La figura
1 m
uestra un
esquema de cóm
o se produciría la liberación del fárm
aco contenido
en el
interior de
las nanopartículas.
Para los estudios de permeabilidad a través de la
barrera hemtoencefálica se ha utilizado la línea
celular MD
CK
. Las célulasfueron sem
bradas y crecidas en form
a de monocapas celulares en
mem
branas de
policarbonato, hasta
su
119
confluencia durante 7-9 días. La integridad de la m
onocapa se evaluó midiendo la resistencia
eléctrica transepitelial
antes y
después del
experimento. U
na vez se administró
el fármaco
encapsulado en las nanopartículas se mantuvo
en incubación 2.5 h con agitación, pasadas las cuales, se tom
aron cuatro muestras durante 90
minutos,
y posteriorm
ente se
analizaron m
ediante CLA
R. Los estudios de transporte se
realizaron en
ambas
direcciones: desde
la cám
ara apical hacia la basolateral y desde la cám
ara basolateral hacia laapical.
Resultados y D
iscusión: Las nanopartículas
obtenidas fueron caracterizadas por difracción de R
ayos-X de polvo y m
icroscopía electrónica de transm
isión. Los difractogramas de
polvo de los sólicos M
CM
-41, MC
M-41 calcinada y los
sólidos finalesm
uestra los picos de reflexión a los valores esperados
(figura 2). Las imágenes
de TEM de la M
CM
-41 calcinada y de los sólidos
finales m
uestran que
el m
aterial sintetizado corresponde a partículas esféricas con diám
etros de 100 a 200 nm que m
uestran la típica porosidad de la m
atriz MC
M-41. Los
datos de los difractogramas de rayos X
de polvo y de TEM
demuestran que tanto el cargado de
los poros como la posterior funcionalización
externa no
modifican
la estructura
tridimensional inicial del m
aterial mesoporoso.
Figura 2.Difractogram
a de RX
de MC
M-41(a),
MC
M41 calcinado (b) y el sólido híbrido(c).
Los ensayos
de liberación
se iniciaron
estudiando la liberación del material híbrido
cargado con el fármaco en ausencia de enzim
a a pH
= 7.5. Los resultados obtenidos para todos los
sólidos indicaron
que la
liberación del
compuesto
es prácticam
ente nula
incluso después de 24 horas. Ensayos de idénticas características
realizados en
presencia de
la -am
ilasa a pH= 7.5 revelaron que se
producía la liberación continua de los distintos fárm
acos durante un período de varias horas. La
figura 3m
uestra los resultados obtenidos para el m
aterial híbrido cargado con Metoprolol
Figura 3.C
inética de liberación de Metoprolol
desde una suspensión de nanopartículas de sílice m
esoporosa funcionalizada con Glucidex®
47en
ausencia y presencia de enzima.
Los ensayos de permeabilidad en m
onocapas M
DC
K revelaron que el encapsulam
iento de los fárm
acos daba
lugar a
diferencias en
su perm
eabilidad respecto al fármaco libre. Los
resultados más prom
etedores se han obtenido con
el celiprolol
el cual
cuando está
encapsulado en la nanopartícula permite el paso
al compartim
ento receptor de cantidades de fárm
aco significativamente superiores
En conclusión,
se han
preparado con
éxito nanoparticulas
porosas de
metoprolol,
celiprolol, atenolol y cortisol, se ha comprobado
la funcionalidad del mecanism
o de activación de la cesión y se ha determ
inadosu capacidad
de internalizarse en la barrera hematoencefálica.
Lo que
demuestra
que esta
estrategia es
prometedora
para increm
entar el
paso de
sustancias a
través de
la barrera
hematoencefalica
Referencias:
(1) Bernardos, A
.; Aznar, E.; M
arcos,M
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ontrolled R
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5884–5887. 73. Park, C.; K
im, H
.; Kim
, S.;(2) B
ernardos,A.; M
ondragón, L.; Aznar, E.;
Marcos,
M.
D.;
Martínez-M
áñez, R
.; �
-�
Enzyme-R
esponsive Intracellular Controlled
Release
Using
Nanom
etric Silica
Mesoporous
Supports C
apped w
ith “Saccharides”. A
CS N
ano, 2010, 4 (11), 6353-6368
(3) Mangas-Sanjuán, V
.; González-A
lvarez, M.;
González-A
lvarez, I.; Berm
ejo,M
.V.
Drug
penetration across the blood¿brain barrier: an overview
. Therapeutic delivery, 2011
120
SÍNT
ESIS Y
CA
RA
CT
ER
IZAC
IÓN
DE
CO
POL
ÍME
RO
S BL
OQ
UE
(PLG
A-PE
G-PL
GA
) T
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SIBL
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RA
EL
DISE
ÑO
DE
PRE
PAR
AD
OS IN
YE
CT
AB
LE
S IN
TR
AO
CU
LA
RE
S DE
LIB
ER
AC
IÓN
PRO
LO
NG
AD
A.
JB. Fariña, A
. González, C
. Monzón, A
., V. V
aleron, A. Santoveña, A
. Oliva y M
. Llabrés. D
epartmento de Ingeniería Q
uímica y Tecnología Farm
acéutica. Facultad de Farmacia. U
niversidad de La Laguna, España
Introducción. La
necesidad de
administrar
medicam
entos biotecnológicos en preparados inyectables de liberación m
odificada, ha llevado al desarrollo de ha llevado al desarrollo y optim
ización de sistem
as polim
éricos term
osensibles que
responden a
pequeños cam
bios en
la tem
peratura de
su entorno
con transiciones
reversibles sol-gel.
Este tipo
de sistem
as perm
iten preparar
dispersiones acuosas
que fluyen com
o líquidos a temperatura am
biente y gelifican
a la
temperatura
corporal (~37ºC
) form
ando un deposito de cuyas propiedades físico-quím
icas depende
la velocidad
y el
tiempo al que se cede el principio activo. Son
varios los
polímeros,
copolimeros
y com
binaciones de estos que se han utilizado con estos
fines y
que perm
iten prolongar
la liberación desde días hasta m
eses, cabe resaltar por
su baja
toxicidad los
hidrogeles de
poloxameros
y sus
mezclas
con el
ácido hialurónico (1) o los copolím
eros bloque de polietilenglicol
(PEG)
y poli(D
,L-lactida-co-glicolida)
(PLGA
) que
se ensam
blan en
copolímeros tribloque tipo A
-B-A
(PEG-PLA
-PEG
o PEG-PLG
A-PEG
) o B-A
-B (PLG
A-
PEG-PLG
A (2). Estos últim
os aparte de su baja toxicidad, son biodegradables y si se adecúan las
condiciones de
preparación y
su com
posición, permiten ajustar la liberación a los
requisitos específicos deseados. El objetivo del presente trabajo es la síntesis y caracterización de copolím
eros tribloque de PLGA
-PEG-PLG
A
con com
posición m
onomérica,
PM
y biocom
patibilidad
adecuados para
preparar hidrogeles
termosensibles,
con propiedades
reológicas aptos
para la
administración
parenteral y
el control
de la
liberación de
fármacos de diferente naturaleza.
Materiales y M
étodos. R
eactivos: Polietilenglicol 1000 y 1500 (Fluka), D
,L Lactida y Glicolida (A
ldrch), etilhexanoato de estaño (Sigm
a). Síntesis del PLGA
-PEG-
PLGA
: Se
utilizo el
método
propuesto por
Zentner y cols (2), utilizando un mini reactor
que permitió un control preciso del tiem
po y tem
peratura de proceso, vacío y agitación. Las variables
utilizadas para
modificar
las propiedades del copolím
ero fueron el PM del
PEG
de partida,
el tiem
po de
vacío. C
aracterización de
los copolím
eros: Los
monóm
eros residuales
en el
polímero
se
analizaron por UPLC
, en fase inversa y detector U
V-V
IS. El PM y la distribución de PM
de los copolím
eros por cromatografía de perm
eación en gel (G
PC) en tetrahidrofurano utilizando 4
columnas
en serie
y
con doble
detección (R
efractometro diferencial y D
ifracción de Luz Laser M
ultiángulo (MA
LLS). La proporciones de láctico/glicólico/PEG
de los polímeros se
determinaron
por 1H
-RM
N
en cloroform
o deuterado. Preparación de los H
idrogeles: Con
el objetivo de preparar hidrogeles que presenten transiciones reversibles sol-gel en el entorno de los 37ºC
se prepararon dispersiones acuosas con los copolím
eros obtenidos con concentraciones entre el 10%
y el 25% (p/p). C
aracterización de los hidrogeles: Las propiedades de gelificación de
los hidrogeles
preparados a
diferentes concentraciones se estudiaron determ
inando las tem
peraturas críticas mínim
as de gelificación (LC
GT) y de disolución (LC
ST) y máxim
a de disolución
(UC
ST) y
construyendo los
diagramas
de fase.
Las propiedades
viscoelásticas se estudiaron con un reómetro
Bholin de geom
etría plato-plato. La estabilidad se estudio por G
PC. La biocom
patibilidad de los polím
eros se evaluó de acuerdo al test HET-
CA
M
(Hen’s
Egg Test-C
horioallantoic M
embrane) siguiendo el protocolo N
ICEA
TM-
ICC
VA
M
(3). La
bioadhesividad de
los polím
eros se
evaluó con
un analizador
de textura TA
-TX Plus de acuerdo con el m
étodo propuesto por B
lanco y cols (4)R
esultados y Discusión.
Los resultados del análisis de los polímeros por
la técnica
de U
PLC
utilizada nos
permiten
afirmar que el contenido residual de estos en
lactida es < 0,5% (p/p). Las propiedades de los
copolímeros obtenidos, PM
, polidispersividad y com
posición, en función de las condiciones de síntesis recogen en la Tabla 1. El copolím
ero A
se preparó partiendo de PEG de PM
1000 y m
anteniendo la conexión del vacío en el reactor abierta
durante las
ocho horas
de síntesis,
mientras que el copolím
ero B se preparó con
PEG de PM
1500 y una vez alcanzado el vacío deseado se cerro la conexión del reactor. En la tabla 2 se recogen los resultados de bioadhesión de los copolím
eros determinados por triplicado,
sobre piel curtida de cabra paquistaní (4). Com
o puede
observarse la
bioadhesividad del
copolímero B
es muy superior a la del A
y se m
antiene cuando se diluye hasta cuatro veces.
121
Tabla 1: PM
relativos a patrones de poliestireno determ
inados por
GPC
, polidispersividad
y com
posición monom
érica de los copolímeros
sintetizados. LA (Láctico). G
A (glicólico)
Tabla 2: Trabajos de bioadhesión evaluados por
triplicado con un analizador de textura TA-TX
Plus,
para los
copolimeros
concentrados y
diluidos y diluidos (1:4) *. La
biocompatibilidad
de los
copolímeros
se determ
inó de acuerdo al test HET-C
AM
que nos da una idea de la iritación ocular potencial, m
ientras que
el copolím
ero B
no
indujo hem
orragia, lisis ni coagulación, el A indujo
coagulación cuando se comparó con controles
negativos de
suero salino
isotónico. En
la Figuras 1 y 2 se recogen los diagram
as de fase de
los hidrogeles
A
y B
. C
omo
puede observarse,
el hidrogel
A
no presenta
transiciones sol-gel
en los
intervalos de
temperatura estudiados
Figura 1. Diagram
a de fase de las soluciones acuosas del copolím
ero A.
Figura 2. Diagram
a de fase de las soluciones acuosas del copolím
ero B.
En la Figura 3 se recoge la evolución de los m
ódulos elástico y viscoso (G’ y G
’’) con la Tª para el hidrogel B
al 25%(p/p). Se observa
igualdad entre
ambos
a la
temperatura
de gelificación (entre 23,4 y 23,9ºC
)
Las condiciones
de síntesis
universalmente
aceptadas para obtener este tipo de copolímeros
(2) deberían permitir obtener lotes reproducibles
al menos en lo se refiere a su PM
y propiedades reológicas. C
uando se controlan los parámetros
Figura 3. Evolución de G’ y G
’’con la Tª para el hidrogel B
al 25% (p/p).
que intervienen en el proceso a través de un m
ini reactor químico y se cam
bia el PM del
bloque de PEG (de 1 a 1,5 kD
a) las propiedades del copolím
ero obtenido cambian sensiblem
ente en
lo referido
a su
PM
relativo y
a su
composición final en láctico y glicólico. C
uanto m
ayor es el contenido en LA y el tam
año de las cadenas de PLG
A m
ayores son las interacciones hidrofóbicas y m
ás bajas son las temperaturas
de gelificación (2). El copolímero A
es apto para
elaborar geles
termosensibles
para adm
inistración intraocular
por su
biocompatibilidad
y por
los valores
de las
temperaturas
a las
que se
producen las
transiciones de sol a gel de sus dispersiones acuosas aunque siendo posible aún optim
izar sus propiedades para elevar sus LC
GTs.
Referencias:
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Blanco-Fuente,
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Vila-D
orrio, S.
Anguiano-Igea,
F.J. O
tero-Espinar, J.
Blanco-M
endez, Tanned
leather: A
good
model f…
Int. J. Pharm. 1996; 138, 103-112
Agradecim
ientos: Este
trabajo ha
sido financiado por el M
inisterio de Economía y
Com
petitividad (SA
F2010-17083). N
uestro agradecim
iento al Departam
ento de Tecnología Farm
acéutica de la Universidad de Santiago por
su colaboración
en la
evaluación de
la biadhesividad
y biocom
patibilidad de
los copolím
eros.
23,5 2424,5 2525,5 2626,5
010
2030
40
T (ºC)
C (%
) Hidrogel A
0 10 20 30 40
010
2030
40
T (ºC)
C (%
)
Hidrogel B
PRO
PIEDA
DES
CO
POLÍM
ERO
A
B
PM
Mn
Mw
M
z
3086 3307 3582
4356 4908 5473
Polidispersividad 1.07
1.13
1H-RM
N
LA
GA
PEG
33,1%
12,8%
54,1%
15,7%
14,8%
69,5%
CO
POLIM
ERO
A
B
Trabajo de biadhesión
(N·m
m)
0.600 (0.100) 0.004 (0.001)*
2.050 (1.060) 1.207 (0.485)*
122
LIB
ER
AC
IÓN
DE
KE
TO
PRO
FEN
O Y
DE
XK
ET
OPR
OFE
NO
TR
OM
ET
AM
OL
EN
C
OM
PRIM
IDO
S MA
TR
ICIA
LE
S DE
PAD
AS Y
MA
NIT
OL
M
argarit Bellver M
.V. 1,R
odríguez Galán I.C
. 1,García Izquierdo M
.L1, L
ópez Navarro A
., R
odríguez Galán A
. 2
1 Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica. Facultad Farmacia. U
niversidad de Granada.
2Departam
ento de Ingeniería Quím
ica, ETSEIB. U
niversidad Politécnica de Cataluña. España.
Introducción:Estudios
precedentes de
la poliesteram
ida biodegradable y biocompatible
poli-(L-alanina-dodecanodioll-L-alanina-sebácico)
(PAD
AS)
ponen de manifiesto sus
características farm
acotécnicas apropiadas
(capacidad de flujo y compresibilidad del polvo;
resistencia a la rotura y a la erosión del polímero
comprim
ido y resistencia a la disgregación)para form
ar com
primidos
matriciales
inertes con
cualidades para el control de la liberación(1).
Aspecto
estudiado en
formulaciones
de com
primidos de diclofenaco sódico
(2).En
este trabajo,
se evalúa
la aplicación
dePA
DA
S como soporte m
atricial insoluble, para controlar
la liberación
de ketoprofeno
y dexketoprofeno
trometam
ol,analizando
la influencia
de los
fármacos
modelo
y del
diluyente m
anitol, sustituyente
parcial del
soporte polimérico en los com
primidos.
Materiales y M
étodos: Los comprim
idos seform
ulan con ketoprofeno(K
)(Fagron Ibercia),
dexketoprofeno trom
etamol
(DK
-T), poli-(L-
alanina-dodecanodiol-L-alanina-sebácico) (P)
preparadopor polim
erización interfacial, segúnm
étodo descrito por Paredes etal. (3), con un
tamaño
medio
de partícula
de 60-125
m,
manitol
(M) y estearato m
agnésico(G
uinama,
Valencia). M
ezclados y homogeneizandos los
componentes de las form
ulaciones indicadas en la tabla
1 se comprim
en en prensa hidráulica (Specac) a 5 tons de presión durante 1 m
inuto.obteniendo
comprim
idos cilíndricos de caras planas y 10 m
m de diám
etro.
Tabla 1.Formulaciones de com
primidos con
ketoprofeno o dexketoprofeno trometam
ol.
También se elaboran cápsulas gelatinosas duras
con 100 mg de K
o DK
-T para determinar el
perfil de
disolución de
los fárm
acosy
comprim
idos sin polímero (fórm
ula 0 PMF)
que permiten apreciar
la influencia del manitol
en la disolución de los fármacos.
Los ensayos de disolución se realizan en el aparato
II de
paletas en
un dispositivo
semiautom
ático (Sotax AT 7 Sm
art). Con
1000m
l de tampón de fosfato pH
6,8 a37ºC
como
medio de disolución;
velocidad de rotación de las
paletas de 50 rpm. C
ada formulación se
analiza por
sextuplicado durante
24 h.
La concentración de K
y DK
-T se determina por
espectrofotometría U
V (Perkin Elm
er Lambda
2) a una longitud de onda de 259,1 nm y 260
nm
respectivamente.
Los resultados
de disolución-liberación
se ajustan a las ecuaciones cinéticas de orden cero, prim
er orden, Higuchi y
Korsm
eyer-Peppas.
Resultados
y D
iscusión: Las
curvas de
porcentaje de ketoprofenoliberado/tiem
po(fig
1) y DK
-T/tiempo (fig.3) ponen de m
anifiesto la influencia del tipo de fárm
aco y la presencia de m
anitol en el comportam
iento matricial de la
poliesteramida.PA
DA
S retiene al K y prolonga
su liberación, cediendoal
medio
de disoluciónel 81,36 (%
) de la dosisla fórm
ula 200P K, es
decir solo poliesteramida. La sustitución parcial
delpolím
ero por manitol increm
enta de forma
moderada la liberación
de K, detectando al final
del ensayo el 97,36 %y 100 %
de la dosis para las fórm
ulas con 100 y 50 mg de PA
DA
S respectivam
ente.
Figura 1.Perfiles de liberación de ketoprofeno
La menor
cantidad de manitol incorporada (47
mg/com
primido)
en la formulación 150 PM
Korigina una liberación lenta y gradual de K
siendo
el 66,89 (%) de la dosis a las 24 h. Tras
el ensayo de liberación, los comprim
idos con 150 m
g de polímero m
antienen su morfología
yuna
superficie ligeram
ente erosionada.
Ladism
inución del contenido en polímero m
atricial (100 PM
K) increm
enta la erosiónen superficie
sin llegar a romperse la estructura m
atricial(fotografías de la fig. 2).
123
Figura 2. Com
primidos de ketoprofeno con
PAD
AS después de 24 de ensayo.
El estudio cinético (tabla 2) indica queen
las form
ulaciones con PAD
AS la liberación de K
se ajusta m
ejor a la cinética de Higuchi y el valor
del exponente
n sugiere
que el
mecanism
o principal de liberación de ketoprofeno es la difusión controlada.
Tabla 2 . Parámetros
de liberación comprim
idosketoprofeno.
PAR
ÁM
ETRO
S CIN
ÉTICO
S
CIN
ÉTICA
S200 PK
150 PMK
100 PMK
50 PMK
0 PMK
Caps.K
OR
DEN
CER
OK
03,13
2,644,03
4,46---
---
r 20,866
0,943 0,967
0,932---
---
OR
DEN
UN
OK
1-0,06
-0,04-0,13
-0,14-0,64
-21,65
r 2 0,973
0,9880,940
0,9880,931
0,963
HIG
UC
HI
KH
17,11413,963
20,97823,702
------
r 2 0,979
0,9980,990
0,994---
---
KO
RSM
EYER-
PEPPAS
KK
P16,25
12,59 13,26
3,27---
---
r 20,961
0,997 0,997
0,991---
---
n0,55
0,53 0,64
0,65---
---
PAR
ÁM
ETRO
S IN VITR
O
AB
C in Vitro (%
· h)1380,12
± 166,321065,76± 23,04
1477,93± 50,62
1732,06± 39,45
446,82±47,44
93,55±1,60
ED (%
)57,51
± 6,93
44,41±
0,9661,58
± 2,11
72,17± 1,64
74,47±
7,9193,55±1,57
TMD
(h)10,20
±1,66
13,34±
0,239,22
± 0,516,68
± 0,401,53
± 0,470,064±0,016
Los comprim
idos con DK
-T sin manitol
(200 PD
K-T),
y los de formulación 150 PM
DK
-T alcanzan el C
max a las 6 h del ensayo.
Sin em
bargo, los comprim
idos mantienen su form
a hasta el final del ensayo (24 h) com
o muestra
las fotografías de la figura 3.
Figura 3. Com
primidos de dexketoprofeno
trometam
ol tras 24 h de ensayo.
Aun
siendo de
liberación convencional,
la velocidad es algo m
ás lenta que en fórmulas con
menor
cantidad de
PAD
AS
(fig. 3).
Lapoliesteram
ida no consigue retener el DK
-T ajustándose los datos de liberación al m
odelo cinético de prim
er orden (r 2=0,992).
Figura 4.Perfiles de liberación de
dexketoprofeno trom
etamol
La incorporación de manitol en la form
ulaciónincrem
enta la
velocidad de
liberación, encontrando en el
medio de disolución la
totalidad de la dosis (100 %) entre la 1 y 4 h de
ensayo y la liberación se origina según una cinética de prim
er orden (tabla 3).
Tabla 3. Parámetros de liberación de
dexketoprofeno trometam
ol.PA
RÁ
METR
OS C
INÉTIC
OS
CIN
ÉTICA
S200
PDK
-T
150
PMD
K-T
100
PMD
K-T
50
PMD
K-T
0
PMD
K-T
Caps.
DK
-T
OR
DEN
CER
OK
013,85
14,08 ---
--- ---
---
r 2 0,854
0,735 ---
--- ---
---
OR
DEN
UN
OK
1-0,36
-0,53 -1,79
-3,33-8,60
-5,17
r 2 0,992
0,965 0,983
0,999 0,972
0,877
HIG
UC
HI
KH
38,4341,10
--- ---
------
r 20,987
0,941 ---
--- ---
---
KO
RSM
EYER-
PEPPAS
KK
H38,67
5,60 ---
--- ---
---
r 20,969
0,968 ---
--- ---
---
n0,49
0,41 ---
--- ---
---
PAR
ÁM
ETRO
S IN VITR
O
AB
C in Vitro (%
· h)2026,27±
17,152199,12±
56,402290,27±
91,162301,05± 22,23
561,96±10,36
90,17± 1,73
ED (%
)84,43
± 0,7291,63
± 2,3595,43
± 3,8095,88
± 0,9393,66±1,73
90,17±1,73
TMD
(h)3,74
± 0,172,01
± 0,561,10
± 0,910,99
± 0,220,38
± 0,100,098± 0,02
Conclusiones:
El polím
ero PA
DA
S puede
considerarse un
excipiente soporte
matricial
adecuado para la elaboración de comprim
idos. C
ontrolay prolonga
la liberación de ketoprofe-no y el m
anitolpermite m
odular esa liberación.M
uestra m
uy poca
eficaciapara
retener el
dexketoprofeno trometam
olen la matriz.
Referencias:
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ndalucía (Proyecto Excelencia 2006 FQM
1370) y por la C
ICY
T (Proyecto MA
T 2006-02406).
124
DE
SAR
RO
LL
O Y
CA
RA
CT
ER
IZAC
IÓN
DE
TR
AN
SFER
SOM
AS
®D
E A
CE
TA
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LA
MID
A
PAR
A E
L T
RA
TA
MIE
NT
O D
EL
GL
AU
CO
MA
M.J. C
ózar-Bernal, A
.M. R
abasco, N. A
bad, M.L. G
onzález-Rodríguez
Departam
entode Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Sevilla, España
IntroducciónA
ctualmente
el fárm
aco de
elección en
el tratam
iento del
glaucoma
agudoes
acetazolamida (A
CZ)
por su efectividaden el
control de la presión intraocular. Para facilitar su adm
inistración tópica, debidoa
su baja solubilidad y permeabilidad (clase IV
,B
CS) y ante la dificultad de los liposom
as convencionales
para atravesar
intactos determ
inadas capas
de la
piel o
mucosas
quedandoacum
ulado el fármaco
en el lugar de aplicación, C
evc y Blum
e propusieron, en1992,
el diseño de vesículas elásticas, Transfersomas ®,
que poseen
una m
embrana
altamente
deformable,
y son
capaces de
atravesar el
estrato córneo sin ser destruidas, accediendoasí
a estructuras más internas.
Para ello, seincluyen en su com
posición los denom
inados “activadores del borde o margen”
en el interior de la matriz fosfolipídica, con el
fin de
incrementar
la elasticidad
ydeform
abilidad de la vesícula(El Zaafarany y
cols., 2010).
Este tipo
de sustancias
son habitualm
ente tensioactivos de cadena única, capaces
de ofrecer
un elevado
radio de
curvatura que
desestabilicen las
bicapas lipídicas
de las
vesículas e
incrementen
su deform
abilidad (H
oneywell-N
guyen y
Bouw
stra, 2005).En
el presente
trabajo se
desarrollan Transfersom
as ®de A
CZ y posteriorm
ente se caracterizarán
en cuanto
a eficacia
de encapsulación,
tamaño
vesicular, índice
de polidispersión y potencial zeta, evaluando la influencia de la adición de tensioactivos de distinta naturaleza, así com
o la adición de un agente portador de carga positiva a las vesículas y de colesterol.
Materiales y M
étodosM
aterialesA
CZ
(Acofarm
a, España),colato, desoxicolato
y taurocolatosódico, 1,2-dipalm
itoil-sn-glicero-3-fosfocolina
semisintética,
estearilamina
ycolesterol (Sigm
a Aldrich, A
lemania), H
epes, acetato de sodio, lauril sulfato sódico y dem
ás disolventes(Panreac Q
uímica S.A
., España).Estudios de solubilidadC
on el fin de obtener una formulación capaz de
incorporar la máxim
a cantidad de fármaco, A
CZ
se repartirá
entre la
bicapa lipídica
y el
compartim
ento acuoso de las vesículas. En prim
er lugar se llevará a cabo unestudio en
placas de solubilidad (Solvinert, Millipore)
en presencia
deH
epes, adicionándole
distintos
tensioactivos: colato sódico, desoxicolato sódico y taurocolato sódico, que form
arán parte de la bicapa y que van a conferir a
los liposomas la
deformabilidad deseada.
La incorporación de fármacos poco solubles en
medio acuoso, com
o es el caso de AC
Z, en form
ulaciones de liposomas, resulta un tanto
compleja.
Norm
almente,
este tipo
de com
puestos forman parte de la bicapa lipídica
de las vesículas. Sin embargo, la adición de una
fracción de la dosis en el compartim
ento acuoso puede ser beneficiosa en térm
inos de estabilidad e increm
ento de la encapsulación del fármaco.
Para ello
se ha
recurrido a
un estudio
decosolvencia con PEG
400y glicerina, con el fin
defavorecer la incorporación del fárm
acoen el
espacio acuoso. Elaboración de vesículas m
ultilaminares
Los Transfersomas ®
se elaboraron utilizando la técnica de evaporación en capa fina o B
angham
(TLE, Thin Layer Evaporation). La m
ezcla de lípidos (fosfolípidos y colesterol), el activador del borde
yla A
CZ
se disolvieron en una m
ezcla de cloroformo: m
etanol (3:2 v/v) El disolvente orgánico se evaporó bajo presión a 58 ºC
hasta obtener una fina película. Éstase
hidrató con
una solución
de H
epes/PEG400
(70:30) mediante cinco ciclos interm
itentes de vortex y calor
a 50 ºC.Tras su elaboración, se
sometieron al proceso de extrusión con el fin de
obtener poblaciones
unilaminares
más
homogéneas.Las
vesículas se almacenaron a 4
ºC hasta su uso.
Caracterización de los sistem
asPara
caracterizar correctam
ente los
sistemas
elaborados se
procedió secuencialm
ente al
estudio de
tamaño
por espectroscopía
de correlación
fotónica.Se
determinó
la carga
superficial utilizando un Zetasizer Nano
ZS.La eficacia
de encapsulación se determinó
por dos m
étodos, extracción en fase sóliday
extracción por centrífuga.Para cuantificar de form
a precisa laA
CZ, se
desarrolló un método analítico isocrático de fase
reversapor
HPLC
, cuya
fase m
óvil está
compuesta por acetonitrilo y solución de acetato
sódico 0.05 Majustada
a pH 4.1 (10:90 v/v),
utilizando un flujo de 0.8 mL/m
in. R
esultados y Discusión
Tras el estudio de solubilidad de AC
Z en los tensioactivos seleccionados, se puede observar en la figura 1,que en los tres casos, conform
e aum
enta la concentración de tensioactivo, se increm
entala solubilidad de la A
CZ en H
epes.
125
No
obstante, dicho
incremento
no es
tan considerable en presencia de taurocolato sódico debido
a la
diferente capacidad
de estos
tensioactivos para autoasociarse en estructuras agregadas
(Mithani
y cols.,
1996). Se
ha obtenido una m
ayor solubilización del fármaco
en el caso de desoxicolatosódico
debido a quese encuentra en una concentración superior al intervalo
de C
MC
, adquiriendo
una conform
ación de hélice, a diferencia de los otros tensioactivos,
que poseen
estructura m
icelarm
ayoritariamente
(Cross y cols., 2011).
Figura 1. C
antidad de ACZ solubilizada en función
dela
concentración de tensioactivos.
Para increm
entar la
cantidad de
fármaco
solubilizado en el compartim
ento acuoso, se estudió la solubilidad de A
CZ en disolventes no
polares (PEG 400 y glicerina), obteniéndose que
unadisolución
al 10%
p/v
de PEG
400
solubiliza 1.77 veces mejor que la disolución al
10% p/v de
glicerina(K
awakam
i y cols., 2006). Por ello, seleccionam
osla disolución al 10% p/v
de PEG 400 com
o codisolvente.Posteriormente,
se estableció el porcentaje de éste en la mezcla
PEG 400/H
epes.Com
o se observa en la figura 2, a m
edida que aumenta la proporción de PEG
400,
se increm
enta la
cantidad de
AC
Z solubilizada. Tam
bién se apreciaque con este
cosolvente al
40%
y al
80%,
se consigue
aumentar m
ucho más la solubilidad del fárm
aco. En relación a este hecho, hay que valorar, ante todo, que la form
ulación deestas
vesículas estará destinada a la adm
inistración oftálmica y,
por consiguiente,
no debe
superar una
proporción del 40% por lo que establecerem
os la proporción 60/40
(Row
e, 2009).
Figura 2. C
antidad de ACZ solubilizada
en función de la proporción de PEG
400.
Con respecto a la caracterización física
de los sistem
as vesiculares (tabla 1) podemos observar
una clara
diferencia entre
Transfersomas ®
extruidos y sin extruir (302nm
vs1343
nm)
mostrando un índice de polidispersión m
ucho m
ás homogéneo
las formulaciones extruidas.
En cuanto a los valores de potencial zeta,no se ven m
odificados por el proceso de la extrusión.
Tam
año (nm) IP Potencial zeta (m
V)
Cargados
SE E SE E SE E
1343 ± 381.1 302 ± 0.47 1 ± 0 0.09 ± 0.02
14.6 ± 0.9 16.7 ± 0.65
Blancos
SE E SE E SE E
1139 ± 0.23 339.2 ± 9.46 1 ± 0 0.05 ± 0.004 15.6 ± 0.9 17.7 ± 0.65
Tabla1. D
atos de tamaño, índice de polidispersión
ypotencial zeta
para lotes sin extruir(SE) y extruidos(E).
Para cuantificar la AC
Z encapsulada se han desarrollado
y com
parado dos
métodos
de extracción. C
omo se observa en la tabla 2, la
eficacia de encapsulación obtenida tras tratar las m
uestras con
ambos
métodos,
tienevalores
similares en vesículas sin extruir. Sin em
bargo, en
las m
uestras extruidas,
la eficacia
de encapsulación se ve aum
entada más de un 200%
cuando la extracción se hace con centrífuga.
EE (x ± sd)
Extracción
Fase sólidaE
xtracciónC
entrífugaSE
E
18.1 ± 10.5 10.5 ± 4.7
SE E
16.1 ± 5.3 26.8 ± 3.6
Tabla 2. Datos de eficacia de encapsulación para lotes sin
extruir(SE) y extruidos (E).
Conclusiones
A
través de
los resultados
obtenidos puede
concluirse que
los sistem
as elaborados
presentan buenas
características físicas
para atravesar intactos la barrera corneal, pudiendopresentarse
como alternativa al tratam
iento del glaucom
a por vía tópica.
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gradecimientos:
Este trabajo
se ha
desarrollado bajo la cofinanciación del Consejo
Andaluz
de C
olegios O
ficiales de
Farmacéuticos.
126
CY
CL
OSPO
RIN
E A
-LIPID
NA
NO
SYST
EM
SFO
R O
RA
L A
DM
INIST
RA
TIO
NM
. Guada, E. Im
buluzqueta, A. Estella-H
ermoso de M
endoza, M.C
. Dios-V
iéitez, M.J. B
lanco-PrietoD
epartment of Pharm
acy and Pharmaceutical Technology,
University of N
avarra, 31080 Pamplona, Spain.
