Post on 29-Mar-2019
ENZIMOLOGIJAH T T P : / / W W W. S B C S . Q M U L . A C . U K / I U B M B / E N Z Y M E /
DNK polimeraze struktura, funkcija i evolucija
MEHANIZMI ODRŽAVANJA INTEGRITETA GENOMA
Genome Integrity & StructuralBiology Laboratory, NIH
Uvod
Pravilna i tačna replikacija DNK je neophodna da bi se sačuvao integritet genetičke informacije kroz generacije.
Učestalost greške tokom replikacije je niska, 10-10–10-11
Tačnost replikacije se zasniva na dva koncepta
DNK mora da bude intakta što je više moguće.Bez bilo kakvih oštećenja pre procesa replikacije.
Tačnost relikacije koja se izvodi naneoštećenoj DNK ima svoja ograničenja.
Otkriće DNK polimeraze I
1956. godine Artur Kornberg je izolovao prvu polimerazu, a 1959.godine je sa Severno Oha dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju imedicinu “za otkriće mehanizma biosinteze DNK”. Istraživanja na DNKPol I su dala osnove za istraživanja strukurnih i biohemijskihmehanizama replikacije DNK.
DNK polimeraza I
Zahteva postojanje prajmera
Aktivna samo u prisustvu matrice
Egzonukleazne aktivnosti u oba smera
Niska proceivnost
Primarna uloga je da popuni pukotine u DNK molekulu koje nastaju tokom replikacije, reparacije i rekombinacije DNK
Mogućnost dopunjavanja aktivnosti između polimeraza koje su izolovane iz evolutivno udaljenih organizama
Bez obzira na raznolikost prokariota i njihovih staništa, sekvenca DNK polimeraze I je ostala
nepromenjena
3D struktura DNK polimeraze I
Tri domena: dlan, palac i prsti
Prsti – dNTP i jednolačana DNK, Palac – dvolančana DNK i Dlan –sadrži katalitički centar i takođe vezuje dNTP
Na C – terminalnom kraju 6 konzervisanih motiva od kojih
3 liče na motive DNK Pol a sisara i označeni su kao motiv A, B i C. A i C – dlan; B – prsti.
Visok stepen aminokselinskih zamena u aktivnom mestu DNK Pol I:
- 3 od 26 aminokiseline neophodne za in vivo funkcionisanje enzima (motiv A Asp610) i (motiv B Arg659 i Lys663)
- zamena 3 od 4 aminokiseline dovodi do promene supstratne specifičnosti enzim (motiv A Ile614, Glu615 i Arg617)
Evolucija aktivnog mesta DNK Pol I
➢ Vrste istog roda imaju gotovo identično aktivno mesto na nukleotidnom
nivou što sugeriše da je brzina evolucije polA gena izuzetno spora.
➢ Izuzetna plastičnost aktivnog mesta
- visoku toleranciju DNK Pol I na visok stepen mutacija sa kojima se sreće i
omogućava generisanje “dobrih” mutacija koje obezbeđuju kratkoročnu
selektivnu prednost.
- postoje mehanizmi za održavanje nukleotidne sekvence tokom evolucije
koji još nisu otkriveni.
Familije DNK polimeraza
Familija A - Pol I, Pol γ, T3, T5 i T7
Familija B – Pol II, Pol α, d, ε, ζ, T4, virusa, arhea
Familija C – Pol III
Familija D – nije dobro okarakterisna, Euryarchaeota
Familija X – Pol b, σ, λ, μ i TdT
Familija Y – TLS polimeraze (Pol η, ι, κ), Rev1, Pol IV, Pol V
Familija RT - retrovirusi, eukariotske telomeraze
DNK polimeraze prokariotaEscherichia coli
DNK polimeraze prokariotaEscherichia coli
Holoenzim DNK polimeraza III E. coli u toku replikacije vodećeg i zaostajućeg lanca
Shema delovanja dnk poli E. coli u nastajanju i sprečavanju grešaka u replikacionoj viljušci
ZAKLJUČAK Pomoćne polimeraze mogu, bar povremeno, da priđu replikativnoj
viljušci i učestvuju u procesu replikacije.
Učestalost greške tokom replikacije zavisi od tipa polimeraze.
