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Evidenze e benefici dell’analisi
clinica di routine in LC-MS/MS
• Immunosoppressori in sangue intero
• 25-OH vitamina D3/D2 in plasma/siero
• Steroidi in plasma/siero/DBS
Dr. Donzelli Simone
Regional Development Specialist Clinical
Waters
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Indice: • Immunosoppressori
Studio del TDM L’importanza del TDM degli immunosoppressori Tecniche a confronto
• Vitamina D3 Perchè la misura della 25-OH Vitamina D3 L’importanza della 25-OH Vitamina D2 Tecniche a confronto Stato dell’arte
• Steroidi Tecniche a confronto Analisi del profilo steroideo (valutazione kit CE-IVD) Applicazioni su siero e DBS del CAH (Congenital Adrenal Hyperplasia)
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Immunosoppressori e l’importanza del Therapeutic Drug Monitoring
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Cos’è il “therapeutic drug monitoring”?
“Il Therapeutic Drug Monitoring (TDM) è un settore della
chimica clinica che si specializza nella misurazione di livelli di
farmaci nel sangue. Il suo principale obiettivo è focalizzato sui
farmaci con un piccolo margine terapeutico: farmaci che
facilmente possono essere sotto o sovradosati.” D. Holt
I clinici useranno la misurazione della concentrazione del
farmaco insieme alle loro osservazioni ed agli altri risultati di
altri tests per modificare il dosaggio del farmaco per ottenere il
risultato migliore possibile per ogni paziente. Questa
individualizzazione della terapia usando tutte le informazioni
possibili è conosciuta come Therapeutic Drug Management.
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La maggior parte dei farmaci terapeutici possono anche avere
effetti di tossicità
Concentration
Sub-t
hera
peutic
Therapeutic Toxic
Ibuprofene
Thera
peutic
Toxic
Sub-t
hera
peutic
Se l’optimum del range terapeutico è vicino alla tossicità
il dosaggio deve essere controllato accuratamente TDM
Perchè il TDM è necessario?
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TDM degli immunosoppressori
Il TDM per i farmaci anti-rigetto è una strategia per la quale il regime
di dosaggio per un paziente è controllato da ripetute misurazioni della
concentrazione del farmaco nel sangue.
Fattori critici che possono aiutare a definire un indice terapeutico:
– Età, sesso, peso del paziente
– Dosaggio del farmaco
– Farmacocinetica
– Co-medicazioni
– Metodiche usate dal laboratorio per misurare i farmaci
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Variabilità inter-individuale
A seconda del paziente ci possono quindi essere anche grandi
differenze inter-individuali nella farmacocinetica e
farmacodinamica. Una terapia opportuna dipenderà appunto
dall’individualizzazione del trattamento
Patient 1 Patient 2
Patient 3 Patient 4
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Perchè TDM per gli immunosuppressori?
L’ individualizzazione del trattamento dovuta alle ampie differenze inter-paziente in PK/PD richiede un accurato TDM;
In alcuni casi il TDM viene utilizzato anche per assicurarsi che i pazienti stiano prendendo le dosi prescritte del farmaco (compliance del paziente).
Il range terapeutico è piccolo per cui il dosaggio deve essere controllato in modo opportuno;
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Tecniche di analisi
Immunoassay (automatizzato / semi-automatizzato)
HPLC con rivelazione a UV / Fluorescenza
LC-MS/MS
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LC-MS/MS 29%
Abbott Architet 44%
Altre Piattaforme IA 5%
Siemens Dimension 22%
Piattaforme di analisi del tacrolimous in US 2010
Waters 58%
AB Sciex 30%
Thermo Fisher 8%
Agilent 4%
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Crescita della tecnica di LC-MS/MS per il monitoraggio degli immunosuppressori
Num
ero
di risultati r
iport
ati
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Set
99
Mar
00
Set
00
Mar
01
Set
01
Mar
02
Set
02
Mar
03
Set
03
Mar
04
Set
04
Mar
05
Set
05
Mar
06
Set
06
Mar
07
Set
07
Mar
08
Set
08
Mar
09
Set
09
Mar
10
Set
10
Mar
11
Set
11
Mar
12
Total
Imx
Emit 2000
ACMIA
CMIA
HPLC MS
LC-MS/MS
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Come mai cresce la LC-MS/MS?
Carenze
Immunoassay
Performance
Immunoassay
Performance
LC-MS/MS
Bassa Specificità
Interferenze dei metaboliti di
Ciclosporina e Tacrolimus sono
bene documentati.