IntroductionC
yclosporine A
(C
yA)
is a
neutral cyclic
peptide consisting of 11 aminoacid residues,
widely used for the prevention of transplant
organ rejection and also for the treatment of
several autoimm
une disorders. The molecule
was
first isolated fromthe fungal extract of
Tolypocladium inflatum
(1).Itsstructure and its
high molecular w
eight (1203 Da) confer
poor biopharm
aceutical properties on this substance such
as low
w
ater solubility
and low
perm
eability trough
biological barriers
(2).Therefore, it is a challenge to form
ulate an appropriate delivery system
that improves its
bioavalaibility and thus drug efficacy. To date,lipid nanosystem
s (LN) seem
to be a very
promising strategy to
overcome the lim
itationsassociated
with
certain drug
characteristics including
low
solubility, poor
permeability,
instability in the gastrointestinal medium
, P-glycoprotein
efflux and
presystemic
drug m
etabolism(3).
Based
on this,
the m
ain objective w
as to develop and characterize lipid nanocarriers for C
yA oral adm
inistration. These novel nanosystem
s areaim
edto m
odify the biodistribution of the drug, and thus prevent renal
toxicity and
enhance its
oral bioavailability.
In order
to evaluate
the encapsulation efficiency of the new
delivery system
s obtained, it was necessary to develop
and validate an analytical method
to quantifyC
yA in lipid m
atrices and also in biological sam
plesfor future in vivo
studies. The method
was based on ultra high perform
ance liquid chrom
atography combined w
ith tandem m
ass spectrom
etry (UH
PLC–M
S/MS).
Material and m
ethodsD
evelopment and validation of the U
HPLC
–M
S/MS
method
The UH
PLC system
consistedof an A
cquity U
PLCTM
system (W
aters Corp., M
ilford, MA
, U
SA).
Chrom
atography was perform
edon an
Acquity U
PLC®
BEH
C18 colum
n (50 mm
x 2.1 m
m, 1.7
m;
Waters, U
SA) w
ith am
obile phase system
consistingof a gradient elution
program of a 2 m
M am
monium
acetate solutionw
ith 0.1% form
ic acid and methanol and w
ith a flow
rate of 0.6 mL/m
in. Colum
n temperature
was m
aintained at 50oC
. The mass spectrom
eterdetection w
as performed on an A
cquityTM
TQD
(Triple Q
uadrupole Detector) m
ass spectrometer
(Waters C
orp., Milford, M
A,
USA
) with an
electrospray ionization (ESI) interfaceoperated
in positive mode. The apparatus w
as set up for
multiple reaction m
onitoring (MR
M) to m
onitor the transition of m
/zfor C
yA
and the
transition of
m/z
amiodarone, used as
internal standard(IS). The
method
was validated in term
s of linearity, accuracy and betw
een- and within-day precision
for both lipid matrices and biological sam
ples.
Application of the U
HPLC
–MS/M
Sm
ethod todeterm
inate CyA
in blood samples
This study was perform
ed in two groups of
BA
LB/c m
ice(n=6). A
nimals w
ere given a single dose of 10 m
g/kg of CyA
as comm
ercial form
ulations either orally (p.o.) (Sandimm
un N
eoral ®) or intravenously (i.v.) (Sandimm
un®).
Whole blood sam
ples were w
ithdrawn at 0 h
(only after i.v. administration), 1 h, 2 h, 5 h, 8 h,
24 h and 48 h. Finally, samples w
ere pretreated w
ith a protein precipitation method and C
yA
was quantified by the U
HPLC
-MS/M
S method.
Preparation and
characterization of
the LN
form
ulationsLN
w
ere prepared
by hot
homogenization
followed by ultrasonication m
ethod(4). B
riefly, 200 m
g of lipid (Precirol ®A
TO 5) and 5 m
g ofC
yA w
ere melted at 70 °C
(slightlyabove
of the lipid m
elting point). Then, 10 mL of a surfactant
aqueous solution (mixtures of
2% polyvinyl
alcohol (PVA
) and 2% sodium
taurocholate (TC
)) (table
1), preheated
at the
same
temperature
were
addedand hom
ogeneously dispersed by
ultrasonicationfor 4
min. Finally,
the formed em
ulsion was cooled in an ice bath
inorder to obtain a nanoparticle
suspension, w
ashed three times
and lyophilized. Particlesize,
polydispersity index
(PDI)
and zeta
potentialof the LNw
ere evaluated by dynamic
light scattering
technique and
laser D
oppler electrophoresis, respectively, using a Zetasizer N
ano(M
alvern Instrum
ents, U
K).
Encapsulation efficiency (EE) was determ
ined by
the U
HPLC
-MS/M
S m
ethod described
above.
Results and discussion
Validation of the U
HPLC
–MS/M
Sm
ethodThe m
ethod was linear in the range of 0.001
g/mL-2.
whole blood. A
ccuracy and precision expressed in coefficient of variation w
ere below 15%
. R
ecoveries in the case of whole blood sam
ples w
ere above 98.72%. This analytical m
ethod proved to be suitable and sensitive enough to allow
a complete pharm
acokineticstudy of C
yA
127
in mice and to evaluate the contained drug in the
new LN
formulations.
Blood
concentration-time
profile of
CyA
in
comm
ercial formulations
CyA
blood
concentration w
as quantified
in order
to determ
ine the
pharmacokinetic
behaviorof
the drug
when
administered
as Sandim
mun
®or Sandim
mun N
eoral ®. Figure 1 depicts the concentration-tim
e courseof C
yAafter its oral and intravenous adm
inistration. The
drug follow
edthe
typical blood
concentration-time
profile of
these adm
inistration routes.
This study
will
be a
benchmark
for com
parison w
ith the
pharmacokinetic behavior
of CyA
administered
as new nanocarrier system
s, and confirmed the
suitability of
the U
HPLC
–MS/M
S m
ethoddeveloped.
Figure 1. CyA
concentration-time profiles after i.v
and p.o
administration
of Sandim
mun
®and
Sandimm
un Neoral ®, respectively, in B
ALB
/c mice
(n=6).
Characterization of LN
formulations
Table 1 summ
arizes the characteristics of the LN
form
ulationsdeveloped.
Nanoparticles
containing PVA
in the formulation presented
mean diam
eters below 250 nm
, which m
ake them
suitable for oral administration H
owever,
LN form
ulated with 100%
of TC (LN
(0:100))show
ed a larger particle size, probably due to the inadequate surfactant effect of TC
in this condition.
Therefore, this
formulation
was
discarded for further studies. PDI w
ere below
0.2 in all the cases, indicating that LN w
ith a narrow
size
distribution w
ere obtained.
Moreover, zeta potential w
as negative in all LN
formulations,
decreasing w
henthe
TCconcentration in the form
ulation was increased
(-23.0m
V for LN
with 0%
of TCto -37.5 m
V
for LN w
ith 100%of it, table 1). Finally, all
formulations achieved a high drug encapsulation
close to 100%.
Table 1.
Physico-chemical
characteristicsof
LN
formulations loaded w
ith CyA
LN
Form
ulation(PV
A:TC
)
Size (nm
)
ZetaPotential
(mV
)
EE(%
)
LN (100:0)
241.8-23.0
99.99LN
(75:25)223.0
-26.899.99
LN (50:50)
227.9-27.5
97.17LN
(25:75)220.1
-30.599.99
LN (0:100)
537.7-37.5
91.55PV
A: polyvinyl alcohol, TC
: sodium taurocholate, EE:
encapsulation efficiency
These LN form
ulations will be evaluated in
future in vivostudies, designed to
reduce the variability
in bioavailability
observed w
ith com
mercially available oral C
yA form
ulationsand to avoid
toxicity due to high concentrations.
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ION
ES L
IPOSO
MA
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ÁL
MIC
AS C
ON
V
ITA
MIN
A C
PAR
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cular (USIO
), Hospital C
línico San Carlos, U
niversidad Com
plutense de Madrid, España.
Introducción
El Síndrom
e de
Ojo
Seco (SO
S) es
una enferm
edad multifactorial de la lágrim
a y de la superficie ocular que cursa con síntom
as de disconfort, alteraciones visuales e inestabilidad en la película lagrim
al con riesgo de dañarla
superficie ocular 1.A
ctualmente no existe ningún tratam
ientoeficaz
para el SOS debido a la com
pleja composición y
carácter dinámico de la película
lagrimal. Las
lágrimas artificiales
constituyen el tratamiento
de elección
en cualquier
estadio de
la enferm
edad.Los
sustitutoslagrim
ales com
ercializados no incluyen la totalidad de los com
ponentes dela lágrim
a natural. No obstante,
haincrem
entadoel núm
ero de formulaciones
oftálmicas
con sustancias
para m
ejorar la
película lagrimal desestabilizada, com
o es el caso
de la
vitamina
C.
El ácido
ascórbico presenta propiedades antioxidantes protegiendo la
superficie ocular
del daño
oxidativo y
favorecela producción de lágrim
anatural 2.En
solución acuosa es altamente inestable por lo
que se recurre al empleo de derivados com
o son el ascorbato sódico, el palm
itoil-L-ascórbico y la sal trisódica 2-fosfo-ascórbica
(SAP).
Debido a la im
portancia de la película lipídica se han desarrollado
formulaciones con lípidos
en forma de liposom
as, capaces de incorporar los dos derivados de la vitam
ina C, palm
itoil-L-ascórbico y SA
P, incluidos en la bicapa lipídica o
en el
núcleo acuoso
de las
vesículas respectivam
ente. El objetivo de este estudio es
el desarrollo de form
ulacionesde adm
inistración tópica ocular con una
composición sem
ejante a la lágrima
natural capaces de estabilizar el filmlipídico
mejorando la calidad de la lágrim
a.
Materialesy M
étodos
Materiales
Fosfatidilcolina(PC
) obtenida de lecitina de soja
(Phospholipon
90G®
, Phospholipid
Gm
bH). C
olesterol (Cht),
-tocopherol (Vit. E),
ácido ascórbico, ascorbato sódico, palmitoil-L-
ascórbico y sal trisódica 2-fosfo-L-ascórbico (Sigm
a Chem
ical Co.).
Estudios prelim
inares de
estabilidad de
soluciones con ácido ascórbico y derivados
Determ
inación del
%
remanente
de ácido
ascórbico, ascorbato
sódico y
SAP
en soluciones acuosas (PB
S isotónico pH 7,2) por
espectrofotometría
UV
-Vis
respectivamente.
Muestras protegidas de la luz y alm
acenadas a tem
peratura ambiente (25°C
) y nevera (2-7°C).
Método de preparación de las form
ulacionesliposom
alesSe
han elaborado
dosform
ulaciones liposom
ales(F-1 y F-2) de acuerdo con la
técnica deevaporación del solvente orgánico
3
modificada por B
enitez et al 4.Los com
ponentes de la bicapa lipídica de laform
ulación liposom
al F-1
son PC
:Cht:V
it E:palm
itoil-L-ascórbico8:1:0,8:0,9
(ratio m
g/mL).
Com
o m
edio de
dispersión se
ha em
pleado PBS isotónico (280 m
Osm
/L). La bicapa lipídica de la form
ulación liposomal
F-2contiene
PC:C
ht:Vit
E 8:1:0,8
(ratio m
g/mL) utilizándose com
o medio de dispersión
una solución de SAP en PB
S isotónico. A
fin de homogeneizar el tam
año y la estructura de las vesículas form
adas, se ha procedido a lasonicación y posterior extrusión (Extruder ®)
en cascada a través de
filtros de policarbonato (N
ucleopore Lipex Biom
embrane
TM),10 ciclos a través de m
embranas con tam
año de poro de 0,8
m y 10 ciclos a través de m
embranas con
tamaño de poro de 0,22
m.
La concentración de PC y vitam
ina C expresada
como ácido ascórbico en F-1 y F-2
ha sido de 40 m
g/ml y 300
g/ml respectivam
ente.C
aracterizaciónde
las form
ulaciones liposom
alesSe ha analizado el tam
año de las vesículas lipídicas
por espectroscopia
de correlación
fotónica em
pleándose un
equipo Zetasizer
3000HR
(Microtrac Inc).
Del m
ismo m
odo se ha estudiado elpH (C
risonG
LP 21)a tem
peratura ambiente
y osmolaridad
(Knauer K
-7000) a una temperatura de 33ºC
5.Estudios de tolerancia in vitroLa tolerancia in vitro
de las formulaciones se ha
determinado
a través de medidas de viabilidad
celular en
dos líneas
celulares:conjuntiva
humana
(IOB
A-N
HC
) y
córnea hum
ana (H
uman C
orneal-Limbal Epithelial C
ells).La evaluación de la tolerancia se ha basado
en la técnica delM
TT a tiempos de exposición cortos
129
(15 minutos) para sim
ular tratamientos breves y
largos (1 y 4 horas)para sim
ular tratamientos
crónicos. Com
ocontrol positivo de viabilidad se
ha empleado
células tratadas con una solución de cloruro de bezalconio (B
AC
) al 0,005% y
como control negativo (viabilidad del 100%
) células sin tratar 6.
Resultadosy D
iscusión
Estudios prelim
inares de
estabilidad de
soluciones con ácido ascórbico y derivadosEl SA
P presenta una estabilidad en solución acuosa durante al m
enos 7 días, sin presentar diferencias significativas con la concentración inicial (p>0,05) tanto a tem
peratura ambiente
como a 2-7°C
. Sin embargo, las soluciones de
ácido ascórbico y ascorbato sódico muestran
una reducida estabilidaden am
bas condiciones de alm
acenamiento
(Fig. 1 y Fig. 2).
Figura 1. Estabilidad de las soluciones de ácido ascórbico, ascorbato sódico y SAP en PBS isotónico alm
acenadas a tem
peratura ambiente
(25°C).
Figura2. Estabilidad de las soluciones de ácido ascórbico,
ascorbato sódico y SAP en PBS isotónico almacenadas en
nevera (2-7°C).
Caracterización
de las
formulaciones
liposomales
Las form
ulaciones liposom
ales F-1
y F-2
presentan una
distribución de
tamaño
de partícula
unimodal
(Fig.3)
con valor
de diám
etro medio volum
en 149,6±9,6nm
para F-1 y de 169,7±5,5
nm para F-2.
Figura 3. Distribución de tam
año de partícula de las form
ulaciones liposomales F-1 y F-2 (n=
3).
El valor de pHde am
bas formulaciones resultó
ser próximo a la neutralidad y una
tonicidad fisiológica (Tabla 1).
Formulación liposom
alpH
Osm
olaridad (m
Osm
/L)
F-17,03 ± 0,04
289,1 ± 4,4F-2
7,09 ± 0,13285,7 ± 3,0
Tabla 1. Valores de pH y osm
olaridad F-1 y F-2 (promedio
±D
E) (n=3).
Estudios de tolerancia in vitroLos valores de viabilidad celular m
edios son superiores al 80%
en ambas líneas celulares
ensayadas (cornea
y conjuntiva)
para los
distintos tiempos de exposición ensayados (Fig.
4 y Fig. 5).
Figura 4.Valoresde viabilidad celular de las formulaciones
F-1 y F-2 en la línea celular de córnea humana.
Figura 5.Valoresde viabilidad celular de las formulaciones
F-1 y F-2 en la línea celular de conjuntiva humana.
Conclusiones
Las form
ulaciones liposom
ales F-1
y F-2
desarrolladas en el presente trabajo presentan propiedades óptim
as para su aplicación por vía tópica
oftálmica.
Los estudios
de viabilidad
celular confirman una tolerancia adecuada en
células que conforman la superficie ocular.
Am
bas formulaciones presentan características
apropiadas para el tratamiento de los síntom
as del Síndrom
e de Ojo Seco.
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r. Ilene K. G
ipson (Schepens Eye Research Institute,
Harvard M
edical School, Boston, M
A-EEU
U) por la línea
celular de córnea humana.
0 20 40 60 80100
02
46
824
168
% Remanente
Tiempo (horas)
Ácido
Ascórbico
Ascorbato
sódicoSA
P
0 20 40 60 80100
02
46
824
168
% Remanente
Tiempo (horas)
Ácido
Ascórbico
Ascorbato
SódicoSA
P
0 5 10 15 20 25
110
1001000
10000
Frecuencia (%)D
iámetro (nm
)
F-1
F-2
0 20 40 60 80
100
Control
negativoF-1
F-2C
ontrolpositivo
% Viabilidad celular
15minutos
1 hora
4 horas
0 20 40 60 80100120
Control
negativoF-1
F-2C
ontrolpositivo
% Viabilidad celular
15minutos
1 hora
4 horas
130
DE
VE
LO
PME
NT
AN
D C
HA
RA
CT
ER
IZAT
ION
OF SU
RFA
CE
-MO
DIFIE
D PL
GA
N
AN
OPA
RT
ICL
ES FO
R C
AN
NA
BIN
OID
S OR
AL
DE
LIV
ER
YI.M
uñoz-Rubio,L. M
artín-Banderas, J. Á
lvarez-Fuentes,M. Fernández-A
révalo, M.A
. Holgado
Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology, Faculty ofPharmacy, U
niversity of Seville,c/ Profesor G
arcía González, nº 2, 41012 Seville, Spain
holgado@us.es
Introduction: PLG
A
nanoparticles (PLG
A-
NPs)
haveproved
to be
very efficient
in im
proving drug
absorption after
oral adm
inistration. H
owever,
PLGA
-NPs
have som
e difficulties
which
tendsto
limit
their intracellular
uptake leading
a low
er bioavailability, such as a slight negative surface charge
or the
recognition on
the reticulo-
endothelial system
(R
ES)of
hydrophobic particles
as foreign
(1). To
solve these
limitations,
modification
of N
Psurface
properties can be achieved either by coating NP
surface with hydrophilic stabilizing, bioadhesive
polymers and
surfactants or by incorporating biodegradable
copolymers
containing a
hydrophilic moiety
(2). In the present w
ork CB
13, 1-Naphthalenyl[4-
(pentyloxy)-1-naphthalenyl] m
ethanonehave
been em
ployed as
a m
odel drug.
It is
a C
B1/C
B2 dual agonist w
hich displays potent antihyperalgesic activity in anim
al models and
limited brain penetration. O
n the other hand, C
B13
is a
cannnabinoid derivate
highly lipophilic w
hich belongs to class II compounds,
and as a consequence of its poor solubility and dissolution
in the
gastrointestinal fluids,
is incom
pletely absorbed (3).The objective of our w
ork is to elaborate CB
13-loaded-PLGA
NPs
and to modify their surface in order to im
prove C
B13 oral bioavailability.
Materials
and M
ethods: 1-N
aphthalenyl[4-(pentyloxy)-1-naphthalenyl]m
ethanone (CB
13) (Tocris, G
reat Britain), R
esomer®
RG
502H
(PLGA
) (B
oehringer Ingelheim
, G
ermany),
Chitosan low
MW
, Span® 60, Tw
een® 80,
Pluronic® F-68 and C
oumarin-6 and N
ile-red as fluorochrom
es (Sigm
a-Aldrich,
Germ
any). Eudragit
RSPO
(Mw
: 32,000 g/mol)
was a
generous gift
from
EvonikR
öhm
Gm
bH
(Germ
any). A
cetone PR
S, H
PLC-grade
acetonitrile, acetic
acid and
DM
SO
were
purchased from Panreac (Spain); threalose and
HC
l were obtained from
VW
R (Spain). V
itamin
E (BA
SF Chem
Trade Gm
bH, G
ermany)
and lecithin (C
argill Texturizing Solutions, Spain). Form
ulation of the PLGA particles:
The NPs w
ere prepared by a nanoprecipitation m
ethod (4). Briefly, a co-solution of PLG
A
(1.5% w
/v) and Span®60 (0.5%
w/v) in acetone
was added dropw
ise at 5 mL/h using a syringe
pump
into 15
mL
Pluronic®
F68 aqueous
solution (0.5% w
/v) under magnetic stirring.
After acetone evaporation,
the suspension was
centrifuged to collect the NPs. A
fter washing
twice, the N
Ps were re-suspended in a threalose
aqueous solution
(5%
w/v)
used as
cryoprotectant and then, the NPs w
ere freeze-dried.
For C
B13-PLG
A
loaded N
Ps, the
polymer and drug w
ere co-dissolved in acetone. N
Ps surface modification:
To produce surface modified-PLG
A N
Ps, four m
ucoadhesive additives were assayed: C
hitosan, Eudragit
RSPO
, Lecithin,
and V
itamin
E. A
dditives, at different concentrations, were co-
dissolved in the polymer solution, except for
chitosan, which w
as added in an additional step (after N
P formation).
Characterization
methods:
the m
ean particle
size and
particle size
distributions w
ere m
easured at
room
temperature
by laser
scattering (Partica
LA-950
V2,
Horiba).
Geom
etry and
surface m
orphology w
ere determ
ined by scanning electron microscopy
(SEM) (Philips X
L-30, Philips Electron Optics)
and transmission electron m
icroscopy (TEM)
(Philips CM
-10, USA
).NPs surface
chargew
asevaluated by m
easuringzeta potential values
(ZP) at r.t. (Malvern M
astersizer 2000). CB
13 content
was
determined
by H
PLC
(Hitachi
LaChrom
(D-7000) Series) and expressed in
terms of entrapm
ent efficiency (EE %).
For in vitrodrug release, N
Ps samples
were
suspended in
phosphate buffer
(pH=7.4)
containing 0.1%w
/v of Tween®
80, maintained
at37 ºC and stirred m
echanically.Aliquots w
ere w
ithdrawn at fixed tim
e intervals and filtered upon centrifugation at 10000 rpm
. The filtered sam
ple was injected into
the HPLC
apparatus for the evaluation of C
B13
(5). Ex vivo
assays were also carried out in order to
evaluate the mucoadhesion properties of each
sample. For this purpose
the falling liquid film
technique was carried out (6).
Results
andD
iscussion: The
main
physicochemical characteristics of PLG
A-N
Ps surface-m
odified (CB
13-loaded or non-CB
13-loaded) w
ere listed in Table 1 in terms of
particle size (nm), drug encapsulation efficiency
(%) and ZP
(mV
).Related to particle size,N
PP m
ethod allow
ed obtaining
particles in
the nanoscale range w
ith almost narrow
particle size distribution in all form
ulations. Studying each form
ulation in deep, there are obtained expected
results. For
PLGA
-Eu-NPs,
was
obtained the smallest particle size. H
owever,
when N
Ps were incubated in C
S (PLGA
-CS-
131
NPs)
mean
diameter
of the
nanoparticles increased up to 45
%.
Different values for ZP w
ere obtainedas a
function of the additive employed. ZP values for
plainPLG
A-N
Ps were
used as control.PLGA
-Tc-N
Ps and
PLGA
-Lc-NPs
showed
slighter negative value. H
owever, the PLG
A-Eu-N
Ps and PLG
A-C
S-NPs ZP values w
ere stronglypositive. So, these tw
o formulations are a priori
the most suitable
for an oral administration.
PLG
A-N
PsSize ± SD
(nm)
ZP ± SD(m
V)
EE
± SD (%
)
Control N
Ps Blank
289,65 ± 97,90 -32,70 ± 0,50-
ControlN
Ps CB
13322,34 ± 113,55
-35,60 ± 1,1071,04
± 2,33E
u-NPs B
lank309,65 ± 113,33
16,10 ± 1,40-
Eu-N
Ps CB
13325,31 ± 131,80
11,80 ± 0,6085,45 ± 3,09
CS-N
Ps Blank
337,75 ± 116,3357,70 ± 2,90
-C
S-NPs C
B13
420,07 ± 193,0059,00 ± 1,10
91,59 ± 0,87L
c-NPs B
lank296,65 ± 103,50
-21,00 ± 1,70-
Lc-N
Ps CB
13337,79 ± 125,10
-16,10 ± 0,4080,85 ± 1,98
Tc-N
Ps Blank
320,97 ± 119,70-18,80 ± 0,40
-T
c-NPs C
B13
343,71 ± 173,20-17,10 ± 0,50
77,78 ± 2,82
Table 1. Physicochem
icalcharacteristics
and drug loading
of PLGA
-NPs surface-m
odified.
SEM and TEM
micrographs for C
B13-PLG
A-
NPs surface-m
odifiedN
Ps showed in all cases
spherical and smooth particles (data not show
n).R
esults obtained
for drug
contentare
summ
arized in Table 1.In terms of entrapm
ent efficiency (EE %
), high values were achieved
for all formulations of N
Ps developed, due to the poor solubility of C
B13 in the external
aqueous phase. In all cases EE was superior to
70%, reaching a higher value to 90%
forPLGA
-C
S-NPs.
The representative CB
13 in vitrorelease profile
from PLG
A-N
Ps surface modified show
ed the typical
drug release
mechanism
s in
PLGA
-based
delivery system
s. M
oreover, after
conducting the
test during
15 days,
no hydrolysis
products w
ere detected
CB
13 or
degradation, indicating that the system keeps the
CB
13 in
the structure
of the
developed nanocarrier(data not show
n).Finally, the results of m
ucoadhesion properties for
PLGA
-Eu-NPs
and PLG
A-C
S-NPs
are show
n in figure 3. Forthis assay, NPs w
ere died w
ithnile red. A
freshly excised porcine small
intestine 15
cm
pieces w
ere cut
fromthe
intestine (duodenum
, jejunum
and
ileum
sections) and washed w
ith physiological saline (37°C
). Then, 600 L of N
Ps suspension in PBS
(or dye
solution, as
control) w
ere added
dropwise, this step w
as repeated ten times. The
fluorescence intensity
of the
final residual
solution was m
easured with a plate reader
=380/40 nm
460/40 nm). A
s it can be seen in figure 1, C
S-PLGA
NPs show
ed the higher
mucoadhesion
strength.These
results w
ere in accordance with ZP values obtained.
Figure 1. Mucoadhesion
strength of PLGA
NPs
containing CB
13 (error bar: SD)
Conclusions: D
ifferent additives to modify the
surface of CB
13 loaded-PLGA
nanoparticles have been em
ployed in order to improve C
B13
oral bioavailability. After in vitro
and in vivoevaluation,
NPs
containing chitosan
and Eudragit
RSPO
w
ere the
most
suitableform
ulations. For these additives, NPs
were
300-420 nm in diam
eter and presented positive ZP values w
hich improved the
mucoadhesion
strength to the intestinal mucosa as ex vivo
assays demonstrated.
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132
EST
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PAR
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DE
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TE
S Y FL
OW
FOC
USIN
G®
J.L. Arias 1, L. M
artín-Banderas 2, M
.M. D
urán-Lobato2, J.Á
lvarez-Fuentes 2, M. Fernández-A
révalo2,
M.A
.Holgado
2
1Dpto.de Farm
aciay Tecnología Farm
acéutica, Universidad de G
ranada, España. 2D
pto. de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de Sevilla, España.
e-mail: holgado@
us.es
Introducción: U
no de
los principales
problemas relacionados con la quim
ioterapia em
pleada en clínica actualmente es
la reducida acum
ulación que el agente antitumoral alcanza
en la
masa
de células
malignas.
Diversos
factores contribuyen
a esta
situación, por
ejemplo,
una intensa
metabolización
(y aclaram
iento presistémico), junto a una extensa
distribución de
la sustancia
activa en
el organism
o. A
demás,
los antineoplásicos
utilizados suelen caracterizarse por una escasa especificidad de acción (1).U
n claro ejemplo de
esta situación
lo constituye
la gem
citabina: m
olécula que
tiene una
muy
rápida m
etabolización sistémica
(t1/2< 17 m
in) (2). R
ecientemente,
se ha
propuesto su
incorporación en
coloides biodegradables
de naturaleza polim
érica para optimizar su eficacia
y seguridad en el tratamiento de diversos tipos
de cáncer (2, 3).Su vehiculización en estos
sistemas intenta asegurar la concentración de la
dosis de este quimioterápico en la m
asa tumoral,
a la
vez que
pretendeuna
mínim
a biodistribución.
En este sentido, la poli( D,L-lactida-co-glicolida)
(PLGA
) puede
presentar interesantes
posibilidades com
o m
atriz biocom
patible y
biodegradable, am
pliamente
utilizada en el diseño de nanopartículas (NPs)
para el transporte de fármacos (4).
El objetivo
dela
presente contribución
es diseñar y optim
izarN
Ps de PLGA
conteniendo clorhidrato de gem
citabina, como nanocarriers
de este antineoplásico. Para ello, se compararon
dos técnicas
de síntesis
mediante
diversas caracterizaciones fisicoquím
icas: el método de
doble emulsión con evaporación de disolventes
(DE/SEV
) y
la novedosa
técnica de
Flow
Focusing®
(FF).
Materiales y M
étodos:El agua utilizada en
todos los
experimentos
fue desionizada
y filtrada antes de su uso (M
illi-Q,
Millipore,
Francia). Todos los reactivos utilizados tenían calidad analítica (Sigm
a-Aldrich, A
lemania).
En los dos métodos de síntesis de N
Ps de PLGA
se utilizó idéntica cantidad polím
ero (2.5%, p/v)
disuelto en
etilacetato.Se
desarrollaron 2
formulaciones (sin carga de fárm
aco y cargadas)para cada m
étodo de elaboración empleado.La
síntesis de NPs de
PLGA
mediante D
E/SEV y
FFha sido previam
ente puesta a punto por
nuestro grupo de investigación (5), siendo las únicas variantes introducidas en este trabajo: (a) la velocidad de agitación (8000 rpm
)en el
método
DE/SEV
,y
(b)las
velocidades del
fluido enfocante
(mezcla
agua:etanol 1:1,
2 m
L/min) y del fluido enfocado (em
ulsión A/O
,fase
acuosa: solución
de gem
citabina, fase
oleosa: PLGA
en etilacetato, 0.1 mL/h), para el
método de FF.
La caracterización fisicoquímica de las N
Psobtenidas
se realizó
mediante
SEM
y PC
S (geom
etría), y electroforesis (potencial zeta, ,
en función del pH del m
edio de dispersión). La incorporación de gem
citabina en las partículas de PLG
A y su posterior liberación in vitro (37
ºC y pH
7.4, método de diálisis) se cuantificó
mediante
un m
étodo validado
de espectrofotom
etríaU
V-V
is(269
nm).
La vehiculización de este principio activo se indicó en térm
inos de entrapment efficiency (EE
%).
Todos los
experimentos
se realizaron
por triplicado.
Resultados y D
iscusión:El m
étodo de síntesis basado en la técnica FF perm
itió obtener NPs
con una distribución de tamaños notablem
ente hom
ogénea (655
± 79
nm,
índice de
polidispersión: 0.054). Sin embargo, la técnica
de D
E/SEV
condujo a
la preparación
de m
icropartículas con
una heterogénea
distribución de
tamaños
(3800 ±
1300 nm
, índice
de polidispersión:
0.257). En
ambos
casos, la incorporación de gemcitabina en las
partículas no tuvo una clara influencia en la geom
etríade
éstas,m
ostrandosiem
pre una
morfología esférica.
Por otro lado, en comparación con el m
étodo D
E/SEV, se lograron valores de EE
(%) de
gemcitabina m
uy superiores mediante el m
étodo FF
(figura 1).
Por ejem
plo, cuando
la concentración utilizada de fárm
acoera 1 m
M,
este parámetro pasó de 57.5 ± 5.2 %
(DE/SEV
) a 97.3 ± 0.1 %
(FF).Com
o puede apreciarse en la
figura, existe
un efecto
positivo de
la concentración de agente antitum
oral utilizada sobre
la incorporación
alcanzada en
las partículas de PLG
A.D
e forma com
plementaria,
las determinaciones de los valores de potencial
zeta de las partículas de PLGA
(cargadas con gem
citabina y sin carga) tuvieron como objetivo
principal la estimación cualitativa del tipo de
133
vehiculización obtenida en los dos tipos de síntesis: adsorción superficial o absorción en m
atriz.
Figura 1.Valores de
EE(%
) de gemcitabina en
las partículas de PLGA
en función del método
de elaboración: y
.
Com
o puede
apreciarse en
la figura
2, los
perfiles electrocinéticos
de las
partículas cargadas con fárm
aco coinciden con aquéllos correspondientes a las partículas sin carga. Estos resultados
ponen de manifiesto que el tipo de
incorporación lograda ha sido la absorción en m
atriz. Por otro lado, queda patente que el tipo de
síntesis utilizada
no influye
en las
propiedades electrocinéticasen función del pH
() de las partículas de PLG
A.
Figura 2.
Potencial zeta
(,
mV
) de
las partículas
de PLG
A
sin fárm
aco (m
étodo
del pH y a fuerza iónica constante (K
NO
310
-3
M).
Por último, la preparación de las partículas de
PLGA
m
ediante la
técnica FF
asegura una
liberación de gemcitabina m
ucho más sostenida
en el
tiempo,
lo cuál
unido al
tamaño
nanométrico
del sistem
a, hace
que esta
estrategia de formulación sea a priori
la más
idóneapara
fines terapéuticos.
La figura
3 m
uestra cómo en am
bos casos el perfil de liberación es bifásico, si bien m
ás rápido en el caso de las m
icropartículas (DE/SEV
, completo
en 72 h). La liberación de gemcitabina desde las
nanopartículas preparadas
mediante
FF
transcurre con una primera fase de liberación
rápida del fármaco situado
más externam
ente en la m
atriz ( 30 %
en 6 h), seguida de una fase lenta (com
pleta en 102 h)debida a
la difusión de este agente y a la degradación polim
érica.
Figura 3.Perfiles de liberación de gemcitabina
(%) desde las partículas de PLG
A preparadas
en una solución tam
pón NaO
H-K
H2 PO
4 (pH 7.4 ± 0.1) a 37.0 ±
0.5 ºC.
Conclusiones:
Se han
comparado
dos estrategias de síntesis
de partículas de PLGA
cargadas
con gem
citabina. Este
estudio ha
demostrado
que el método FF es claram
ente m
ejor que el DE/SEV
: se obtienen partículas m
ás pequeñas, con una mayor capacidad de
carga del
antitumoral
y con
un perfil
de liberación m
ucho más sostenido en el tiem
po. La utilidad de estas nanopartículas en
la mejora
de la actividad de gemcitabina se encuentra
en evaluación in vitro
ein vivo.