Pol III nema tendenciju da proces sinteze novih lanca prepusti drugim polimerazama osim u određenim situacijama. Najverovatnije prva za to je Pol II.
Pol IV i Pol V moraju da se takmiče sa Pol II za ovu aktivnost i to prevashodno na zaostajućem lancu.
t je ključni faktor koji detektuje zastoj Pol III i omogućava njenu eventualnu zamenu drugom Pol koja nastavlja sintezu.
Sve napred rečeno daje odgovor na pitanje zašto je vernost replikacije u wt ćelijama nekoliko puta veća na zaostajućem nego na vodećem lancu.
Familije DNK polimeraza
Familija A - Pol I, Pol γ, T3, T5 i T7
Familija B – Pol II, Pol α, d, ε, ζ, T4, virusa, arhea
Familija C – Pol III
Familija D – nije dobro okarakterisna, Euryarchaeota
Familija X – Pol b, σ, λ, μ i TdT
Familija Y – TLS polimeraze (Pol η, ι, κ), Rev1, Pol IV, Pol V
Familija RT - retrovirusi, eukariotske telomeraze
Jedna DNK polimeraza – više funkcijaJedan događaj sinteza DNK –učešće više DNK polimeraza
POLIMERAZNA subjedinica idruge funkcionalne subjedinice
Aktivno mesto veoma konzervisano tokom evolucije
❖ 5’-3’ polimerazna aktivnost
❖ nema egzonukleaznu aktivnost
❖ niska procesivnost
❖ započinje sintezu DNK sintetišući
prajmer i kratak lanac DNK
❖ B familija
Glavna karakteristika svih DNK polimeraza je njihovanesposobnost da sintetišu lanac DNK de novo.
Arezi and Kuchta, Trends Biochem. Sci. 2000
49kDa subjedinica-počinje sintezu DNK de novo-katalitički centar primaze
70-90kDa (B) subjedinica-nema enzimsku aktivnost-uključena u regulaciju inicijacije replikacije
58kDa i 49kDa subjedinice-formiraju heterodimer primaze i tada je njena aktivnost max
180kDa subjedinica-elongacija početnog prajmeraod najmanje 8-12 nukleotida koji Polαprodužuje sa još ~20 nukleotida
Arezi and Kuchta, Trends Biochem. Sci. 2000
➢DNK pol α igra značajnu ulogu u koordinisanju replikacije, DNK reparacije i kontrolnim tačkama ćelijskog ciklusa
➢Kinaze zavisne od ćelijskog ciklusa fosforilišu i na taj način regulišu aktivnost DNK pol α tokom ćelijskog ciklusa
- Dva domena na polipeptidnom lancu od 39kDa:
31kDa domen (DNK polimerazna aktivnost)
8kDa domen ( dRPase za uklanjanje fosfata sa 5‘-kraja)
-Tri aspartata u aktivnom mestu su uključena u trasfer dNMP isto kao i kodDNK Pol I prokariota.
- Učestvuje u procesu isecanja baza tokom reparacije kod sisara:
short patch BER - (zamena jednog nukleotida) Pol β
long patch BER - (zamena nekoliko nukleotida, 2-13) Pol δ i Pol ε
Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK
Bailey and Doherty, Bioche. Soc. Trans. 2017
Mitohondrijska DNK čoveka. Shematski dijagram 16,6 kb dugog cirkularnog dvolančanog molekula mtDNK, gde spoljašnjikrug predstavlja teški lanac, a unutrašnji krug laki lanac. Prikazani su geni koji kodiraju komponente mitohondrijskog
respiratornog lanca: MTND1-6, MTCOI-II, MTATP6 i 8, MTCYB; geni za dve rRNK (zeleni boksevi) i geni za 22 tRNK (crveni kružići). Prikazana je i kratka trolančana struktura: D-petlja. (Chinnery and Hudson, British Medical bulletin, 2013.)
Heterotrimer, Polimerazna 5’-3’ aktivnost, Egzonukleazna 3’-5’ aktivnost, Reparacija- katalitička γA subjedinica (POLG1)- γB subjedinica (POLG2) – homodimerni pomoćni protein
Replikacija i reparacija mitohondrijske DNK
Szymanski et al., EMBO J, 2015.
Mutacije POLG gena dovode do brojnih poremećaja. Sve kopije mitohondrijske DNK kod čoveka vode poreklo od majke.