Specificità altissima: massa
e frammenti caratteristici
per ogni farmaco
Bassa Sensibilità
Molti, se non tutti gli IA TDM
hanno problemi con la
sensibilità
Eccellente: < 0,5 ug/L
Alti costi*
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Confronto di Performance
tra IA e LC-MS/MS
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LC-MS/MS è più specifica degli IA
Interferenze con metaboliti
1Ther Drug Monit 2009;31(2):269-272 2Ther Drug Monit 2009;31(6):743-745 3Ther Drug Monit 2007;27(1):94-97 4Clinica Chimica Acta 2010;411:77-80
Interferenze da anticorpi endogeni1
Interferenze da fattori reumatoidi2
Effetto dell’ematocrito3
Interferenze sconosciute4
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Perchè la LC-MS/MS?
Tecnica considerata “Gold standard” per il TDM
degli immunosoppressori
Alta Specificità per ogni farmaco
―Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco
elimina ogni cross-reaction con i metaboliti
Accuratezza e precisione superiori
Sensibilità elevata (0,5 ug/L)
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Immunosuppressant Immunoassays - Company Assay % Metabolite Cross Reactivity Siemens Dimension Systems SIRO Assay 89% Emit 2000 Sirolimus Assay 61% ADVIA Centaur Systems CsA Assay 16% Dimension Clinical Chemistry System CSA/CSE Assay 6% Emit 2000 Cyclosporine Assay 8% Dimension Clinical Chemistry System Tacrolimus 18% Emit 2000 Tacrolimus Assay 21% Abbott ARCHITECT Sirolimus Assay 37% ARCHITECT Tacrolimus Assay 94% ARCHITECT Cyclosporine Assay 3.3% TDx Cyclosporine Monoclonal‐Whole Blood Assay 96% IMx Sirolimus Assay 77% IMx Tacrolimus/Tacrolimus II Assay 67% Thermo-Fisher Thermo Scientific QMS Everolimus Immunoassay 63% Thermo Scientific Innofluor Certican (Eve) Seradyn 142% CEDIA Cyclosporine Plus (Microgenics) 32.5 % CEDIA Tacrolimus (Microgenics) 38% % Metabolite cross reactivity is the highest % of cross reactivity for a specific metabolite of the parent drug. References Advances in Chromatographic Techniques for Therapeutic Drug Monitoring – Amitava Dasgupta 2010
Perchè la LC-MS/MS?
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LC-MS/MS vs. MEIA
Ther Drug Monit Volume 28, Number 4, August 2006
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LC-MS/MS vs. MEIA e CEDIA
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LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus
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LC-MS/MS vs. ACMIA per tacrolimous
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“The analytical methods FPIA and LC-MS/MS are not in
agreement. . . . using FPIA results in higher everolimus
concentrations compared with LC-MS/MS.”
“FPIA can lead to clinically relevant differences in everolimus
dosage advice and higher intra-patient variability.”
“LC-MS/MS outperforms FPIA for clinical monitoring and
intervention of everolimus therapy in adult renal transplant
recipients…”
LC-MS/MS vs. FPIA per everolimus
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Perchè la LC-MS/MS?
Tecnica considerata “Gold standard” per il TDM degli
immunosoppressori
Alta Specificità per ogni farmaco Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco
elimina ogni cross-reaction con i metaboliti
Accuratezza e precisione superiori
Sensibilità elevata (0,5 ug/L)
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Ciclosporina
Cut-off: cuore: 350 ng/ml
Linearità Massa 2000 ng/ml
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ARCHITECT tacrolimus package insert
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Innofluor Certican package insert
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Tecnica considerata “Gold standard” per il TDM degli
immunosoppressori
Alta Specificità per ogni farmaco
Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco
elimina ogni cross-reaction con i metaboliti
Accuratezza e precisione superiori
Sensibilità elevata (0,5 ug/L)
Perchè la LC-MS/MS?
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LC-MS/MS accuratezza
Concentrazione del Tacrolimus
misurata con il kit MassTrak in
relazione al valore medio dei report
NEQAS di tutti i laboratori che
utilizzano la tecnica di LC-MS/MS
Linearità:
Y = 0.998X + 0.099; r2 = 0.996
Differenza media 1.1% in un range
di 0.0 – 30.7 ng/mL
Accuratezza
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Perchè la LC-MS/MS?
