Post on 11-Feb-2021
SYNTHESE VON LIPIDEN
FÜR
DIE LIPOSOMALE GENTRANSFEKTION
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt der
Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät
(mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich)
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von Herrn Dipl. Pharm. Ingo Christian Schulze
geb. am 8. Oktober 1975 in Leverkusen
Gutachter:
1. Prof. Dr. habil. B. Dobner
2. Prof. Dr. habil. A. Langner
3. Doz. Dr. habil. G. Brezesinski
Halle (Saale), den 07.04.2006
urn:nbn:de:gbv:3-000010121[http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000010121]
Ingo Christian Schulze
Synthese von Lipiden für die liposomale Gentransfektion
Dissertation, (2006)
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Fachbereich Pharmazie, Institut für
Pharmazeutische Chemie
123 Seiten, 56 Abbildungen
Inhaltsverzeichnis 1
1. Inhaltsverzeichnis
1. Inhaltsverzeichnis ...............................................................................................................1
2. Verzeichnis der Abkürzungen und Symbole.......................................................................3
3. Einleitung ............................................................................................................................5
4. Problemstellung ................................................................................................................10
5. Synthesekonzeption .........................................................................................................12
6. Darstellung von lipophilen Malonsäurediamiden als Transfektionslipide..........................16
6.1. Malonsäureester als Ausgangsverbindungen für die Synthese neuartiger
Transfektionslipide ................................................................................................16
6.2. Alkylierung von unterschiedlichen Malonsäureestern...........................................16
6.3. Malonsäuremonoamide ........................................................................................18
6.4. Malonsäurediamide...............................................................................................22
7. Darstellung von Gemini-Lipiden als Transfektionslipide ...................................................24
7.1. Gemini-Lipide........................................................................................................24
7.2. Gemini-Lipide ausgehend von alkylierten Malonsäureestern ...............................24
8. Darstellung von α-verzweigten Säureamiden als Transfektionslipide ..............................28
8.1. α-Verzweigte Carbonsäuren .................................................................................28
8.2. α-Verzweigte Säureamide.....................................................................................29
8.3. α-Verzweigte Säurediamide..................................................................................30
9. Darstellung hydrophober TRIS-Derivate als Transfektionslipide ......................................33
9.1. Tris-(2-amino-2-hydroxymethyl)-1,3-propandiol (TRIS) ........................................33
9.2. Hydrophobe TRIS-Derivate...................................................................................34
10. Darstellung hydrophober Pentaerythritol-Derivate als Transfektionslipide .......................40
10.1. Pentaerythritol .......................................................................................................40
10.2. Hydrophobe Pentaerythritol-Derivate....................................................................41
11. Darstellung hydrophober Glycerol-Derivate als Transfektionslipide .................................44
11.1. Glycerol .................................................................................................................44
11.2. Hydrophobe Glycerol-Derivate mit Ketalstruktur...................................................44
12. Darstellung von Phospholipiden als Transfektionslipide...................................................47
12.1. Lysophosphatidylserin-Analoga ............................................................................48
12.2. Quarternierung von Phospholipiden .....................................................................50
12.3. Phospholipide als neutrale Helferlipide für die Gentransfektion............................51
13. Physikochemische Untersuchungen.................................................................................56
13.1. Monoschichtuntersuchungen ................................................................................56
13.2. Interpretation der Druck-Flächen-Diagramme.......................................................57
13.3. GIXD-Untersuchungen..........................................................................................58
Inhaltsverzeichnis 2
13.4. IRRAS-Spektroskopie ...........................................................................................60
14. Transfektionsuntersuchungen ..........................................................................................61
15. Zusammenfassung ...........................................................................................................66