Referencias:
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Agradecim
ientos:Ingeniatrics
Tecnologías S.L., Sevilla, España; Proyecto FIS 11/02571 (Instituto de Salud C
arlos III, España).
134
CY
CL
OD
EX
TR
IN-PO
LY
(AN
HY
DR
IDE
) NA
NO
PAR
TIC
LE
S FOR
TH
E O
RA
L
DE
LIV
ER
Y O
F CA
MPT
OT
HE
CIN
J. Huarte, S. Espuelas, J.M
. Irache
Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology;University of N
avarra,
Pamplona, Spain
Introduction:
Cam
ptothecin (C
PT) is
a topoisom
erase I
inhibitor that was first isolated from
the bark of C
amptotheca acum
inatain 1966. A
though it show
s powerful anticancer activity, it has great
limitations such as poor solubility and stability
[1].
Figure 1. Cam
ptothecin. Chem
icalstructure.
When adm
inistered orally, camptothecin and its
analogues display a high variability and a low
bioavalability due
to their
physicochemical
characteristics and their presystemic m
etabolismw
ich has been related with the fact that they are
substrates of both the intestinal P-glycoprotein (P-gp)
and the
cytochrome
P450 enzym
e com
plex (CY
P 450)[2].
Recently,
the com
bination betw
een cyclodextrins and poly(anhydride) nanoparticles have been found to be effective to increase the ex
vivoperm
eability [3]
and the
oral bioavailability
[4] of
paclitaxel. These
cyclodextrin-poly(anhydride) nanoparticles
would conduct the loaded drug to the surface of
the enterocyte in which their cargo w
ould be released.
Then, the
presence of
the oligosaccharide w
ould inhibit the activity of both P-gp and C
YP450 allow
ing the absorption of the anticancer drug.
The aim
of
this w
ork w
as to
prepare and
characterizeC
PT-loaded nanoparticles. For this purpose, three different cyclodextrins have been studied:
sulfopropylated--cyclodextrin
(SP-N
P), hydroxypropyl-
-cyclodextrin (H
P-NP)
and methyl-
-cyclodextrin (M-N
P).
Materials and M
ethods:
Materials
Poly(methyl vinyl ether-co-m
aleic anhydride) or poly(anhydride)
(Gantrez®
A
N
119; M
W200,000) w
as kindly gifted by ISP (Barcelona,
Spain). Sulfopropylated-
-cyclodextrin w
as provided
by C
yclolab (H
ungary), hydroxypropyl-
-cyclodextrin and
methyl-
-cyclodextrin
were provided by Sigm
a (Spain).C
PT was purchased from
21CEC
PX PH
AR
M
Ltd (UK
). Acetone w
as obtained from V
WR
Prolabo
(Fontenay-sous-Bois,
France).
prepared by
a w
ater purification
system
(Wasserlab,
Pamplona,
Spain). A
ll other
chemicals and solvents used w
ere of analytical grade.
CPT-C
D-PVM
/MA nanoparticles preparation
Nanoparticles containing C
PT were prepared by
a solvent
displacement
method
previously described [3] w
ith some m
odifications. Briefly,
100m
g of
poly(anhydride), 18
mg
of cyclodextrin and a 4.5m
g of CPT (1:1 m
olar ratio of C
D:C
PT) were dispersed in 5 m
l of acetone.
Inmediately,
the nanoparticles
were
formed by the addition of ethanol and w
ater.A
fter elimination of the organic solvents, the
resulting suspensions were filtered through a
0.45 m
m
embrane
andpurified
twice
by centrifugation. The supernatants w
ere removed
and the pellets resuspended in water. Finally,
the formulations w
ere frozen and freeze-dried (G
enesis 12EL, Virtis, U
SA) using sucrose (5%
, w
/w) as cryoprotector.
Characterization ofnanoparticles
The particle
size and
the zeta
potential of
nanoparticles were determ
ined ina Zeta Plus
apparatus (B
rookhaven Instrum
ents C
orporation). The morphological exam
ination
135
of the nanoparticles was perform
ed by SEM.
The amount of C
PT loaded was quantified by
HPLC
from digested nanoparticles.
In vitro release studies
In vitrorelease studies w
ere carried out under sink
conditions after
the dispersion
of the
nanoparticles in simulated gastric (SG
F) and intestinal fluids (SIF) containing 1%
(w/v) of
Tween 80 as surfactant.
At different tim
es, sam
ples were taken and centrifuged through
Vivaspin
tubes at
3000xg for
20 m
in. Supernatants w
ere recovered and analyzed by H
PLC.
Results and D
iscussion:
The main physicochem
ical characteristics of the nanoparticles
are sum
marized
in Table
1.N
anoparticles displayed spherical shape with a
slightly rough surface, sizes between 130 and
170 nm and a negative surface of around -40
mV
. The amount of C
PT incorporated in the nanoparticles
ranged from
34
to 50
g/mg
depending on
the cyclodextrin
used. The
encapsulation efficiency ranged between 40 and
63%
.
Table 1.
Physico-chemical characteristics of
CPT-C
D
nanoparticles. D
ata expressed
as m
eanSD
(n=3).
Figure 2.Scanning Electron Microscopy (SEM
) of freeze-dried nanoparticles. A: SP-N
P; B: HP-
NP; C
: M-N
P.
Figure 3 shows the release profile of C
PTfrom
SP-N
P, HP-N
P and M-N
P. The in vitrorelease
profile of the three formulations exhibited a
biphasic pattern, characterized by an initial non
release period
when
the nanoparticles
were
incubated in
the SG
F follow
ed by
a rapid
release of about 50-60% of the loaded drug
when the nanoparticles w
ere dispersed in the SIF. The release then is m
antained and complete
after 18 hours of incubation.
Figure3.In vitro release profile of C
PT from
SP-NP, H
P-NP and M
-NP. D
ata expressed as m
eanSD
(n=3).
Conclusions:
SP-NP, H
P-NP and M
-NP
are able to load cam
ptothecin. The three types of nanoparticles show
gastroresistantproperties and they only
release the
loaded anticancer
drug under
simulated intestinal conditions.
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Acknow
ledgements:
This work w
as supported bythe A
sociación de A
migos of the U
niversity of Navarra and the
Spanish Ministry of Science and Innovation
(Project SAF2008-02538).
136
PRE
PAR
AC
ION
Y C
AR
AC
TE
RIZA
CIO
N D
E N
AN
OPA
RT
ÍCU
LA
S DE
PLG
A Y
QU
ITO
SAN
O C
ON
N
IME
SUL
IDA
C
. Huerta,M
.J. Peñas, L. Ludeña, M.R
. Aberturas,J. M
olpeceres
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia, U
niversidad de Alcalá, 28871 A
lcalá de H
enares, Madrid.
Introducción
La nimesulida (N
S) (4-nitro-2-fenoxi-metano-sulfon-
anilida) es un inhibidor selectivo de CO
X-2 clasificado
como
fármaco
clase II
dentro del
Sistema
de C
lasificación B
iofarmacéutico
(1). Su
perfil toxicológico a nivel
gastrointestinal es comparable
al que presentan
otros AIN
Es pero su riesgo hepatotóxico es m
ayor. La EMA
publicó en el 2012 un documento
en el que se establece la eficacia clínica de la NS para
uso sistém
ico en
tratamientos
a corto
plazo (2).
Algunos
autores han
puesto de
manifiesto
la sobreexpresión de C
OX
-2 encélulas tum
orales (3). Existen
trabajos publicados
que sugieren
quela
incorporación de la NS en nanopartículas (N
P) puederepresentar una alternativa para obtener una liberación controlada
del fárm
aco y
reducirasí
los efectos
adversos del mism
o cuando es administrado (4).
La finalidad de este trabajoes m
ejorar el potencial terapéutico de la N
S para el tratamiento coadyuvante y
prevención del
cáncer de
próstata, m
ediante su
incorporación en NP
capaces de actuar como depósitos
del fármaco y
de prolongar sus efectos sobre las células tum
orales de la próstata.
Materiales y m
étodos
Preparación de las NP
Las NP de
ácido poliláctico glicólico (PLGA
,RG
-504)y quitosano (C
S) cargadas con NS
(NPC
S)fueron
obtenidas mediante el m
étodo de evaporación del disolvente.La fase orgánica
que contiene PLGA
yN
S se dispersa utilizando ultrasonidos en una fase acuosa con PV
A.
Posteriormente se elim
ina el disolvente orgánico de la em
ulsión utilizando un rotavapory las NP obtenidas se
centrifugan a 12000g durante 15 min para elim
inar el PV
A en exceso de la fase acuosa. El residuo obtenido
se resuspende con una disolución de CS en ácido
acético. Tras incubar las NPC
S15 m
in en un baño a 37°C
, se vuelven a centrifugar a 20000g durante 15 m
in. Com
o formulaciones control se prepararon N
PCS
sin N
S (N
PBC
S) siguiendo
el m
ismo
esquema
experimental.
Caracterización de las N
PEl
porcentaje de
fármaco
encapsulado se
obtuvo m
ediante espectrofotometría U
V-V
is a 230 nm. El
rendimiento del proceso de elaboración de las N
PCS
se determinó a partir del peso de los residuos secos
obtenidos tras centrifugar las NPC
S a 20000g durante 15 m
in.Para realizar el análisis m
orfológicode las partículas
se emplearon técnicas de
microscopía electrónica de
barrido(SEM
; Philips XL-20). El tam
año de partícula y
el potencial
zeta fueron
medidos
en equipos
Microtrac
UPA
y
Zetatrac, respectivam
ente. La
capacidad de retención y la cinética de liberación de la N
Sa partir de lasN
PCS se determ
inarona tem
peratura am
biente (37ºC)
y utilizando un tampón PB
Sde
pH
7.4.Los estudios de perm
eabilidad se llevaron a cabo utilizando
el m
odelo PA
MPA
con
diferentes concentraciones de N
S(control)
y NPC
S. El sistema
se incuba durante 6 ha tem
peratura ambiente.
Acontinuación se m
iden mediante espectrofotom
etría U
V-V
is las cantidades de NS encontradas en los
compartim
entos donador y receptor en el rango de 600-190 nm
. La
viabilidad celular
y la
eficacia de
la N
S se
valoraron mediante un ensayo M
TT realizado concultivos de células de cáncer de próstata (PC
-3).
Resultados y discusión
Las NPC
Sobtenidas son esféricas y de superficie lisa.
PresentanPV
A residual asociado a su superficie
(Fig. 1).El tam
año de partícula obtenido para las NPC
S y N
PBC
S fue de 393nmy 374nm
y el potencial zeta, 10.07±4.45 m
V y 7.56±2.24 m
V, respectivam
ente.
F
igura1.-
Fotografía electrónica
de barrido
de N
PCS.
137
Las NPC
S encapsulan un 82.71±6.79% del fárm
aco añadido inicialm
ente. Con respecto a la cantidad de
fármaco
presente en
el producto
final, las
NPC
S presentan
un porcentaje
de captación
del 98.75±0.85%
. El porcentaje de recuperación de la NS
fue de un 84.07±11.72%.
En cuanto al rendimiento
del proceso de obtención de las NPC
S y NPB
CS
el valor
obtenido fue
de un
68.57±16.36%y
70.04±8.04%, respectivam
ente. En condiciones sink
las NPC
S liberaron la práctica totalidad
del fárm
aco tras
la prim
era hora
de incubación.(Fig. 2).
0 20 40 60 80
100
120
140
05
1015
2025
30
%NS liberado
tiempo (h)
Figura
2.-NS liberada por las N
PCS.
Los resultados obtenidos en el estudio de liberación inm
ediata ponen de manifiesto la afinidad de la
NS por
el polímero
(Fig. 3).
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
9990
500
% retenido
% dilución
Figura
3.-N
S retenida por NPC
S en los estudios de liberación inm
ediatacon agua m
illiQ (barras blancas)
o pH 7.4 PBS (barras negras) (n=
3).
Los estudios deperm
eabilidad demuestran que
la NS
pasa a través de barreras lipídicas de forma rápida
(Pe =1-1.5x10
-5cm/s) aunque dism
inuye ligeramente en
los estudios realizados con las NPC
S (Fig. 4). Tal y com
o recoge la figura 5, la NS y
las NPC
Sm
uestran un
marcado
efecto citotóxico
sobre las
células de cáncer de próstata (PC-3).Sin em
bargo, las N
PCS dem
ostraron ser más eficaces
que el fármaco
libre. En
los cultivos
realizados, las
NPB
CS
no presentaron un efecto citotóxico significativo
lo que
demuestra el potencial terapéutico de la form
ulación estudiada.
0,0E+00
2,0E-06
4,0E-06
6,0E-06
8,0E-06
1,0E-05
1,2E-05
1,4E-05
1,6E-05
1,8E-05
NPNSCS7,5
NPNSCS15
NPNSCS25
NS100M
NS200M
NS400M
Pe (cm/s)
Figura
4.-C
oeficiente de permeabilidad de la N
S en form
a libre o unido a NPC
S (n=4).
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,000,00100,00
200,00300,00
400,00500,00
% control
NS
(M
)
Figura
5.-Viabilidad celular a las 48 h en presencia
de NPBC
S (círculo negro), NS (triángulos) y N
PCS
(círculo blanco) (n>6).
Conclusiones
Se han
obtenido N
P esféricas
con tam
años de
particular inferiores a 0,5 m
. La NS se incorpora de
forma eficaz en las N
P y muestra una liberación
dependiente de la dilución realizada. La permeabilidad
del fármaco
cuando está incluido en las NPC
Sse ve
ligeramente dism
inuida. Los estudios realizados con células
PC-3
demostraron
quela
formulación
desarrolladapodría
constituir una contribucióneficaz
en el tratamiento del cáncer de próstata.
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DE
LIV
ER
ING
GSE
24.2 PEPT
IDE
FRO
M B
IOD
EG
RA
DA
BL
E
NA
NO
PAR
TIC
LE
S FOR
APPL
ICA
TIO
N IN
DE
FEC
TIV
E T
EL
OM
ER
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D
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AM
C/A
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IBER
de Enfermedades
RarasC
IBER
ER,V
alencia Spain.
INT
RO
DU
CT
ION
Defective telom
erase disorders are rare inherited diseases characterized by defects in telom
ere m
aintenance, caused by mutations in different
components of the telom
erase complex (1). It
has been described that the peptide GSE 24.2,
corresponding to an internal domain of D
CK
1 gene
(encoding dyskerin,
a com
ponent of
telomerase
complex),
is able
to induce
telomerase reactivation (2). H
owever, peptides
are unstable and prone to degradation when
administered,
and so,
lose their
activity. M
oreover, GSE 24.2 site of action is localized
inside the
nucleus, and
thus it
must
be appropriately internalized inside cells and
reach the nucleus. Therefore, in this study a m
ethod to overcom
e these
shortcomings
has been
proposed, by the encapsulation of GSE 24.2 into
biodegradable nanoparticles,
elaborated w
ith poly-lactic-co-glycolic acid (PLG
A N
Ps) and the addition of differentpolycations.
EX
PER
IME
NT
AL
ME
TH
OD
S
Nanoparticle elaboration:
PLGA
NPs containing G
SE 24.2 were prepared
by the solvent extraction technique using a W
/O/W
double emulsion system
(3). Briefly,
the NPs w
ere developed emulsifying 0.5%
(w/v)
GSE 24.2 aqueous solution containing PEG
400 w
ith 2 ml of a 5%
(w/v) PLG
A (R
esomer ®
RG
503) solution in dichloromethane by 30 s
sonication at 50W (B
ranson Sonifier ®). This prim
ary emulsion w
as then added to 10 ml of a
5% (w
/v) polyvinyl alcohol aqueous solution and sonicated 60 s at 50W
to obtain the W/O
/W
emulsion. Finally, this second em
ulsion was
poured into a 2% (v/v) isopropanol aqueous
solution and left under magnetic stirring for 2 h
to allow the evaporation of the organic solvent.
The resulting
NPs
were
recovered by
centrifugation, washed three
times in distilled
water
and lyophilized
after the
addition of
trehalose. For the preparation ofthe cationic
NPs, different coating polym
ers were used:
polyethyleneimine
(PEI), chitosan
(CS)
and dextran (D
X). D
ifferent concentrations of CS
and DX
were dissolved in the PV
Aaqueous
solution, w
hilst PEI
was
dissolved in
dichloromethane.
Nanoparticles characterization:
PLGA
NPs w
ere characterized in terms of size
and potential by D
ynamic Light Scattering and
Laser D
oppler M
icro-Electroforesis, respectively. Particle m
orphology and surface characteristics
were
analyzed by
scanning electron
microscopy
(SEM).
GSE
24.2 encapsulation
efficiency, surface
adsorbed peptide
and in
vitro release
profile w
ere evaluated
by m
icro-BC
A
assay kit.
The structural integrity of G
SE 24.2 extracted from
NPs
was
assessed w
ith polyacrylam
ide gel
electrophoresis (SDS-PA
GE). The cytotoxicity
of N
Ps w
as assayed
in H
eLa and
murine
embryonic
fibroblasts (M
EF) cell
lines. Intracellular uptake w
as performed in F9 cell
line and in vitro biological activity of GSE 24.2
using F9
A353V
cells
harbouring a
DK
C1
mutation.
RE
SUL
TS A
ND
DISC
USSIO
N
As exposed in table 1, PLG
A N
Ps size was
around 220 nm w
ith a narrow size distribution
(polydispersity index (PDI) <0.1).
potential values confirm
ed the presence of polycation chains shielding a positive charge at the N
Ps surface, resulting in cationic PLG
A N
Ps, with
the exceptionof C
S, which acquires positive
charge in acidic media.
Formulation
Size (nm
)PD
IPotential
EE
(%)
SAP
(%)
PLG
A231.2
0.126-20.1
60.2728.64
PLG
A-C
S243.9
0.151-3.05
18.899.36
PLG
A-PE
I221.9
0.144+30.4
86.4223.33
PLG
A-D
X226.2
0.095+24.4
30.484.32
Table 1: Characteristics of G
SE 24.2 PLGA
NPs.
139
0 20 40 60 80
100
120
010
2030
4050
6070
% release
Time (days)
As observed in SEM
images (Figure 1), sm
all spherical particles in the nanom
eter size range w
ith smooth surface w
ere obtained.
According to the G
SE 24.2 structural integrity study
with
SDS-PA
GE
(Figure 2),
no configuration or conform
ational damage of the
peptide occurred
during the
encapsulationprocess. Therefore, the biological activity of G
SE 24.2 incorporated into PLGA
NPs should
be maintained.
The cytotoxicity test (Figure 3) displayed an acceptable viability for PLG
A N
Ps and CS
PLGA
NPs, and greater toxicity for PEI and D
X
PLGA
NPs.
0 20 40 60 80
100
120
140
00,625
1,251,875
2,5
Viability (%)
NP concentration (m
g/ml)
PLGA
PLGA-CS
PLGA-PEI
PLGA-DX
A
s demonstrated by the in vitro
release studies (Figure 4), a biphasic G
SE 24.2 release profile w
ith an initial burst effect of 20% w
as observed. This first phase is follow
ed by a second constant slow
release phase, until nearly 100% of the
loaded GSE 24.2 is released.
To check if GSE 24.2 PLG
A N
Ps were able to
be internalized
in F9
cells, intracellular
localization was assayed
(Figure 5). During the
first 48hours of incubation, results illustrated an
important confocal internalization of N
Ps inside cells and nucleus.
Finally, the
bioactivity of
GSE
24.2 encapsulated into PLG
A N
Ps was assessed in
vitroby the incubation of 15
g of the peptide w
ith F9 A353V
cells. As exposed in figure 6,
GSE
24.2 incorporated
into PLG
A
NPs
preserves the
in vitro
biologicalactivity,
rescuing DN
A dam
age. Moreover, the
addition of PEI seem
s to, slightly;enhance the D
NA
rescue, probably due to the positive charge on the
surface of
NPs
which
could increase
internalization.
Formulation
% D
NA
rescuedPL
GA
20,09 ± 0.07PL
GA
-PEI
38,21 ± 0.11
CO
NC
LU
SION
From the data obtained, w
e can conclude that G
SE 24.2
peptide has
been successfully
encapsulated into
biodegradable N
Ps. In
addition, structural
integrity and
biological activity of G
SE 24.2 are maintained after the
encapsulation, and also an acceptable viability w
as obtained. Finally, PLGA
NPs are efficiently
uptaken by
F9 cells
and are
able to
be internalized w
ithin the nucleus.
AC
KN
OW
LE
DG
ME
NT
S
This project was partially supported by the U
niversity of the B
asque Country (U
PV/EH
U) (U
FI 11/32),FISP11-00949
and F.
Ram
ón A
reces. S.P.
Egusquiaguirre thanks
the Basque
Governm
ent (G
obierno Vasco,
Departam
ento de
Educación, U
niversidades e Investigación)for the fellow
ship research grantand C
.Manguan-G
arcía is supported by C
IBER
ER.
RE
FER
EN
CE
S(1) W
alne A.J. et al. Br J H
aematol.145(2):164-172, 2009
(2) Machado-Pinilla R
. et al., Blood. 111(5):2606-2614, 2008 (3) G
utierro I et al., Vaccine.22;21(1-2):67-77, 2002
Figure 1: Morphology of G
SE 24.2 PLGA
NPs.
Figure 6:In vitro biological activity of GSE 24.2 PLG
A N
Ps.
Figure 5:Intracellular localization of GSE 24.2 PLG
A N
Ps.
Figure 2:SDS-PA
GE
of GSE 24.2 PLG
A N
Ps.
Figure 3:In vitrocytotoxicity of G
SE 24.2PLG
A N
Ps in MEF
cells.
Figure 4:In vitro release profile of GSE 24.2 -PLG
A N
Ps.
140
NO
VE
L T
HE
RM
OR
EV
ER
SIBL
E A
ND
pH-D
EPE
ND
EN
T H
YD
RO
GE
LS FO
R C
ON
TR
OL
LE
D
DR
UG
RE
LE
ASE
E. Moreno
1,2,3and J. Schwartz
1,2, J.M. Irache
1,E. Larrañeta
1,P.A. N
guewa
2,C. Sanm
artín2,3,S.
Espuelas 1,2
1Pharmacy and Pharm
aceutical Technology Departm
ent, University of N
avarra, Spain2Tropical H
ealth Institute, University of N
avarra, Spain3O
rganic and Pharmaceutical C
hemistry D
epartment,U
niversity of Navarra, Spain
Introduction:
Thermosensitive hydrogels are aqueous polym
er solutions that are transform
ed into gels throughtem
peraturechanges.
Under
physiological conditions, gels are form
ed upon heating to body
temperature
and can
maintain
their integrity for a period of tim
e. Thesehydrogels
may
provide the
advantage of
easier adm
inistration and
could have
several biom
edical applications such as drug controlled release,
cell im
movilization
and tissue
regeneration(1-2).
In this work,
we synthesized a new
serie of random
X
—Y
copolym
ers that
form
thermosensitive
and pH
-dependent hydrogels
whose
gelation tem
perature and
mechanical
properties can
be controlled
by the
molar
relationshipof
X
and Y
polymers
and copolym
er concentration in water.
Materialand M
ethods: Synthesis of the X
—Y
colopymer
Briefly, 2.0 g of Y
were added into a one-
necked glass flask and dissolved in 150 mL of
anhydrous THF
with a m
echanical stirrer. Then, different
amounts
of X
w
ere added
to the
solution(X
m/Y
molar ratios: 1,2, 5, 10 and 20;
Xm
=X m
onomer) and they reacted for 48 hours
at room tem
perature under magnetic stirring.
The organic
solvent w
as elim
inated by
evaporation and the residue was m
ixed with
cold ethyl
ether to
precipitate the
polymer.
Later, the polymer precipitate w
as filtered and dried at room
temperature under vacuum
.
FT-IR
analysisThe IR
spectra were obtained on a Therm
o N
icolet FT-IR N
exus spectrophotometer.
Preparation of
the X
—Y
hydrogels
and phase diagram
s measurem
entsThe copolym
ers were prepared in 10 m
L glass vials at concentrations of 0.5, 1, 2, 2.5, 3, 5, 7.5 and 10 w
t.% in deionized w
ater to a final volum
e of
2 m
L. The
vials w
ere kept
in continuous stirring at room
temperature until
complete
dissolution (24-72
hours).Then,
NaO
H w
as added carefully in order to adjust the pH
(6-7.5). Finally, the solutions were kept in a
water bath at different tem
peratures toallow
gel form
ation. The
temperature
at w
hich the
polymer solution stopped flow
ing upon the vialinversion
(during at
least 30
seconds)w
as visually observed and recorded as the gelation tem
perature.
Viscosity analysis
Viscosity m
easurements of the X
—Y
hydrogels w
ere carried out at different temperatures using
a Haake V
iscotester 550 rotational viscometer
with
a SV
2 rotor
and equipped
with
a therm
ostatic bath Thermo Phoenix II.
In vitro cytotoxicity of X—
Y copolym
erM
TT assay was used to test the cytotoxicity of
X—
Y hydrogels on J774.2 m
acrophages after 20 hours of treatm
ent in Transwell m
icroplates.The solution w
ith the copolymer w
as placed in the apical side
whereas the m
acrophages were
located inthe
basolateral side.
Resultsand D
iscussion:
All
synthesized copolym
ers show
ed pH
-dependent
(6-7.5) gelation
behaviour. Therefore, their
sol-gel transition temperatures
couldbe m
odulatedby m
anipulation of the X
m/Y
molar ratios and concentrations of the
copolymers
(Figures 1 and 2).The gelation
temperature tended to decrease w
hen the Xm
/Y
ratio increased
till X
m/Y
of 20,
when
the gelation occurred
at room tem
perature. At a
fixed X
m/Y
value,
the sol-gel
temperature
decreasedat higher copolym
er concentrations (Figure 2). In all cases, gels reverted to solution upon cooling.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
05
1015
2025
% w/v
Xm/Y m
olar ratio
Figure 1:Influence of X
m/Y
molar ratios and
concentrations in sol-gel transition phases (indicates sol. and
indicates gel).
141
20 25 30 35 40
05
1015
T (°C)
% w
/v
Xm/Y 251020
Figure 2:Influence of X
m/Y
molar ratios and
concentrations in the gelation temperature.
The gelation
temperature
was
confirmed
by viscosity
measurem
ents (Figure
3).The
viscosity is an important param
eter that could affect
the drug
release. A
s expected,
the viscosity
sharply increased
around gelation
temperature, reaching higher values and faster at
high polymer concentrations (i.e.
3.5 Pa.s for the X
m/Y
=5 copolymer at 10%
vs. 1.2Pa.s at
3%,
Figure 3a)
and low
er X
m/Y
ratios
(Xm
/Y=5 in Figure 3a vs. X
m/Y
=10 in Figure 3b).B
oth,viscosity
values and
gel transition
temperature w
ill determine w
hichcopolym
er concentration and X
m/Y
ratiow
ill be chosen according
totheir use.
a
0 1 2 3 4
2030
4050
Viscosity (Pa·s)
T (°C)
Xm/Y=5
3%5%10%
10% w
/o reaction
b
0 1 2 3 4
2030
4050
Viscosity (Pa·s)
T (°C)
Xm/Y=10
2,50%
5%
Figure 3:V
iscosities vs. temperature profile at
different concentration
of hydrogel
prepared w
ith X
m/Y
=5 (a)
and X
m/Y
=10 (b)
copolymers.
Biocom
patibility of new polym
ersis a requisite
for biomedical application. Thus, cytotoxicity of
the hydrogels was
evaluated by an MTT assay
using J774.2 macrophages (Figure 4). For X
—Y
hydrogels with a m
olar ratio of 5, cell viability w
as slightly higher than hydrogels with a m
olar ratio of 10, although in all the experim
ents cell viability w
as > 70%.
0 20 40 60 80
100
120
140
Cell viability (%)
Control
Xm/Y=5
3%Xm
/Y=5 5%
Xm/Y=10
3%
Figure 4:In vitro cytotoxicity of synthesized
X—
Y
copolymer.
The results
represent the
means ± SD
for n = 4.
Overall, w
e have synthesized a new series of
random X
—Y
copolymers that are able to form
non-toxic,
pH-sensitive
and therm
osensitive hydrogels.
The gelation
temperature
can be
manipulated as a function of the X
m/Y
molar
ratio between 30 and 37
ºC. The viscosity can
be controlled bythe copolym
er concentration.Thus,
they could
be used
as vehicles
for controlled
topical, ocular
or subcutaneous
delivery of drugs.
References:
(1) Liu, C., G
ong, C.Y
., Pan, Y.F., Zhang, Y
.D.,
Wang,
J.W.,
Huang,
M.J.,
Wang,
Y.S.,
Wang, K
.., Gou, M
.L., Tu, M.J., W
ei, Y.Q
., Q
uian, Z.Y. Synthesis and characterization
of a
thermosensitive
hydrogel based
on biodegradable
amphiphilic
PCL-Pluronic
(L35)-PLC block copolym
ers. Colloids and
Surfaces; 302: 430-438 (2007).
(2) Garripelli,
V.K
., Kim
, V.K
.,N
amgung R
., K
im, W
.J.,R
epka, M.A
., Joa, S. A novel
thermosensitive polym
er with pH
-dependent degradation
for drug
delivery.A
cta B
iomaterialia; 6: 477-485 (2010).
142
SKIN
PEN
ET
RA
TIO
N ST
UD
IES O
F CH
ITO
SAN
HY
DR
OG
EL
S CO
NT
AIN
ING
NO
VE
L
DISE
LE
NID
E D
RU
G A
GA
INST
CU
TA
NE
OU
S LE
ISHM
AN
IASIS
1,2J Schwartz &
1,2E Moreno, 1JM
Irache, 2,3CSanm
artín,2P
Nguew
a, 1,2SEspuelas.
1Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology, 2Tropical Health Institute, 3D
epartment of
Organic
and PharmaceuticalC
hemistry, U
niversity of Navarra, Spain
Introduction:Leishm
aniasis is
a zoonotic
infection caused by parasitic protozoans from
the genus Leishmania and transm
itted by means
of sandfly bite to vertebrate hosts including m
an. Chem
otherapy remains the prim
ary tool for treatm
ent of human leishm
aniasis. How
ever, currently
available drugs
present serious
problems
regarding side-effects,
variable efficacy, and cost (1). Local therapy can be of value in nondissem
inated disease(C
L)because
it offerssignificant advantages over system
ic therapy such as few
er adverse effects andease
of adm
inistration (2).
The diselenide
(diSe) com
pound 2a
(4-bis-aminophenyl-diselenide)
showed stronger in vitro
antileishmanial activity
than m
iltefosine, w
hile show
ing negligible
toxicity against mam
malian cells
(3).The aim
of this work w
as to develop topical formulations
that areable to carry the 2a drug into the skin
dermis, w
here parasites arem
ainly located in C
L (2).C
hitosan was selected as the m
ain com
ponent of
the hydrogels
because of
its biodegradability and bioadhesive properties(4),w
hich make it suitable for the treatm
ent of ulcerative lesions. Furtherm
ore, this polymer
has shown antim
icrobial activity, which could
boost the drug effect. In this work
we optim
ised hydrogels
based on
chitosan- -C
Ds-
cyclodextrins (CD
s) networks that are suitable
to load hydrophobic drugs (i.e. diSe compound).
Including the diSe drug in the hydrogels was
-CD
s within the
hydrogel network.
Materials and M
ethods:C
hitosan hydrogels containing the diSe drug (3, 4 and 5 m
g/ml) and
PM (15 and 30 m
g/ml) w
ere prepared by adding -
-GP) solution (5 and
15%), as w
ell as methyl-
-cyclodextrin (M-
-C
D, 5.74%
) or a hydroxipropyl--cyclodextrin
(HP-
-CD
, 6.4 and 19.8%) solution in different
concentrations to
several concentrations
of chitosan
(1 and
1.5%),
which
had been
previously dissolved
in 2%
of
lactic acid.
Chitosans
of different
molecular
weights
(95/100 and 95/200) were used. The am
ount of C
Ds introduced w
as adjusted to maintain a 3:1
molar
ratio w
ith the
diSe drug.
The skin
permeation experim
ents across intactpig
earskin w
ere performed in Franz diffusion cells
(Hanson R
esearch Microette, m
embrane surface
of 4.909 cm2 and volum
e of the receptor fluid of 4 m
l). Thestratum
corneum (SC
,
separated using the microtom
e cryostat Leica C
M 1900 (Leica M
icrosystems). The different
skin layers
were
pretreated w
ith nitric
acid before determ
ining the diSe drug concentration in each layer.
Results and
Discusion:
In order to optimize
formulations
forthe
treatment
of C
L, the
influence of several parameters
on skin drug perm
eation(drug
concentration, chitosan
molecular w
eight and CD
concentration and type), w
as assessed. The formulations that w
e evaluated in the Franz cells w
ith the diSe drug (3, 4 or 5 m
g/ml) w
ere composed of chitosan
--
-CD
s (6.4
or 12.8%
and
5.74%,
respectively) (see figs. 1to 5).
As expected,
formulations containing a higher am
ount of the diSe drug (4 m
g/ml) led to higher levels of this
compound in the D
and in the E, where the
amount of drug w
as around 2 times higherin the
E than in the D (fig. 1).
Effect of diSe concentration
SCE
D0
200400600800
1000PBS3 m
g4 m
g
Drug concentration(nmoles/g tissue)
Fig. 1:Effect of drug concentration on
the penetration of D
iSe across the skin.
Higher levels of the diSe drug w
ere found in the SC
and in the D at higher concentrations of H
P--C
D
(nearly 2
and 1.5
times
more,
respectively) (fig. 2).O
ur data for permeation
across intact skin are consistent with several
studies previously published, in that dermal and
transdermal
delivery of
hydrophilic drugs
entrapped in
the H
P--C
D
structure w
ere greater
than that
observed for
conventional form
ulations (6).
Effect of C
D concentration
SC
ED
0500
1000150020002500
PB
S6.4%12.8%
nmoles DiSe/g tissue
143
Fig. 2:
Effect of
CD
concentration
onthe
penetration of DiSe across the skin.