Tecnica considerata “Gold standard” per il TDM degli
immunosoppressori
Alta Specificità per ogni farmaco
Le selezioni della massa e dei frammenti caratteristici per ogni farmaco
elimina ogni cross-reaction con i metaboliti
Accuratezza e precisione superiori
Sensibilità elevata (0,5 ug/L)
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Sensibilità elevata
La sensibilità,la specificità e la precisione degli strumenti immunochimici ai livelli bassi delle finestre terapeutiche iniziano a diventare critiche per il monitoraggio.
Con livelli funzionali vicini a 1 ng/ml (pediatrici), LC-MS/MS ha prestazioni decisamente superiori della strumentazione immunochimica
La combinazione di immunosoppressori ha portato ad una diminuzione dei livelli di dosaggio terapeutico:
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25-OH Vitamina D3/D2
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25 OH - Vitamina D
Che cos’è la Vitamina D?
•Vitamina D è una classe a se’ stante: gli effetti che ottiene nel corpo sono allineati a un ormone che agisce per influenzare i percorsi metabolici, le funzioni cellulari…
•La forma metabolica attiva della Vitamina D, chiamata 1,25-diidrossivitamina D (o calcitriolo) è un ormone secosteroide (pro ormone)
•Non bisogna considerare la Vitamina D come una vera e propria Vitamina (sostanza che, come la Vitamina C, partecipa alle reazioni biologiche, aiutando il corpo a operare ottimamente)
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Benefici della Vitamina D
• Metabolismo Osseo: previene osteoporosi, rachitismo, fratture
• Salute cellulare: previene tumori (seno, prostata, pancreas, ovaie, colon)
• Salute organismo: previene problemi cardiaci ed infarti, diabete di tipo 2, perdita dei denti…
• Salute muscolare
• Salute Mentale: previene la depressione (stimola la produzione di serotonina), schizofrenia, Alzheimer,...
25 OH - Vitamina D
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Misurazione della Vitamina D
Nel corpo sono presenti circa 30 metaboliti che in maggior parte non svolgono alcuna funzione fisiologica ma costituiscono soltanto prodotti di degradazione Migliore indicatore dello stato della vitamina D: 25-OH-vitamina D3
Come mai la forma attiva 1,25-(OH)2-vitamina D3 non viene considerata come il principale indicatore della carenza di Vitamina D?
25 OH - Vitamina D
•È il metabolita principale (prodotto nel fegato); •Emivita di 8 settimane; •Si presenta in concentrazioni rilevabili in siero/plasma: 20 – 70 µg/L; •È l‘indicatore principale dello stato della presenza di Vitamina D3 nel corpo
• molto instabile (emivita 8 minuti)
• quantità di almeno 1000 volte inferiore alla 25-OH-vitamina D
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Il fatto che la sintesi della VitD3 viene attivata anche dai raggi UV solari
porta ad un valore medio di Vitamina D3 diverso tra estate ed inverno
ed a un valore basso in zone poco esposte ai raggi solari
Carnagione scura meno Vit.D3; Carnagione chiara più Vit.D3
In Gran Bretagna più del 50% della popolazione ha livelli di vitamina D
insufficienti
In Medio Oriente alta presenza di sole ma le donne sono
completamente vestite
Range terapeutici Vitamina D:
•Grave Carenza: < 10 ug/L (ng/mL)
•Insufficienza: 10 ug/L < Vit D < 20 ug/L
•Livello Ottimale: 20 ug/L < Vit D < 70 ug /L
25 OH - Vitamina D
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Valutazione di: • Roche • Diasorin RIA • Diasorin Liaison • IDS EIA • HPLC UV • LC-MS/MS
•Capacità di analizzare 25OH vitD2 e 25OH vit D3 separatamente •Capacità di misurare Vit D2 e vit D3 totali •Capacità di discriminare l’epimero •LOQ •Precisione •Produttività •Flessibilità nel settaggio metodi
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Valutazioni Metodiche Immunoassay:
Diasorin:
Sensibilità: 4 ug/L
Range di linearità: 4 – 150 ug/L
IDS:
Sensibilità: 2,5 ug/L
Range di linearità: 2,5 – 144 ug/L
Abbott:
Sensibilità: 8,0 ug/L
Range di linearità: 8 – 120 ug/L
Entrambe le metodiche:
• Misurano la Vitamina D TOTALE!