16. Arbeitsvorschriften ............................................................................................................68
16.1. Allgemeine Angaben.............................................................................................68
16.2. Kommerziell erworbene Chemikalien....................................................................70
16.3. Synthese der Ausgangsverbindungen ..................................................................71
16.4. Synthese der Verbindungen .................................................................................76
16.4.1. Synthese der Malonsäurediamide...................................................................76
16.4.2. Synthese der Gemini-Lipide............................................................................86
16.4.3. Synthese der α-verzweigten Säurediamide ....................................................91
16.4.4. Darstellung hydrophober TRIS-Derivate .......................................................103
16.4.5. Darstellung hydrophober Pentaerythritol-Derivate ........................................107
16.4.6. Darstellung hydrophober Glycerol-Derivate ..................................................110
16.4.7. Darstellung von Phospholipiden....................................................................111
17. Literaturverzeichnis.........................................................................................................117
18. Danksagung
19. Lebenslauf
20. Anhang
Abkürzungsverzeichnis 3
2. Verzeichnis der Abkürzungen und Symbole Abb. Abbildung
abs. absolut
β-Gal β-Galactosidase
BOP (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-
phosphoniumhexafluorophosphat
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
d Duplett
DC Dünnschichtchromatographie
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DMAP 4-Dimethylaminopyridin
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleinsäure
DOPE 1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
DOTAP N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium-
methylsulfat
DOTMA N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid
E. coli Escherichia coli
EEDQ 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydrochinolin
ESI-MS Elektronenstoß-Ionisations MS
EtAc Ethylacetat
EtOH Ethanol
exp. experimentell
Fp. Festpunkt, Schmelzbereich
g Gramm
gef. gefunden
GIXD Synchrotron Röntgendiffraktion unter streifendem Einfall
h Stunde
HOBT 1-Hydroxybenzotriazol
IRRAS Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie
kDa kilo Dalton
KOtBu Kalium-tert.butylat
LM Laufmittel
m Multiplett
MHz Megahertz
Abkürzungsverzeichnis 4
MsCl Methansulfonylchlorid
NMR Kernresonanz-Spektroskopie
ONPG ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
PEG Polyethylenglykol
PETN Pentaerythritoltetranitrat
p-TsOH p-Toluolsulfonsäure
q Quartett
Rf-Wert Retentionsfaktor
s Singulett
t Triplett
TBAI Tetrabutylammoniumiodid
TEA Triethylamin
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
X-Gal 5-Brom-4-chlor-indol-3-yl-β-D-galactopyranosid
Einleitung/Problemstellung 5
3. Einleitung Einige Krankheiten können zurzeit mit herkömmlichen medizinischen Methoden nur
unzureichend oder gar nicht geheilt werden. Neben anderen Therapieformen sind
insbesondere mit der Gentherapie große Hoffnungen verbunden, in Zukunft unter anderem
Erbkrankheiten sowie chronische Krankheiten und einige Krebserkrankungen nachhaltig
behandeln zu können. Das Konzept basiert auf der Grundlage, eine Krankheit durch gezielte
Übertragung fremden genetischen Materials in bestimmte Zellen eines Patienten zu
korrigieren1. Die Suche nach geeigneten Strategien um DNA in eine Zelle einzuschleusen ist
einer der Schwerpunkte auf diesem Forschungsgebiet. Die gegenwärtig eingesetzten
Gentransfersysteme lassen sich in biologische, physikalische und chemische Methoden
unterteilen.
Mit bestimmten Viren ließen sich bisher recht große Erfolge erzielen. Vor allen Dingen
Adeno- und Retroviren erwiesen sich als sehr effiziente Vektoren2,3. Dabei werden
modifizierte Virusgenome verwendet, damit sichergestellt ist, dass die Viren die
transduzierten Zellen nicht wieder verlassen können4. Allerdings ist die Virus-vermittelte
Gentransduktion mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Adenovirale Vektoren lösen eine
sehr starke Immunantwort aus. Dies führte in klinischen Studien bereits zu einem Todesfall5.
Retrovirale Vektoren werden vom unspezifischen Immunsystem sehr schnell zerstört, so
dass sie nur an isolierten Zellen unter Laborbedingungen angewendet werden können4. Die
aufwendige Produktion und die abschließenden Qualitäts- und Sicherheitskontrollen stellen
einen zusätzlichen Nachteil dar. Es besteht außerdem die Gefahr der potenziellen Induktion
von Onkogenen durch Viren6,7. Auf der Suche nach Alternativen wurden unterschiedliche
physikalische8,9 und vor allen Dingen chemische Gentransfersysteme entwickelt. Besonders
vielversprechend sind Liposomen, Polymernanopartikel und Polylysinpartikel. Diese sind
weder immunogen noch onkogen. In der Regel sind sie leicht herzustellen und erfordern
weniger aufwendige Kontrollen. Sie stellen deshalb eine sichere Transfektionsmethode dar10.
