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Cours II
Exemple de pathologie cardiaque:Le syndrome du QT long congénital
H. Abriel
Département de Pharmacologie et Toxicologie, UNILService de Cardiologie, CHUV
4 mai 2004, Formation continue des laborantin(e)s en recherche
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Plan du cours II
Pathologie modèle: Syndrome du QT long congénital
• Histoire d’un cas et description clinique du SQTL
• Excitabilité cardiaque (Rappel)
• Canaux ioniques et « patch-clamp »
• Mécanismes moléculaires et cellulaires du SQTL
• Investigations génétiques
• Investigations cellulaires
• Etudes animales
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Jon N. Mettler, Webpublisher: Jon est né le 27 mars 1974 dans la ville de Bienne. Al’âge de 17 ans, en hiver 1991, il fut confronté pour la première fois au syndrome du QT long. Lorsd’un camp de ski, il perdit connaissance à trois reprises. Puis, alors qu’il était transporté à l’hôpitalde Coire, il fit un arrêt cardiaque.
Après cet évènement dramatique, il fut investigué par les médecins jusqu’au moment où onl’informa de son diagnostique : il souffrait du syndrome du QT long congénital (SQTL).
Rapidement, Jon se rendit compte que le SQTL était peu connu en Europe ; et, à la recherched’informations au sujet du SQTL, il atteint bientôt les limites.
C’est pour cette raison qu’en 1997, Jon démarra le projet internet du « European Long QTSyndrome Information Center » (à présent QTsyndrome.ch), en équipe avec deux de ses amis (nonatteint par le SQTL) et de son plus jeune frère. Les objectifs de QTsyndrome.ch sont de collecter etde dispenser des informations précises à propos de cette maladie.
Jon est journaliste en économie et travaille pour la « Berner Zeitung », un des plus grands journauxen Suisse. Il pratique le Kendo, un art martial japonais.
Traduit du site www.QTsyndrome.ch, le 30 avril 2004
Un cas de syndrome du QT long congénital
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ECG avec intervalle QTc prolongé à 507 ms / (ne doit pas dépasser 440 ms)
intervalle QT prolongé
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Electrophysiologie cellulaire(Rappel)
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Couplage excitation-contraction (version 2)
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Conduction électrique à travers les cellules cardiaques
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Canaux ioniqueset la
technique du « patch-clamp »
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Canaux ioniques
•Les canaux ioniques sont des protéines membranairesqui permettent le passage des ions à travers la membrane cellulaire
•L’ouverture et la fermeture de ces canaux sont régulées soit par ladifférence de voltage transmembranaire, soit par des ligands intra-ou extracellulaires
Voltage-dépendants
Ligand-dépendants
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Appareillage de “patch-clamp”
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inside-out
Cellule attachée Cellule entière
Les “configurations” du patch-clamp
•Quatre configurations:
•Cellule entière•Cellule attachée•Patch inside-out•Patch outside-out
1 canal
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“Seal” de la pipette avec la cellule
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Voltage et Courant imposés
Voltage-clamp = voltage imposé Mesures de courants
Current-clamp = courant imposé Mesures de différences de voltage
5 n
A
2ms
50ms
-80 mV
0 mV
courants sodiquesde cardiomyocytes
isolés de souris
potentiel d’action cardiaquede cardiomyocytes
isolés de souris
-80 mV10 ms
0 pA
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Bases ioniques du potentiel d’action cardiaque
Nav1.5 (SCN5A) and β subunits
Cav1.2 and auxiliary subunits
Cav3.2 and auxiliary subunits
Na+-Ca2+ exchanger
Kv4.3
--
Kv7.1 (KCNQ1) and MinK (KCNE1)
Kv11.1 (hERG-KCNH2) and MirP1 (KCNE2)
Kir2.1
CFTR (Cl-), K2P family
Kv1.5
GIRK1+4 (IK-ACh), Kir6.2+SUR1 (IKATP)
Na+ current
L-type Ca2+ current
T-type Ca2+ current
Na+-Ca2+ exchange
ITo1 (4-AP sensitive)
ITo2 (Ca2+ activated)
IKs
IKr
IK1
ICl or IKp
IKur
IK ATP/ACh
0 mV
(0)
(1)(2)
(3)
(4)Courants Transporteurs ioniques
•Le potentiel d’action résulte des courants dépolarisants (en rouge –entrants) et, ensuite, repolarisants (en bleu – sortants)
•La durée du potentiel d’action est déterminée par un l’équilibre entre lescourants dépolarisants et repolarisants
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Canaux sodiques voltage-dépendants
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Structure des canaux sodiques
•Les canaux sodiques sont formés par desprotéines avec 24 segmentstransmembranaires (4x6 segmentsfortement homologues)
•Les segments S4 possèdent denombreux acides aminés positifs
•En microscopie électronique, les canauxont la forme d’une cloche
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Activation et inactivation des canaux sodiques
Repolarisation de la membrane, déplacement du segment inactivateur, et fermeturede la porte d’activation (lent, plusieurs millisecondes)
Dépolarisation initiale de la membrane,mouvement des α-hélices sensibles auvoltage, et ouverture du canal (<1ms)
Retour des α-hélices sensibles au voltagedans la position de repos, et inactivationdu canal (0.5-1.0 ms)
Ported’activation
Segmentinactivateur
α-hélicessensiblesau voltage
Pore Vestibule externe
Vestibuleinterne
Canal Na+ fermé Canal Na+ ouvert Canal Na+ inactivé
Extérieur
Cytosol
Membranedépolarisée
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-120
-30
2 ms
F O I
Courants unitaires mesurés en “patch-clamp”
Patch« inside-out »
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Syndrome du QT long congénital
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1856: Meissner en Allemagne présente le premier cas de QT long congénital.Il décrit le cas d’une fille sourde qui, suite à une émotion forte, perd connaissanceet décède subitement. Les parents de la fille rapportent que deux de ses frèressont aussi décédés subitement.
