Estudios de expresión génica con microarrays

Aplicaciones de Data Miningen ciencia y tecnología

Bioinformática

Marcelo A. Soria (soria@agro.uba.ar)Maestria en Data Mining. DC-FCEN

Expresión diferencial de genes frente a dos tratamientos

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Tratamiento 1

Tratamiento 2

gen 1 gen 2

…

gen 3 gen 4 gen n

gen 1 gen 2

…

gen 3 gen 4 gen n

Comparación tratamiento 1 vs. tratamiento 2…

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Utilizando microarrays se puede analizar la expresión relativa de miles de genes simultáneamente

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.html

Una animación sobre experimentos con microarrays:

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Un microarray es un soporte sólido, por ejemplo, un vidrio de 8 x 2,5 cm.

Sobre el soporte se diseña una grilla, con tantos números de celdas como genes se van a analizar, más duplicados y controles

Sobre cada celda de la grilla se pegan moléculas de ADN complementarias del gen a analizar

Puntos importantes (1/2)

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Se realizan los experimentos, se extrae ARNm y después de varios pasos químicos, se agrega el material procesado a los microarrays

Se escanea el microarray iluminando con uno o dos láseres de diferentes colores, se procesan las imágenes

Se extraen los datos de expresión de la imágen

Puntos importantes (2/2)

Experimentos con microarrays. Esquema de trabajo

hipótesis

diseño experimental

experimento

análisis de imágenes

normalización

pre-procesamiento

análisisfiltradoestimación agrupamiento

integración de los datosenriquecimiento

funcionalanálisis de vias

metabólicas

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procesamiento de imágenes

Los spots se distribuyen en grillas, cada grilla se corresponde con uno de los probes (o genes) a analizar.

A veces las grillas no están bien alineadas entre sí.

Puede haber curvaturas dentro de una grilla

El espaciado entre los spots puede ser desigual

un microarray escaneadoMarcelo A. Soria (soria@agro.uba.ar)Maestria en Data Mining. DC-FCEN

procesamiento de imágenes

Cualquiera sea el tipo de microarray que utilicemos, tenemos que convertir los pixels de la imagen escaneada del microarray en información de expresión

1. escaneado (uno o dos canales)2. manipulación del contraste3. estimación preliminar de los centros de los

spots4. eliminar artefactos5. determinar la localización precisa del spot6. determinar la forma y tamaño del spot7. estimar el background

Dependiendo del tipo de microarray y de la plataforma, esto proceso puede ser más o menos automatizado

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Estrategia de un experimento con un microarray de cDNA

El análisis de expresión con un chip de Affymetrix

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normalización

Es una colección de métodos para tratar con los errores sistemáticos y los sesgos introducidos por la plataforma experimental utilizada

Etapas

Limpieza de los datos y transformación Normalización dentro del array (para arrays de 2 canales) Normalización entre arrays

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normalización

1. Limpieza de los datos y transformación

Remover spots marcados en el paso anterior

Sustracción del background

Aplicar logaritmos

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2. Normalización dentro del array (para arrays de 2

canales)

Posibles problemas:

normalización

Las marcas con Cy3 y Cy5 se incorporan diferencialmente

Los fluorógenos pueden tener diferentes respuestas de emisión a diferentes abundancias

Las emisiones pueden ser medidas diferencialmente a distintas intensidades

Problemas de enfoque

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normalización

Soluciones (1/2):

Regresión lineal de Cy5 contra Cy3: Graficar los logaritmos de las intensidades Ajustar una recta de regresión Reemplazar los valores de Cy3 con los valores

ajustados

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Soluciones (2/2):

Gráficos MA Graficar para cada spot en el eje x el promedio de los

logaritmos de Cy3 y Cy5. Y en el eje y la diferencia entre los logaritmos de los dos canales.

Ajustar una recta de regresión Recalcular la diferencia de logaritmos restando el valor

ajustado a la diferencia cruda

Regresión no-lineal de las diferencias de logaritmos (Regresión Loess)

Realizar un gráfico MA Aplicar la regresión Loess Recalcular la diferencia de logaritmos restando el valor

ajustado a la diferencia cruda

normalización

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normalización

A veces es necesario corregir diferencias de intensidad que varían espacialmente sobre el microarray, en ese caso se pueden aplicar regresiones Loess bidimensionales

La causa de esto son las diferencias entre bloques de spots

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3. Normalización entre arrays

Antes de hacer comparaciones entre distintos microarrays

tenemos que analizar y eliminar las diferencias entre arrays

debidas, por ejemplo, a diferencias entre las reacciones de

hibridación que ocurrieron en cada uno.

normalización

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normalización

Soluciones

Realizar un gráfico Box-Plot conjunto para todos los arrays del experimento, para ver diferencias en variabilidad y en valores medios.

Asumiendo que las diferencias no tienen origen biológico se puede:

Escalar los datos: restarle a cada valor de logaritmos (o log-ratio), la media de su microarrray.

Centrarlos: restar la media y dividir por el desvío estándar

Normalizar la distribución: 1) ordenar los datos por array de mayor a menor. 2) calcular una nueva distribución, el primer dato es el promedio de los más altos; el segundo, el promedio de los segundos más altos, y así sucesivamente.3) Reemplazar cada medida en cada array con el promedio de la distribución calculada en 3).

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