Nachteilig wirken sich kurze Halbwertzeiten und eine im Vergleich zu viralen Vektoren
schlechte Transfektionsrate aus11. Trotzdem besitzen besonders die Liposomen ein großes
Potential für den Gentransfer. Sie haben eine hohe Beladungskapazität und schützen die
DNA vor dem Abbau durch Nukleasen. Liposomen, die im Zusammenhang mit
Gentransfersystemen genannt werden, bezeichnet man auch als Lipoplexe. Sie setzen sich
aus kationischen und bestimmten neutralen Lipiden zusammen. Durch elektrostatische
Wechselwirkungen interagieren die kationischen Lipide spontan mit negativ geladenen
Phosphorsäureresten der DNA12. Die Liposomen-DNA-Komplexe sollten nach außen positiv
geladen sein, damit sie aktiv oder passiv von den allgemein negativ geladenen Zellen
aufgenommen werden können. Bei negativer Außenladung der Lipoplexe sinkt die
Einleitung/Problemstellung 6
Endozytoserate und es kommt zu einem raschen Abbau13,14. Um eine längere
Zirkulationszeit im Organismus zu gewährleisten werden häufig pegylierte Verbindungen
verwendet15. In letzter Zeit konnte zudem herausgefunden werden, dass der pH-Wert des
Lipoplexes einen hohen Einfluss auf die intrazelluläre Stabilität, die DNA-Freisetzung aus
dem Komplex und die Applizierbarkeit hat16. Im folgenden werden die unterschiedlichen
Bausteine der Lipoplexe näher erläutert.
Neutrale Lipide
Neutrale Lipide sind aufgrund ihrer Eigenschaften selbst nicht transfizierend wirksam. Sie
werden vor allen Dingen als so genannte Helferlipide bei der Darstellung der Lipoplexe für
eine Vielzahl von Aufgaben benötigt. Unter anderem verringern neutrale Lipide die Toxizität,
sorgen damit für eine gute Allgemeinverträglichkeit und verbessern aufgrund ihrer Struktur
die Transfektionsrate17. Weiterhin beteiligen sie sich entscheidend am strukturellen Aufbau
der Lipoplexe18. Mischungen aus dem natürlich vorkommenden Lipid DOPE und einem
kationischen Lipid bilden zum Beispiel invers hexagonale Mizellen19. Es wird diskutiert, dass
DOPE eine Fusion zwischen Lipoplex und Endosomenmembran vermittelt. Dies führt
möglicherweise zu einer Destabilisierung der Endosomenmembran und damit zu einer
verbesserten Freisetzung der DNA20. Cholesterol und seine Derivate eignen sich ebenfalls
gut als Helferlipide, da sie in Kombination mit kationischen Lipiden in vielen Organen gute
Transfektionsraten erzielen konnten21,22. Eine Weiterentwicklung stellen fluorierte Helferlipide
dar, die in vivo und in vitro zu einer effizienteren Transfektion führten als die bisher
beschriebenen Helferlipide23.
O
OO
O
OP
OH3N
OO DOPE
O (C 2)8F
OO
PO
H3NO O
F
[F8E11][C16]OPE
Abb. 1: Chemische Strukturen neutraler Lipide.
Einleitung/Problemstellung 7
Kationische Lipide
Kationische Lipide bestehen aus einer positiv geladenen Kopfgruppe, die über einen Linker
mit einer hydrophoben Einheit verbunden ist. Sie ermöglichen als amphiphile Verbindungen
die Komplexierung mit negativ geladener DNA. Auf dem Gebiet der nicht-viralen
Gentransfersysteme entwickelte Felgner24 1987 DOTMA, das erste für die Transfektion
geeignete kationische Lipid.