1957: Jervell et Lange-Nielsen décrivent des cas d’enfants sourds avec uneprolongation de l’intervalle QT et une histoire de morts subites dans la famille.
1964: Romano et Ward décrivent de manière indépendante des enfants avec unehistoire de morts subites et une prolongation de l’intervalle QT (sans surdité).
1980: Moss et Schwartz débutent un registre international de patients et famillesavec un syndrome du QT long congénital.
1995-1996: Identification et caractérisation des trois principaux gènes impliqués chezles patients avec un syndrome du QT long congénital.
2001: Publication du premier modèle murin porteur d’une mutation humaine causantle syndrome du QT long congénital.
Historique du syndrome du QT long congénital
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Syndrome du QT long congénital
• Causes génétiques (mutations familiales ou de novo)
• 7 différents gènes mutés
• Sous-unités de canaux ioniques -> canalopathies cardiaques génétiques
• Syndrome de Romano-Ward
• Syndrome de Jervell and Lange-Nielsen
• Dans env. 20-40% des cas les gènes sont encore inconnus
• La pénétrance des phénotypes (cliniques et ECG) est très variable
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Potentield’action
cardiaque 0 mV
ECG de surface
Intervalle QT
(0)
(1)(2)
(3)(4)
P
Q
S
R
T
Torsades de pointes
Le syndrome du QT long provoque des arythmies malignes
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IK
Courant Na+
0 mV
Mutations avec“perte de fonction”
Mutations avec“gain de fonction”
Normal Normal SQTLSQTL
Mécanismes du QT long congénital
Type LQT-3
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LQT-3: mutations de SCN5AInvestigations génétiques
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1 2 3 51 2 3 5 61 2 3 5 61 2 3 5 6
NH2
+++++++
+++++++
+++++++
+++++++
I II IVIII
COOH
6
Trois mutations du gène SCN5A: SQTL type 3
Y1795C
ΔKPQet
ΔQKP
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Mutation LQT-3 Y1795C
Rivolta I. et al, JBC 2001
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Analyse de l’ADN génomique des patients:Extraction de l’ADN et PCR
Sang complet(anticoagulé)
Frottis de la muqueuse
buccale
Autres spécimens
Extraction de l’ADN génomique
Amplificationpar PCR des exons
codants des gènes candidats
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Analyse de l’ADN génomique des patients:HPLC dénaturante et séquencage
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LQT-3: mutations de SCN5AExpression dans des cellules mammifères
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Etudes des canaux sodiques dans les cellules HEK
Génération des mutations dans
de l’ADNc
cDNAWT
cDNAmuté
X
Mesures en patch-clamp des
courants WT et mutants
Transfectionde l’ADNcdans les
cellules HEK
+cDNACellules HEK
ou
cDNA
X
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WT Y1795C
5 ms
Expression dans les cellules HEK des canaux mutés
Rivolta I. et al, JBC 2001
•Les canaux mutés s’expriment normalement dans les cellules HEK et lespropriétés biophysiques de ces courants peuvent être analysées en détails
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Y1795CWT
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Per
sist
ent
curr
ent
(% o
f th
e p
eak
curr
ent)
Y1795CWT
**
50 ms
Mutation du canal sodique qui génère un courantpersistant
•La mutation Y1795C interfère avec l’inactivation du canal sodique et génère un«courant persistant»•Ce courant persistant, dans les cellules cardiaques, est un courant dépolarisantet ainsi il retarde la repolarisation du potentiel d’action•Le potentiel d’action prolongé chez les porteurs de cette mutation est à l’originede la prolongation de l’intervalle QT et des manifestations cliniques
courantpersistant
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Les canaux mutés restent ouverts plus longtemps
Patch« inside-out »
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Modèle animal:Souris porteuse d’un gène mutant LQT-3
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ECG de souris avec mutation LQT-3: ΔKPQ
•ECG mesurés chez des souris WT et porteuse de la mutation ΔKPQ
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Potentiel d’action de souris avec mutation LQT-3: ΔKPQ
WT
MutantΔKPQ
•Potentiel d’action cardiaque mesuré en condition de cellule entière et en courant imposé
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Courants persistants mesurés sur des myocytes de souris
WT
mutant
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Tachycardie ventriculaire chez une souris LQT-3
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Résumé et Conclusions
• Le SQTL est une maladie rare, mais aux conséquences dévastatrices
• En 2004, nous avons une compréhension des mécanismes patho-
logiques du SQTL (génétique, moléculaire, cellulaire et animal entier)
• Cependant, il n’existe pas encore de traitements efficaces…
• Le SQTL représente une « pathologie modèle » pour la compréhension
des morts subites survenant lors de maladies cardiaques fréquentes