Entrapment of the diSe drug in the structure of
the M
--C
D
resulted in
improved
topical delivery
into and
across intact
skin w
hen com
pared with form
ulations that contained HP-
-CD
. Se levels were 1.7 tim
es higher in the D
when
the hydrogel
contained M
--C
D
thanw
hen it contained HP-
-CD
(fig. 3).
Effect of CD type
SCE
D0
500
1000
1500PBSH
P--C
DM
--C
D
Fig. 3:Effect of C
D type on
the penetration of D
iSe across the skin.
Formulations
containing chitosan
95/200 (higher
molecular
weight)
resulted in
an im
proved topical delivery of the drug across theskin. The levels of Se in the E
were 1 tim
e higher w
hen the hydrogel contained chitosan 95/200 (fig. 4).
Effect of chitosan MW
SCE
D0
200
400
600
800PBS95/10095/200
Fig. 4:Effect of form
ulation onthe penetration
of DiSe across the skin.
Finally, the
effect of
the form
ulation w
as studied. For this purpose, a solution containing only H
P--
-GP 5%
and the diSe drug (5 m
g/ml), w
as compared w
ith a hydrogel that contained chitosan 95/100 1.5%
, HP-
-CD
-G
P 5% and the diSe drug (5 m
g/ml).
The levels of the diSe compound from
the hydrogel
were
higher in
the different
skin layers, especially in the SC
(1.7 times higher),
but also in the D (1.35 tim
es higher) (fig. 1e).
Effect of formulation
SCE
D0
200
400
600
800P
BS
Solution
Gel
Fig. 5:Effect of C
D type on
the penetration of D
iSe across the skin.
DiSe drug levels in the receptor com
partment
were very low
or under the limit of detection
within the first hours. They peaked at 24h, but
levels were still very low
(data not shown). This
is of great importance because it proves that the
formulation enters the D
, but it does not reach substantial levels in the receptor com
partment,
which sim
ulates the blood circulation under the skin. Therefore, the drug does not enter the blood circulation and this prevents system
ic side effects.D
rugs topically applied for the treatment
of CL m
ust be able to target the Leishmania
parasites w
ithin the
phagolysosome
of the
infected macrophages in the deep derm
al layer of the skin (7). O
ur topicalform
ulations based on chitosan-
-GP hydrogels led to the delivery
of the diSe drug to the dermis of the skin in the
in vitroassay (see figs. 1 to 5).Therefore, the
diSe drug
is a
good candidate
for topical
treatment of C
L.
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Acknow
ledgements:
-The first author of this work is supported by the
AD
A grant (A
sociación de Am
igos, University
of Navarra).
144
ESTUD
IO D
E LA A
BSO
RC
IÓN
TRA
NSD
ÉRM
ICA
DE PIZO
TIFENO
MA
LATO
DESD
E SISTEMA
S M
ATR
ICIA
LESC
.E. Serna Jim
énez1, S. del R
io Sancho1, M
.A. C
alatayud Pascual 1,C
. Balaguer Fernández
1, A. Fem
enía Font 1, V. M
erino2,A
. López C
astellano1
1Instituto de Ciencias B
iomédicas.D
pto. de Farmacia, Facultad de C
iencias de la Salud. Universidad
CEU
Cardenal H
errera, Valencia, España.
2Instituto de Reconocim
iento Molecular y D
esarrollo Tecnológico, Centro M
ixto Universidad Politécnica
de Valencia-U
niversidad de Valencia. D
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica,
Universidad de V
alencia, Valencia, España.
Introducción: El
pizotifeno m
alato es
un principio activo utilizado para la prevención de m
igraña así como para aum
entar el apetito. Por su
seguridad se
utiliza habitualm
ente en
pacientes de corta edad. Este
estudio form
a parte
del desarrollo
de nuevas form
as de administración del pizotifeno,
en concreto de parches transdérmicos.
Objetivos: Evaluar la absorción transdérm
ica del
pizotifeno incorporado
en parches
transdérmicos, form
ulados con los promotores
químicos ácido decenoico o ácido oleico.
Materiales y M
étodos: El estudio de absorción transdérm
ica se llevó a cabo con tres parches: control
(sin prom
otor quím
ico), con
ácido decenoico y con ácido oleico. La com
posición de los m
ismos se m
uestra en la Tabla 1.
Parche C
ontrolParche A
c. O
leico
ParcheA
c. D
ecenoicoPV
P K90
17.017.0
17.0Plastoid E
35H10.0
10.0 10.0
Propilenglicol51.7
51.751.7
Etanol
20.015.0
15.0Á
cido oleico-
5.00-
Ácido
decenoico-
- 5.00
Pizotifeno m
alato1.34
1.341.34
Tabla 1:Com
posición en % (p/p) de los parches
de pizotifeno utilizados en el estudio.
Los experimentos de absorción transdérm
ica se realizaron en células de Franz utilizando com
o m
odelo de piel oreja de cerdo, a 37 ± 1 ºC y
durante 56 horas. Las muestras se analizaron
mediante
un m
étodo H
PLC
previamente
validado [1].
Los parám
etros cinéticos
se obtuvieron por m
edio del ajustado de la segunda ley de Fick. El fárm
aco retenido en piel se determ
inó al
finalizar los
experimentos.
Asim
ismo se realizó la caracterización física de
los parches determinando la elongación hasta
rotura, la resistencia máxim
a, la bioadhesión, hum
ectación y desecación [2]. R
esultados y Discusión:
A partir de los datos
obtenidos del
análisis de
las m
uestras se
representaron lascurvas de
las cantidades de fárm
acoacum
uladasen el com
partimento frente
al tiem
po, representativas
del proceso
de absorción
(Figura 1).
Tiempo (h)
010
2030
4050
60
Cantidad acumulada en compartimento receptor ( g/cm2)
0 50
100
150
200Parche Á
c. decenoicoParche Á
c. oleico Parche control
Figura 1.Cantidades acum
uladas de pizotifeno (
g/cm2) en el com
partimento receptor frente al
tiempo (h).
El flujo en el estado estacionario de pizotifeno a través de la piel con el parche control fue de 0.60
± 0.18
g/(cm2h).
Los parches
que contenían
ácido decenoico
y ácido
oleico proporcionaron unos flujos de 3.41 ± 0.44 y 1.81 ±
1.20 g/(cm
2h), respectivamente.
La caracterización física de los parches puede observarse en la figura 2.
Control BackingControl
Ác. oleico Backing
Ác. oleico
Ác. decenoico Backing
Ác. decenoico
Elongación hasta rotura (%)
0 50
100
150300
350
400
**
*
**
**
(a)
145
Control BackingControl
Ác. oleico Backing
Ác. oleico
Ác. decenoico Backing
Ác. decenoico
Resistencia máxima (N/mm2)
0 2 4 6 8 10 12
*
**
**
**
**
Parche control
Parche Ác. oleico
Parche Ác. decenoico
Trabajo de Adhesión (mJ)
0 50
100
150
200
250
Fuerza Máxima de Adhesión (N)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Trabajo de A
dhesión (mJ)
Fuerza Máxim
a de Adhesión
*
******
Parche Ác. decenoico
Parche Ác. oleico
Parche control
% (p/p)
0 5 10 25 30 35 40H
umectación (%
) D
esecación (%)
**
*
Figura 2.Caracterización física de los parches
de pizotifeno formulados: (a) Elongación hasta
rotura; (b) Resistencia m
áxima; (c) Trabajo y
fuerza máxim
a de adhesión; y (d) Hum
ectación y desecación.
“*” y “**” presentan diferencias estadísticam
ente significativas entre sí mism
os (p<0.05; A
NO
VA
; Dunnet T3).
De los 3 parches form
ulados, el que contenía ácido decenoico presentó los m
ayores valores
de elongación hasta rotura y bioadhesión, y el valor m
ás bajo de resistenciam
áxima. N
o se apreciaron
diferencias estadísticam
ente significativas en cuanto a la hum
ectación de los parches,
no obstante
los porcentajes
de desecación
sí que
resultaron diferentes,
obteniendoel
parche control
el valor
de desecación m
ás bajo, seguido por el parche de ácido decenoico.C
onclusiones:Se
desarrollaron 3
parches transdérm
icos de
pizotifeno. El
parche que
contiene ácido decenoico parece óptimo para
administrar
el fárm
aco, tanto
por sus
características físicas,
como
por el
efecto observado sobre la absorción transdérm
ica del fárm
aco. R
eferencias:(1)
Serna-Jiménez,
C.E.
et al.
HPLC
-UV
analytical
method
for determ
ination of
pizotifen after in vitro transdermal diffusion
studies. B
iomedical
Chrom
atography 26:
769-774 (2012). (2)
Balaguer-Fernández, C
. et al. Developm
ent and
evaluation of
occlusive system
s em
ploying polyvinyl
alcohol for
transdermal
delivery of
sumatriptan
succinate.D
rug D
elivery17
(2): 83-91
(2010). A
gradecimientos:
- Ministerio de Sanidad y C
onsumo
(PI060108).- U
niversidad CEU
Cardenal H
errera(beca
FPDI).
- U
niversidad C
EU
Cardenal
Herrera
(PRC
EU-U
CH
34/10)
(b)
(c) (d)
146
DE
SAR
RO
LL
O FISIC
OQ
UÍM
ICO
DE
NA
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CO
MPU
EST
OS M
AG
HE
MIT
A/PO
LI(D,L-
LA
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-CO
-GL
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LID
A)PA
RA
FINE
S FAR
MA
CO
TE
RA
PÉU
TIC
OS
B. Pérez-A
rtacho1, A
.V. D
elgado2, A
. Fini 3,M.López-V
iota1, J.L. A
rias 1 1D
pto.de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Universidad de G
ranada, España. 2D
pto.de FísicaA
plicada,Universidad de G
ranada, España.3D
pto. Scienza dei Metalli, Elettrochim
ica e Tecniche Chim
iche, Università degli Studi di B
ologna,Italia.
Introducción: Num
erosos estudios se centran actualm
ente en
el uso
de coloides
para la
formulación de nanosistem
as transportadores de fárm
acos (1).
Así,
sepretende
lograr la
acumulación m
asiva y específica de la dosis de principio activo en el lugar de acción, junto con una
minim
ización de
los problem
as de
estabilidad y seguridad asociados a su uso (2).En
este trabajo
se describe
una técnica
reproducible para la síntesis de nanocompuestos
de maghem
ita (-Fe
2 O3 ) y
poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG
A) com
o sistema transportador
de fárm
acos. La
-Fe2 O
3se
eligió por
su carácter no tóxico y superparam
agnético que confiere
al sistema sus propiedades m
agnéticas, m
ientras el PLGA
se seleccionócom
o matriz
biocompatible y biodegradable, con capacidad
para el transporte de principios activos.
Materiales
y M
étodos: El
procedimiento
seguido en la síntesis de las nanopartículas de -
Fe2 O
3 se fundamentó en la síntesis m
ediante co-precipitación
química
y oxidación
denanopartículas de m
agnetita (3). La síntesis de los nanocom
puestos se basó en unm
étodo de em
ulsión con evaporación de disolvente puesto a punto por nuestro grupo de investigación (4). Las nanopartículas de PLG
A se sintetizaron de
igual form
a.B
revemente,
se añadió
bajo agitación m
ecánica, una solución de PLGA
(250 m
g) en acetato de etilo, a una solución acuosa de polivinilalcohol (3%
, p/v) que contiene los núcleos m
agnéticos (125 mg). Posteriorm
ente, se redujo
la velocidad de agitación, dejando evaporar com
pletamente
el disolvente.En cuanto a la caracterización fisicoquím
ica de los nanocom
puestos, su geometría
se determinó
mediante m
icrofotografías FeSEM y H
RTEM
ym
ediante PC
S. A
demás,
Se utilizó
la difractom
etríade rayos X
para determinar la
estructuracristalina
de las nanopartículas
-Fe
2 O3 /PLG
A.
Las propiedades
eléctricas superficiales
de los
nanocompuestos
se analizaron m
ediante electroforesis en función del
pH.
Por otro
lado, las
propiedades term
odinámicas superficiales se estudiaron a
partir de determinaciones de ángulo de contacto
con agua, formam
ida y -brom
onaftaleno, junto con un adecuado tratam
iento termodinám
ico.Las
propiedades m
agnéticas de
lasnanopartículas
-Fe2 O
3 /PLGA
se investigaronm
ediante la obtención yanálisis de
suciclo de
histéresis. Finalm
ente, se
investigó la
estabilidad térm
ica de
los nanom
ateriales m
ediante DSC
y TGA
.
Resultados
y D
iscusión: G
racias a
la m
etodología de
síntesis desarrollada,
se obtuvieron
partículas completam
ente esféricas con un tam
año medio de 135 ± 50 nm
, muy
adecuado para
la vía
de adm
inistración parenteral. La eficacia del recubrim
ientopolim
éricode los
núcleos magnéticos se dem
ostró comparando el
potencial zeta () de los nanocom
puestos conel
de los nanomateriales que los constituyen. En
efecto, la
figura 1
muestra
valores de
prácticamente iguales para los nanocom
puestos y el polím
ero puro.
Figura 1.Valores de potencial zeta (
, mV
)de
las nanopartículas
de -Fe
2 O3 ,
PLGA
y-
Fe2 O
3 /PLGA
en función del pHy
a fuerza iónica constante.
El estudio de las propiedades termodinám
icas de las nanopartículas confirm
ólos resultados
obtenidos en la caracterización electroforéticacon respecto a la eficacia del recubrim
iento polim
érico de los núcleos magnéticos.La figura
2 muestra nuevam
ente la similitud entre los
nanocompuestos
y las
nanopartículas de
polímero puro, así com
o las diferencias con los núcleos m
agnéticos. De hecho, en esta figura
puede apreciarse cómo el carácter hidrófilo de
los núcleosde óxido de hierro
se pierde al quedar
englobados en
la m
atriz polim
érica hidrófoba.
147
Figura 4.C
arácter hidrófilo/hidrófobode
-Fe
2 O3 ,
PLGA
y
nanocompuestos
-Fe
2 O3 /PLG
A.
La difractom
etría de
rayos X
nos
permite
afirmar
que la
estructura cristalina
de los
núcleos m
agnéticos se
mantiene
tras su
inclusión en la matriz de PLG
A (figura 3). Este
es un
aspecto m
uy im
portante ya
que las
propiedades magnéticas de las nanopartículas
-Fe
2 O3 /PLG
A
dependen fundam
entalmente
de esta estructura cristalina.
Figura 3.
Difractogram
a de rayos X de los
nanocompuestos
-Fe2 O
3 /PLGA
. Figura
insertada: difractograma de rayos X
de-Fe
2 O3.
En cuantoa las propiedades
magnéticas, la
figura 4 muestra el ciclo de histéresis de los
nanocompuestos. Los valores de susceptibilidad
inicial (i
= 2.51 ± 0.11) ym
agnetización de saturación
(206±
12 kA
/m)
demuestran
la elevada capacidad de respuesta a gradientes decam
po m
agnético que
exhiben las
nanopartículas -Fe2 O
3 /PLGA
.
Figura 4.
Ciclo
de histéresis
de las
nanopartículas -Fe2 O
3 /PLGA
.
Finalmente, se llevó a cabo una evaluación
preliminar
de la
estabilidad térm
ica de
las nanopartículas
-Fe2 O
3 /PLGA
(figura 5).Com
o puede
apreciarse en
esta figura,
los nanocom
puestosse caracterizan por un perfil
térmico
muy
estable hasta
temperaturas
próximas a 330 ºC
. De esta m
anera, podría postularse
la posibilidad
de som
eter las
formulaciones basadas en estas
nanopartículas aprocedim
ientos de esterilización mediante calor.
Figura 1.Termogram
a DSC
(a) y TGA
(b) de los nanocom
puestos -Fe2 O
3 /PLGA
.
Conclusiones:
Se ha
desarrollado una
metodología reproducible para la síntesis de
nanocompuestos
-Fe2 O
3 /PLGA
.La
extensacaracterización
química,
electrocinética y
termodinám
ica ha demostrado la eficacia de la
metodología
de form
ulación desarrollada.
El estudio
de las
propiedades m
agnéticas dem
uestra la excelente capacidad de respuesta a gradientes de cam
po magnético que presenta
este tipo de nanopartículas. Por lo tanto,puede señalarse que estos nanocom
puestosdeben ser
útiles en el diseño de sistemas transportadores
de fármacos.
Referencias:
(1)A
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treatment: an overview
. Mini R
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Chem
. 2011;11:1-17.(2)
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Agradecim
ientos:Proyecto
FIS 11/02571
(Instituto de Salud Carlos III, España).
148
NA
NO
TU
BO
S DE
CA
RB
ON
O FU
NC
ION
AL
IZAD
OS M
AG
NÉ
TIC
AM
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ITU
MO
RA
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CÉ
LU
LA
S DE
CÁ
NC
ER
DE
CO
LO
NM
. López-Viota
1, A. G
onzalez2, K
. Rudzka
2, J.A. M
uñoz-Gam
ez3, A
. Carazo
3, J.L. Arias 1, J.L.V
iota3,
A.V
. Delgado
2
1Dpto.de Farm
aciay Tecnología Farm
acéutica, Universidad de G
ranada, España2D
pto. de Física Aplicada, U
niversidad de Granada,España.
3Unidad de A
poyo a la Investigación, Hospital U
niversitario San Cecilio, G
ranada, España.
Introducción: Los nanotubos de carbono son nanopartículas cilíndricas com
puestas por una o varias capas de grafeno enrrolladas, form
adas por
varios anillos
de átom
os de
carbono perfectam
ente estructurados. Su tamaño varía
desde un diámetro de pocos nanóm
etros hasta varios m
ilímetros de longitud. D
ebido a la baja solubilidad
que presentan
este tipo
de nanopartículas en cualquier solvente com
ún, es necesario
funcionalizarlas, bien
con polielectrolitos o bien con nanopartículas. D
e este m
odo se consigue aumentar su solubilidad
y su biocompatibilidad.
Siguiendo los resultados descritos por Yang y
cols. [1],
en este
trabajo estudiam
os la
posibilidad de
combinar
ambos
tipos de
funcionalización: con polímeros (PEG
) y con nanopartículas
magnéticas.
Estudiaremos
la capacidad
que tienen
estas nanopartículas
compuestas de vehiculizar un fárm
aco como la
doxorubicina, y
comprobarem
os su
eficacia com
o vehículos transportadores de fármacos in
vitro, en cultivos celulares de cáncer de colon. A
demás analizarem
os la capacidad de liberar fárm
acos recubriendo
los com
puestos con
receptores específicos
sobre expresados
por células tum
orales como es el ácido fólico.
Materiales
y M
étodos: La
síntesis y
funcionalización de partículas se realizaron en agua
Milli
Q.
Los productos
químicos
necesarios para la síntesis de nanopartículas fueron
adquiridos a
Sigma
Aldrich,
y los
nanotubos de
carbono fueron
comprados
en cheaptubes.com
. Síntesis
de nanopartículas
magnéticas:
Las nanopartículas de m
agnetita fueron obtenidas de acuerdo
con el
método
de coprecipitación
descrito por
Massart
[2]. B
revemente,
a tem
peratura ambiente se prepara una solución 1
M de C
l3Fe en un volumen de 40 m
L y otra solución de H
Cl 2 M
de Cl2FE 2M
. Am
abas soluciones se m
ezclan bajo agitación mecánica
en una solución acousa 0.7 Mde am
onia. El resultado es un precipitado de color negro. El proceso
de lim
pieza consiste
en decantar
magnéticam
ente este
precipitado, redispersándolo
en m
edio acuoso,
hasta conseguir que la conductividad del sobrenadante sea inferior a 2
S/cm.
Los nanotubos de carbono fueron dispersados con la ayuda de un ultrasonidos en una solución acuosa a pH
2 de ácido nítrico. La funcionalización de los nanotubos con las nanopartículas
magnéticas
fue efectuada
añadiendo gota a gota, una suspensión acousa de
nanopartículas m
agnéticas al
1 %
en
volumen, sobre una suspensión acousa a pH
natural de nanotubos de carbono, con la ayuda de un vortex. La m
ezcla se dejó reposar en contacto toda la noche. La funcionalización con PEG
se realizó suspendiendo los nanotubos de carbono en una solución de PEG
, a pH natural.
Caracterización
eléctrica superficial.
Las m
edidas de la carga eléctrica superficial se realizaron en un dispositivo M
alvern NanoZS.
Las suspensiones fueron preparadas añadiendo una gota de la suspensión sobre la solución al pH
determinado y m
edidas 24 h después de preparar la suspensión.
Cantidad
de doxorrubicina
y ácido
fólico adsorbida/absorbida por las nanopartículas. La concentración de doxorubicina retenida por las partículas fue determ
inada mediante m
edidas de absorbancia
óptica en
un espectrofotóm
etro Perkin-Elm
er Lam
bda 11
UV
-vis spectrophotom
eter (Perkin-Elm
er, U
SA).
Las medidas fueron realizadas a la longitud de
onda de máxim
a absorbancia.
Microscopía confocal.La liberación de fárm
aco antitum
oral en
las células
de colon
fueron evaluadas
por m
icroscopia confocal
en un
dispositivoLeica
Fluorescence M
icroscope (B
ensheim, G
ermany) utilizando un objetivo de
inmersión 63X
.
Experimentos in vivo. El estudio de liberación
de doxorubicina
en cultivos
in vivo
fue realizado sobre células de cáncer de colon D
LD-
1, mantenidas en m
onocapa en medio de cultivo
RPM
I, suplementada con un 10 %
de serum
bovino, 100 U/m
L de penicilina y 100 de estreptom
icina, incubados a 37 º C bajo
una atmósfera del 5 %
de CO2 .
Resultadosy
Discusión:
La eficiencia
del recubrim
iento de los nanotubos de carbono con nanopartículas m
agnéticas fue seguida mediante
microscopía de transm
isión de alta resolución. com
o se puede observar en la Fig. 1.
149
Figura 1.Figura de Microscopia de Transm
ision de
nanotubos de
carbono recubierto
de nanopartículas m
agnéticas.
La funcionalización superficial de los nanotubos con PEG
y con nanopartículas magnéticas fue
evaluado en términos de la m
odificación de su carga superficial, com
o se puede ver en la Fig, 2.
Figura 2.M
ovilidad electroforética
de suspensiones
de nanotubos
de carbono
Transmision
de nanotubos
de carbono
recubierto de nanopartículas magnéticas.
La Fig. 3 muestra la adsorción del fárm
aco doxorrubicina, claram
ente se observa a partir de las
medidas
de m
ovilidad electroforética
en función de la concentración de fárm
aco y esta es tanto
más
positiva cuanto
mayor
es la
concentración de
fármaco.
Por
último,
la incorporación
de uno
de los
receptores específicos sobre expresado en líneas celulares de cáncer, com
o el ácido fólico ha sido seguida en
términos
de m
edidas de
movilidad
electrocinética (ver
Fig. 4).
Com
o puede
apreciarse, las partículas funcionalizadas con PEG
y sin PEG m
uestran punto isoeléctrico, en las
proximidades
de pH
4
y pH
5.5
respectivamente.Finalm
ente la
liberación de
doxorrubicina por los nanotubos decarbono in
vitro en cultivos celulares de células DLD
-1, se m
uestran en la Fig. 4. Com
o puede apreciarse, la liberación de fárm
aco es mayor en presencia
de ácido
fólico com
parada con
la m
isma
formulación de nanopartículas sin funcionalizar
con ácido fólico.
Figura 3.M
ovilidad electroforética
de suspensiones
de nanotubos
de carbón
recubiertos con
nanopartículas m
agnéticas, doxorubicina, y ácido fólico, con y sin PEG
.
Figura 4.Imagen confocal de la liberación de
doxorrubicina por
nanotubos de
carbono recubiertos
de PEG
y
funcionalizados con
nanopartículas m
agnéticas, doxorubicina,
recubiertos y sin recubrir con ácido fólico.
Referencias:
(1) YangF.,
y cols. Magnetic functionalized
carbon nanotubes as drug vehicles for cancer lym
ph node
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Preparation of
aqueous m
agnetic liquids in alkaline and acidic m
edia, IEEE
Trans. M
agn.17: 1247-
1248 (1981)
Aradecim
ientos:Proyectos
FIS 11/02571
y FIS2010-19493
(Instituto de Salud Carlos III,
España).
150
CO
MPA
RA
TIV
E ST
UD
Y O
F CA
NN
AB
INO
IDS PL
GA
NA
NO
PAR
TIC
LE
S FOR
OR
AL
D
EL
IVE
RY
I.Muñoz-R
ubio,L. Martín-B
anderas, J. Álvarez-Fuentes, M
. Fernández-Arévalo, M
.A. H
olgado
Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology, Faculty ofPharmacy, U
niversity of Seville,c/ Profesor G
arcía González, nº 2, 41012 Seville, Spain
luciamartin@
us.es
Introduction: The International Association for
the Study of Pain (IASP) defines neuropathic
pain(N
P) as thatresulting from
diseaseor
damage of the peripheral or central nervous
systems, and from
dysfunction of the nervous system
(1). Drug treatm
ents currently available, norm
ally opioids and anti-inflamm
atory drugs, are not effective in m
any clinical situations. C
annabinoids have
different antinociceptive
mechanism
, providing
a new
line
for the
treatment of N
P that is unresponsive to actual treatm
ents.The problem
is that these actives present
unfavourable characteristicsfor their
oral adm
inistration: not
adequate physicochem
ical properties,
stability or
solubility problem
s (2).
In this
work,
acom
parativestudy
of physicochem
icalcharacteristics
and in
vitro behaviour
of different
poly(D,L-lactide-co-glycolide)
(PLGA
) nanoparticles
(NPs)
containing tw
o cannabinoids is described. The
selected cannabinoids
are 1-
Naphthalenyl[4-(pentyloxy)-1-naphthalenyl]
methanone (C
B13), a C
B1/C
B2 dual agonist
(the selective
activation of
peripheral cannabinoid C
B1 receptors has the potential to
become a valuable therapy for chronic pain)
which displays potent antihyperalgesic activity
in animal m
odels, and limited brain penetration
(3)9-
9-THC
or TH
C), w
hich is the cannabinoid with m
ajor psychoactive activity
(4).
Materials
and M
ethods: 1-N
aphthalenyl[4-(pentyloxy)-1-naphthalenyl]m
ethanone (CB
13)9-tetrahydrocannabinol
(Tocris, G
reat B
ritain), poly(DL-lactide-co-glycolide) (PLG
A
50:50) R
esomer®
R
G
502 (M
w:
12,000; inherent viscosity: 0.24 dl/g), R
esomer®
RG
502H
(M
w:12,000;
inherent viscosity:
0.19 dl/g), R
esomer®
RG
504 (Mw
:48,000; inherent viscosity: 0.5 dl/g), R
esomer®
RG
504H (M
w:
48,000; inherent viscosity: 0.53 dl/g) and PLGA
75:25,
Resom
er®
RG
752S
(Mw
: 15.000;
inherent viscosity: 0.24 dl/g), were obtained
from B
oehringer Ingelheim (G
ermany),Span®
60,
Tween®
80, Pluronic®
F-68
(Sigma-
Aldrich,G
ermany). A
cetone PRS, H
PLC-grade
acetonitrileand
HPLC
-grade m
ethanol w
ere purchased from
Panreac (Spain); threalose and H
Cl w
ere obtained from V
WR
(Spain).
Formulation of the PLG
A particles:
The NPs w
ere prepared by the nanoprecipitation m
ethod (NPP) (5) in w
hich aco-solution of
PLGA
(1.5% w
/v) and Span® 60 (0.5%
w/v) in
acetone was added dropw
ise at a constant rateinto 15 m
L Pluronic® F68 aqueous solution (0.5
% w
/v) under magnetic stirring. A
fter acetone evaporation,
the particle
suspension w
as centrifuged to collect the N
Ps. Then, the NPs
were
re-suspended in
a threalose
aqueous solution (5%
w/v) used as cryoprotectant and
they were freeze-dried.
For CB
13and TH
C-PLG
A loaded N
Ps, the polym
er and drug were co-dissolved in acetone.
Characterization m
ethods:
The particle size was calculated by a laser
scattering method (Partica LA
-950 V2, H
oriba). The
study of
the geom
etry and
surface m
orphology w
as perform
ed by
scanning electron
microscopy
(SEM)
(Philips X
L-30, Philips
Electron O
ptics). The
electrical characteristics,
zeta potential
(ZP), of
the particle surface w
ere measured w
ith a Malvern-
Mastersizer 2000. C
B13 and TH
C content w
as determ
ined by HPLC
(Hitachi LaC
hrom(D
-7000)
Series) and
expressed in
terms
of entrapm
ent efficiency (EE %).
In order
to show
if
there are
significant differences betw
een the formulations developed,
AN
OV
A statistics studies
were realised in term
s of size and zeta potential. A
value of p< 0.001 w
as considered to be significant.For in vitro drug release, N
Ps samples w
ere suspended
in phosphate
buffer (pH
=7.4) containing 0.1%
w/v of Tw
een® 80, m
aintained at37 ºC
and stirred mechanically.A
liquots were
withdraw
n at fixed time intervals and filtered
upon centrifugation at 10000 rpm. The filtered
sample w
as injected into the HPLC
apparatus for quantifying of drugs (6).
Results and
Discussion: The physicochem
ical characteristics of PLG
A-N
Ps (CB
13-loaded andTH
C-loaded) w
ere listed in Table 1. R
elated toparticle size, it w
as obtained particles in
the nanoscale
rangefor
all form
ulationsassayed.
No statistical differences in size w
ere obtained
(p= 0.0017).
This result
could be
explaineddue to the m
ethod preparation of the PLG
A-N
Ps, nanoprecipitation (NPP). In spite of
151
the differences in theform
ulations, NPP allow
s to
obtain N
Psw
ith narrow
particle
size distribution
(7). M
oreover, the
NPs
surface charge
(zeta potential-ZP)
was
negative for
all sam
plesassayed.
The A
NO
VA
test
shows
statistical differences betw
een the formulations developed
(p= 0,0006) because the different PLGA
used (R
esomer ®
) confer to PLGA
-NPs different
surface charges.B
esides, results obtained for drug content show
high values of EE % for all form
ulations of NPs
developed.
Resom
erD
rugTh. drug
%
w/w
Size (nm) ±
SDPotencial Zeta (m
V) ± SD
EE (%)
R502
THC
1,5 308,34 ± 127,30
33,40 ± 0,3077,7648
R502
THC
3,3 330,74 ± 110,40
28,90 ± 0,4079,1469
R502
CB
1315
319,60 ± 111,30
19,48 ± 0,4083,1356
R502
CB
1333
352,39 ± 161,20
20,23 ± 0,2081,7009
R502H
TH
C1,5
215,71 ± 115,80
42,90 ± 0,4088,8813
R502H
TH
C3,3
259,76 ± 63,80
42,20 ± 1,0094,6954
R502H
C
B13
15236,08 ±
96,2040,19 ± 0,20
89,9016
R502H
C
B13
33279,82 ± 105,60
38,49 ± 0,1084,9772
R504
THC
1,5 313,58 ± 109,40
38,50 ± 0,4070,3875
R504
THC
3,3 359,64 ± 140,70
34,50 ± 0,2064,0488
R504
CB
1315
368,24±
138,1042,29 ± 0,30
77,7050
R504
CB
1333
426,08 ± 194,80
41,30 ± 0,4069,6371
R504H
TH
C1,5
304,59 ± 121,60
40,58 ± 0,2063,9855
R504H
TH
C3,3
310,54 ± 115,30
34,80 ± 0,2070,5174
R504H
C
B13
15385,74 ± 128,40
45,28 ± 0,8056,7229
R504H
C
B13
33410,84 ± 132,10
41,49 ± 0,6053,5276
R752S
THC
1,5 438,49 ± 156,20
39,48 ± 0,5065,7645
R752S
THC
3,3 576,74 ± 228,90
34,40 ± 0,4073,3286
R752S
CB
1315
336,35 ± 114,50
38,49 ± 0,5064,8486
R752S
CB
1333
530,40 ± 184,20
35,39 ± 0,5062,9563
Table 1. Physicochem
ical characteristics and drug loading of C
B13 and TH
C PLG
A-N
Ps.
In Figures 1a and 1bare show
n, as examples,
SEM and TEM
micrographs, for C
B13
and TH
C-PLG
AN
Ps,respectively. A
s it can be seen,
spherical and
smooth
particles w
ere obtained
in all cases with a sim
ilar size.
Figure 1.M
icrophotographiesof PLG
A-N
Ps obtained by (a) SEM
and (b) TEM
Finally, the CB
13and TH
Cin vitro
release profiles from
PLGA
-NPs show
ed the typical drug
release m
echanisms
in PLG
A-based
delivery systems(D
ata not shown).
After
2 h
of assay,
hydrolysis degradation
products ofC
B13
and THC
were not detected
and only a well-defined peak appeared
onits
respectivechrom
atograms,
indicating that
developed PLG
AN
Ps allow
s to
retain cannabinoids
in theirstructures,
reaching the proposed objectives.
Conclusions:
Results obtained allow
to concludethat the
proposed m
ethod(N
PP)has
been able
to produce
cannabinoid-PLGA
-NPs
in a
nanometer
range,w
ith appropriate
surface characteristics
and adequate
EE %
values.
Furthermore, the in vitro
dissolution studies of the assayed form
ulations show adequate and
controlled releaseprofiles of the PLG
A-N
Ps.
References:
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(4-pentyloxynaphthalen-1-yl)methanone:
A
potent, orally
bioavailable hum
an C
B1/C
B2
dual agonist with antihyperalgesic properties
and restricted
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Fabrication of
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18.
Acknow
ledgments:
Financial support
from
Junta de
Andalucía,
Spain, Project
P09-CTS-5029,
is gratefully
acknowledged.