Heute differenziert man zwischen zwei Hauptgruppen; monovalente und polyvalente
kationische Lipide. Bei den monovalenten kationischen Lipiden handelt es sich hauptsächlich
um quarternäre Ammoniumsalze mit einer oder zwei langen Alkylketten. CTAB, ein
Ammoniumsalz mit nur einer Kette, transfiziert zwar, bildet jedoch nur schlecht Liposomen
und ist aufgrund lytischer Eigenschaften ausgesprochen toxisch25. Besser geeignet sind die
Lipide DOTMA24 und das analoge DOTAP26. Diese besitzen immer noch eine hohe Toxizität
und müssen deshalb in Mischungen mit dem Helferlipid DOPE verwendet werden12. DOTAP
besitzt im Gegensatz zu DOTMA Esterstrukturen. Diese lassen sich durch Esterasen im
Organismus leicht spalten und führen möglicherweise zu einer besseren Metabolisierung der
Verbindung. Lipide, die über eine Pyridinium-Kopfgruppe verfügen, erwiesen sich in der
Gruppe der monovalenten Substanzen als überlegen, da sie eine geringe Toxizität bei
gleichzeitig guter Transfektionsrate aufweisen27. Aufgrund der bisher ermittelten Struktur-
Wirkungs-Beziehungen sind bei allen Lipiden, die eine verhältnismäßig gute
Transfektionsrate zeigen, folgende Merkmale erforderlich:
- Aminogruppen (als basischer bzw. kationischer Rest),
- zwei hydrophobe aliphatische Ketten mit jeweils 12-18 Kohlenstoffatomen (diese
können gesättigt bzw. ungesättigt sein) oder
- Cholesterol als lipophiler Rest.
O
ON
DOTMA
N
O
O
O
O
DOTAP
N
CTAB
Abb. 2: Chemische Strukturen monovalenter kationischer Lipide.
Einleitung/Problemstellung 8
Multivalente Kopfgruppen erhöhen generell die Transfektionsrate28. Bei Lipiden mit Spermin
als Kopfgruppe, etwa bei DOGS, nimmt man an, dass diese mit der „minor groove“ der DNA
interagiert29. MLV5 ist ein neuartiges Lipid mit 5 Ladungen und zwei ungesättigten Ketten auf
der Basis von 3,4-Dihydroxybenzoesäure30. Ein weiteres viel versprechendes System basiert
auf Glycinbetainen, die mit Acylketten kovalent gebunden sind. Sie verfügen über Peptid-
und Esterbindungen und sollten somit optimal metabolisierbar sein31. Weiterhin sind Amid-
und Carbamoylbindungen sehr gut geeignet, da sie chemisch stabil aber bioabbaubar sind.
Polyamine sind bei neutralen ph-Werten nur partiell protoniert und die einzelnen primären,
sekundären bzw. tertiären Aminofunktionen weisen unterschiedliche pKs-Werte auf. Sie
wirken deshalb als Puffer und schützen die DNA somit ausreichend vor dem sauren Milieu
im Endosom32. Ein neues Konzept basiert auf Guanidinen, die an ein ungesättigtes
Glycosidgerüst gebunden werden. Man verspricht sich hiervon eine gesteigerte
Transfektionsrate33. Neben aliphatischen Alkylketten wird häufig auch Cholesterol im
hydrophoben Bereich verwendet. Ein sehr gut transfizierendes Lipid auf Cholesterolbasis,
DC-Chol, hat sich leider als zelltoxisch erwiesen und kann nur in Mischungen mit DOPE
verwendet werden12. Deshalb zielte die Entwicklung auf galactosylierte Cholesterolderivate
mit großen Spacern34. Sie stellen eine moderne Gruppe von Transfektionslipiden mit hoher
Transfektionsrate dar. Zudem haben cholesterolhaltige Lipide eine hohe Affinität zu
Bronchoepithelzellen, besitzen jedoch nur geringe Wechselwirkungen mit Plasmaproteinen14.
Dies ist ein großer Vorteil, da viele kationische Lipide und Liposomen durch
Wechselwirkungen mit negativ geladenen Plasmaproteinen inaktiviert werden können.
H3N N NN
NH3N
OH
HH
H
H ODOGS
O
O
O
N
H
N
H
O
NH2
NH3
N
H3N
H3N
H
MVL5
O
O
NN
HH
DC-Chol
Abb. 3: Chemische Strukturen polyvalenter kationischer Lipide.
