DNA İzolasyonu

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

DNA’nın Özellikleri,

Negatif yüklüdür,

Suda çözünebilir,

Alkolde çözünmez.

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ

İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR:

1-Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması,

2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi,

3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

cell growth cell harvest

and lysis

DNA purification

DNA purification: overview

DNA concentration

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

Bacterial genomic DNA prep: cell extract

Lysis:

• Detergents

• Organic solvent

• Proteases

(lysozyme)

• Heat

“cell extract”

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

Genomic DNA prep: removing proteins and RNA

Add the enzyme RNase to degrade RNA in the aqueous

layer

Need to mix gently! (to avoid shearing breakage of the

genomic DNA)

chloroform

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

2 ways to concentrate the genomic DNA

70% final conc.

“spooling” Ethanol precipitation molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

*Enzimler (RNase) RNA’yı yok etmek için,

*Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı olarak

bulunan proteinleri yok etmek için,

*İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin

çöktürülmesinde,

*Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin

çöktürülmesinde,

*Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını

bozmada,

***İzole edilen DNA +4°C’da uzun süre saklanabilir.

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

Plasmids: vehicles of recombinant DNA

Bacterial cell

genomic DNA plasmids

Non-chromosomal DNA

Replication: independent of the chromosome

Many copies per cell

Easy to isolate

Easy to manipulate molekulce.com/Tuba ERTÜRK

Plazmidler;

F Plazmidleri: Kromozom dışında veya bakteri

kromozomuyla birleşmiş halde bulunabilen genetik

elementlerdir. Kendilerinde bulunan genetik mteryali veya

bakteri kromozomunun bir kısmını oluşturdukları seks

pilusları ile alıcı bakterilere aktarırlar.

R plazmidleri: antibiyotiklere karşı direnç sağlarlar.

Kolisin plazmidleri: kolisinleri kodlayan genleri taşırlar.

Virulans plazmidleri

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

Plasmid purification: alkaline lysis

Alkaline

conditions

denature

DNA

Neutralize:

genomic DNA

can’t renature

(plasmids

CAN because

they never

fully

separate)

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

DNA purification: silica binding

Binding occurs in presence of high

salt concentration, and is disrupted

by elution with water

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

DNA purification: phenol/chloroform extraction

1:1 phenol : chloroform

or

25:24:1 phenol : chloroform : isoamyl alcohol

Phenol: denatures proteins, precipitates form at

interface between aqueous and organic layer

Chloroform: increases density of organic layer

Isoamyl alcohol: prevents foaming

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

1. Aqueous volume (at least 200 microliters)

2. Add 2 volumes of phenol:chloroform, mix well

3. Spin in centrifuge, move aqueous phase to a new tube

4. Repeat steps 2 and 3 until there is no precipitate at

phase interface

5. (extract aqueous layer with 2 volumes of chloroform)

Phenol extraction

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

DNA’nın Analizi

Nükleik asitlerin nanogram veya mikrogram

düzeyindeki miktarlarının belirlenmesinde absorbsiyon

temeline dayanan spektrofotometrik yöntemler

kullanılır

Ayrıca nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde

özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz

enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki

DNA parçalarının saptanmasında elektroforetik

yöntemler kullanılır.

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK

molekulce.com/Tuba ERTÜRK