152
IN V
ITR
O A
ND
IN V
IVO
EV
AL
UA
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F SUR
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E-M
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IFIED
PLG
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ISTR
AT
ION
CO
NT
AIN
ING
A SY
NT
HE
TIC
CA
NN
AB
INO
IDM
.M. D
urán-Lobato, I. Muñoz-R
ubio, M.A
.Holgado, J. Á
lvarez-Fuentes, M. Fernández-A
révalo, L. M
artín-Banderas
Dpto. de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Sevilla, Españaluciam
artin@us.es
Introduction:CB
13, a cannabinoiddrug w
hich produces
high antihyperalgesic
activity is
a highly
lipophilic com
pound w
ith low
w
ater solubility
(~0.001–0.002 m
g/mL).
As
a consequence, this com
pound is incompletely
absorbed when adm
inistered orally (1). Particles com
prised of
poly(lactic-co-glycolic acid)
(PLGA
) have been widely studied as therapeutic
delivery vehiclesto im
prove bioavailability of lipophilic
compounds
and present
special interest
in oral
delivery. H
owever,
PLGA
nanoparticles
(PLGA
N
Ps) present
some
drawbacks e.g.
their limited ability to interact
with
the mucosa. Strategies to im
prove this interaction and escape clearance m
echanisms,
thus improving in vivo biodistribution of PLG
A
nanoparticles, have been developed.M
ost of them
are based
on nanoparticle
surface engineering w
hich can be achieved by surface coating
or incorporating
biodegradable copolym
ers in the formulation (2). In this w
ork, chitosan, vitam
in E, lecithin and Eudragit have been
evaluated in vitro and in vivo as additives to
improve
CB
13-loaded PLG
A
NPs
bioavailability by
means
of particle
surface m
odification.
Materials
and M
ethods:The
NPs
were
prepared by the nanoprecipitation method (N
PP) (3). For C
B13-PLG
A loaded N
Ps, the polymer
and drug were co-dissolved in acetone at a 20 %
w
/w
concentration. To
produce surface
modified PLG
A N
Ps:chitosan, Eudragit RSPO
, Lecithin, and vitam
in E were co-dissolved in the
polymer solution except for chitosan w
hich was
added in an additional step (after NP form
ation). For this purpose, N
Ps w
ereincubated in a
chitosan solution
overnight (0.25
%
w/v
chitosan in
acetic acid
1%
v/v) and
then collected by centrifugation.
Cell viability C
B13
loaded-PLGA
nanoparticles
and surface
modified
nanoparticles were
measured by M
TT assay in H
uman colon adenocarcinom
a cells, C
aco-2 cells
(Am
erican Type
Culture
Collection)
as described previously (4). The cells w
ere incubated with the C
B13-loaded N
P suspensions or C
B13 at concentrations ranging
from 0.025 to 25
mg/m
L for 24 and48h.C
ells w
ithout particles were used as a negative control
and cells incubated with D
MSO
asa positive
control.C
ell viability was calculated
as the percentage of absorbance referred to the control m
ean value of absorbance. To quantitatively
measure
in vitro
cellular uptake
of nanoparticles, C
aco-2 cells were cultivated in
culture flasks until 80% confluence. Then, the
medium
was changed w
ith nile red-loaded NPs
suspension in culture medium
(500, 250 and 100
mg/m
L).A
fter2
hof
incubation, the
suspension was rem
oved and the flasks were
washed w
ith medium
. The cells were rem
oved w
ith a trypsinsolution (1x) and the am
ount of fluorescence
present in
each w
ell w
as then
500 MPL). A
s a qualitative cellular uptake study, cells w
ere seeded in a chamber
(250 uL of a 4 m
g/mL N
Ps suspension) (Ibidi, Germ
any) until 80 %
of confluence. After that, cells w
ere incubated w
ith a medium
suspension containing nile red N
Ps for 2 h. Then, cells were w
ashed w
ith PBS and then fixed w
ith paraformaldehyde
(PFA) The nuclei w
ere counter stained with
Hoescht 33258
andobserved by confocal laser
scanning microscope (C
LSM) (Zeiss LSM
410). To
determine
the N
Ps biodistribution,
fluorescently labeled
particles w
ere orally
administered
to unchallenged
twelve
weeks
CD
/57 male m
ice (25- 30 g).Seven groups of
three mice per group
were treated w
ith 4 mg of
labeled NPs in 0.2 m
L sterile saline by oral gavage.
After
1 and
4 days,
organs w
ere collected and hom
ogenized on ice in PBS and
analyzed for fluorescent particles on a plate reader
(Biotek,
Winooski,
Verm
ont) at
excitation and emission
wavelengths of 488 nm
and 525 nm
, respectively.
Results and discussion:
After N
PP synthesis PLG
A N
Ps resulted in 320-420 nm w
ith almost
narrow
size distribution.
NPs
treated w
ith chitosan
and Eudragit
showed
positive zeta
potential (ZP) values. On the other hand, plain
PLGA
NPs and those elaborated w
ith lecithin and vitam
in E resulting in negative ZP. In order to
increase the
mucoadhesion
properties to
retain drugs at a site of action positively charged N
Ps are required. In this sense, CS-PLG
A and
Eud-PLGA
are a priorithe m
ost suitable NPs
for CB
13 oral drug delivery.M
TT assays after 24 and 48 h demonstrated that
formulations assayed w
ere non cytotoxic.
153
Figure 1.
Caco2
cell viability
after 48h
of incubation w
ith surface-modified PLG
A N
Ps containing C
B13
Cellular uptake of N
Ps was
studied qualitatively and
quantitatively by
CLSM
andflow
cytom
etry (figure
3), respectively.
Figure 2
showC
LSM
microphotographs
where
it is
possible to observe the internalization of NPs
into Caco2 cell, used as
gastrointestinal mucosa
model.
Figure 2. CLSM
images of C
aco2 cells after 2h exposure w
ith plain PLGA
NPs
(red: nile red N
Ps; green: nuclei)
Figure 3.
Quantitative
analysis by
flow
cytometry of uptake rate in C
aco-2 cells after 30 and 120 m
in incubation of CB
13 loaded-PLGA
nanoparticles.
NPs biodistribution w
as evaluated after 1 and 4 days after oral adm
inistration into mice. N
Ps accum
ulation into heart, liver, kidney, lung, spleen
and brain
were
quantified by
fluorescence m
easurements.
Results
obtained are
summ
arized in
figure 3.
NPs
were
accumulated
mainly
in spleen
and liver
followed by brain, kidney, lungs and heart.
Nevertheless, chitosan-PLG
A N
Ps showed the
lower accum
ulation in all the analyzed organs.
Figure 3.
Tissue distribution
graphicallyrepresented
as a
measure
of percentage
of particles detected of the total particles
(n=3) (error bars indicate SD
): (a) 24 hoursand
(b) 4 day
Successful in
vivodrug
delivery for
oral adm
inistration m
ay require
not just
a w
ell-defined
nanostructure but
also a
low
cytotoxicity, cellular
uptake efficacy
by the
gastrointestinal gut
and long
circulating efficacy. In present w
ork, various PLGA
NPs
coated w
ith C
S, Eudragit
RSPO
and
other additives
were
successfully elaborated.
CS-
PLGA
and Eu-PLGA
NPs resulted positively
charged and were effectively uptaken by C
aco2 cell. In vivo distribution assays dem
onstrated a low
er amount of C
S-PLGA
NPs sequestered in
spleen, liver and kidney. Based in the above
results, these polymeric N
Ps are presented as good candidate for oral delivery of C
B13.
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eceptor A
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polymers
poly(N-isopropylacrylam
ide), poly(N
-
poly(N-vinylcaprolactam
), Biom
aterials 26 (2005) 3055–3064A
cknowledgm
ents: L. M
.-B. and M
. D. L. are especially grateful to
the Junta de Andalucía (Spain) (Project N
r. P09-C
TS-5029) and IVPlan Propio (U
niversidadde
Sevilla). We thank also M
icroscopy and NM
R
services of CITIU
S (University of Seville) for
technical assistance.
Fi3
Qtit
til
ib
f
154
INC
OR
POR
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AN
TE.
J.Morales 1, P. B
ustos 1,E Lem
p2,A
. Zanocco2, G
. Günther 2.
1Departam
ento de Ciencias y Tecnología Farm
acéuticas, Universidad de C
hile.2D
epartamento de Q
uímica O
rgánica y Fisicoquímica, U
niversidad de Chile.
Introducción: Los flavonoides son compuestos
polifenólicos am
pliamente
distribuidos en
el reino
vegetal. En
muchos
estudios se
han descrito sus
propiedades beneficiosas para la salud, destacando el rol que cum
plen en la prevención de enferm
edades cardíacas y cáncer. Las
propiedades farm
acológicas de
los flavonoides
están relacionadas
a su
efecto antioxidante,
protegiendo a
los organism
os vivos que sufren estrés oxidativo, del daño que producen
radicales libres
y otras
especies reactivas, incluyendo al oxígeno excitado. El oxígeno
molecular
singulete (O
2 ( 1g ))
es el
estado de mayor energía del oxígeno m
olecular, norm
almente presente en sistem
as en los cuales hay un desbalance entre el sistem
a antioxidante y
la producción
deespecies
oxidantes. Las
reacciones del O2 ( 1
g ) son importantes en los
sistemas biológicos, en los cuales puede ejercer
un papel
nocivo (dañando
valiosas biom
oléculas) y/o
un papel
benéfico, principalm
ente debido a su uso en la terapia fotodinám
ica del cáncer. Los
flavonoides se
han propuesto
como
antioxidantes en formulaciones para productos
farmacéuticos y de alim
entos funcionales. Sin em
bargo, el uso de estos compuestos es lim
itado por
restricciones de
solubilidad en
agua e
inestabilidad
bajo ciertas
condiciones
de tem
peratura, luz y pH.
El objetivo
de este
trabajo fue
estudiary
caracterizar la incorporación de flavonoides en sistem
as m
icroheterogéneos de
interés farm
acéutico (liposom
as, fantasm
as de
eritrocitos y nanopartículas de sílice) y evaluar sus propiedades antioxidantes frente al oxígeno m
olecular singulete.
Materiales y M
étodos:Q
uercetina (QU
ER),
canferol (C
AN
F) y
morina
(MO
R)
fueron seleccionados
como
flavonoides de
estudio. Liposom
as unilam
elares de
DPPC
, PO
PCy
mezcla de am
bos, obtenidos por extrusión y sonicación, fueron preparados en el laboratorio. Las m
embranas de eritrocitos
(gosth)fueron
obtenidas por
hemólisis
de sangre
de voluntarios
sanos. N
anopartículas de
sílice fueron sintetizadas por hidrólisis de TEO
S y posterior m
odificación superficial con grupos N
H2 .
Se evaluó la incorporación de flavonoides en liposom
as y mem
branas de eritrocitos mediante
la determinación del coeficiente de reparto y
modulación
de la
fluidez de
la m
embrana,
utilizando pruebas
fluorescentes (laurdan
y D
PH) que se ubican a distintas profundidades en
la bicapa.En las nanopartículas de sílice se determ
inó la eficiencia
de incorporación
de estos
antioxidantes, dependiendo
del tam
año, potencial
superficial por
modificaciones
estructurales y pH del m
edio de dispersión.En todos los sistem
as propuestos se estimó
la capacidad
antioxidante frente
a oxígeno
molecular
singulete, generado
por fotosensibilización, m
ediante determinación de
la reactividad
química
bajo condiciones
experimentales de estado estacionario.
Resultados y D
iscusión:La Tabla 1 m
uestra los resultados del reparto
de los flavonoides estudiados en sistem
as hidrofílico / lipofílico (sistem
a octanol / medio
tamponado; liposom
a / fase acuosa externa. Los hidroxilos
de estos com
puestos tienen
una fracción
ionizada dependiendo del pK
a del grupo sustituyente y delpH
del medio. Los resultados m
uestran que en un m
edio tamponado a pH
7,4, sólo el hidroxilo
ubicado en posición 3 del anillo C de
morina
se encontraría
ionizado, y
el de
quercetina y
canferol, se
encontrarían parcialm
ente desprotonados. Al aum
entar el pH
del medio, aum
entaríamos
la ionización de este hidroxilo en C
-3 y también del O
H ubicado en
la posición 5 del anillo A. A
pHfisiológico, este
hidroxilo que se encuentra ionizado, favorecería su interacción con la superficie de
liposomas
con carga positiva (DO
DA
C). Los liposom
as de PO
PC / D
PPC sintetizados, poseen un
potencial zeta
negativo, interacción
mem
brana –
flavonoide m
odulada por
el efecto
de la
densidadelectrónica de los grupos hidroxilos
que no se encuentran ionizados a este pH.
Tabla 1: Valores obtenidos para el coeficiente
de reparto de los flavonoides
FLAV
log D (distribución) o log P (partición)
Octanol /
tampón
pH 7.4
Liposomas
POPC
/DPPC
(7:3)
Liposomas
DO
DA
C
QU
ER2.8
3.84.5
MO
R1.9
5.05.4
CA
NF
3.54.5
5.2
155
2025
3035
4045
50-0,5-0,4-0,3-0,2-0,10,00,10,20,30,40,5
Liposomas blancos
Liposomas con flavonoide
G P
T / oC
0,02,0x10
-54,0x10
-56,0x10
-58,0x10
-51,0x10
-41,2x10
-40,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
quercetina m
orina canferol
Anisotropia
Flavonoide / molar
En cuanto al efecto de flavonoides sobre la m
odulación de la fluidez de mem
branas(Figura
1 y Figura 2), se observa que para liposomas
con los antioxidantes incorporados, existe un decrem
ento de losvalores de la polarización
generalizada de Laurdan (GP),
en comparación
a los datos obtenidos en liposomas blancos
(Figura 1). Esto se debe al cambio en el acceso
del agua enel m
icroentorno donde está ubicada esta
prueba fluorescente
por presencia
del flavonoide.
Así,
los
flavonoides y
laurdan com
partirían una
ubicación sim
ilar en
la m
embrana. Sin em
bargo, no se aprecia cambio
en la temperatura crítica por presencia de los
tres flavonoides en la bicapa, resultado que es corroborado con los datos de la anisotropía de D
PH en eritrocitos (Figura 2). La anisotropía es
utilizada para obtener datos sobre la estructura y dinám
ica de la porción hidrocarbonada (zona hidrofóbica) de las m
embranas, evaluando la
microviscosidad.
Figura 1:
Variaciones de
GP de laurdan en
liposomas
POPC
/DPPC
. Efecto
de la
incorporación de flavonoide morina.
Figura 2: Cam
bios de la anisotropía (DPH
) en m
embranas de eritrocitosV
alores obtenidos para el coeficiente de reparto de los flavonoides.
Respecto a la reactividad de estos antioxidantes
con oxígeno excitado (Tabla 2), los valores obtenidos
en m
edio m
icroorganizados presentan diferencias de m
agnitudes conlos de
medio hom
ogéneo, sin embargo, el orden de
reactividad es similar:
morina>quercetina>canferol.
La inhom
ogeneidad característica
de las
bicapas lipídicas propicia un medio
de óptimo
para la reacción de flavonoides con oxígeno m
olecular singulete con similitudes a un
medio
con menor polaridad que el etanol, otorgado por
la presencia
de grupos
gliceroles en
lasm
embranas
fosfolípidicas. Los
valoresobtenidos
en m
embranas
de eritrocitos
mantienen
latendencia
a los
resultados obtenidos para liposom
as. La mem
brana de los eritrocitos
contiene –al
igual que
todas las
mem
branas naturales-
una gran
cantidad de
proteínas, las cuales otorgan unm
edio ambiente
distinto.
Tabla 2:
Constantes
experimentales
de reactividad
química
en m
edios m
icroheterogéneos.
La incorporación
de los
flavonoides en
nanopartículas de sílice se incrementa (90-95%
) cuando se m
odifica la superficie del vehículo con
grupo N
H2 ,
en com
paración con
las nanopartículas porosas con grupos O
H, donde el
porcentaje de
antioxidante adsorbido
se encuentra por debajo del 10%
. Sin embargo, las
nanopartículas con
grupos N
H2
tienen problem
as de dispersión en medio acuoso, lo
cual puede ser mejorado con la adición de PEG
, agente que tam
bién favorece la cesión de los com
puestos antioxidantes.
Referencias:
Javier Morales, G
ermán G
ünther, Antonio L
Zanocco, Else Lemp.Singlet O
xygen Reactions w
ith Flavonoids. A
Theoretical -Experimental Study.
Plos one (ISI). Julio 2012. Volum
e 7. Issue 7. e40548
Agradecim
ientos:Proyecto V
ID I09/05-2 U
niversidad de Chile.
Proyecto Fondecyt de Iniciación No11121172.
FLAV
Constante experim
ental( kEX
P ) / s -1
Liposomas
POPC
Liposomas
POPC
/DPPC
(7:3)
Mem
branaEritrocitos
QU
ER4.3 x 10
-4
(1.6 x 10-5)
3.6 x 10-4
(9.5 x 10-6)
6.3 x 10-4
(7.8 x 10-5)
MO
R5.4 x 10
-3
(1.6 x 10-4)
3.6 x 10-3
(1.5 x 10-4)
2.6 x 10-3
(9.4 x 10-5)
CA
NF
1.3 x 10-4
(5.9 x 10-6)
1.7 x 10-4
(8.1 x 10-6)
1.6 x10-4
(1.7 x 10-5)
156
OPT
IMIZA
TIO
N O
F O/W
NA
NO
-EM
UL
SION
S SUIT
AB
LE
FOR
DR
UG
DE
LIV
ER
YB
Y A
CE
NT
RA
L C
OM
POSIT
E FA
CT
OR
IAL
DE
SIGN
G. M
orral Ruíz
1*,P. Melgar-Lesm
es 1,M.L. G
arcía2, C
. Solans 3*, M.J. G
arcía-Celm
a1*
1Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Unidad I+D
asociada al CSIC
, Facultad de Farm
acia, Universidad de B
arcelona, Spain.2D
epartamento de Fisicoquím
ica, Facultad de Farmacia, U
niversidad de Barcelona, Spain.
3Departam
ento de Nanotecnología Q
uímica y B
iomolecular, IQ
AC
-CSIC
, Barcelona, Spain.
*Centro de Investigación de B
iomedicina en R
ed en Bioingeniería, B
iomateriales y N
anomedicina
(CIB
ER-B
BN
).
Introduction:N
ano-emulsions are
aclass of
emulsions w
itha uniform
and very small droplet
size ranging between 20 and 200 nm
1. Ow
ing to their
small
size, som
e nano-em
ulsions are
optically transparent or translucent appearingm
icroemulsions but they are non-equilibrium
system
s and therefore require energy input for their form
ation. Nevertheless, in spite of being
thermodynam
ically unstable dispersions, they m
ayexhibit a long kinetic stability. A
ll of these characteristic properties m
akenano-em
ulsionsidoneous system
s for different applications in chem
ical, cosm
eticaland
pharmaceutical
fields 2,3. The choice of composition variables as
well as the suitable preparation m
ethod plays a key role in the form
ation of nano-emulsions
with a sm
all droplet size and low polydispersity
index. In this context, experimental design is a
useful tool to evaluate the influence of differentcom
positionvariables collectively, contrasting
to the conventional method in w
hich one only variable
is studied
while
the others
remain
constantand the combined effect of all variables
is not taken into consideration4.T
he aimof this
research has been to study the formation of O
/W
nano-emulsions
in w
ater(W
)/ nonionic
surfactant(S)/ nonionic cosurfactant
(coS)/ oil system
s w
ith biocom
patible com
ponents suitable for drug delivery and to optim
ize these nano-em
ulsions through
the study
of com
position parameters by
a central composite
factorial design.M
aterials and methods: The phase diagram
s of
water/
Crem
ophor ®EL:
Poloxamer
188/ saturated
medium
chain
triglyceride system
s w
ere determined visually
at 25ºC by stepw
ise addition of one com
ponent to the mixture of the
other com
ponents.A
fter each
addition the
samples w
ere stirred, homogenized
and kept at 25ºC
. N
ano-emulsions w
ere preparedat 50ºC
by the Phase
Inversion C
omposition
(PIC)
emulsification m
ethod5
through the addition of w
ater to oil/surfactant/cosurfactant
mixtures
under mechanical stirring at 2500 rpm
using a vibrom
ixer. The m
ean droplet sizesand polydispersity index
of nano-emulsions w
ere determined at 25ºC
just
after preparation by Dynam
ic Light Scattering (D
LS) using
a Zetasizer
nano Zs
(Malvern
Instruments, U
K).
Nano-em
ulsionsform
ulationsw
ere optimized
by a central composite factorial design
which
allows generating a specific response surface
through the statistical analysis of the selected variables.In this study, w
e selected the droplet size
and polydispersity
index as
dependent variables
andthree com
positionparam
eters (S, C
oSand
water
concentration)w
hich w
ere studied at five different levels
as independent variables. Therefore, a m
atrix with a total of 16
experiments
was designed using Statgraphics
Centurion
software.
Response
surfaces w
ere represented
by a
second-order polynom
ial regression m
odelas show
n in the following
equation:y=b
0 +b1 (x
1 )+b2 (x
2 )+b3 (x
3 )+b12 (x
1 x2 )+b
13 (x1 x
3 )+b
23 (x2 x
3 )+b11 (x
1 ) 2+b22 (x
2 ) 2+b33 (x
3 ) 2
where y corresponds to the m
easured response, x
i to the influence ofindependent variable iand b
ii to the effect derived of interaction between
different independent
variables.The
significance of
the effects
and interactions
between variables w
ere performed through the
analysis of variance (AN
OV
A).
Results
and D
iscussion:A
liquid
isotropic region
corresponding to
nano-emulsions
and m
icroemulsions
was identified in the
water/
Crem
ophor ®EL:
poloxamer
188/ saturated
medium
chain triglyceride systems
as shown in
Fig.1.
Figu re 1:Liquid isotropic region (shadow
ed areas) determ
ined visually at 25ºC in the w
ater/C
remophor ®
EL: poloxam
er 188/
saturated m
edium chain triglyceride system
s.
gy
yg.1.
157
In order
to optim
ize the
nano-emulsion
formulations,
a central
composite
factorial designed
was
developed. Surfactant
concentration (corresponding
to O
/S ratio
expressed in %S), cosurfactant
concentration (corresponding to S/C
oS ratio and expressed in %
CoS) and w
ater concentrationw
ere selected as the m
ost influencing factors that might affect
the physicochem
ical properties
of nano-
emulsions.
Droplet
size and
polydispersity index
were
selectedas
main
nano-emulsion
properties to evaluate. Experimental m
atrix with
droplet size and polydispersity index values obtained
by DLS for each experim
ent is plotted in table 1.
Table
1:Experim
ental field
for a
central com
posite design matrix: Form
ulation variables and m
easured response (mean droplet size and
polydispersity index) in nano-emulsion system
s.
To evaluate the statistical significance of the effects and their interactions derived of the influence
of independent
variables in
nano-em
ulsion properties,
AN
OV
A
statistical test
were perform
ed for each factor by Pareto charts (Fig.2).
Figure 2:
Pareto chart
of the
standardized effects on the m
eandroplet size of O
/W nano-
emulsions.
Factorial design
showed
five statistically
significant effects in the nano-emulsion droplet
size with a p
value lower than 0.05. Thereby,
the concentration
of surfactant
and w
ater provided a negative effect
in the mean
droplet
contrasting to
the cosurfactant
concentrationw
hichshow
ed a positive effect.To establish the relationship
between the factors
and the response, quadratic polynomial equation
was
calculated and
the three-dim
ensional response surface w
as plotted (Fig 3).
Figure 3: Response surface of nano-em
ulsion droplet diam
eter as a function of surfactant and co-surfactant concentration. A
s shown in Fig 3, for a constantconcentration
of water (90w
t%),the form
ation of O/W
nano-em
ulsions w
ith a
small
droplet diam
eter is
achieved with low
concentration of CoS but
high concentration of surfactant. Moreover, a
lineal correlation between surfactant and co-
surfactant concentration with the droplet size
was observed.
Therefore, w
e can
conclude that
low
concentrations of
poloxamer
188 and
high concentrations
of surfactant
are required
to obtain O
/W nano-em
ulsions with the sm
allest droplet size and low
polydispersity index.
References:
(1)Solans C
. et al. Nano-em
ulsions.C
ur Op
Colloid Inter Sci. 10: 102-110 (2005).
(2) Sadurní N. et al.Studies on the form
ation of O
/W
nano-emulsions,
by low
-energy em
ulsification m
ethods, suitable
for pharm
aceutical applicationsJ. Pharm
. Sci. 26: 438-445
(2005).(3) M
orral G. et al. Form
ation of Pegylated polyurethane
and Lysine-coated
polyurea nanoparticles
obtained from
O
/W
nano-em
ulsions. Langmuir28: 6256-6264
(2012). (4) M
ontgomery D
.D
esign and Analysis of Experim
ents,7th
Edition. W
hiley and
Sons eds., N
ew Y
ork, 2010.(5) Solè I.
Nano-em
ulsions prepared by the phase
inversion com
position m
ethod: preparation variables and scale up.
J Colloid
Interface Sci.344:417-23(2010).
Aknow
legments:
The authors acknowledge the sponsorship of the
Spanish Ministry of Education and Science,
DG
I (CTQ
2011- 29336 - C03 - 03 / PPQ
),“G
eneralitat de Catalunya” D
UR
SI (Grant 2009
SGR
-961) and CIB
ER-B
BN
.
158
CA
RA
CT
ER
IZAC
IÓN
DE
L PR
OC
ESO
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FRA
CC
ION
AM
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A E
LA
BO
RA
CIÓ
N D
E
HID
RO
GE
LE
S DE
HA
/PLU
RO
NIC
F-127 A
. Oliva
1, C. M
onzón,A. Santoveña, M
. Llabrés, J. Fariña 1D
epartmento de Ingeniería Q
uímica y Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia,
Universidad de La Laguna, 38200, Tenerife, España
Introducción El
ácido hialurónico
(HA
) es
un polím
ero natural com
puesto de cadenas lineales de -1,3-
N-acetilglucosam
ina y -1,4 ácido glucurónico
con un peso molecular de hasta 6 m
illones de D
alton. El
HA
es
un im
portante com
ponente de
la m
atriz extracelular
en el
tejido conectivo te y particularmente abundante
en el humor vítreo y fluidos sinoviales. D
ebido a su im
munoneutralidad ha sido am
pliamente
utilizado com
o m
aterial biocom
patible y
biodegradable para
la adm
inistración de
fármacos,
en procesos
de regeneración
de tejidos, sutura de heridas y com
o promotor de la
absorción de fármacos y proteínas (C
ho et al, 2003).
Sin em
bargo, los
hidrogeles de
HA
m
uestran unas pobres propiedades mecánicas
con una rápida degradación in vivo debido a su elevada capacidad de adsorción de agua y a la degradación
enzimática
por la
hialuronidasa (Lee
et al,
2010). Los
hidrogeles
de H
A/Pluronic-F127
representan un
tipo de
hidrogeles con
una transición
sol-gel dependiente
de la
temperatura,
con unas
excelentes propiedades de adhesión a los tejidos y
podrían ser
una alternativa
para la
administración de fárm
acos (Lee et al, 2010). Para la síntesis de este tipo de hidrogeles se requiere H
A de bajo peso m
olecular (~130kDa).
En este
punto,
los ultrasonidos
han sido
aplicados en
procesos de
degradación de
polímeros,
reacciones de
copolimerización,
reacciones quím
icas de
diferente naturaleza,
purificación de
polímeros
dado que perm
ite elim
inar las
fracciones de
elevado peso
molecular y en el fraccionam
iento de HA
. En este tipo de estudios, el peso m
olecular es uno de los factores determ
inantes de la eficacia del proceso que puede ser controlado durante la degradación por ultrasonidos. A
diferencia de la degradación física o quím
ica, la degradación por ultrasonidos
es un
proceso no
aleatorio y
reproducible si
se m
antienen constantes
las condiciones del proceso y adem
ás, sus efectos son perm
anentes (Mahalik et al. 2005, G
rönroos et al. 2008). La velocidad y extensión de la degradación dependen de la concentración de polím
ero, duración y potencia del ultrasonido y de la naturaleza quím
ica del disolvente y del polím
ero. Hay varios m
odelos que describen la evolución
del peso
molecular
durante la
sonicación, la mayoría de ellos basados en la
cinética de distribución continua (Madrás y col.
2003). El objetivo de este trabajo fue obtener H
A de bajo peso m
olecular a partir de un proceso
de fraccionam
iento por
ultrasonidos para utilizarlo posteriorm
ente como producto de
partida en
la síntesis
de hidrogeles
de H
A/Pluronic. En segundo lugar, com
probar si el proceso de degradación del H
A por ultrasonidos
sigue un
proceso no
aleatorio aplicando
el m
odelo de Madras y col. (2003) basado en
cinéticas de distribución continua.M
ateriales y Métodos
Fraccionamiento del ácido hialurónico (H
A)
comercial
Se utilizó una solución al 1% de H
A (Fluka) en
tampón fosfato (PB
S) sumergida en un baño de
agua-hielo a una temperatura entre 0-4ºC
que fue
sonicada utilizando
una sonda
de ultrasonidos
(SON
IFIERTM
150) a
una frecuencia de 35kH
z y una densidad de potencia de 0,2 W
/mL. Se tom
aron alícuotas a intervalos de
tiempo
regulares durante
3 horas
y se
analizaron inmediatam
ente por duplicado. D
eterminación del peso m
olecular absoluto Se utilizó un crom
atógrafo Waters com
puesto por una bom
ba (modelo 600E), un inyector
automático
(Wisp
700), una
columna
Ultrahydrogel
lineal (W
aters), y
un refractóm
etro diferencial
(Modelo
410) conectado en línea a un detector de dispersión de
luz laser
multiángulo
(Treos ®
, W
yatt Technology).
Am
bos detectores
fueron calibrados previam
ente. Se asignó un valor de dn/dc de 0,155 m
L/g para el ácido hialurónico y sus derivados. La adquisición y análisis de los datos se realizó a través del program
a ASTR
A®
(W
yatt Technology). M
odelo teórico C
onsiderando que la rotura de la cadena del polím
ero (Px) se produce en el punto medio
dando lugar
a dos
cadenas hijas
de pesos
moleculares
similares,
el proceso
puede ser
descrito como:
Ec. 1 A
sumiendo que la constante de degradación K
(M) viene dada por:
KEc. 2
Esta expresión indica que la degradación no progresa cuando se alcanza un peso m
olecular lím
ite (MLim ) y la velocidad de degradación k,
es independiente del peso molecular.
Aplicando una cinética de distribución continua,
considerando los mom
entos de la distribución de los pesos m
oleculares y asumiendo unas
159
condiciones iniciales
adecuadas (para
más
detalles ver
Konaganti
y M
adras 2010),
obtenemos:
Ec. 3
Donde
Mt
representa la
variación del
peso m
olecular (en
número)
con el
tiempo
de sonicado t, en función de un peso m
olecular inicial (M
o ) y un peso molecular lím
ite que corresponde a la cadena m
ás pequeña que se puede obtener en el proceso de degradación (M
Lim ). R
esultados y Discusión
La Figura 1 muestra el ajuste de la variación del
peso molecular (en núm
ero) con el tiempo,
considerando el modelo de M
adras y col (2003).
Figura 1. Variación del peso
molecular en
número con el tiem
po de sonicado de acuerdo con el m
odelo de Madras y col.
Com
o puede verse, el peso molecular desciende
rápidamente en una prim
era fase, antes de 30 m
inutos, pasando
de 6700kD
a a
menos
de 1000kD
a y posteriormente progresa lentam
ente hasta alcanzar un peso m
olecular límite.
Figura 2. Variación de la polidispersidad del
HA
con el tiempo de sonicado.
Por el
contrario, la
polidispersidad (pd)
se aproxim
a a la unidad (pd media de 1,055) lo que
pone de manifiesto que el fraccionam
iento de
HA
por ultrasonidos permite obtener polím
eros m
onodispersos (Figura 2).
La representación del Ln (H1 ) vs tiem
po permite
obtener la constante de velocidad del proceso 4,47·10
-8 (mol·g
-1·min
-1), mientras que el peso
molecular lím
ite fue de 257kDa (Figura 3). Este
resultado confirma que la rotura del H
A por
ultrasonidos sigue
un proceso
no aleatorio,
donde la cadena inicial se fragmenta en dos
cadenas hijas y así sucesivamente, hasta un peso
molecular lím
ite.
Figura 3. Representación del ln (H
1) frente al tiem
po de sonicado de acuerdo con el m
odelo de Madras y col.
Los resultados obtenidos indican que bajo las condiciones de trabajo del ultrasonido es posible obtener H
A de bajo peso m
olecular (en peso), ~270kD
a, prácticamente m
onodisperso, aunque lejos del objetivo inicial, ~130kD
a. Dado que la
velocidad y extensión de la degradación del HA
depende
de varios
factores, es
necesario optim
izar las
condiciones de
trabajo por
ultrasonido para obtener HA
de peso molecular
inferior a 150kDa.
Referencias:
1) Cho, K
et al., Int. J. Pharm. 260:83-91
(2003). 2) Lee, Y
et al., Soft Matter 6:977-983 (2010).
3) Mahalik JP, M
adras G, Ind. Eng. C
hem. R
es. 44:6572-6577 (2005) 4) G
rönroos A et al., U
ltrason. Sonochem.15:
644-648 (2008) 5) C
hattopadhyay S, Madras G
, J. Appl. Polym
. Sci. 88:2812-2822 (2003) 6) K
onaganti VK
, Madras G
, Ultrason.