Replikacija i reparacija mitohondrijalne DNK
Shematski prikaz humanog mtDNK replizoma.Hudson and Chinnery, Human Mol Gen, 2006.
Dva predložena modela replikacije mtDNK:- Model asinhrone replikacije tj.
asinhrone zamene lanaca- Dvosmerni model replikacije spojenih
lanacaOdvija se u svim fazama ćlijskog ciklusa –relaksirana replikacija
POLRMT – primaza mitohondrija
PrimPol – nova eukatiotskaprimaza/polimeraza, jedro i mitohondrije,nije esencijalan protein
http://www.kerchner.com/mtdnachart.htm
http://www.norwaydna.no/mtdna_en/
Alpers sindromDečije miocerebrohepatopatijeDominanten i recesivne oftalmoplegijeNeuropatije
▪ kompleks od četiri subjedinice (heterodimer)
▪ 5’-3’ polimerazna i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost
▪ katalitička aktivnost zavisi od PCNA
▪ visoka procesivnost i tačnost
▪ replikacija i reparacija
(isecanje nukleotida,
“mismatch”, TLS)
C terminalni domen katalitičke subjedinice
- neophodan i dovoljan za funkcionisanje
- senzor replikacije, Zn2+ prstići (koordiniše transkripcioni odgovor, odgovor ćelije
na blokiranje replikacije i oštećenje DNK tokom S faze ćelijskog ciklusa)
- nije odgovorna za proveru kontrolnih tačka u S fazi (DNK polimeraza α-primaza)
▪ kompleks od četiri subjedinice
▪ 5’-3’ polimerazna i 3’-5’ egzonukleazna aktivnost
▪ visoka procesivnost i tačnost
▪ replikacija i reparacija
Replikativna viljuška28 godina kasnije
A. Model iz 1990. godineB. Trenutno važeći model
Pavlova & Scherbakova, Mutat. Res. 2011
Rezultati eksperimenata sa mutantima Pol δ i Pol ε koji nisu imali egzonukleaznu aktivnost
✓ Obe polimeraze su uključene u replikaciju✓ Sinergisički efekat njihove egzonukleazne aktivnosti✓Mora da postoji neki mehanizam po kome se određuje koja polimerazareplikuje određeni lanac DNK molekula
Rezultati eksperimenata sa mutantima Pol δ i Pol ε za seleciju baza
✓ Pol δ popravlja greške koje napravi Pol α✓ Pol ε uključena u replikaciju vodećeg lanca✓ Pol α i Pol δ sintetišu zaostajući lanac, a Pol ε sintetiše vodeći lanac.
Replikativna viljuška 28 godina kasnijeŠta se ne slaže u u modelu jedna polimeraza jedan lanac DNK
❖ Kada je deletiran gen za Pol ε, Pol δ može da je zameni, ali ne i obrnuto
❖ Kada je inaktivirana egzonukleazna aktivnost Pol δ znatno se povećava stopa mutacija u genomu, ali ne kada se naprave analogne mutacije u Polε
❖ Pol δ i Pol ε imaju afinitet ka istom tipu grešaka koje nastaju pri replikaciji (u tom slučaju bi smo imali aditivni efekat njihove aktivnosti)
❖ Pojava lezija na matrici regrutuje TLS polimeraze, a u tome učestvuje Pol δ i to na oba lanca
❖ in vitro eksperimenti su pokazali da je Pol δ efikasnija od Pol ε
Pavlova & Scherbakova, Mutat. Res. 2011
Autonomous ReplicationSequence
Pavlova & Scherbakova, Mutat. Res. 2011
❖ Kada je inaktivirana egzonukleazna aktivnost Pol δ znatnose povećava stopa mutacija u genomu
❖ Pol δ i Pol ε imaju afinitet ka istom tipu grešaka koje nastajupri replikaciji
❖ U korelaciji je sa starim modelom da su obe polimeraze angažovane u replikaciji na odvojenim lancima, ali se to dešava samo u domenu starta replikacije
❖ U replikaciji genoma učestvuju i TLS polimeraze, sa posebnim osvrtom na ulogu Pol ζ
Četvrta polimeraza iz B familije
Jezgro od dve subjedinice koje su u asocijaciji sa Rev 1 proteinom:
Rev3 katalitička polimerazna subjedinica
Rev7 subjedinica (povećava katalitičku aktivnost polimeraze)
nema egzonukleaznu aktivnost
Transleziona sinteza DNK
Najverovatnije četvrta polimeraza u replikativnoj viljušci čije je uključivanje u proces replikacije ograničeno i veoma dobro kontrolisano.