• non riescono a separare l’epimero della Vit. D
Valutazioni Metodiche HPLC:
HPLC-UV: Sensibilità: 3 ug/L Range di linearità: 3 – 250 ug/L HPLC-MS/MS: Sensibilità: 1,0 ug/L Range di linearità: 1,0 - 250 ug/L
Entrambe le metodiche:
• Possono calcolare separatamente la 25-OH vitamina D3 e D2
• La massa riesce a separare l’epimero della Vit. D
25 OH - Vitamina D
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PERCHE’ E’ IMPORTANTE QUANTIFICARE LE DUE ISOFORME:
La Vitamina D3 non è presente in natura perché viene prodotta solo nel
corpo mediante la reazione vista precedentemente
La Vitamina D2 è di origine vegetale. Mediante la dieta si può raggiungere
una concentrazione massima nel corpo di circa 2 ug/l.
Ci sono quindi differenze nelle attività biologiche e nella tossicità fra le due
isoforme:
– L’assorbimento intestinale della Vitamina D2 è minore che quello della
vitamina D3
– La clearance della 25OH-VitD2 è più veloce di quella della 25OH-VitD3.
Ciò dovrebbe essere dovuto alla
minore affinità del 25OH-VitD2 al legame D-proteico (DPBV)
Ci sono quindi differenze nel metabolismo di queste due forme di Vitamina:
la Vit D2 non può essere considerata efficace come la Vit D3!
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Compares DiaSorin RIA, Nichols CPBA, IDS RIA with LC/UV
Vitamin D2 is a common supplement worldwide for the
treatment of vitamin D deficiency. Consequently, assay
recognition of 25OHD2 is critically important
Treatment with vitamin D2 may not be accurately monitored
with any of the three commercial assays studied
Stato dell’arte della Vitamina D
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Stato dell’arte della Vitamina D
Comparazione di diversi metodi di rilevazione: -RIA (Diasorin) -Diasorin Liaison (CLIA) -IDS – ISYS (CLIA) -Abbott (CMIA) -Siemens (CLIA) -Roche (ECLIA) -2 LC-MS/MS Diasorin R&D: Waters Acquity TQD
Pathology Queensland: Waters Acquity XE premiere (Tecan)
Analisi di 170 pazienti selezionati a caso
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Stato dell’arte della Vitamina D
Calcoli fatti: Passing-Bablock Regression Y=a + bX
Intrassay precision CCC= Concordance Correlation Coefficient Bias
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Stato dell’arte della Vitamina D
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Steroidi
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Steroidi in Immunoassay
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Steroidi in Immunoassay
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Analisi del profilo steroideo utilizzando kit diagnostici CE-IVD
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Obiettivo:
Valutazione del kit per analisi degli steroidi CHS su
strumentazione ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S
Il metodo usato utilizza la preparazione del campione del kit diagnostico: Precipitazione proteica del siero + evaporazione del surnatante + ricostituzione Il kit presenta calibratori in matrice a 7 livelli (L1-L7) e 3 controlli di qualità sempre in matrice (QC1-QC3)
Abbiamo utilizzato la colonna Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 1.0x100mm
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Pannelo steroideo
Analiti misurabili nel PE
MSMS Steroidi Kit
– Testosterone
– Cortisolo
– Corticosterone
– DHEA,
Deidroepiandrosterone
– Progesterone
– 4-androsten-3,17-dione
– 11-deossicortisolo
– DHEAS,
Deidroepiandrosterone
solfato
– 17-alfa-idrossiprogesterone
– Aldosterone
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Produttività
Grazie a Acquity UPLC la cromatografia è stata migliorata portando il tempo a 12
minuti di corsa da iniezione ad iniezione (aumentando produttività e salvando
circa il 25% di fase mobile). Inoltre è stata migliorata la separazione tra i picchi
del 11-deossicortisolo e del corticosterone.
Corticosterone
11-deoxycortisol
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Precisione
Analyte Aldosterone Androstenedione
Level Low Middle High Low Middle High
Mean (ng/mL) 0.46 1.26 3.34 1.58 4.1 10.7
CV(%) 2.9 2.9 2.8 3.8 4.5 3.7
Analyte Corticosterone Cortisol
Level Low Middle High Low Middle High
Mean (ng/mL) 7.14 19.22 51.5 70.95 128.21 232.14
CV(%) 3.2 3 4.4 2.7 3.3 2.3
Analyte 11-deoxycortisol Dehydroepiandrosterone
Level Low Middle High Low Middle High
Mean (ng/mL) 1.49 4.05 10.66 7.74 19.68 52.98
CV(%) 3 4.2 4 5.4 5.7 3.8
Analyte Dehydroepiandrosterone sulfate Progesterone
Level Low Middle High Low Middle High
Mean (ng/mL) 1056.2 1485.7 2015.7 1.64 4.38 11.42
CV(%) 7.2 6.1 6.2 3.7 3.5 2.8
Analyte 17á-hydroxyprogesterone Testosterone
Level Low Middle High Low Middle High
Mean (ng/mL) 1.86 5.34 14.65 2 3.52 5.46
CV(%) 3.2 2.7 2.4 3.3 3.3 2.3
Il migliore valore di precisione (2.3% RSD) è stato ottenuto sul controllo di qualità alto del cortisolo e del testosterone (Q3). Il peggiore sul controllo di qualità basso (Q1) del DHEAS (7.25 RSD).