Einleitung/Problemstellung 9
Polyplexe
Neben den Lipoplexen werden hauptsächlich Polyplexe für die Gentransfektion eingesetzt.
Es handelt sich hierbei vor allen Dingen um kationische Polymere. Diese komprimieren die
DNA auf eine relativ geringe Größe und werden ebenfalls als Polymer-DNA-Komplexe durch
Endozytose von der Zelle aufgenommen. Ähnlich den polyvalenten kationischen Lipiden
besitzen sie aufgrund vieler basischer Reste eine intrinsische Pufferkapazität. Man geht
davon aus, dass einige Polymere als so genannter „Protonenschwamm“ im Endosom wirken.
Aufgrund des damit verbundenen Konzentrationsunterschiedes kommt es zu einem
osmotischen Gefälle an der Endosomenmembran, das zu einem Einströmen von Wasser
führt und damit eine Destabilisierung der Struktur verursacht. Dies kann wiederum zu einer
besseren Freisetzung der DNA führen35. Das molekulare Gewicht, der Verzweigungsgrad,
die Ionenstärke, das Zeta-Potential und die Partikelgröße der Polymere sind Faktoren, die
einen entscheidenden Einfluss auf die Transfektionseffizienz, aber auch auf die Zytotoxizität
der Polyplexe haben36. Es zeichnet sich ab, dass es schwierig wird, diese Faktoren
untereinander abzustimmen und zu optimieren. Um die Toxizität zu senken werden die
Polymer-DNA-Komplexe pegyliert. Ein hoher Pegylierungsgrad senkt jedoch die zelluläre
Aufnahme und folglich wird die Transfektionsleistung gemindert37. Poly(ethylenimin) (PEI) ein
Polymer, das durch kationische Polymerisierung, ausgehend von einem 2-substituierten 2-
Oxazolidin-Monomer und anschließender Hydrolyse gewonnen wird, stellt ein viel
versprechendes Gentransfersystem dar38. PEI-Moleküle, die größer als 10 kDa sind, konnten
bereits erfolgreich bei der Gentransfektion eingesetzt werden39. Das Einführen von
Antikörperstrukturen ermöglichte bei diesem Polymer zudem ein gewisses Zelltargeting40.
Um die Effizienz weiter zu steigern sind auch Kombinationen mit kationischen Lipiden
denkbar41.
Poly(L-Lysin) und Poly(L-Arginin), lineare Polypeptide der Aminosäuren Lysin bzw. Arginin,
stellen weitere Vertreter der Klasse der kationischen Polymere dar. Aufgrund der
vorliegenden Amidbindungen besitzen sie Vorteile bei der Metabolisierung in vivo. Allerdings
werden sie unter Umständen sehr schnell abgebaut um ausreichend effizient zu sein. Eine
Co-Applizierung von Chlorochin hat sich als günstig erwiesen, erhöhte jedoch die Toxizität42.
Schlechte Transfektionsraten lassen zudem PLL und PLA als wenig geeignete Vektoren
erscheinen. In Kombination mit PEG und Fettsäureestern konnten jedoch Verbesserungen
hinsichtlich Effizienz und Toxizität erzielt werden43. Protamin, selbst kleiner als PLA, dafür
aber aufgrund von 21 Arginin-Resten hochgradig positiv geladen, wechselwirkt
ausgezeichnet mit Phosphorsäureresten und kondensiert DNA entsprechend gut. Es
verhindert eine Zerstörung durch Nukleasen und ermöglicht eine bessere Aufnahme der
DNA in den Zellkern. Der Grund dafür liegt möglicherweise in einer Nachahmung der nuclear
localization signals (NLS)44. Als weitere Substanzen für die nicht virale Gentransfektion seien
Einleitung/Problemstellung 10
noch Chitosan45, Dendrimere vom Polyamidoamin Typ46 und so genannte Block-
Copolymere47 erwähnt.