Član Y familije eukariotskih DNK polimeraza
Ima ubikvitin-vezujući domen za interakciju sa PCNA
C-terminalni domen (AK 1130-1251) za interakciju u kompleksu Rev3-Rev7 i sa drugim translezionim polimerazama
Hoolog UmuC kod E.coli (Pol IV) Johanson et al., PNAS 1999
Eubacteria – familija C DNK polimeraza
Archaea/Eukarya – familija B DNK polimeraza
Zn prsti na C – terminusu Pol ε homologi Zn prstima Pol II i polimeraza izD familije
Hipoteza da je arhea predak eukariota kodirao tri DNK polimeraze, dve zasebne B familije i D familiju polimeraza.
Inaktivirani Pol-Exo domen Pol ε je esencijalan za život ćelije što ukazuje na neku njegovu još ne otkrivenu funkciju.
(a) – Pol α*, (b) - Pol ε, - Pol δ*; * - esencijalneU familju B spada jos i Pol ζ ali ona ne učestvuje u replikaciji već u translezionoj sintezi.
Klasična struktura eukariotskihpolimeraza iz B familije :N---Exo-Pol---Zn---C
Jezgro DNK Pol ε – Pol2, je protein dugačak preko 2000 AK što je znatnoduze od drugih navedenih polimeraza
Zapaža se umetak između katalitičkihdomena i terminalnih Zn-prstiju po dužini sličan exo-pol modulu.
Analiza neokarakterisanog međudomena
Heterotetramer Pol ε[Krioskopska EM, 20 Å]
„Site-directed“ i deleciona mutagenezakatalitickog exo-pol modula na N krajupokazala je da on nije esencijalan za vijabilnost. Ono sto je jako iznenađujuće, je da ako se iste metode primene na međudomen, doznajemo da on jeste esencijalan.Dalje je analizirana sekundarna struktura i pokazano je da prvih 1200 AK na N krajugrade klasičan polimerazni domen što je iočekivano. Ono što nije ocekivano je da narednih ~1000 takođe grade polimeraznidomen.BLAST analiza je pokazala da druga polimerazna jedinica poseduju najveći stepen homologije sa bakterijalnim B DNK Pol (DNK Pol II, Photbacterium profundum, 90%).
Analiza sekvence
Konzervirani egzonukleazni i polimerazni domeni kod aktivnih polimeraza B familije poređeni sa neaktivnim C domenom Pol ε.Motivi koji su sastavni deo aktivnog centra su obeleženi sa Exo I-III odnosno Region I-III za Exo odnosno Pol domene. Ostaci katalitičkih AK su označeni sa #, i primećujemo da su to najkonzerviraniji regioni, ali da nisu konzervirani kod posmatranog međudomena.To nam govori da taj domen zapravo nije katalitički aktivan. Jedini motiv koji je konzervisan je „DIE“ motiv u exo domenu, zbog čega ova jedinica verovatno zadržava sposobnost vezivanja jona metala.
Tahirov et al., Biology Direct, 2009.
Male subjednice kompleksa DNK Pol
Još jedna esencijalna komponenta Pol ε je njena mala subjedinica DPB2 za koju je pokazano da je ona derivat exo domena arhealne DNK Pol iz familije D, ipokazano je da je i ona neaktivna.Dolazimo do zaključka da su obeesencijalne subjedinice Pol ε neaktivne, što nam govori o tome kako postoji selekcionipritisak da se iskoriste i neaktivne formeenzima odnosno da one steknu noveuloge. Najverovatnije da ove subjediniceučestvuju u formiranju kompleksa.