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Precisione
Questi dati ottenuti sono migliori di quanto dichiarato sul technical note della Perkin Elmer.
QC1 QC2 QC3
Steroid %RSD %RSD %RSD
Aldosterone 3.73 2.50 2.39
Androstendione 1.78 1.26 0.84
Corticosterone 2.01 1.15 1.71
Cortisol 2.66 2.33 2.70
11-Deoxycortisol 2.88 4.74 2.49
DHEA 5.09 2.36 3.43
DHEAS 1.03 1.03 2.75
Progesterone 4.57 3.53 3.41
17-alpha hydroxyprogesterone 4.93 3.42 4.30
Testosterone 1.52 2.65 0.98
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Linearità Compound name: Aldosterone
Correlation coefficient: r = 0.999677, r^2 = 0.999355
Calibration curve: 0.682043 * x + 0.00654052
Response type: Internal Std ( Ref 11 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0.0 5.0 10.0 15.0 20.0
Re
sp
on
se
0.0
5.0
10.0
Compound name: Androstendione
Correlation coefficient: r = 0.999838, r^2 = 0.999675
Calibration curve: 0.605509 * x + 0.00262052
Response type: Internal Std ( Ref 12 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0
Re
sp
on
se
0.0
10.0
20.0
30.0
Compound name: Corticosterone
Correlation coefficient: r = 0.999358, r^2 = 0.998717
Calibration curve: 0.188787 * x + -0.00745606
Response type: Internal Std ( Ref 13 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0 25 50 75 100 125 150 175
Re
sp
on
se
0.0
10.0
20.0
30.0
Compound name: Cortisol
Correlation coefficient: r = 0.999617, r^2 = 0.999234
Calibration curve: 0.0339563 * x + 0.00774359
Response type: Internal Std ( Ref 14 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0 100 200 300 400 500 600 700 800
Re
sp
on
se
0.0
10.0
20.0
30.0
Compound name: 11-Deoxycortisol
Correlation coefficient: r = 0.999140, r^2 = 0.998281
Calibration curve: 0.247126 * x + 0.0126426
Response type: Internal Std ( Ref 15 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0
Re
sp
on
se
0.0
5.0
10.0
Compound name: DHEA
Correlation coefficient: r = 0.997390, r^2 = 0.994787
Calibration curve: 0.00692836 * x + -0.00609587
Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0 50 100 150 200 250
Re
sp
on
se
0.00
0.50
1.00
1.50
Compound name: DHEAS neg
Correlation coefficient: r = 0.999556, r^2 = 0.999113
Calibration curve: 0.00199494 * x + 0.0129063
Response type: Internal Std ( Ref 16 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0 2000 4000 6000
Re
sp
on
se
0.0
5.0
10.0
15.0
Compound name: Progesterone
Correlation coefficient: r = 0.998980, r^2 = 0.997962
Calibration curve: 1.04123 * x + -0.00904292
Response type: Internal Std ( Ref 17 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0.0 20.0 40.0 60.0
Re
sp
on
se
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
Compound name: 17-alpha hydroxyprogesterone
Correlation coefficient: r = 0.998220, r^2 = 0.996442
Calibration curve: 0.440317 * x + 0.00113332
Response type: Internal Std ( Ref 18 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0.0 20.0 40.0 60.0
Re
sp
on
se
0.0
10.0
20.0
30.0
Compound name: Testosterone
Correlation coefficient: r = 0.999759, r^2 = 0.999518
Calibration curve: 0.926357 * x + 0.0148422
Response type: Internal Std ( Ref 19 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
nmol/L0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
Re
sp
on
se
0.0
10.0
20.0
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Linearità
Sovrapposizione di 8 curve di calibrazione:
Steroid Lowest cal (nmol/L)
Highest Cal (nmol/L)
r^2
Aldosterone 0.087 21.50 >0.999
Androstendione 0.290 63.60 >0.999
Corticosterone 0.844 190.00 >0.998
Cortisol 3.960 853.00 >0.999
11-Deoxycortisol 0.190 50.60 >0.998
DHEA 1.290 254.00 >0.994
DHEAS 34.300 7564.00 >0.999
Progesterone 0.364 77.20 >0.997
17-alpha hydroxyprogesterone 0.376 70.70 >0.996
Testosterone 0.113 27.80 >0.999
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Robustezza
Nota: Risoluzione Cromatografica mantenuta!