[N
NN
NN
N]n
H
NH2
O
H
NH2
O
H
NH2
O
H
NH2
O
H
NH2
O
H
NH2
O
[N
NN
N]n
H
N
NH2
NH
H
O
H
N
NH2
NH
H
O
H
N
H
NH2
NH
O
H
N
H
NH2
NH
O
[N
]n
H
PLL
PLA
PEI
Abb. 4: Chemische Strukturen kationischer Polymere.
4. Problemstellung Die beschriebenen nicht-viralen Gentransfersysteme stellen eine sichere und effiziente
Methode für die Gentherapie dar. Besonders die liposomalen Systeme besitzen gegenüber
den viralen Vektoren einige Vorteile. Sie sind weder infektiös noch lösen sie eine
Immunantwort im Organismus aus. Dadurch wird eine wiederholte Applikation möglich. Im
Vergleich zu viralen Vektoren gestatten Liposomen eine wesentlich höhere DNA-
Beladungsrate und können somit auch komplexe Gene in die Zellen einschleusen. Die
Synthesen der notwendigen Lipide sind einfach und die Darstellungsmethoden der
Liposomen zum Teil in der pharmazeutischen Technologie etabliert. Dadurch lassen sich die
Herstellungsverfahren optimieren und die Produktionskosten reduzieren. Dennoch besitzen
Liposomen für die Gentransfektion zum gegenwärtigen Zeitpunkt eine Reihe von Nachteilen.
Sie besitzen keine Gewebespezifität und führen lediglich zu einer transienten
Genexpression, da die transfizierte DNA nicht dauerhaft in das Wirtsgenom integriert wird.
Einleitung/Problemstellung 11
Das Hauptproblem der liposomalen Gentransfektion stellt jedoch die grundsätzlich geringe
Transfektionsrate dar. Aus diesem Grund ist es nach wie vor notwendig, neue Lipide für die
Gentransfektion zu synthetisieren. Die Entwicklung eines erweiterbaren Synthesekonzeptes
zur Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen stellt einen Schwerpunkt dieser Arbeit
dar. Durch die physikochemische Charakterisierung und die in-vitro Testung sollten die
dargestellten Lipide direkt weiterentwickelt und optimiert werden. Es wurde vorausgesetzt,
nach Möglichkeit kostengünstige Ausgangssubstanzen und einfache Synthesewege zu
verwenden.
Synthesekonzeption 12
5. Synthesekonzeption Zielstellung der vorliegenden Arbeit war es, neuartige Lipide zu entwickeln, die bei der nicht-
viralen Gentransfektion eingesetzt werden sollten. Die Synthesen erfolgten auf der
Grundlage folgender Aspekte:
1. kostengünstige Ausgangsstoffe
2. einfache Methoden
3. gute Reproduzierbarkeit
4. hohe Variabilität.
Zur Realisierung dieser Kernpunkte wurde für diese Problematik ein neuartiges
Bausteinprinzip entwickelt. Die synthetisierten Zielverbindungen bestehen grundsätzlich aus
Einheiten, die variabel zusammengesetzt werden konnten. Die einzelnen Bausteine ließen
sich im Rahmen effizienter Synthesen modifizieren.
Zentralbaustein
Abb. 5: Bausteinprinzip
Als Ausgangsverbindungen wurden folgende Substanzen verwendet:
• unterschiedliche Malonsäureester (I)
• Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) (V)
• Pentaerythrit (VII)
• Glycerol (IX).
Diese sind nicht toxisch, kostengünstig, leicht zu erwerben und in der Industrie allgemein
etabliert. Aufgrund ihrer Eigenschaften, Reaktivität und funktionellen Gruppen konnten sie
sehr gut für die Darstellung von Lipiden verwendet werden. Bei den angewandten Synthesen
handelt es sich um einfache und reproduzierbare Methoden. Diese wurden unter Umständen
modifiziert und generell auf ihre allgemeine Anwendbarkeit überprüft.