Poreklo neaktivnog exo-pol domena?Kada prepoznamo ovakav motiv u proteinu, da se slične jedinice nalaze jedna uz drugu, očekujemo da je to produkt tandemske duplikacije gena. Medjutim, pokazalo se da je neaktivnapolimerazna jedinica dosta sličnija nekim drugim polimerazama iz familije B (konkretnobakterijskim), nego aktivnoj polimeraznoj jedinici uz koju se nalazi. Štaviše, aktivna polimeraznajedinica Pol ε se po konzerviranim blokovima razlikuje od inaktivne jedinice kao i svih drugih B polimeraza po prisustvu nekoliko dodatnih unikatnih inserata.
Shema konzerviranih i specifičnih inserata u najkonzerviranije delove katalitičkihdomena polimeraza B familije. Tahirov et al., Biology Direct, 2009.
Poreklo Zn-prstiju eukariotskih polimeraza
Uporedjivanjem sekvenci Zn-prstiju utvrđeno je da Zn-prstiPol ε pokazaju mnogo veću homologiju sa arhealnim Pol iz D familije nego sa ostalimeukariotskim Pol. To daljesvedoči o filogenetskojudaljenosti ove polimeraze.
Tahirov et al., Biology Direct, 2009.
To nam svedoči o komplikovanijem evolutivnom scenariju, za koji je potrebno još dokaza.
Pomoću ovakvih informacija o homologijikonstruisano je filogenetsko stablo, u kome se
primećuje da je neaktivna polimerazna jedinicaPol ε povezana sa drugim aktivnim polimerazama,
ali bliže od njih sa bakterijskim B DNK polimerazama, dok je aktivna polimerazna
jedinica slabo povezana sa svima njima, i da je blisko povezana sa glavnim arhealnim B DNK
polimerazama.
Filogenetsko stablo DNK Pol B familije
Korišćenjem konzerviranih blokova dobijenih nakon poređenja Exo-Pol domena konstruisano je filogenetsko stablo. Neaktivni C domen Pol ε ima x. Zn finger 2* označava različitu verziju kod Pol ε.
Tahirov et al.,Biology Direct,2009.
Eukariotska B familija polimeraza vodi poreklo od dve evolutivno udaljene B familije Archaea, jedna je dala Pol
ε, druga je najverovatnije predak Pol α, Pol δ i Pol ζ
Najverovatniji evolutivni scenario
Pre-Pol αδζ najverovatnije vodi poreklood minornih arhealnih B DNK polimeraza. Duplikacijom idiversifikacijom ove pre-Pol su nastalePol α, δ, i ζ. S druge strane, pre-Pol ε, koja sadrži samo aktivnu polimeraznujedinicu, vodi poreklo od majorniharhealnih DNK pol. Svoju inaktivnujedinicu stekla je najverovatnije od nekebakterijske B DNK polimeraze, na šta ukazuje njena homologija. Najviše smisla ima da to budu polimeraze alfa-proteobakterija, koje su učestvovale u eukariogenezi (mitohondrije).
Predačke arhealne polimeraze
Male subjedinice vode poreklo od arhealnih DNK pol D, odnosnoporedstavljaju njihove inaktiviraneegzonukleazne domene. Od D DNK Pol nasleđeni su i C-terminalni Zn-prsti.Dakle, znamo da je poslednji arhealnizajednički predak morao nositi baremdve vrste B DNK Pol i jednu vrstu D DNK Pol, kao i da su njegove B DNK Pol u nekom trenutku primile Zn-prsteod D DNK Pol, što još nije nadjeno nikod jedne arhee. Približavanje ovakvomdokazu bi bio sledeći korak u razumevanju evolucije eukariotskihpolimeraza.
DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA
Aschenbrenner and Marx., Curr. Opin. Biotech. 2017
DNK POLIMERAZE I NJIHOVA BIOTEHNOLOŠKA PRIMENA
➢Veliki napredak u biotehnologiji je povezan sa otkrićemrazličitih DNK polimeraza
➢Posledično i dalje postoji potreba za DNK polimerazamaodređenih karakteristika
➢Sofisticirane metode za selekciju enzima značajno pomažu
➢Dodatne modifikacije metodama genetičkog inženjerstva
➢ Identifikacija i karakterizacija novih DNK polimerazabakterija, arhea i virusa
Teme za prezentacije- Primena DNK polimeraza
- DNK polimeraze Archea
- DNK polimeraza α – primaza
- Reverzne transkriptaze – virusa
- Reverzne transkriptaze – eukariota
- Mitohondrijska genetika