Sonochem.17: 403-408 (2010)
Agradecim
ientos: -
Este trabajo
ha sido
financiado por
el M
inisterio de Economía y C
ompetitivdad de
España (Proyecto SAF2010-17083)
160
DE
VE
LO
PME
NT
OF N
AN
OC
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JUG
AT
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R E
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ME
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PLAC
EME
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UA
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FRE
EZE
-DR
YIN
G PR
OT
OC
OL
M O
liva1,2,3, M
Enjuanes 2,3, F Andrade
4, MI G
iannotti 1,2,5, F Sanz1,2,5
1 Biomedical Research Center on Bioengineering, Biom
aterials and Nanom
edicine (CIBER-BBN), Zaragoza.
2 Nanoprobes &
Nanosw
itches Group, Institute for B
ioengineering of Catalonia (IB
EC), B
arcelona. 3 Pharm
aceutical Technology Departm
ent, Universitat de B
arcelona, Barcelona.
4Laboratory of Pharmaceutical Technology, LTF/C
ICF. U
niversity of Porto, Porto, Portugal.5 Physical C
hemistry D
epartment, U
niversitat de Barcelona, B
arcelona.
moliva@
ibecbarcelona.eu
Introduction:
Fabry disease is an X-linked recessive disorder
caused by a deficiency of lysosomal hydrolase
-galactosidase A
(G
LA).
Current
enzyme
replacement therapy (ER
T), with exogenously
administered recom
binant enzyme, has a lim
ited treatm
ent efficacy because the enzyme m
ay be opsonized, due to the lack of effective protein delivery
systems
that allow
the
controlled release of G
LA into the lysosom
es. In that respect, w
e have recently developed functional trim
ethyl chitosan (TMC
)-based polyelectrolyte com
plexes (PECs) through self-assem
bly and ionotropic gelation, able to release the enzym
e at acidic pH
[1]. These PEC nanoparticles w
ere stable
and active
under physiological
conditions, and were efficiently internalized by
human endothelial cells and m
ostly accumulated
in lysosom
al com
partments.
The superior
physicochemical characteristics of these PEC
s together
with
their excellent
cellular uptake
properties indicate their enormous potential as
advanced protein
delivery system
s for
the treatm
ent of Fabry disease. How
ever, stability in liquid m
edium during storage w
as found to be a m
ajor limitation for these system
s. To overcom
e this problem, lyophilization should be
an appropriate method for isolating PEC
s in solid state. The aim
of this work w
as therefore to establish the adequate conditions for freeze-drying (FD
) TM
C/G
LA PEC
s. To this end, dynamic light
scattering (DLS) and atom
ic force microscopy
(AFM
) analyses were perform
ed in a routine w
ay to all samples in order to evaluate the
suitability of the assayed methods.
Experim
ental:
Polyelectrolyte complexes form
ation :R
ecombinant G
LA (obtained by transient gene
expression in
the H
EK
293F cell
line and
purified by affinity chromatography [2]) w
as kindly supplied by D
r. J.L. Corchero and Prof.
A.
Villaverde
from
the Institute
for B
iotechnology and Biom
edicine, Autonom
ous U
niversity of Barcelona (IB
B, U
AB
). TM
C
was
synthesized in
our lab
from
comm
ercially available middle-viscous chitosan
(Fluka) with a deacetylation degree of 87%
(as determ
ined by 1H N
MR
), following a tw
o-step m
ethod described in the literature [3]. For PECs preparation, penta-sodium
triphosphate (TPP, Fluka), used to induce ionotropic gelation, w
as first dissolved in a GLA
solution (100 g/m
L in 10 m
M H
EPES buffer pH 7.4) to a concentration
of 23 g/m
L. Afterw
ards, a solution of TMC
at a concentration of 35
g/mL (in 10 m
M H
EPES buffer pH
7.4) was added in a volum
e ratio 70:30 for PEC
s formation, follow
ed by vortex mixing
for 5" and incubation at room tem
perature for at least 60 m
in [1].
Freeze drying
of PEC
s : H
ere w
e use
a LyoM
ega-30 freeze-dryer
(Telstar, Terrassa),
equipped with product tem
perature probes. FD
vials (12 mL) w
ere filled with 6m
L sample.
In a previous study [4], different freeze-drying protocols
were
tried, defining
a constant
condenser temperature of -80ºC
and a vacuum
limit of 300
mH
g. The eutectic point was
found to be -27.4 ± 0.8ºC, so that freezing at
-35ºC
seemed
a reasonable
safety lim
it. C
onditions of the most suitable protocol are
listed in Table 1.
Freezing Slow
, -35ºC
Sublimation
+20ºC, 8 h
Secondary drying +30ºC
, 10 h
Tem
perature holds N
o
Table 1. Freeze-drying conditions.
In this
work
the convenience
of using
a cryoprotector is studied. A
5% (w
/v) mannitol
solution w
as prepared,
and added
to PEC
suspensions at a 0%
, 30%, 50%
and 70% (v/v).
PECs characterization :
In order to characterize FD-PEC
s, 5 mL of
ultrapure water w
ere injected inside the vials for resuspension. W
henever further dilution was
needed, 10mM
HEPES buffer (pH
7.4) was
used to this end, in order to maintain the pH
conditions. -
Size and -potential: The average size (D
), polydispersity index (PD
I), and -potential values
for the PEC suspensions w
ere determined by
161
dynamic light scattering (D
LS) with a Zetasizer
Nano ZS (M
alvern Instruments) equipped w
ith a H
e-Ne laser (
= 633 nm) as the incident beam
, using folded capillary cells.
-M
orphology: Imaging of PEC
s was done
with a M
ultimode
® VIII A
FM (N
anoscope® V
controller), operated in the PeakForce Q
NM
®
(Quantitative N
anomechanical Property M
apping) m
ode. Nanoscope
® and PeakForce QN
M® are
trademarks
from
Bruker.
V-shaped
Si3N4
cantilevers with a pyram
idal SiO2 tip (nom
inal spring constant 0.58 N
/m, nom
inal tip radius 5 nm
) w
ere used
for im
aging. Scanning
was
performed at 1 H
z frequency with a resolution
of 512x512 pixels. A drop (35
L) of the suspension sam
ple was placed on top of freshly
cleaved highly
oriented pyrolytic
graphite (H
OPG
) and left for 30 min. Then, the solution
was rem
oved and replaced with 10 m
M H
EPES buffer pH
7.4 for imaging under a controlled
liquid environment.
Results and D
iscussion:
The results obtained from the D
LS analysis of FD
-PECs after redispersion are sum
marized in
Table 2.
Sample
Size(d, nm
)Size
(3 weeks)
PdIZeta (m
V)
PEC
s 238,1
+18,7%
0,154 17,6
FD-PE
Cs (0%
) 158,1
+7,9%
0,299 16,0
FD-PE
Cs (30%
) 425,5
-51,9%
0,458 22,6
FD-PE
Cs (50%
) 331,7
-47,2%
0,429 23,2
FD-PE
Cs (70%
) 274,2
-7,3%
0,465 23,0
Table 2. Mean values resulting from
DLS analysis of
freeze-dryed samples at different cryoprotector %
. Size (3 w
eeks) column show
s the diameter increase
after 3 weeks in suspension, storage at 4ºC
.
A notable diam
eter increase after freeze-drying is observed in PEC
s with cryoprotector. Even if
this effect decreases by increasing mannitol
concentration, no higher percentages were used,
since it would reduce excessively PEC
s amount
in the final drug presentation. Moreover, a PdI
around 0,5 was found w
hen using cryoprotector, despite
Zeta potential
was
>20 m
V,
which
excludes particle aggregation. O
n the other hand, when m
annitol solution was
employed, PEC
s diameter w
as reduced after 3 w
eeks storage at 4ºC (particularly those w
ith low
er %), w
hereas PECs and FD
-PECs diam
eter increased.
Moreover,
resuspended FD
-PECs
without cryoprotector, seem
to be more stable in
terms of particle size than freshly prepared
PECs. A
comparison of D
LS results between
PECs and FD
-PECs w
ithout cryoprotector is show
n in Figure 1.
Figure 1. a) Size and b)
-Potential distributions of PEC
s and redispersed FD-PEC
s (0%) resulting from
D
LS analysis.
AFM
characterization confirmed som
e of the assum
ptions made from
DLS results. W
hen no cryoprotector
was
used, FD
-PECs
exhibited sim
ilar morphology to freshly prepared PEC
s, as show
n in Figure 2, confirming the suitability
of freeze-drying
without
cryoprotectors. C
onversely, when PEC
s were free-dried using
50% and 70%
(v/v) mannitol 5%
(w/v) solution,
big particles
were
observed, rather
than aggregate of sm
aller particles. No im
ages were
obtained from FD
-PECs (30%
), probably due to tip-sam
ple interactions,
which
hindered continuous scanning.
Figure 2. AFM
images of a) Freshly prepared PEC
s, and b) FD
-PECs w
ithout cryoprotector. Scan area w
as 10x10 m
in both cases.
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arch 2012.
Acknow
ledgements:
Financial support
from
CIB
ER-B
BN
(FA
BR
Y
project) and
Fundació La
Marató de TV
3 (NanoFabry project) is gratefully
acknowledged.
162
EST
IMA
TIN
G T
HE
NU
MB
ER
OF C
APSU
LE
S PER
MIL
LIL
ITE
R A
ND
TH
E N
UM
BE
R O
F C
EL
LS PE
R C
APSU
LE
E. Santos 1,2,J.L. Pedraz1,2,R
.M. H
ernandez1,2,G
. Orive
1,2
1NanoB
ioCel, U
PV/EH
U, V
itoria-Gasteiz, Spain, 2B
iomedical R
esearch Netw
orking Center in
Bioengineering, B
iomaterials and N
anomedicine (C
IBER
-BB
N)
Corresponding em
ail (G. O
rive):gorka.orive@ehu.es
Introduction:C
ell m
icroencapsulationhas
been studied
over the
3 last
decades as
a potential treatm
ent for several diseases such as type
I diabetes,
Parkinson, A
lzheimer
and genetic disorders am
ong others (1,2).The num
ber of microcapsules adm
inistered with
each dose or the number of cells per capsule are
two
often om
itted param
eters that
add uncertainty
to all studies carried out in the field of cell m
icroencapsulation. Current
strategiesfor
capsule and
cell-counting provide
meaningful
intra- and
inter-individual variability, as w
ell as tedious procedures that result exhausting for researchers.The
possibility to
estimate
the num
ber of
capsules within a specific volum
e (p.e. number
of capsules/m
L) according
to the
capsule diam
eter, m
akes m
uch easier,
for exam
ple, designing in vitro assay protocols w
here certain num
ber of capsules per well are required
or identifying the m
inimum
number of capsules
that results
effectivein
agiven
treatment.
Moreover, estim
ating the average number of
encapsulated cells
per capsule
represents a
valuable and
useful tool
when
it com
es to
working w
ith microcapsules. This w
ould enable us
to exert
more
accurate and
standardized relations betw
een the capsule doses and the num
ber of cells employed in both plate assays
and the animal practice.
The present study aims to establish a w
ell define m
athematical m
odel to estimate the num
ber of capsules per m
illiliter and the number of cells
per capsule according to the particle diameter
and the initial cell load. This is intended to becom
e a general standard guide in the field of cell m
icroencapsulation. M
aterial and
Methods:
C2 C
12m
yoblasts derived from
the skeletal muscle of a C
3H
mouse w
ere encapsulated into alginate-poly-L-lysine-alginate
(low-viscosity
high guluronic
acid alginate,
FMC
B
iopolymer,
Norw
ay) m
icrocapsules (A
PA)
using an
electrostatic droplet generator follow
ing a brief modification
of Lim &
Sun’s procedure (3).M
icrocapsule counting
was
performed
fromm
icrocapsule pellets of 100L in 1.5 m
L tubes. A
ccording toparticle diam
eter, capsules were
resuspended in the minim
um volum
e of PBS
required to achieve analyzable aliquots. These aliquots
were
subsequently exam
ined using
inverted optical microscopy (N
ikon TSM). For
cell-counting, enclosed cells from m
icrocapsule pellets of 100
L were firstly de-encapsulated
using 500 g/m
L of alginate lyase (Sigma-
Aldrich) and filtered through a 40
m m
esh filter.
Resulting cell suspensions w
ere countedby using a neubauer cham
ber.A
ll statistical
computations
were
performed
using SPSS 19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL).
Observed
values w
ere tested
for potential
regression.
Results and D
iscussion: Taking into account that alginate gel beads are deform
able bodies, it m
ay be assumed that no voids are left w
ithin certain volum
e of sedimented m
icrocapsules. Thus, know
ing thevolum
e of a single sphere,the num
ber of capsules per milliliter
may be
easily calculated. From this value,if w
e assume
that a specific volume of pre-gelled solution
results in
the sam
e volum
e of
sedimented
microcapsules,
it is
possible to
deduce the
number of cells per capsule by just know
ing the initial cell load in the pre-gelled cell suspension. Thus, the follow
ing table is built with calculated
values for some of the m
ost widely em
ployed capsule diam
eter and cell loads:
cells/cap
DIA
MET
ER
caps/mL
2x106
cells/mL
5x106
cells/mL
10x106
cells/mL
10001910
10472618
5236
7005568
359898
1796
45020959
95239
477
35044545
45112
224
200238732
8 21
42
1001909859
1 3
5
Table 1.Estim
ated number of m
icrocapsules per m
illiliter and cells per microcapsule depending
on the microcapsule diam
eter and initial cell load.
163
Since all empirical procedures for cell-counting
entail an
intrinsic variability,
the error
accumulated
through serial
procedures m
ay distort the real num
ber of cells per capsule. In fact, taking the theoretical values proposed in Table 1 into account, below
are shown the
equations to obtain the maxim
um and m
inimum
expectable values (M
MEV
) of cells per capsule for
a typical
cell-counting routine
with
3 procedures:
z
y xT
MM
EV1
1 1
Equation 1.
Where,
x= variability of the 1
st
procedure (%) (p.e. counting of cells to prepare
pre-gelled alginate suspensión),y
= variability of the 2
ndprocedure (%
) (p.e. measuring of
capsule pellet
to be
de-encapsulated),z
=variability
of the
3rd
procedure (%
) (p.e.
counting of
de-encapsulated cells),
T=
Theoretical value (see the table)and M
MEV
=M
aximum
and minim
um expectable values.
Therefore, the estimated num
ber of cells per capsule represents a reliable central point to set as reference.O
n the other hand, from calculated values of
Table 1, it ispossible to draw
a well defined
mathem
atical function to describe the relation betw
een the number of capsules contained in a
specific volume of sedim
ented particlesand the
capsule diameter. Such relation is show
n in Eq. 2:
312
1091
.1/m
LC
apsules
Equation 2. W
here, = capsule diam
eter.
Following
the same principle explained above,
simple
mathem
atical functions
may
be attributed to each cell load
to estimate the
number
of cells
per capsule.
Correction
coefficient (), nam
ely the quotient of the difference betw
een the volume of the initial pre-
gelled solution
and the
resulted volum
e of
particles, m
ust be
applied w
hen these
two
volumes do not m
atch up with each other.In
the follow
ing example, Eq. 3
defines the curve for the load of 5 x 10
6cells/mL:
36
10595
.3/C
apsuleC
ells
Equation 3. W
here, = capsule diam
eter, and = correction coefficient.
In order to validate our mathem
atical model, w
e counted
manually
the num
ber of
capsules
sedimented in know
n volumes and com
pared against the proposed m
athematical function for
several particle diameters. A
s seen in Figure 1A,
empirical results fitted perfectly the equation
(p<0.001). Figure 1B show
s that, when the
number
of cells
per capsule
was
manually
counted, observed values were adjusted to the
proposed equation(p<0.001).
Figure 1. Validation of the m
athematical m
odel for the num
ber of capsules per milliliter (A
) and the num
ber of cells per capsule (B).
Conclusion:
This w
ork proposes
am
athematical m
odel to establish well defined
estimations
of the
number
of capsules
per m
illiliter and the number of cells per capsule.
This may be a valuable and useful tool for the
handling of microcapsules in the lab routine.
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Acknow
ledgments:
Authors w
ould like to thank the Departm
ent of M
athematics of the U
niversity of the Basque
Country (U
PV-EH
U) for their invaluable help
and advice.
A B
164
EASY TO
HA
ND
LE, POW
DER
FOR
M M
ICR
OPAR
TICLES A
S A C
HO
LERA
VAC
CIN
EA
PPRO
AC
HM
Pastor a,b, I. M
arquíneza,b, A
Talaverac, JL Pedraz
a,b,A E
squisabel a,b
aNanoB
ioCel G
roup, Laboratory of Pharm
aceutics, University of the B
asque Country, School of P
harmacy,
Vitoria-G
asteiz, Spain
.
bBiom
edical Research N
etworking C
enter in Bioengineering, Biom
aterials and Nanom
edicine (CIB
ER
-B
BN
), Vitoria-G
asteiz, Spain
cInstituto Finlay. Centro de Investigación – P
roducción de Vacunas. C
iudad de la Habana,C
uba.
Introduction
Now
adays, cholera
remains
to be
a huge
problem, causing 100
000-120000
deaths per year (1). R
ecent outbreaks in Sierra Leone, H
aiti and D
emocratic R
epublic of Congo have
pointed out
the urge
for a
massive
oral cholera
vaccination cam
paign. B
earing in
mind
the econom
ical situation of the developing countries, the
requirement
for a
low
cost vaccine
is im
perative. H
ence, the
development
of a
powdered
vaccine such
as spray
dried m
icroparticles would be
a step forward
towards
a cheap vaccine due to its easy transport and feasibility
to adm
inister as
asuspension,
especiallyfor elderly population and children.
The goals of this study have been, i)to apply the spray drying technology for m
icroparticle (MP
) elaboration,
ii) to
characterize the
MP
elaborated, iii) toperform
in vivoassays in order
to analyse
whether
the exerted
imm
une response is com
parable to the heat killed Vibrio
cholerae (VC
) protection.
Materialand M
ethodsM
icroparticle preparation:
A
spray drying
technique w
as chosen
for the
elaboration of
microparticles
(MP
s). B
riefly, spray
drying conditions w
ere set as following, 60 or 80ºC
as inlet tem
perature, pump perform
ance at 5% and
600 L/h of spray flow rate.
Cellulose acetate
phthalate (Aquacoat ®)
7.5% (w
/V) suspension
was prepared and 1.5%
(w/w
) of triethyl citrate w
as added
as polym
er plasticizer.
When
required, 0.1%
of
low
viscosity alginate
was
poured into
the form
ulation. The
resulting suspension w
as fed into the system in order to
obtain the microparticles. Four different M
P w
ere elaborated, A
quacoat ®M
P prepared at 60ºC
as inlet
temperature,
Aquacoat ®
MP
at
80ºC,
Aquacoat ®
alginate M
P
at 60ºC
, A
quacoat ®
alginate MP
at 80ºC.
The MP
s obtained were characterized in term
s of
size, surface
morphology,
encapsulation efficiency
(EE
), antigenicity
and gastro-
resistance, as previously described(2).
In vivoassays:based on the in vitro
results, theM
Ps elaborated at 80ºC
were selected
for the follow
ing rat experiments.
Two
different doses w
ere assayed in the study, 30 and 60m
g for the follow
ing batches:
Aquacoat ®
MP
and
Aquacoat ®
alginate MP
or VC
.
Sprague D
awley rats w
ere administered per os
with M
Ps or V
C at w
eeks 0 and 2. At w
eeks 0, 2, 4, 8, 12, 15, 20
and22
blood samples w
ere
collected from the fem
oral vein. Total IgG and
IgM
were
determined
by ELIS
A
for all
the sam
pling times.
Results and D
iscussion
A
spray drying
technique w
as successfully
applied for the elaboration of MP
as previously reported by our
research group (2).The m
ain properties of M
P are sum
marized in Table 1. A
ll M
Ps displayed a particle size around 6
m and
high encapsulation efficiency values (>90%). In
this regard, it is postulated that particle sizes below
10m
are the most adequate ones in
orderto ensure gut residence and slow
release of
the antigen
thatw
ill finally
triggerIgA
secretion (3).
Table 1.Main characteristics of M
P elaborated (n=3), w
here d m
eans diam
eter, E
E
encapsulation efficiency
and E
Yencapsulation yield.
Formulation
d (m
)EE (%
)EY(%
)
Aquacoat ®M
P, 60ºC6.4 ± 0.2
89.8 ± 9.656.8 ± 5.6
Aquacoat ®alginate M
P, 60ºC
6.5 ± 0.590.2 ± 5.3
47.6 ± 5.7
Aquacoat ®M
P, 80ºC6.1 ± 0.2
94.9 ± 6.061.4 ± 7.5
Aquacoat ®alginate M
P, 80ºC6.3 ± 0.3
95.1 ± 4.357.9 ± 6.2
Antigenicity preservation is believed to be the
most
important
property in
order to
studyw
hetherantigen capability rem
ains unchanged after encapsulation. As show
n in Fig. 1,upon
encapsulation, VC
kept its antigenicity values w
hen compared to the
standard VC
suspension (100%
). M
oreover, 60
and 80ºC
inlet
temperature groups show
ed similar values.
Antigenicity (%)
Fig.1.A
ntigenicity value
in com
parison to
VC
cellular
suspension.
In order to verify that Aquacoat ®
led to gastro-resistant
formulation, M
Ps w
ere mixed
for 2h
with H
Cland
replaced with neutral m
edium.
As displayed
in Fig.2, all formulations ratified their
gastro-resistance, as MP
s did not releasem
ore than
the 10%
of
the V
C
content in
acidic m
edium, w
hereasV
C w
as liberated in neutral
Aquacoat ®MP, 60ºC
Aquacoat ®MP, 80ºC
Aquacoat ®alginate MP, 60ºC
Aquacoat ®alginate MP, 80ºC
165
environment,
reaching around
30%
after 24
hours of the study.
Cumulative release, (%)
Time , (h)
Aquacoat ®MP, 60ºC
Aquacoat ®MP, 80ºC
Aquacoat ®alginateMP,60ºC
Aquacoat ®alginate
MP,80ºC
Fig. 2. Gastro resistance assay for Aquacoat ®
MP
s with and
without alginate, prepared either at 60ºC
or 80ºC.
The in vivoassay dem
onstrated that Aquacoat ®
MP
s were capable of evoking a suitable im
mune
responsethat
would
protect against
cholera infection
as shown in
the total IgG secretion
represented in
Fig. 3.
Antibody
production increased after
the administration of the first
dose of the vaccine. At weeks 4 and 8, the rats
receiving 60
mg
of Aquacoat ®
MP
s and
Aquacoat ®
alginate M
Ps
displayed low
er antibody levels than the groups
receiving theequivalent
dose of
VC
. N
evertheless, this
difference was not detected for serum
samples
at the following w
eeks. At the 12
thw
eek, 30m
g of
Aquacoat ®
alginate M
P
exerted higher
antibody titres than 60m
g of Aquacoat ®
MP
s or A
quacoat ®alginate M
Ps.
0 2 4 6 8 10 12
24
812
1520
22
Specific anti-VC IgG (log10)
Time (weeks)
60 mg Aquacoat MP
60 mg Aquacoat alginate MP
30 mg Aquacoat MP
30 mg Aquacoat alginate MP
free VC (60 mg)
free VC (30 mg)
*
§
§
Fig.3. Serum
total Anti-V
C IgG
levels expressed as log10 of the
last reciprocal dilution above pre-imm
une OD
492 plus 2 S.D
.*and § represents statistically significant differences betw
een groups (p<0.05).
At
the 15
thw
eek, this
difference w
as only
detectable for rats receiving 60m
g of Aquacoat ®
MP
s. At the end of the study, no difference could
be achieved forany group. Thus, as far as IgG is
concerned, spray
driedcholera
vaccinedeveloped the sam
e antibody response as VC
suspension.
Sim
ilar results
were
reported by
Borde and co-w
orkers (4); as they administered
freeze dried VC
, the exerted imm
une response w
as very similar to the com
mercially available
heat killed VC
along with toxin B
subunit.
Regarding
IgM
production, at
the 4
thw
eek groups receiving 60 and 30
mg of A
quacoat ®
MP
s evoked lower IgM
production than 30m
g A
quacoat ®alginate
MP
s and
the low
estV
C
dose. As the assay w
ent on, this difference was
no longer
observable. A
t the
end of
the experim
ent, 60m
g of Aquacoat ®
alginate MP
s show
ed lower protection values than the low
er
dose of
VC
. It
could be
concluded that,
especially 30
mg
of A
quacoat ®alginate
MP
s w
ere able to mim
icthe
IgM production
ofV
C.
Yeh et al.described in an earlier w
ork that VC
P
LGA
microparticles w
ere able to induce IgM
andIgG
response against VC. H
owever, they
achieved higher imm
unoglobulin levels than VC
w
hen adding amphotericin B
to the formulation.
0 2 4 6 8 10 12
24
812
1520
22
Specific anti-VC IgG (log10)
Time (weeks)
60 mg Aquacoat MP
60 mg Aquacoat alginate MP
30 mg Aquacoat MP
30 mg Aquacoat alginate MP
free VC (60 mg)
free VC (30 mg)
*
§
§
Fig.4. Serum
Anti-V
C IgM
levels. * and § pointsout the
statistically significant
differences detected
in the
study(p<0.05).
Conclusions
Spray drying w
as found to be an appropriate technique for M
P elaboration
in terms of size,
high encapsulation
efficiency, V
C
loading, antigenicity
and gastro-resistance.
The subsequentin vivo study dem
onstrated that MP
w
ith or without alginate w
ere able to induce asuitable im
mune response, com
parable to that of V
C alone. B
esides that, groups administered
with 30
mg of A
quacoat ®alginate M
Ps w
ere especially capable of exerting the sam
e imm
une response as the heat killed V
C. A
ltogether, it m
ight be concluded that spray drying of VC
along w
ith Aquacoat ®
and alginate leads to an easy to handle and transport pow
derproduct
that is able to mim
ic VC
imm
une response.
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thanks the
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Governm
ent (D
epartment
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ducation, U
niversities and
Research) for the fellow
ship grant. The authors w
ould like to thank FMC
Biopolym
er for kindly provide A
quacoat ®. This project was partially
supported by
the B
asque G
overnment
(Consolidated G
roups, IT-407-07). The authors gratefully acknow
ledge the support of University
of the Basque Country U
PV
/EHU
(UFI11/32).
pH 6.8pH1.2
*
166
HIDROGELES pHEMA/CICLODEXTRINAS PARA LA LIBERACIÓN CONTROLADA DE ACETÓNIDO DE TRIAMCINOLONA
Pourantru P.,García Millán E.,Sobarzo Sánchez E., Otero Espinar F.J.
Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Facultad de Farmacia. Universidad de Santiago de Compostela.
IntroducciónLas
lentes blandas de contactode
poli-(hidroxietil-metacrilato) han demostrado un interesante potencial como sistemas de liberaciónocular
controlada de
medicamentospara
tratar afecciones
oftálmicas de la zona anterior. Para ello, es necesario incorporar el fármaco en la dosis adecuada y que éste se libere a una velocidad adaptada para obtener dosis terapéuticas durante tiempos más o menos prolongados(1).El acetónido de triamcinolona (TA)es
un glucocorticoide sintético con elevada potencia antiinflamatoria
y efecto prolongadoque se
emplea habitualmenteen el tratamiento de patologías
oculares. Pero debido a su reducida hidrosolubilidad, plantea problemas para ser formuladoa dosis elevadas enformulaciones acuosas(2). Una aproximación interesante para
mejorar las prestaciones de las lentes de pHEMA
como sistemas de liberaciónes la incorporación
de ciclodextrinas (CD) en la estructura de los hidrogeles durante la fase de polimerización, bien en
mezcla física o unida químicamente a los monómeros formadores del hidrogel. La formación de complejos de inclusión CD-fármaco
en el interior del hidrogel debe favorecer la afinidad del fármaco y la estructura del hidrogel lo que redundaría enmejorarlas propiedades decarga y/oliberación (1).La
elaboración de
los hidrogeles
con ciclodextrina
unída -CD
modificadas químicamente que se unen covalentemente a los monómeros de 2- hidroxietil-metacrilato (HEMA) en relación estequimétrica 1:1. El objetivo de este estudio ha sido optimizar la carga y la liberación de TA de los hidrogeles mediante la variación de su composición en cuanto a la cantidad de agua incorporada, la ausencia o presencia de CDs y el empleo de CDs
unidas químicamente a la red del hidrogel.
Materiales y métodos
Materiales
2-polihidroxietilmetacrilato (pHEMA),
ácido metacrílico
(AM)(Merck); Etilenglicoldimetacrilato (EGDMA) (Aldrich), Irgacure ®2959 (BASF), Acetónido de triamcinolona
(Fagron)y Kleptose HPCD
(Roquette).
Hemosutilizado dos monómeros de HEMA a los
que se unen covalentemente las CDs, para lo que hemos empleado dos tipos de espaciadores, uno de ello un
cromóforo (HEMA-CD(2)) que actúacomo marcador (Fig 2).
La síntesis de HEMA-CDs se realizó usando derivados monosubstituidos de ácido, ester
y amida y halometil CDs e hidroxil derivados de HEMA en condiciones básicas, (N(CH
3 )3 ) o Cs2 CO3 , en DMF a temperature ambiente. La
formación de los derivados de CDs-HEMA se caracterizó mediante RMN y masas.
Fig1. Estructuras de las CDs modificadas quimicamente, R1 representa la CD y R2 el HEMA.
Elaboración de los hidrogelesmediante fotopolim
erización
El agente reticulante EGDMA (80 mM,1%), el monómero funcional
AM (200 mM, 2.5%)y las disoluciones
acuosas (en función de la cantidad de agua)
delas diferentes CDs
estudiadasfueron
disueltos en HEMA (6 ml; 96.5%) bajo agitación magnética
constante durante 45 min(Tabla 1 y 2).
Posteriormente seincorporó el iniciador Irgacure ®2959 (10 mM) durante 15 min
más. La solución de monómeros resultante fue inyectada en un molde constituido por dos placas de vidrio (10x10 cm) impregnadas internamente con diclorodimetilxilano y separados por un marco de silicona de 1 mm de ancho.Los moldes se irradiaron con una lámpara UV
durante 30minutos. Tras la polimerización, los
hidrogeles fueron lavados hasta eliminación de los monómerosno
reaccionantes.
La superficie
de las
lentes se
caracterizo mediante
un PERFILÓMETRO ÓPTICO 3D Z-20(Zeta instruments).
Tabla 1.Composición de los
hidrogeles sintetizados en función de la cantidad de agua incorporada, con el fin
de modificar la
microestructura de las lentes.
Tabla 2. Composición de los hidrogeles sintetizados conteniendo
CDsy HEMA-CD..
Estudios de cargade
TA enlos hidrogeles
Los estudios de carga de TA en los diferentes hidrogeles sintetizados
se llevó a cabo por inmersión de los mismos en una disolución suturada del fármaco (10 ml)en Nacl al 0,9%
durante cuatro
días. El
contenido en
TAse
determinópor
espectrofotometría UV a = 242 nm tras ser filtradas por filtros de
membrana (0,45 m Sartorius ®, Alemania).Cada ensayo ha sido
realizado por triplicado.
Estudios de liberación de TA de los hidrogeles
Los hidrogeles cargados fueron sumergidos en un vial conteniendo 5 ml de fluido lacrimal simulado (FLS; 6.7 g/l NaCl, 2.18 g/l NaHCO
3 , 1.38 g/l KCl, 0.084 g/l CaCl2 ·2H2 O, pH 8) bajo agitación
orbital a 100 rpm y 37ºC. A intervalos de tiempo predeterminados, se tomaron muestras de 1 ml del medio de liberación y este volumen extraído era reemplazado con la misma cantidad de FLS. La determinación de la concentración de TA se realizó mediante espectrofotometría a
242nm. Cada ensayo ha sido realizado
por triplicado.
0%H
2 020%
H2 0
40%H
2 0HEMA (g)
6,2184,974
2,218EGDMA (g)
0,0950,076
0,038AM (g)
0,1030,082
0,0412Agua (m
l)--
1,22,4
Irgacure (g)0,011
0,0110,011
0%H
2 05%
CD20%
H2 0
5% CD
40%H
2 0+5%
CD
40%H
2 0HEMA-CD
HEMA (g)6,218
4,9683,73
1,865 (5%
HEMA-CD / 95%
HEMA)EGDMA (g)
0,0950,076
0,0570,0285
AM (g)0,103
0,08240,0618
0,0309AGUA (ml)
--1,2
2,41,2
CD (g)0,3
0,240,18
Irgacure (g)0,011
0,0110,011
0,0055
ddasasqquiuimimicacamementntee
opolimerización
, el monómero func
167
Resultados y discusión
En la imagen obtenida en los estudios de perfilometría (figura 3) se observa que la incorporación de agua en el proceso de síntesis de las lentes de pHEMA dan lugar a la formación de poros superficiales que se adentran profundamente en el hidrogel. Dichos poros presentan un diámetro medio de 1.74±0.69 y 4.29±9.36 para AM200 40%
agua y AM200 20% de agua, ocupando un 3.5%
de la superficie del hidrogel(figura 4). La formación de porosesdebido a que durante la etapa de polimerización
aumenta la hidrofobicidad del polímero por lo que el agua deja de ser miscible formándosegotas que dan lugar a la formación de
pequeños poros en el hidrogelque alcanzan a la superficie.
Figura 3. Imágenes topográficas de la superficie de los hidrogeles
ma200_p
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25
Fe
ret d
iam
ete
r (m
)
size distribution (%)
ma200_p
40
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 10 20 30 40
Feret diam
eter (m
)
size distribution (%)
Figura 4. Distribución de tamaño de poro superficial estimado mediante análisis de imagen.
Fig 2.Velocidad de liberación de TA a partir de los hidrogels
elabarados con y sin CD..
Los hidrogeles que contienen mayor proporción de agua son los que más cantidad de TA incorporan (datos no mostrados) y liberan probablemente debido a que la formación de poros facilita la difusión delfármaco tanto
durante el proceso de carga como en la liberación. Por otra parte no se observó una influencia significativa de la presencia de CD en la incorporación de TA en el hidrogelaunque sí que da lugar a perfiles
de cesiónmás lentos y
controlados, lo que sugiere que aunque no incremente la afinidad por el polímero la posible formación de complejos CD-TA
de gran tamaño
molecular, dificulta la difusión del fármaco a través del hidrogel.