Malonsäureester Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Pentaerythrit Glycerol
Polare Kopfgruppe Symmetrische Oligoamine Aminosäuren
Lipophiler Teil Gesättigte / ungesättigte Alkylketten
Synthesekonzeption 13
Die Malonsäureester I wurden in einem ersten Schritt mit hydrophoben Alkylhalogeniden umgesetzt. Nach selektiver Esterspaltung war es möglich via Amidbindung eine weitere
gesättigte/ungesättigte Alkylkette einzuführen. Im Anschluss daran konnte der verbliebene
Ester verseift werden und es gelang, die resultierende Säure mit unterschiedlichen Aminen
zu verbinden II. Die monoalkylierten Malonsäureester ließen sich außerdem durch Bisalkylierung zu so genannten Gemini-Lipiden IIIa,b umsetzen. Weiterhin wurden ausgehend vom Malonsäurediethylester in α-Position verzweigte Säuren synthetisiert, die mit
unterschiedlichen Aminen gekuppelt werden konnten IVa. Hierbei war es möglich, die polare Kopfgruppe durch unterschiedliche Aminosäuren zu erweitern IVb.
O
O
O
O
R1
R2N R3
H
O
R2
O
R2
R3O
(CH2)4R2
R3O
O O
R2
R3
OR4
O O
O
R3
R2
R2
R2
O
R3
R2
R2
O
N (CH2)x NR5
H H
I
II IIIa IVa
R1= unterschiedliche ResteR2= AlkylkettenR3= AmineR4= SpacerR5= Aminosäuren IIIb IVb
Abb. 6: Malonsäurederivate
Es ließ sich zeigen, dass Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) V durch Anwendung einer gezielten Schutzgruppenstrategie selektiv alkyliert werden kann. Im Gegensatz zu den bisher
dargestellten Substanzen für die Gentransfektion besitzt diese hydrophobe Verbindung zwei
unterschiedliche funktionelle Gruppen, die eine Erweiterung der Synthesestrategie erlauben.
NO O
OH
H33C16 C16H33
H R1NH2HO OH
OH
R1= Aminosäure
V VI
Abb. 7: TRIS-Derivate
Synthesekonzeption 14
Pentaerythrit VII wurde ähnlich wie Tris(hydroxymethyl)aminomethan V durch eine Schutzgruppenstrategie modifiziert. Auch hierbei war es möglich, ein hydrophobes Molekül
VIII darzustellen, das über zwei unterschiedliche funktionelle Gruppen verfügt. Zusätzlich war die OH-Gruppe durch einen Benzylether vor weiteren Umsetzungen geschützt.
O
NH2
OC16H33
H33C16 O
OH
OH
HOOH
VII VIII
Abb. 8: Pentaeryhrit-Derivate
Ausgehend vom Glycerol IX wurden so genannte pH-sensitive Verbindungen synthetisiert. Es handelt sich hierbei um hydrophobe Ketale mit freier OH-Gruppe. Diese wurde via
Mesylat in das entsprechende Amin umgewandelt. Als funktionelle Gruppe konnte das Amin
mit einer Aminosäure zum Amid X umgesetzt werden.
N
O
O C15H31
C15H31
R1H
OH
OH
OH
IX X
R1= Aminosäure
Abb. 9: Glycerolderivate
Glycerol IX wurde weiterhin als Ausgangsstoff für die Synthese eines neuartigen Helferlipides mit zwei bzw. drei hydrophoben Alkylketten verwendet XI. Für diese Verbindungen waren bereits Synthesen beschrieben, die jedoch hinsichtlich Darstellung,
Aufarbeitung und Ausbeuten modifiziert wurden. Sie basieren auf den Grundlagen der
Phospholipidsynthesen.
O
O
O C14H29
P OO O
N
R1
O
OH
OH
OH
R1= Alkylrest
IX XI
Abb. 10: Helferlipide
Synthesekonzeption 15
Weiterhin sollten die dargestellten Lipide nach Möglichkeit eine hohe Transfektionsrate bei
gleichzeitig niedriger Toxizität gewährleisten. Durch Verwendung geeigneter Kopfgruppen
konnte die Transfektionsrate im Vergleich zu bekannten Transfektionslipiden gesteigert
werden. Um die Toxizität möglichst niedrig zu halten, wurden gering bis nicht toxische
Ausgangsverbindungen verwendet. Bei den Bindungen in den Molekülen handelt es sich
hauptsächlich um die auch natürlich vorkommenden Amidbindungen.