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CAH in Serum
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CAH in DBS
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Grazie
per
l’attenzione
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17-OHP analysis in dried blood spots (DBS)
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17-OHP analysis in DBS
System: ACQUITY Xevo TQ MS
Protocol:
– 2 x 3mm punches
– LLE ACN/acetone
– 20µL injection
– HSS C18 2.1x50mm
– 4.5min run time
– Calibration 3-400ng/mL
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Linearity
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Precision
Intra-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50,
100ng/mL) (n=5)
QCs obtained from CDC (Atlanta, GA)
Low Mid High
mean(ng/mL) 27.97 52.48 108.88
Std.Dev 0.77 1.79 5.35
%CV 2.76 3.41 4.91
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Precision
Inter-assay precision of QCs at three levels for 17-OHP (25, 50,
100ng/mL) over five days
Low Mid High
mean(ng/mL) 27.5 53.8 99.6
Std.Dev 1.3 3.5 6.0
%CV 4.8 6.5 6.0
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Ion suppression profile
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Sensitivity
LLOQ 3.27ng/mL
min1.50 1.60 1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40
%
0
100
F1:MRM of 6 channels,ES+
339.3 > 100
Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2)
3.27 ng/mL
2.167e+005d8-17-OHP
1.69
6560.95
min
%
0
100
F1:MRM of 6 channels,ES+
331.3 > 109.1
Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2)
3.27 ng/mL
1.387e+0042.3917-OHP
1.70
415.52
1.661.591.43 1.51
2.36
2.292.18
2.112.041.941.86
1.82
2.42
min
%
0
100
F1:MRM of 6 channels,ES+
331.3 > 97
Sample_20March09_004 Smooth(Mn,2x2)
3.27 ng/mL
1.393e+00417-OHP
1.71
398.02
1.45 1.58
2.482.422.372.192.14
1.871.91 2.042.25
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Plasmatic Metanephrines analysis
with Off-line SPE
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Sample Preparation
Matrix :Plasma
WATERS Oasis® WCX 1cc Cartridge 30mg 30µm
– 1ml ACN
– 1ml Buffered Water pH 6.8
– 1ml Plasma + 25µl Internal Standard Solution
– Wash with 2X 1 ml Buffered Water pH 6.8 an 1ml ACN
– Elute with 1 ml ACN + 2% FA
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Chromatograpghic Conditions
Column: Waters Acquity HILIC 50 x 2.1 mm, 1.7 µm with in-line filter
Waters Acquity UPLC TQD Sytem
Flow Rate: 0.6 ml/min
Injected Volume: 20 μL (full loop)
Column Oven: 30°C
Mobiles Phases:
– A = Water + 0.5% FA + 50mM AmFo
– B = Acetonitrile
Total Run Time: 5 minutes
Gradient:
Temps (min.) %A %B Slope
0.0 5 95 1
2.0 30 70 6
3.0 30 70 6
3.5 5 95 6
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Calibration curve (can be performed in Extracted Water)
Metanephrine: 0.125-5nM
Normetanephrine: 0.25-10nM
Metanephrine Normetanephrine
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Same Sample Positive Patient TQD
Metanephrine 1.4 µg/L
Normetanephrine 1.4 µg/L
Metanephrine
Normetanephrine
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Conclusion
Quantification of Plasmatic Metanephrine and Normetanephrine using off-line SPE with UPLC-Quattro Premier XE or TQD
Sensitivity is similar on Quattro Premier XE and TQD
Run time set to 5 minutes in order to maximize the Analytical Column Life-Time (about 1000 injections so far)
Excellent linearity across the analytical range
LOQ < 0.1nM for Metanephrine and < 0.2nM for Normetanephrine
This method has been validated internally and is used by Angers University Hospital as well as Lille University Hospital
Cross Analysis of 10 samples Groningen University Hospital (On-line SPE) gave CV around 10%