Fig 4.Liiberación de TA a partir de los hidrogelesfabricados con un 40%
de agua,sintetizados empleando CDen mezcla física o unida
mediante enlaces covalentes.
El análisis estadístico de los resultados ha demostrado que no hay diferencias significativas, en cuanto a la carga de TA,
entre hidrogeles contenido
-CD-1. En cambio, sí se han encontrado diferencias entre éstos y HEMA-CD-2, que carga menos cantidad de
fármacoque los anteriores. Esto podría
deberse a la presencia del grupo cromóforo empleado como espaciador ya que debido al alto tamaño molecular de la TA podría dificultar el intercambio del fármaco entre el medio y la cavidad de la ciclodextrina.En cuanto a la liberación (fig. 4) apenas existen diferencias entre los tres hidrogeles con idénticos perfíles hasta las 10 horas. A
partir de este período los elaborados conHEMA-CD-1
liberancantidades ligeramente superiores.
Conclusiones
A partir de los resultados mostrados podemos concluir quela
incorporación de aguapermite modular la microestructura de
los hidrogeles
y de esa manera modificar los procesos de carga y difusión de la TA.
La incorporación deCDs
en mezcla física o unida al HEMA no modifica significativamente el proceso de carga, salvo la que incluye el grupo cromóforo si bien permiten ejercer un mayor contol sobre la liberación del fármaco
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020
4060
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
AM
200 0% H
20A
M 200 20%
H2O
AM
200 40% H
20
AM
200 0% H
20 5%C
DA
M 200 20%
H20 5%
CD
AM
200 40% H
20 5%C
D
tiempo (h)
mg TA liberados
024
4872
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
40%H
20 5% C
D 40%
H20 H
EM
A-C
D(1)
40% H
20 HE
MA
-CD
(2)
tiemp
o (h)
mg TA liberados
168
TH
E E
FFEC
T O
FPL
GA
MIC
RO
PAR
TIC
LE
S CO
NT
AIN
ING
EPID
ER
MA
L G
RO
WT
H
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TO
R (E
GF) O
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HE
HE
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OF FU
LL
-TH
ICK
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SS EX
CISIO
NA
L W
OU
ND
S IN
DIA
BE
TIZE
D W
ISTA
R R
AT
S
G. G
ainza1,2, F.B
. Gutierrez, J.J. A
guirre,M. Igartua
1,2, R.M
. Hernández
1,2, J.L. Pedraz1,2
1NanoB
ioCel
Group, Laboratory of Pharm
aceutics, University of the B
asque Country, School of
Pharmacy, V
itoria, 01006, Spain2B
iomedical R
esearch Netw
orking Center in B
ioengineering, Biom
aterials and Nanom
edicine (CIB
ER-
BB
N), V
itoria, 01006, Spain.
INT
RO
DU
CT
ION
Non-healing
diabetic foot
ulcer (D
FU),
a chronic
ulceration com
monly
suffered by
diabetic patients,
has becom
e a
problem
tohealth
care system
s. The
ulcers are
characterized by an atypical extracellular matrix
(ECM
) synthesis
and rem
odelation, re-
epithelization disturbance
and a
recurrent inflam
matory
response(1).
The Epiderm
al G
rowth Factor (EG
F) is essentialfor a correct
dermal
and epithelial
regeneration(2).
How
ever, the short half-life of rhEGF in vivo
requires m
ultiple adm
inistrations and
this restricts
its clinical
application.The
encapsulation of
rhEGF
into polym
eric m
icrospheres (M
S) represents
a prom
ising strategy to overcom
e this limitation (3).
In the
current w
ork, rhEG
F Poly-Lactic-co-
Glycolic-A
cid (PLGA
) MS w
ere optimized and
evaluated for the treatment of a
full-thicknessw
oundm
odelin diabetized Wistar rats.
MA
TE
RIA
LS A
ND
ME
TH
OD
SM
icrospheres preparationEG
F-MS
were prepared using a w
/o/w double
emulsion/solvent evaporation m
ethod. Briefly, a
dichloromethane:acetone
(3:1) solution
containing 5%
(w
/v) of
PLGA
(R
esomer
RG
503) was em
ulsified by sonication for 15 s at 50 W
with an 1%
(w/v) rhEG
F aqueous solution containing H
uman Serum
Album
in (HSA
),polyetilenglycol 400
and sodium alginate (v/v).
The resulting emulsion (w
/o) was poured into
15 mL of 5%
polyvinyl alcohol (PVA
) and 5%
NaC
laqueous solution and em
ulsified by apaddle
stirrer during 60 s to perform the double
emulsion
(w/o/w
). Finally,
800 m
l of
an aqueous solution of 5%
NaC
l and 0.6 mM
of C
alcium chloride w
asadded and stirred for 30
min. The
MS w
ere thencollected by filtration
and lyophilized.Lastly, the rhEG
F-MS w
ere -
irradiation (rhEGF-M
S-and the influence of
the sterilization process was studied.
Microspherescharacterization
After M
S preparation the following param
eters w
ere m
easured: size
distribution,surface
morphology,
zeta potential,
encapsulation efficiency
(EE) and
in vitro
rhEGF
releaseestim
ated byELISA
. The in vitrobiological
activity and
wound
healing assay
were
performed
using BA
LB/C
3T3 fibroblasts.
In vivow
ound healing studyW
istar rats were diabetized by a single i.p.
administration of 0.5%
streptozocin.One w
eek after,
2 full-thicknessexcisional w
ounds were
made in the dorsum
of each rat. Anim
als were
sacrificedon days 7, 11 and 17 after w
ounding. Lastly,
wound
closure (%
), re-epithelization
grade and
restoration of
the inflam
matory
processw
ere analyzed.
The experim
ental groups w
ere set as,(i) blank control, (ii) vehicle control, (iii) blank M
S control, (iv)75
g of non-encapsulated rhEG
F twice a w
eek and (v) 75
g rhEG
F-MS.
All
the treatm
ents w
ere applied in the w
ound by injection.
RE
SUL
TS A
ND
DISC
USSIO
NM
icrospheres characterizationTable 1 show
thatrhEGF-M
S, before and after -sterilization, presented sim
ilar size and zeta potentialvalues. N
evertheless, the EE decreased after the sterilization process. Som
e authors attribute this decrease to a degradation of thedrug during the sterilization process(4).
Table1: Characteristics of the M
S.Form
ulationSize (
m)
EE (%)
rhEGF-M
S12.18
-25.5068.82
rhEGF-M
S-14.94
-28.5060.01
SEM photographs show
ed regular and smooth
surfaces in both cases (Figure1).
Figure 1:SEM photographs of M
S x1000 enlargement. (A
) rhEG
F-MS. (B
) rhEGF-M
S-
AB
169
No
difference w
as found
between
both accum
ulative released
profiles (Figure
2).
Figure 2: rhEGF released from
MS.
In vitroC
ell culture assaysB
ioactivity of released EG
F
As show
nin Figure 3 the biological activity of
EGF w
as not significantly affected during them
icroencapsulation or
thesterilization
processes.
Figure 3: ED50 of the
rhEGF released from
MS.
Wound healing assay
In the
presence of
rhEGF,
Balb/c
3T3 fibroblasts closed the w
ound faster than control group.
No differences w
ere detectedbetw
een rhEG
F released from M
S and non-encapsulated rhEG
F (Figure 4).
Figure 4:W
ound healing assay. (A)
freshserum
free m
edium, (B
) rhEG
F released from the M
S (C) non-
encapsulated rhEGF.
In vivostudiesW
ound closureFigure
5show
s that
7 and
11 days
after w
ounding, rhEG
F-MS
group show
ed a
statistically significant decrease of the wound
areain com
parison with the other experim
ental groups. B
y days 14 and 17 all the groups closed.
Figure 5: Wound closure during the experim
ent. (A) B
lank control, (B
) Vehicle control, (C
) Blank M
S control, (D)
Non-encapsulated EG
F group and (E) EGF M
S group.
Re-epithelization grade
For rhEGF-M
S and Blank control group there
was a com
plete re-epithelization on the11
thday. For the other
groups the re-epithelization was
not complete until the end of the study.
Resolution of the inflam
matory
processEG
F-MS
treated groups
leftthe
acute-inflam
matory phase on the 7
thday. B
y the 11th
day after wounding EG
F-MS and B
lank control show
ed a complete recovery and healing. A
t the end of the study, all the experim
ental groups show
ed a complete recovery (Figure 6).
Figure 6: Inflamm
atory recovery of the experimental groups
on days 7, 11 and 17after w
ounding.
CO
NC
LU
SION
In this study EGF containing m
icrospheres have been optim
ized. Neither the m
icroencapsulation nor
the -sterilization
processesaffected
significantly the activity of the rhEGF.
The in vivo
results demonstrate the potential use of
rhEGF-loaded m
icrospheres to promote a faster
wound healing on the excision region of rats
than control groups.
RE
FER
EN
CE
S (1)
Cook H
, Davies K
J, Harding K
G, Thom
as D
W.
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KN
OW
LE
DG
ME
NT
SG
. Gainza thanks the “U
niversidad del País V
asco- UPV
-EHU
” for the Fellowship G
rant.
171
AC
CIÓ
N C
OD
ISOL
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NT
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MIZO
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NÉ
SICO
EN
ME
ZCL
AS A
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OSA
S Y N
O
AC
UO
SAS
MA
. Peña,B. Escalera, A
BSánchez, A
. Reíllo
Departam
entode Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Alcalá de H
enares, España
Introducción:En
la solubilización
de los
principios activos sondiversos los factores que
influyen, durante
la prim
era fase
de este
proceso, el sólido sufre una desestructuración de su
red cristalina, y en la segunda, las moléculas
del soluto seseparan superando sus fuerzas
cohesivas, en el disolvente se crean cavidades para
acomodar
al soluto.
En esta
etapa se
absorbe calor, por lo que su contribución a la solubilidad es desfavorable, por otro lado, las m
oléculas de
soluto se
introducen en
las cavidades creadas en el disolvente. Se produce la solvatación, es decir, la interacción entre el soluto y el disolvente m
ediante fuerzas de van der
Waals
y/o enlaces
de hidrógeno.
Esta segunda etapa contribuye favorablem
ente a la solubilidad porque el proceso es exotérm
ico (1). La solubilidad se relaciona directam
ente con las
magnitudes
termodinám
icas del modo
(ec. 1): G
S=H
S- TS
S=- RT lnX
2 (ec.1)
G, es la energía libre,
H, la entalpía,
S, la entropía, X
2la fracción m
olar del soluto, que representa la solubilidad.
Esas magnitudes term
odinámicas sirven para
interpretar el mecanism
o de acción codisolvente y
para com
probar si
existen relaciones
de com
pensación entalpía-entropía (H
-G
).
Materiales y M
étodos:En este trabajo se ha
utilizado el
metam
izol M
g (Fagron),
antiinflamatorio no esteroideo (pirazolonas), y
dos m
ezclas binarias
que contienen
un codisovente com
ún. Acetato de etilo, etanol
(grado espectrofotométrico. Panreac, M
onplet &
Esteban, España), y agua destilada.
Métodos:
Las disoluciones
saturadas se
preparan a
15º-35ºCy
se sitúan
en baños
provistos de agitación (Heto SH
02/100, AT
110) hasta alcanzar el equilibrio de solubilidad. La fase sólida se separa por filtración (0,2
m).
La concentración
disuelta se
mide
en un
espectrofotómetro (Shim
adzu UV
-2001PC) a la
longitud de
onda de
máxim
a absorción
seleccionada. Se determina la
entalpía (F)
ytem
peratura de
fusión(T
F)por
calorimetría
diferencial de barrido (Mettler TA
4000).
Para realizar
el análisis
de com
pensación entalpía-entropía, se determ
inan las magnitudes
termodinám
icas de
disolución utilizando
el
método de K
rug et al. (2,3). Se representa lnX2
frente a(1/T-1/T
mh ), donde T es la tem
peratura experim
ental y
Tm
hla
media
armónica
del intervalo de tem
peratura empleado. Las gráficas
obtenidas son lineales, a partir de la pendiente y ordenada en el origen se obtienen la entalpía (
S)y la energía libre de disolución (G
S): S=
-R pendiente
(ec. 2) S=
-R T
mh pendiente
(ec. 3)
Los valores de las entalpías y entropías de m
ezclase
calculan con
las ecs.
4 y
5,(T
F=152,59ºC,
HF= 260,83 J/g):
MS -
F
(ec.4) M
S – F
(ec. 5)
El porcentaje
de contribución
entálpico-entrópico
H y
TS respectivamente) para cada
fase del proceso de solubilidad se calcula (4): H
/100
(ec.6) TS
/100
(ec.7)
Resultados
y D
iscusión:Las
magnitudes
termodinám
icasde
disolución y
mezcla
se m
uestran en esta tabla.
Tabla
I.Funciones
termodinám
icas del
proceso aparente de disolución y m
ezcla(K
J/mol)
% Et.
SS
SM
HTS
049,34
42,36-26,4
-23,483,67
16,33
3032,65
25,80-24,3
-39,977,33
22,67
6031,34
23,75-25,4
-42,275,76
24,24
8030,08
21,36-27,8
-44,472,44
27,56
9024,87
15,63-30,9
-50.162,43
37,57
10052,11
40,72-38,4
-25,177,8
22,2
9052,64
40,38-41,2
-25,476,44
23,56
8052,35
39,57-42,9
-26,275,33
24,67
7040,87
27,50-44,7
-38,267,1
32,9
5042,07
27,12-49,9
-38,764,34
35,66
3028,47
13,52-49,9
-52,247,4
52,6
028,35
13,84-48,7
-5248,78
51,22
172
HS
GS
No-acuosa
El cam
bio entálpico
(ec. 6)
involucra los
requerimientos energéticos del proceso global
de disolución.
La entropía
aumenta
por la
ubicación del soluto en el seno del disolvente, tam
bién debe
considerarse la
posible organización por asociación de las m
oléculas del disolvente alrededor de las partículas del soluto, lo cual dism
inuye la entalpía.
Para el
proceso de
mezcla,
los valores
de entalpía y de entropía son negativos, la entalpía soluto-disolvente es exotérm
ica, ésta magnitud
es superior a la de formación de cavidades. La
estructuración de las moléculas alrededor de los
grupos no
polares del
soluto(hidratación
hidrofóbica) contribuye a disminuir el calor neto
de m
ezcla (
HF)
en solución
acuosa hasta
valores negativos (Tabla I).
La Figura 1m
uestra el perfil de solubilidad se observa un único m
áximo de solubilidad situado
en el segmento m
ás polar de la mezcla de
solventes. D
icho m
áximo
alcanza su
mayor
valor en el porcentaje 40% etanol-agua, aunque
se trata de un máxim
o muy am
plio . La Figura 2 representa
la variación
de la
entalpía de
disolución con
la proporción
de etanol.
El descenso de la
entalpía en etanol-agua, se relaciona
con el
incremento
de solubilidad
observado (Tabla I).
Las fuerzas
que dirigen
el proceso
de solubilidad durante la fase de disolución son de naturaleza predom
inantemente entálpica (T
abla I, Figura 2).
La Figura
3 representa
la com
pensación entalpía-entropía. En las dos m
ezclas se obtiene una relación lineal. Esta relación indica que existe un único m
ecanismo responsable
de la variación de solubilidad, la
entalpía, cuando se añade el codisolvente.
El m
ecanismo
de disolución
depende de
la naturaleza de la m
ezcla disolvente, y de la proporción de codisolvente en la m
ezcla.Los
resultados apoyan
la hipótesis
de que
la com
pensación entalpía-entropíaes característica
de la
solubilidad de
fármacos
en m
ezclas
disolventes, tanto acuosos como no acuosos. Los
resultados tam
bién perm
iten identificar
mecanism
os com
unes que
explican la
acción codisolvente.
En anteriores
trabajos
en las
mezclas acuosas se observaron dos m
ecanismos,
entalpía y entropía, cada uno de ellos dominante a
una cierta
proporción de
codisolvente que
depende de la hidrofobicidad del fármaco
(5-7).
Figura 3.Com
pensación entalpía-entropía
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s associated w
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Acuosa
No-acuosa
10 19 28 36 45 6000 8500
11000 13500
16000
Figura 1. Solubilidad metam
izol Mg,
enfunción de la polaridad y de la T
Acuosa
HS
etanol10 19 28 36 45 0
25 50
75 100
Figura 2.Calor de disolución frente a
proporciónde etanol de am
bas mezclas
0,000 0,018 0,037 0,055 0,073 15,0
23,3 31,5
39,848,0
delta
X
173
BIO
AV
AIL
AB
ILITY
OF Q
UE
RC
ET
IN E
NC
APSU
LA
TE
D IN
POLY
ME
RIC
N
AN
OPA
RT
ICL
ES.
R. Peñalva, I. Esparza, E. R
incón, M. A
güeros, JM Irache
Departm
ent of Pharmacy and Pharm
aceutical Technology; University of N
avarra,31008 Pam
plona (Spain)
Introduction:Q
uercetin, 3,3’,4’,5’-7-
pentahydroxy flavone,
is one
of the
most
abundant flavonoids
in plants.
It has
been dem
onstrateda w
idevariety of pharm
acological effects,
such as
dilating coronary
arteries, decreasing
blood lipids,
anti-platelet aggregation,
anti-oxidation,anti-anaem
iaand
anti-inflamm
ative activity[1]. In spite of the
potentially beneficial effects of quercetin, it show
s a
very low
absorption
in the
gastrointestinal tract,
andthus,
its oral
bioavailability is lowerthan 10%
[2]. Quercetin
hasaffinity for
drug transporters, including P-glycoprotein,
multidrug
resistance-associated protein2
(MR
P2) and
cytochrome
P450 (C
YP3A
); all of themhighly expressed in the
gut epithelium[1], [3].In addition, quercetin
is easily degraded in the presence of factors suchas light and oxygen. [1], [3]. In order to overcom
e these problems, the aim
of this w
orkw
as to study the encapsulation of this flavone in nanoparticles in order to im
prove its stability and increase its oralbioavailability.
Material and M
ethods:Two different types of
quercetin-loaded polymeric nanoparticles (N
P-A
and
NP-B
) w
ere prepared
following
a patented procedure (PC
T/ES2011/070118).For the characterization, the size, zeta potential, m
orphology and
shape of
the resulting
nanoparticles w
ere evaluated.
The size
and surface charge of nanoparticles w
ere determined
by Laser
Doppler
Electrophoresis using
a ZetaPlus,
(zeta potential
and size
analyzer B
rookhaven Instrum
ents C
orporation). The
morphology of nanoparticles w
as observed by scanning
electron m
icroscopy (Zeiss
DSM
940A
, G
ermany).
The am
ount of
quercetinencapsulated in nanoparticles w
as quantified by H
PLC [4].
In vitro release studies“In vitro”
release studies were carried out under
sinkconditions after dispersant ofnanoparticles
in simulated gastric
(SGF)
and intestinal fluids(SIF)
containing 1%
(p/v)
Tween
80 as
surfactant.A
t different
times,
samples
were
taken and
centrifuged in
a M
ikro 220R
centrifugefor
15 m
in at
10000 rpm
. Supernatants w
ere recovered and analyzed by H
PLC[4].
Pharmacokinetic studies in rats
The oral
bioavailability of
quercetinw
as determ
ined in male W
istar rats. The animals
were
fasted overnight before experiment w
ith free access
to water.The study w
as conducted after adm
inistration of a single dose of 25
mg/kg
quercetin to
rats in
the follow
ingform
ulations: (i)
Solution, (quercetin-PEG
400:w
ater (40:60
by vol)),
(ii) Suspension
(quercetin-water
suspension),(iii)
NP-A
(quercetin loaded nanoparticles in pol A) and
(vi) NP-B
.(quercetin loaded nanoparticles in
polB
)In
addition, the
flavonoid w
as also
administered
i.v. at the same dose. A
t different tim
es, 250 L of blood sam
ples were extracted.
The am
ountof
quercetinin
plasma
was
determined by H
PLC.
The pharmacokinetic analysis of concentration–
time data, obtained after the adm
inistration of the
different flavonoid
formulations,
was
analyzed using
a noncom
partimental
model
using W
inNonlin
6.0 softw
are (Pharsight
Corporation, M
ountain View
, USA
).
Results and discussion:
The main physico-
chemical characteristics of the nanoparticles are
summ
arized in Table 1. Nanoparticles displayed
spherical shape with sizes around 300
nm and
anegative
surface charge.
The am
ount of
quercetin incorporated in these nanoparticles w
as dependent on the polymer used and ranged
from 24
g/mg N
P-A to 80
g/mg N
P-B. The
encapsulation efficiency
in both
cases w
as closed to 80 %
.
Table
1Physico-chem
ical characteristics
of quercetin-loaded nanoparticles. D
ata expressed as m
ean ± SD (n=
3).
Formulation
Size (nm
)
Zeta potential
(mV
)
QU
loading (
g/mgN
P.)EE (%
)
NP-A
251 ±9 -29.5 ±0.9
23.9 ±0.879.4±0.9
NP-B
352 ±4 -45.5 ±0.7
79.1 ±6.992.4±1.2
Regarding
the in
vitrorelease
studies of
quercetin, Figure 1 shows the release profile of
this component w
hen loadedin
NP-A
and NP-
B. The in vitro
release profile of NP-A
and NP-
B exhibited a biphasic pattern, characterized by
an initial
non release
period w
hen the
nanoparticles w
ere incubated
in the
SGF
174
followed
by a
rapid release
when
the nanoparticles w
ere dispersed in SIF .
0 20 40 60 80
100
120
02
46
810
1214
1618
2022
2426
2830
3234
Quercetin released (%)
Time (h)
NP-B
NP-ASIF, pH 6.8
SGF, pH 1.2
Figure 1In vitro release profile of quercetin
from N
P-A and NP-B. D
ata expressed as mean
± SD (n=
3)
Figure 2 shows the plasm
a concentration of quercetin
(ng/mL)
vs. tim
e (hour)
for the
different form
ulations tested.
When
the form
ulations loaded
on nanoparticles
were
evaluated, the curves were characterized
by a rapid
increase in
quercetinplasm
a concentrations till the C
max w
as reached.Then, constant levels w
ere maintained until 8 hours
and finally the quercetin plasma concentration
declined slow
ly w
ith tim
e. The
flavonoidplasm
a levels
when
loaded in
nanoparticles (N
P-A and N
P-B) w
ere significant higher than those
observed for
either the
solution or
suspension of the flavonoid (p<0.05)
Figure 2. Quercetin plasm
a levels after the oral adm
inistration of a single dose of 25 mg/kg.
in different form
ulations: (i) Solution (quercetin after their dissolution in a m
ixture PEG 400-H
2 O (40:60
by vol.))
(ii) Suspension
(quercetin dispersed
in w
ater) (iii) NP-A (quercetin-loaded nanoparticles in
pol A) and (iv) NP-B (quercetin-loaded nanoparticles
in pol B). Data expressed as m
ean±SD (n=
6).
Table 2
summ
arizes the
pharmacokinetic
parameters. Significant differences w
ere found by com
paring AU
Cs. In fact, A
UC
s obtained for both
nanoparticle form
ulations w
ere significantly higher than for both the solution and the suspension of quercetin used as control(p<0.05). O
n the other hand, the oral bioavailability of quercetin form
ulated as solution was calculated
to be about 2% w
hichis in line w
ith previously
reporting data [2]. For the quercetin suspension, this param
eter was significantly reduced. O
n the contrary,
the relative
oral bioavailability
of quercetin
when
loaded in
nanoparticles w
as betw
een 3 and 6 times higher than the value
observed for the PEG:w
atersolution of the
flavonoid. In
any case,
the highest
bioavailability was found for N
P-B.
Table 2.
Pharmacokinetic param
eters of QU
Ein
rats for the different formulations tested. (i)
I.V. (i.v adm
inistration of quercetin after their dissolution in a m
ixture PEG 400-H
2 O (40:60 by vol.))
(ii) Solution(oral
administration
of quercetin
after their
dissolution in a mixture PEG
400-H2 O
(40:60 by vol.))
(iii) Suspension
(oral adm
inistration of
quercetin dispersed in water) (iv) N
P-A (QU
E-loaded nanoparticles
inpol A) and (v) N
P-B (QU
E-loaded nanoparticlesin pol B).
Formulation
T max (h)
C m
ax (g/m
L) AUC
[(g/m
L)h] Fr (%
)
I.V.0 ± 0
59.1 ± 14.8 633.8 ± 152.0
Solution 1.5 ± 1
1.7± 0.7 8.5 ± 4.6
100
Suspension6.8 ± 1.7
0.4 ± 0.08 3.9 ± 1.8
45.3
NP-A
3.6 ± 1.9 3.0 ± 1.4*
25.1 ± 18.5* 296.6*
NP-B
6.3 ± 2.3 3.1 ± 1.2*
51.1 ± 20.6* 603.7*
* p<0.05all groups vs Solution
(U-M
ann Whitney test)
Conclusions:
NP-A
and NP-B
are able to load quercetin. B
oth types of nanoparticles show
gastro-retentive properties
and they
only released the loaded flavonoid under sim
ulated intestinal
conditions. B
oth types
of nanoparticles increased the oral bioavailability of quercetin in com
parison with the traditional
approaches of formulation based on solutions or
conventionalsuspensions of the flavonoid.
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ekker, cop. 2000; 14(24)575-620
Acknow
ledgements
This w
ork is
supported by
AD
ICA
P(IN
NPA
CTO
Project, IPT-2011-1717) from the
Ministry
of Science and Innovation and by the G
overnment
ofN
avarra in
Spain.R
ebeca Peñalva
is financially
supported by
the “A
sociación de Am
igos de la Universidad de
Navarra” (A
DA
).
175
EN
TR
AM
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CT
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VA
SES A
CT
IVO
S
L.Pereiro Expósito,C. A
lvarez-Lorenzo, A. C
oncheiro
Departam
ento de Farmacia y Tecnología Farm
acéutica, Facultad de Farmacia, U
niversidad de Santiagode C
ompostela, 15782-Santiago de C
ompostela,España.
Introducción: Los agentes antioxidantes tienen un gran interés en la prevención y tratam
iento de patologías de la piel y del globo ocular
(1). Adem
ás, se utilizan
habitualmente
como
aditivos alim
entarios para prolongar la vida útil de los alim
entos, previniendo
la alteración
de sus
propiedades organolépticas. Cualquiera de estas
aplicaciones plantea problemas de form
ulación, dado que los agentes antioxidantes presentan, en general,
una baja
hidrosolubilidad y
son quím
icamente
lábiles. U
na m
olécula todavía
pocoestudiada
pero que
encierra notables
posibilidades debido
a su
elevada actividad
antioxidante (considerado
como
el segundo
agente m
ás potente)
y reconocida
biocompatibilidad
e inocuidad
es el
hidroxitirosol, que se extrae del aceite de oliva(2). Se pretende sintetizar hidrogeles acrílicos, diseñados
con los
grupos quím
icos m
ás adecuados
para interaccionar
con el
hidroxitirosol, que
cuenten con
elevada capacidad
de carga
de antioxidante
y que
puedan controlar la cesión durante periodos de tiem
po prolongados,
con vistas
a dos
aplicaciones: a)
confección de
lentes de
contacto blandas
medicadas
potencialmente
útiles para
la prevención
de retinopatías
y cataratas,
y b)
confección de
películas adecuadas
para ser incorporadas a estructuras lam
inares que puedan servir como m
ateriales de envases activos. Para optim
izar la afinidad del entram
ado por hidroxitirosol se aplicó latécnica
de im
printing m
olecular, que
consiste en
incorporar el
fármaco
a la
disolución m
onomérica, de m
anera que los monóm
eros se reordenen
espacialmente
y que,
tras la
polimerización
y la
eliminación
de las
moléculas que han actuado com
o molde, se
formen cavidades con afinidad por el fárm
aco.
Materiales y M
étodos: Síntesis
de los
hidrogeles: Se
prepararon m
ezclas de 2-hidroxietil metacrilato (H
EMA
): 2-butoxietilm
etacrilato (BEM
)40:60 vol/vol, y
se les
incorporó ácido
acrílico(A
Ac)
en distintas proporciones (Tabla 1). C
omo agente
reticulante se utilizó etilenglicol dimetacrilato
(EGD
MA
)y
como
iniciador de
la polim
erizaciónazoisobutironitrilo
(AIB
N).
A
alícuotas de
estas m
ezclas se
les añadió
hidroxitirosol acetato (Seprox Biotech, M
adrid) para preparar entram
ados imprinted (Tabla 1).
La composición de los entram
adosno im
printed fue
la mism
a, salvo que no se incorporó fármaco
durante la
síntesis.La
polimerización
transcurrióa
70ºCdurante 48 horas. Todos los
entramados
selavaron
en agua en ebullicióndurante 30 m
inutos,se cortaron
en piezasde
10x10m
my
se secaron a 40ºC durante 24h.
Finalmente, los entram
ados se acondicionaronen bolsas de plástico herm
éticamente cerradas y
protegidas de la luz.C
aracterización de los hidrogeles:Se registró la tem
peratura de transición vítrea (Tg )
de los hidrogeles
secos en
unD
SC
Q100
(TA
Instruments, U
K) y la transm
itanciaa 600 nm
de
los hidrogeles
húmedos
en un
espectrofotómetro A
gilent 8453 (Alem
ania).La biocom
patibilidad se evaluó mediante
el ensayo de
HET-C
AM
[3]. El grado de hinchamiento en
agua a temperatura am
biente se obtuvo pordiferencia entre los
pesos húmedo (W
s)y seco
(Wd) de los hidrogeles, aplicando la ecuación:
Wd
xW
dW
sQ
/100
)(
Cesión a partir de entram
ados imprinted recién
preparados: Piezas
de entram
ado se
sumergieron
en 30m
l de aguay se conservaron
en viales topacio a temperatura am
biente, bajo agitación m
agnética y protegidos de la luz. A
distintos tiempos, se tom
aron muestras de 3 m
l de cada vial y se registró su absorbancia a 280nm
(Agilent 8453, A
lemania). Las m
uestrasse
devolvieron a loscorrespondientes viales. El
ensayo se
prolongó durante
23días,
y transcurrido este tiem
po, las piezas se pesaron y se
lavaron exhaustivam
ente con
mezcla
etanol:agua 50:50 para completar la extracción
dehidroxitirosol.
Com
o controles se utilizaron piezas de entram
ados no imprinted.
Carga y cesión a partir de entram
ados no im
printed e imprinted recargados:
Piezas de entram
ados no imprinted e im
printed una vez extraído
el hidroxitirosol,
se incubaron
en disoluciones
de agente
antioxidante de
concentración (0.2 g/l, 10 ml) y se m
onitorizó la concentración de hidroxitirosol rem
anente en el m
edio de carga durante 1 semana a tem
peratura am
biente. Una vez cargados, se evaluó la cesión
a partir de los entramados en las condiciones
indicadas.
176
Tabla 1.C
omposición quím
ica de los hidrogeles.
Hidrogel
12
34
2-HEM
A
2.2 ml
2.2 ml
2.2 ml
2.2 ml
BEM
3.3 ml
3.3 ml
3.3 ml
3.3 ml
Ac. A
crílico 0.5 m
l0.5 m
l0
0EG
DM
A
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
0.5 ml
AIB
N
16 mg
16 mg
16 mg
16 mg
Hidroxitirosol acetato
0100 m
g0
100 mg
Resultados y D
iscusión:C
aracterización de
los hidrogeles:
Latem
peratura de transición vítrea (Tg ) de todos
los entram
ados, tanto
imprinted
como
no im
printed, se situó en el intervalo 54-57 ºC.
En agua, los entramados m
ostraron un grado de hincham
iento de 1-2%. U
na vez hidratados, presentaron una elevada transparencia óptica con
valores de
transmitancia
a 600
nm
superiores al 90%.
El proceso de lavado tras la polimerización,
mediante
inmersión
en agua
en ebullición
durante 30 minutos, resultó ser suficiente para la
eliminación de m
onómeros residuales, com
o se confirm
ó al registrar la absorbancia UV
-vis del m
edio en la región 190-220 nm durante el
ensayo de cesión de los entramados im
printed y no
imprinted
recién lavados.
Es interesante
destacar que
tras este
procedimiento
de lim
pieza, los
entramados
imprinted
todavía retienen
más
del 50%
del
hidroxitirosol incorporado durante la síntesis. Por lo tanto, el procedim
iento es
adecuado para
extraer los
monóm
eros residuales,
permitiendo
el uso
directo de
los entram
ados im
printed. En
la Figura 1 se m
uestra el perfil de cesión de hidroxitirosola partir de estos entram
ados.
Tiempo (días)
05
1015
2025
Hidroxitirosol cedido (mg/g)
0 1 2 3 4 5 6
Figura1.Perfiles de cesión de hidroxitirosol en
agua a partir del entramado im
printed tipo 2 (Tabla 1).
Los entramados m
ostraron una elevada afinidad por el hidroxitirosol acetato, que puede unirse alos
componentes
poliméricos
a través
de interacciones hidrofóbicas tipo
-(con B
EM)
y puentes de hidrógeno (con ácido acrílico). Enagua
a tem
peratura am
biente, la
cesión se
sostuvo durante más de un m
es.Los ensayos
preliminares de carga de los entram
ados no im
printed y de recarga de los imprinted ponen
de manifiesto que pueden incorporar cantidades
suficientesdel agente antioxidante. A
demás, los
entramados
mostraron
una elevada
biocoimpatibilidad
elensayoH
ET-CA
M.
Conclusiones:
La incorporación de monóm
eros funcionales a entram
ados de HEM
A perm
ite m
odular el
grado de
hinchamiento
y la
incorporación de
olopatadina sin
alterar las
propiedades m
ecánicas. La
presencia del
fármaco en la m
ezcla de polimerización no
causó cambios en las propiedades m
ecánicas, ópticas
nide
biocompatibilidad
de los
entramados,
que presentan
características adecuadas com
o lentes de contacto medicadas.
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(3) NIC
EATM
-ICC
VA
M, In vitro test m
ethod for detecting ocular corrosives and severe irritants. http://iccvam
.niehs.hih.gov/methods/ocutox/
ivocutox/ocu_brd_hetcam.htm
, 2012.
Agradecim
ientos:Trabajo financiado por la X
unta de Galicia
(10CSA
203013PR),
FEDER
y
MIC
INN
(SA
F2011-22771; IN
NPA
CTO
IPT-060000-
2010-14, MIPFO
OD
project).
177
DISE
ÑO
Y D
ESA
RR
OL
LO
TE
CN
OL
ÓG
ICO
DE
NA
NO
CÁ
PSUL
AS L
IPÍDIC
AS D
E U
N
CA
NN
AB
INO
IDE
. L. Prieto
1,A. I. Torres-Suárez
1,2
1Departam
entode Farm
acia y Tecnología Farmacéutica; 2Instituto
de Farmacia Industrial.U
niversidad C
omplutense de M
adrid, España.
Introducción:Los cannabinoides son un grupo
de com
puestos que
derivan de
la planta
Cannabis sativa, siendo los m
á9-tetrahidrocannabinol
(THC
)y
cannabidiol (C
BD
). La investigación en cannabinoides ha
experimentado
en los últimos años un gran
auge, planteándose su posible utilización en el tratam
iento de diferentes patologías como las
nauseas y vómitos asociados a la quim
ioterapia, la anorexia en
pacientes con SIDA
, el dolor neuropático, la esclerosis m
últiple, el glaucoma
y el cáncer. Estos efectos son consecuencia de la estim
ulación de receptoresC
B1 (localizados
preferentemente
a nivel
del SC
N)
y C
B2
(asociados preferentemente al sistem
a inmune).
Nuestro equipo de investigación ha com
probado el elevado efecto citotóxico de TH
C y C
BD
en un
modelo
xenográfico de
glioma
humano
inducido en ratones 1, y ha desarrolladocon
ambas m
oléculas nanopartículas poliméricas 2y
micropartículas
biodegradables para
su liberación prolongada durante 3 sem
anas tras su adm
inistración subcutánea3.
El objetivo del presente trabajoes el diseño y
desarrollo de nanocápsulas lipídicas (LN
Cs)
como un sistem
a eficaz de vehiculización de cannabidiol.
EstasLN
Cs
facilitarían la
dosificación del principio activo y, su acceso a biofase potenciando los efectos
antitumorales
de esta molécula.
Materiales y M
étodos: 1.- Elaboración de
LCN
s: para la elaboración de las nanoparticulas
lípidicasse ha utilizado el
método
de inversión de fases 4, realizándose
tres ciclos de temperatura. C
omo com
ponentes lipídicos
se utiliza
Labrafac W
L 1349
(triglicéridos de ácido cáprico-caprílico), Lipoid S75-3
(lecitina de
soja con
un 69%
de
fosfatidilcolina)y Solutol H
S 15 (mezcla de
polietilenglicol 660
e hidroxiestearato
de polietilenglicol 660). La tem
peratura de inversión se fases seha
determinado
por conductimetría, realizándose
medidas cada 2ºC
, entre 45ºC y 95ºC
, bajo agitación m
agnética.Se
elaboran tres
lotes de
LNC
s blancas
y cargadas con C
BD
según las fórmulas de la
tabla 1,con el fin de evaluar la influencia de la com
posición lipídica sobre el tamaño de las
LNC
s. Una vez obtenidas, las nanocápsulas se
esterilizan mediante filtración utilizando una
mem
brana de 0,22m
y se conservan a 4ºC en
forma de suspensión acuosa.
Para la elaboración de las LNC
s cargadas, se incorpora entre un 4%
y un 9% de C
BD
a la fase lipídica.
% Fase lipídica
Com
ponenteL
-1L
-2L
-3Solutol
65.741.5
26.1Labrafac
28.850.4
65.1Lipoid
5.58.1
8.8Tabla 1. C
omposición lipídica de los tres lotes
de LNC
s.
2.C
aracterización de las LNC
s: se determina el
tamaño m
edio y la distribución de tamaños de la
suspensión de
nanopápsulas, por
dispersión dinám
ica de luz láser, utilizando un equipo Zetatrac N
PA152, con el que tam
bién se mide el
potencialZ
de las
nanocápsulas blancas
y cargadas con activo. El aspecto de las LN
Cs se
observa por
microscopía
electrónica de
trasmisión
(TEM), tiñendo previam
ente las m
uestras con
acetato de
uranilo al
2%
y utilizando
un
microscopio
Jeol 100C
X.
Resultados y D
iscusión: C
on las tres fórmulas ensayadas se obtuvieron
suspensiones acuosas
de nanopartículas
blancas, con apariencia turbia azulada al incidir sobre ellas la luz.
Formulaciones
Tamaño
medio (nm
) Potencial Z
(mv)
L-1 B
lanca22.25
20.89 C
BD
24.73 12.84
L-2 B
lanca40.80
21.59C
BD
42.2021.49
L-3 B
lanca108.9
1.77C
BD
119.7-3.71
Tabla 2:Tam
año medio y potencial Z de las
distintas form
ulaciones de
nanoparticulas blancas y cargadas con C
BD
.
Según se recoge en la tabla 2, al disminuir el
porcentaje de
Solutol y
aumentar,
en consecuencia,
el porcentaje
de Labrafac,
aumenta el tam
año de las LNC
s; de manera que
la modificación de las proporciones de estos
dos componentes resulta una form
a eficaz de controlar
el tam
año de
las nanocápsulas
obtenidas. Mientras que Labrafac constituye el
núcleo de las nanocapsulas, Solutol actúaen la
formulación com
o agente surfactante hidrófilo
178
y quedaría localizado en la superficie exterior de las nanocápsulas, aportándolas estabilidad física
ya que
presenta una
temperatura
de solidificación de 35ºC
. En concreto, con las fórm
ulas estudiadas, se obtienen nanocápsulas con un tam
año medio de
22.25nm, 50.80nm
y 108.9nm
, y una muy estrecha distribución de
tamaños, com
o puede observarse en las gráficas A
y C de la figura 1.
Figura 1:
distribución de
tamaños
de las
nanopartículas: L-1 blancas (A) y con C
BD
(B);
L-2 blancas (C) y con C
BD
(D)
Esta estrecha distribución de tamaños tam
bién queda
patente por
microscopía
electrónica (figura 2 A
), observándose esferoides lipídicos con una elevada uniform
idad de tamaño.
Figura 2.
Aspecto
de las
nanocápsulas al
microcopio
electrónico: L-1 blancas (A) y L-1
con CB
D (B
).
La figura
3 representa
la
variación de
la conductividad en función de la tem
peratura para la m
ezcla de fase lipídica y CB
D. C
omo se
puede observar la TIF se encuentra alrededor de los 76.4C
, valor sólo ligeramente
superior alque, según la bibliografía, presenta la m
ezcla de lípidos
sin principio
activo(TIF
=74.3ºC) 4.
Teniendo en cuenta este valor se elaboraron los tres lotes de nanocápsulas cargadas de C
BD
.C
on las tres fórmulas estudiadas se obtuvieron
suspensiones de
nanocápsulasde
CB
D,
verificado visualmente por presentar un claro
efecto Tyndall y una tonalidad azulada debido a la
dispersión
de R
ayleigh, especialm
ente m
arcado en el caso del Lote 2.
Figura 3. Resultados de la determ
inación de la TIF de la m
ezcla lipídica-CB
D.
Las LC
Ns
cargadas con
CB
D
presentan características sim
ilares a las LNC
s blancas. A
unque se obtuvieron valores de tamaño m
edio ligeram
ente superiores, las diferencias no fueron significativas
(figura 1.B y D
). Tampoco se
observaron diferencias
por m
icroscopía electrónica
(figura 2.B
)de
manera
que la
presencia del principio activo no afecta a las características de las nanocápsulas obtenidas.C
onclusión:Se
han puesto
a punto
tres protocolos para la obtención de LN
Cs de C
BD
que perm
iten obtener nanocápsulas contam
años m
edios de 20nm, 50nm
y 100nm. Estudios
posteriores permitirán determ
inar la influencia del tam
año de partícula en la eficacia de las nanocápsulas
desarrolladas
como
vehículos para la adm
inistración de cannabidiol.R
eferencias:(1)
D.
Hernán
et al.
Microspheres
of cannabinoids:
a tool
for im
proving their
administration in pharm
acological studies. C
annabinoids in
biology and
Medicine.
Jerusalem, 2010.
(2) M.R
. Aberturas et al. Preparation and cha-
racterization of
polymeric
nanoparticles loaded w
ith a cannabinoid model drug. 1st
Conference on Innovation in D
rug Delivery:
from biom
aterials to devices. Nápoles, 2007.
(3) D
. H
ernán et
al. Poly-
-caprolactone m
icrospheres as a drug delivery system for
cannabinoid adm
inistration: D
evelopment,
characterization and in vitro evaluation of their
antitumoral
efficacy. J
Controlled
Release, 161 (3) 927–932, 2012.
(4) B.H
eurtault et al. A N
ovel Phase Inversión-B
ased Process for the Preparation of Lipid N
anocarriers.Pharm
. Research, 19 (6)875-
879, 2002
Agradecim
ientos:al
Centro
Nacional
de M
icroscopía Electrónica,por su ayuda en la
realización de las fotografías.
179
APL
ICA
CIÓ
N D
EL
DISE
ÑO
EX
PER
IME
NT
AL
A L
A O
PTIM
IZAC
IÓN
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CIÓ
ND
E A
CE
TA
ZOL
AM
IDA
A PA
RT
IR D
E T
RA
NSFE
RSO
MA
S®
M.J. C
ózar-Bernal, A
.M. R
abasco, N. A
bad, M.L. G
onzález-Rodríguez
Departam
entode Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, U
niversidad de Sevilla, España
IntroducciónA
cetazolamida (A
CZ) es elfárm
acode elección
empleado en el tratam
iento de ataques agudos de glaucom
a y para el control de la presión intraocular (PIO
) post-quirúrgica.A
ctualmente se está investigando la vía tópica
como alternativa a la vía oral.
Este fármaco
presenta tanto baja solubilidad(0.7 m
g/mL)
como
permeabilidad (clase IV
, BC
S). Para solventar estas
dificultades, con el fin de que pueda atravesar intacto determ
inadas capas de
la m
ucosa, se
han diseñado
vesículaselásticas
o Transfersomas ®, capaces de cruzarel
estrato córneo sin ser destruidas, accediendoasí
a estructurasmás internas.
LosTransfersom
as ®son liposom
as modificados
que incluyen
en su
composición
los denom
inados “activadores del borde o margen”
en el interior de la matriz fosfolipídica, con el
fin de
incrementar
la elasticidad
ydeform
abilidad de la vesícula(El Zaafarany y
cols., 2010).
Este tipo
de sustancias
son habitualm
ente tensioactivos de cadena única, capaces
de ofrecer
un elevado
radiode
curvatura que desestabilizalas bicapas lipídicas
de las vesículas e incrementa
sudeform
abilidad (H
oneywell-N
guyen y Bouw
stra, 2005).El diseño experim
ental (DO
E)es una estrategia
que im
plica la
utilización de
elementos
matem
áticos y
estadísticos (G
onzález-R
odríguez y cols.) con objeto de obtener la m
áxima
información
a través
de datos
experimentales
y encontrar
las condiciones
óptimas para la ejecución de un determ
inado proceso experim
ental(Lewis y cols., 1999).
En el presente trabajo se pretende optimizar las
condiciones del método de extracción de
AC
Z de las vesículas
formuladas por centrifugación
con el
fin de
evaluar la
eficacia de
encapsulación de los Transfersomas ®.Para ello,
se ha llevado a cabo un estudio de cribado de distintos factores, con el objetivo
de conocer aquellos que influyen significativam
ente en las respuestas seleccionadas.
Materiales y M
étodosM
aterialesA
CZ
(Acofarm
a, España),desoxicolato sódico, colesterol
y1,2-dipalm
itoil-sn-glicero-3-fosfocolina
semisintética
(Sigma
Aldrich,
Alem
ania), H
epes, acetato
de sodio,
lauril sulfato sódico y dem
ás disolventes(Panreac
Quím
ica S.A., España).
Elaboración de vesículas multilam
inaresLos Transfersom
as ®se elaboraron utilizando la
técnica de evaporación en capa fina o Bangham
(TLE, Thin
Layer Evaporation).La m
ezcla de lípidos (fosfolípidos y colesterol), el desoxicolato (activador del borde)
yla A
CZ
se disolvieron en una mezcla de cloroform
o:m
etanol (3:2 v/v) El disolvente orgánico se evaporó bajo presión a 58 ºC
hasta obtener una fina
película. Éstase hidrató con
una solución de H
epes/PEG400 (60:40) m
ediante cinco ciclos interm
itentes de vortex y calora 50 ºC
. Lasvesículas se alm
acenarona 4 ºC
hasta su uso. O
ptimización de la eficacia de encapsulación
Se ha desarrollado y optimizado
un método de
separación de
fracciones (encapsulada
y no
encapsulada) y su posterior cuantificación.Este
método
consiste en
centrifugar la
dispersión liposom
al (Eppendorf
Centrifuge
5804R) a
una velocidad
apropiada (8000
- 12000 r.p.m
), durante un tiempo y tem
peratura adecuados (C
himanuka y cols., 2002; Fang y
cols., 2008).Tras
someter
las m
uestras a
las distintas
condiciones, se
separa el
sobrenadante del
precipitado y se realizandistintos tratam
ientos previos a su cuantificación por H
PLC:
1)El sobrenadante se filtra y se cuantifica directam
ente por HPLC
, determinando
así la
cantidad de
fármaco
no encapsulado.
2)A
l precipitado se le añade una solución de lauril sulfato sódico (LSS) 0.5%
p/v para
facilitar la
destrucción de
las vesículas (B
hardwaj y cols.,2010) y se
determina
la cantidad
de fárm
aco encapsulado por H
PLC.
En la tabla 1 se recogen las variables estudiadas en el proceso de optim
ización.Para cuantificar de form
a precisa laA
CZ, se
desarrolló un método
analíticode fase reversa
por HPLC
, utilizando uncrom
atógrafo Hitachi
HPLC
Elite Lachrom.
FactoresN
iveles
Tiempo (m
inutos)V
olumen de m
uestra (mL)
T de centrifugación (ºC)
Velocidad
centrifugación(rpm
)
-1 0 +1
60 90 1200.4 0.7 1 2 4 6
8000 10000 12000
Tabla 1.Factores seleccionados para el estudio, con sus niveles correspondientes.
180
Resultados y D
iscusión La
determinación
de la
cantidad de
AC
Z encapsulada
en las
vesículas requiere
la destrucción de las m
ismas con una solución de
LSS una vez sedimentadas tras el proceso de
centrifugación. C
on el fin de establecer las condiciones óptimas
del proceso de centrifugación, se procedió al estudio m
ediante la aplicación del DO
E. En la tabla 2 se recogen las condiciones fijadas para cada uno de los experim
entos, así como los
resultados obtenidos de porcentaje de fármaco
encapsulado.C
omo
se aprecia,
se obtienen
porcentajes de
encapsulacióncom
prendidos entre un 26.5 y 52.4%
.
Exp
r.p.m.
ºCm
inm
Lx (%
) ± sd12 3
800080008000
24 6
6090120
0.40.71.0
38.5 ± 2.1752.4 ± 3.7935.5 ± 6.86
45 6
100001000010000
24 6
9012060
1.00.40.7
32.5 ± 1.2241.7 ± 1.8943.5 ± 0.60
78 9
120001200012000
24 6
1206090
0.71.00.4
39.7 ± 4.8426.5
± 3.4634.5 ± 4.05
Tabla 2.M
atriz ortogonal L9 de Taguchi yresultados de eficacia de encapsulación (x) de AC
Z (sd: desviación estándar).
En primer lugar, se llevó a cabo un
análisis de las
medias
(AN
OM
), obteniéndose
como
resultados más concluyentes que únicam
entedos
de los
factores (velocidad
y volum
en) ejercen significación estadística en la eficacia de encapsulación, ya que los valores obtenidos se encuentran
fuera de
los lím
ites de
error establecidos
en el
diseño. Por
tanto, la
temperatura y el tiem
po de centrifugación no influyen en la eficacia de encapsulación del fárm
aco, puesto que los valores se encuentran dentro del intervalo, lo que significa que esas diferencias
son debidas
a errores
experimentales.
En lo que respecta a la velocidad, se obtiene una relación
inversamente
proporcional con
la respuesta analizada, es decir, los valores de atrapam
ientoaum
entan conforme dism
inuye la velocidad. Este hecho podría atribuirse a la destrucción de los liposom
as cuando se utilizan velocidades de centrifugación m
uy elevadas.En relación al volum
en de muestra, existe un
valor máxim
o de eficacia de encapsulación, que se corresponde con la utilización de 0.7 m
L.Este
estudio ha
sido corroborado
con un
AN
OV
A.
Una vez analizados los distintos factores de la
matriz experim
ental en cuanto a su significación estadística respecto a las distintas respuestas, se
procedió al estudio de la optimización de dichos
parámetros, con el fin de conseguir una m
ayoreficacia de encapsulación del fárm
aco.C
on el
fin de
determinar
las condiciones
óptimas bajo las cuales se debe realizar el
proceso de
centrifugación para
obtener una
eficacia de
encapsulación elevada
en las
muestras, es estudian
las medias m
arginales (figura 2)donde
se representan secuencialmente
los factores de la matriz con sus respectivos
valores de eficacia de encapsulación. Dado que
lo que se pretende es maxim
izar la respuesta, es decir, obtener valores m
áximos de atrapam
iento del fárm
aco, se seleccionan los datos mayores
de los distintos factores. F
igura 2.Representación gráfica de las medias
marginales de los parám
etros estudiados para la respuesta “eficacia de encapsulación”.
Conclusiones
Las condiciones
de centrifugación
que se
aplicarán a
partir de
este m
omento
para sucesivos estudios serán:
oV
elocidad de centrifugación: 8000 rpmo
Temperatura: 4 ºC
oTiem
po de centrifugación: 60 minutos
oV
olumen de m
uestra: 0.7 mL
Bibliografía
Bhardw
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is y
cols., M
arcel D
ekker, N
ew
York
(1999). A
gradecimientos:
Este trabajo
se ha
desarrollado bajo la cofinanciación del Consejo
Andaluz
de C
olegios O
ficiales de
Farmacéuticos.
181
Evaluación de la utilidad
deun polím
ero hiperramificado (H
ybraneH
1500)para la elaboración de pelets de liberación controlada por extrusión por fusión.
Elena Raviña Eirín, José Luis G
ómez A
moza, R
amón M
artínez PachecoD
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farm
acia, Universidad de Santiago
de Com
postela, Santiago de Com
postela, España
Introducción
La extrusión por fusión es unatécnica am
pliamente
utilizada en el sector alimentario y en la industria de
plásticos (1),que
sólo en los últimos años ha sido
objeto de atención en el ámbito farm
acéutico. Por ello, hoy se dispone de un núm
ero reducido de excipientes adecuados para esta finalidad. Los polím
eros hiperramificados han sido objeto de
estudiosm
uy recientes, centradosmayoritariam
enteen
su uso como m
ateriales de recubrimiento en form
as de liberación controlada (2,3). Tom
ando estos hechos como punto de partida, en este
trabajo se han evaluado las posibilidades que ofrece un
polímero
hiperramificado
con estructura
de poliesteram
ida (H
ybrane H
1500) com
o excipiente
base para
la elaboración
de pelets
de estructura
matricial
de liberación
controlada, elaborados
por extrusión por fusión, conteniendo cafeína (C
AF) com
o fárm
aco modelo de elevada hidrosolubilidad.
Materiales y m
étodos
Materiales:
Principio activo:Cafeína (G
uinama), lote: 0012939
Excipiente:
Hybrane
H1500
(DSM
N
ew
Jersey, U
SA),
insoluble en
agua y
con tem
peratura de
transición vítrea de 78ºC, lote: H
vH
Métodos
Formulaciones objeto de estudio. Se han elaborado y
evaluado 12form
ulacionesde pelets,
en las que se com
binan 3 proporciones de CA
F/H1500 y
4 tamaños
de partícula, cuyas características se detallan en la tabla 1.E
laboración de las formulaciones. La m
ezcla de excipiente y principio activo (Turbula
® T2C
15m
in., 30
rpm)
se introdujo en un extrusor Randcastle R
CP
0375 equipado con tornillo sin fin girando a 30rpm y
con temperaturas
de 105, 110, 115y 115ºC
en las zonas de control. Los pelets se obtuvieron m
ediante corte m
anual del extruido. Lasfracciones
con tamaño
inferior a 1mm
se obtuvieron por pulverización del extruido
en m
ortero y
posterior separación
por tam
ización.
Tabla 1.Com
posición y propiedades de las formulaciones objeto de
estudio.
Caracterización de las form
ulaciones:D
ifractometría
de rayos
X.La
cristalinidad de
muestras
de fárm
aco, polím
ero, form
ulaciones y
mezclas físicas equivalentes se evaluó en un equipo
Philips PW1710 en el intervalo 0-
Tamaño de partícula.Se determ
inó por microscopía
óptica (Estereom
icroscopio O
lympusSZ-C
TV
conectado a
una videocám
ara JV
C
TK-S350),
el diám
etro medio de Feret de, al m
enos, 600 peletsde
cada formulación.
Velocidad de disolución.Los perfiles de disolución de
CA
Fa partir de m
uestras de 200 mg de pelets
seobtuvieron en aparato tipo II, U
SP 29(Turu G
rau DT-
6, Barcelona, España). Los ensayos se llevaron a cabo
en 900 ml de agua destilada, a 37ºC
, con las paletas girando a 50 rpm
. La cantidad de CA
F disuelta a cada tiem
po de
muestreo
se determ
inó por
espectrofotometría U
Vdirecta (A
gilent 8453) a 273nm
. Los perfiles de disolución se caracterizaron a través de la eficacia de la disolución 0-24 horas (ED
24h ).A
nálisis de los resultados. Para la evaluación de los efectos de las variables bajo estudio sobre
ED24h
se acudió a la regresión m
últiple secuencial (SPSS, v.15) y a la construcción de la correspondiente superficie de respuesta.
%H
1500%CA
FTam
año medio
(m
±SD)
ED 24h
9010
168±3714,56
9010
373±729,89
9010
763±1326,08
9010
1609±3432,80
8020
170±3713,33
8020
403±659,98
8020
825±1095,59
8020
1912±2992,33
7030
168±3811,99
7030
361±668,21
7030
806±1224,12
7030
1978±3691,54
182
Resultados y discusión
En la tabla 1 se recogen los resultados obtenidos en la caracterización de las form
ulaciones objeto de estudio. C
abe destacar que, para cualquiera de las proporciones fárm
aco-polímero
ensayadas, no
fue necesaria
la incorporación de un agente plastificante para obtener pelets
de hom
ogeneidad y
de propiedades
morfológicas adecuadas.
Los difractogramas de rayos X
(Figura 1) indican que el proceso de extrusión provoca
una m
oderada dispersión del fárm
aco en el seno del polímero, siendo
menor la cantidad de fárm
aco dispersada a medida
que aum
enta la
proporciónde
fármaco
en la
formulación.0
1000020000
3000040000
5000060000
70000
2-Theta
abcdefgh
9000counts
Figura
1. Difractogram
as de Rayos X
de las formulaciones indicadas: (a)
Cafeína, (b) H
ybrane H1500 (c) m
ezcla física 10% C
AF-90%
H1500, (d)
10% C
AF-90%
H1500 pelet, (e) m
ezcla física 20% C
AF-80%
H1500, (f)
20% C
AF-80%
H1500 pelet, (g) m
ezcla física 30%C
AF-70%
H1500, (h)
30% C
AF-70%
H1500 pelet.
a)b)0
2001400
14400 20 40 60 80
100
% Cafeína disuelta
Tiempo (m
in)
c)0
2001400
14500 20 40 60 80
100
% Cafeína liberada
Tiempo (m
in)
0200
14001450
0 20 40 60 80
100
% Cafeína disuelta
Tiempo (m
in)
Figura 2. Curvas acum
uladas de disolución de CA
F para las form
ulaciones indicadas.(a) 10% C
AF-90%
H1500, (b) 20%
CA
F-80%
H1500, (c) 30%
CA
F-70%H
1500. Pelets: -
-250
En la Figura 2se recogen las curvas acum
uladas de disolución de C
AF a partir de
cada una delas 12
formulaciones analizadas.
Cabe
destacar la
amplia
variedad de
perfiles de
disolución de fármaco que se obtienen con este tipo de
formulaciones. C
omo reflejo de la velocidad global de
disolución se tomó el parám
etro ED24h cuya superficie
de respuesta muestra
la clara incidencia del tamaño de
los peletssobre la velocidad dedisolución de cafeína y
la ligera influencia del porcentaje del fármaco sobre
el valor de este parám
etro (Figura 3).
0 2 4 6 8
10
12
14
16
500
1000
1500
200010
15
2025
30
ED 24h
Tamaño(m
cm)
% C
afeína
ED
24h =17.10-2E-2xT
amaño+5.78E
-6xTam
año2-3E
-3x%C
af 2
R2=0.988
Figura3. Superficies de respuesta para el parám
etro ED24h .
La observación de los diferentes perfiles de disolución sugiere que hay un m
ecanismo com
ún de liberación del fárm
aco en todas las formulaciones.
El polímero
portador experim
enta, en
medio
acuoso, una
progresiva gelificación/hidratación
provocando la
liberación del
fármaco
a través
de la
estructura m
atricial que se origina, aspecto que ratifica el ajuste, m
ás que aceptable, de los perfiles de disolución a la cinética de raíz cuadrada de H
iguchi. Adem
ás, las partículas de m
ayor tamaño perm
iten una importante
prolongación del proceso de disolución de un fármaco
tan marcadam
ente hidrosoluble (22 mg/m
l) como la
cafeína.
Conclusiones
El Hybrane H
1500 permite una fácil extrusión por
fusión sin
necesidad de
incorporar agentes
plastificantes y utilizando temperaturas relativam
ente bajas .Las form
ulaciones de pelets de cafeína/ Hybrane
H1500 obtenidas por EF perm
iten obtener una amplia
variedad de velocidades de disolución del fármaco,
controladas por difusión del fármaco a través de la
estructura hidratada/gelificada del polímero portador
en el medio de disolución y fuertem
ente dependientes del tam
año de los pelets.
Referencias
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Agradecim
ientosTrabajo
financiado por
la X
unta de
Galicia
(07CSA
006203PR).
183
IMPL
AN
TE
SIN
YE
CT
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S DE
POL
OX
AM
INA
, HE
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Y Á
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PRO
TE
ÍNA
S
M.I. R
ial-Herm
ida, S. Blanco-D
orado, A. C
oncheiro, C. A
lvarez-LorenzoD
epartamento de Farm
acia y Tecnología Farmacéutica. Facultad de Farm
acia. Universidad de Santiago de
Com
postela. 15782-Santiago de Com
postela, España.
Introducción:La
elevada incidencia
de las
enfermedades
degenerativasque
afectan al
sistema m
usculoesquético dotade gran interés a
la preparación de andamiajes o scaffolds
que prom
uevan la
regeneración del
tejidoo
elórgano afectado. Las poloxam
inas (Tetronic®)
soncopolím
eros tribloque
ramificados
que cuentan
con un grupo central etilendiamina
del que
parten cuatro
cadenas con
bloques hidrofílicos de poli(óxido de etileno) (PEO
) ehidrofóbicos de poli(óxido de propileno)
(PPO)
(Figura 1).
Esta arquitectura
hace que
sus dispersiones
acuosas se
comporten
como
sistemas sensibles al pH
y ala tem
peratura (1)y experim
enten transiciones de sol a gel a la tem
peratura corporal
formando
depotsútiles
para cesión controladade proteínas
(2). Por otra parte, se ha observado que la conjugación conheparina (glucosam
inoglucano aniónico)mejora
la capacidad
de diversos
polímeros
para interaccionar
con proteínas
morfogénicas,
lo que resulta en un control m
ás preciso de sucesión y de la actividad osteogénica (3).
Figura 1.Estructura de una poloxamina
El objetivo de este trabajo fue prepararsistemas
inyectablesutilizando
poloxamina
Tetronic®
908 y heparinaen form
a de mezcla física y de
conjugados químicam
ente unidos y evaluar in vitro su utilidad para liberación sostenida de proteínas.
También
se prepararon
sistemas
ternarios poloxamina/heparina/ácido hialurónico
y se evaluaron las posibilidades que ofrece la incorporación
de este
último
glucosamino-
glucanopara
modular
las propiedades
mecánicas y de cesión de los geles. El ácido
hialurónico actúa
como
promotor
de la
organización estructural de tejidos y aumenta la
expresión de marcadores de diferenciación de
células mesenquim
ales a osteoblastos (4), pero form
a hidrogeles de baja resistencia mecanica in
vivo. La combinación de los tres polím
eros podría
dar lugar
a geles
con propiedades
mejoradas com
o scaffolds óseos.
Materiales y M
étodos:M
ateriales:Tetronic
®908
(T908)de B
ASF
(Alem
ania); hialuronato
sódico(A
H)
de
Guinam
a(España);
heparina sódica
de la
mucosa intestinal porcina
(HEP)de C
albiochem
(Alem
ania); anhídrido
succínico, 4-
dimetilam
inopiridina, dioxano, MES (ácido 4-
morfoniloetanosulfónico),
N-
hidroxisuccinimida
(NH
S) y
1-etil-3-(3-dim
etilaminopropil)-carbodiim
ida (ED
C)
de Sigm
a-Aldrich
(Alem
ania); trietilam
ina y
n-hexano de B
DH
(Inglaterra); HC
l 37 % y azul
de toluidina de Panreac (España); mem
brana de diálisis
Spectra/Por (M
WC
O=3500)
de laboratorios Spectrum
(Holanda), seroalbúm
ina B
ovina (BSA
) de Acros (B
élgica); BC
A Protein
Assay K
it de Thermo Scientific (EE.U
U.); agua
purificada por
ósmosis
inversa (M
illiQ®
,M
illipore,España).
Todos los
restantes reactivos fueron de calidad analítica.Preparación de los geles:
Se prepararongeles,
en tampón fosfato de pH
7.4,a partir de mezclas
físicas y conjugados con las composiciones que
se recogen en la Tabla 1.
Tabla 1.C
omposición de los hidrogeles
Hidrogel
Com
posición1
T908 20%2
AH
1%3
HEP 12%
4C
onjugado T908-HEP 32%
5C
onjugado T908-HEP 32%
+ AH
0,5%
6M
ezcla física T908 20% + H
EP 12%
7M
ezcla física T908 20% + H
EP 12%
+ AH
0,5 %
La conjugación se llevó a cabo en dos pasos. Enprim
er lugar
se carboxiló
la poloxam
ina disolviendo 0,46 m
moles
de T908, 2,49 mm
olesde
anhídrido succínico,
1,99 m
moles
de 4-
dimetilam
inopiridina y 2 mm
olesde trietilamina
en 300 ml de 1,4 dioxano anhidro
agitando durante 24 horas a tem
peratura ambiente. A
continuación, se
evaporó el
dioxano en
rotavapor y
el residuo
se redisolvió
en cloroform
o. La conjugación con la heparinase
llevó a cabo porel método ED
C/N
HS, haciendo
reaccionar0,24 m
moles de T908 carboxilado,
0,27 mm
oles de heparina, 1,0935 mm
oles de ED
C y 0,5535 m
moles de N
HS
en 200 ml de
tampón M
ES pH5,6 durante 24 h, Finalm
ente, se dializó durante 3 días y
el producto resultantese
liofilizó.El
contenido en
heparina del
conjugado se
determinó
colorimétricam
ente
184
utilizando, como reactivo crom
ogénico, el azul de toluidina. FTIR análisis:
Se registraron los espectros de infrarrojos (FTIR
) del T908, la heparina,el
conjugado y la mezcla física, en com
primidos
de KB
r,enun espectrofotóm
etro Bruker m
odelo IFS-66v (U
SA).
Incorporación y cesión de BSA: Se dispersaron 50 m
g de seroalbúmina en 8 g de gel m
ediante agitación a 4ºC
.Porcionesde 2 g de cada gelse
llevaron a
un baño
a 37ºC
, en
el que
se m
antuvieron bajoagitación oscilante a 50 rpm
y se tom
aron muestras durante 7 días. La cantidad
de BSA
cedidase determ
inó utilizando el kitB
CA
. R
esultados y Discusión:
Preparación y caracterización de los geles: Las dispersiones de poloxam
ina sin y con HEP y de
conjugado T908-HEP, sin
y con AH
, dieron lugar a geles hom
ogéneos y semitransparentes
cuando la temperatura se increm
entó hasta37º
C. La H
EP sola no dio lugar a geles ni a tem
peratura ambiente ni a 37ºC
.El porcentaje
de heparina conjugadadetectado por el m
étodo colorim
étricofue próxim
o al 100%
, lo que indica que el conjugado está constituido por T908:H
EP 60:40 p/p.En
el espectro
FTIRdel
conjugado T908-
heparina(Figura 2),
se observóuna banda a
1625 cm-1
atribuible al enlace carbonilo o al grupo am
ida monosustituído de
la heparinay
otra a 1735 cm-1
correspondiente a la vibración del
enlace carbonilo
de la
poloxamina
conjugada. También se aprecia una banda a
3421 cm
-1, que
puede corresponder
a la
vibración de los grupos hidroxilo de la heparina conjugada.
Núm
ero de onda (cm-1)
10002000
30004000
Transmitancia0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0