Synthetischer Teil 16
6. Darstellung von lipophilen Malonsäurediamiden als Transfektionslipide
6.1. Malonsäureester als Ausgangsverbindungen für die Synthese neuartiger Transfektionslipide Im Rahmen der Aufgabenstellung wurden neuartige Verbindungen synthetisiert, die für die
nicht virale Gentransfektion eingesetzt werden sollten. Aufgrund ihrer vielfältigen
Reaktionsmöglichkeiten erwies sich die Malonsäure als eine sehr gut geeignete
Ausgangsverbindung. Sie wird, zumeist in Form ihres Diethylesters, für zahlreiche
Synthesen genutzt. Als reaktive Methylenkomponente wird der Malonsäureester zum
Beispiel bei der Knoevenagel-Reaktion48, einem Spezialfall der Aldolkondensation,
verwendet. Unter reaktiven Methylenverbindungen oder CH-aciden Komponenten versteht
man Verbindungen, in denen eine CH2-Gruppierung von zwei elektronenziehenden
Substituenten flankiert wird.
Weiterhin sind die Malonestersynthesen48 von großer präparativer Bedeutung. Bei ihnen ist
das Carbanion der entscheidende Reaktionsträger. Wie beschrieben48, weist die im
Malonester enthaltene CH2-Gruppe eine hohe CH-Acidität auf, und kann durch Basen in das
Anion überführt werden. Dieses Anion reagiert leicht mit Elektrophilen und kann mit
Alkylhalogeniden zum Alkylmalonester umgesetzt werden. Es handelt sich um eine
nukleophile Substitution am Alkylhalogenid, wobei das Anion der CH-aciden Komponente als
nukleophiles Reagens fungiert. Eine Wiederholung dieses Prozesses ermöglicht die
Einführung eines weiteren Alkyl-Restes unter Bildung des Dialkylmalonesters, der via
Malonsäure in die freie Monocarbonsäure umgewandelt werden kann. Aufgrund dieser
Eigenschaften und der sich damit ergebenden mannigfaltigen Anwendungsmöglichkeiten,
wurde der Malonsäureester als eine neue Ausgangsverbindung für die Synthese von
Transfektionslipiden gewählt.
6.2. Alkylierung von unterschiedlichen Malonsäureestern
Entsprechend der in der Einleitung erwähnten Forderung an die Struktur effizienter
Transfektionslipide sollten die Verbindungen im hydrophoben Bereich über zwei Alkylketten
verfügen. In einem ersten Schritt wurden die Malonsäureester mit Natriumhydrid als Base
und Hexadecylbromid 2a als alkylierendem Agens in absolutem Toluol nach einer in der Arbeitsgruppe erprobten Vorschrift umgesetzt. Diese bekannte Reaktion führte im Fall des
Synthetischer Teil 17
Malonsäurediethylesters 1a zu einem nahezu DC-reinen Produkt. Um jedoch eine größere Variabilität für weitere Reaktionen zu gewährleisten, sollte mit gemischten Malonsäureestern
als Ausgangsverbindungen gearbeitet werden. Es handelte sich um Verbindungen, bei
denen die Esterfunktionen selektiv und unabhängig voneinander verseift werden konnten. Es
wurden Substanzen mit Benzylesterstruktur 1b, die sich zur Carbonsäure hydrieren lassen, und Tertiärbutylester 1c ausgewählt. Ester tertiärer Alkohole lassen sich basisch nur noch sehr schwer verseifen. Die sauer katalysierte Reaktion verläuft hingegen sehr leicht. Dabei
entsteht über den protonierten Ester die Carbonsäure und ein energiearmes tertiäres
Alkylkation, das je nach Reaktionsbedingungen zu einem tertiär-Alkanol oder/und Isobuten
weiterreagiert.
O
O
O
O
NaH oder KOtBuH33C16I 2bTBAITHF
O
O
O
OH33C16
O
O
O
OH33C16
NaH33C16Br 2aTBAIEtOH
O
O
O
OH33C16
NaHH33C16Br 2a TBAIToluol
O
O
O
OH33C16
NaHH33C16Br 2aTBAIToluol
3b 3a
1c
3c 3a3c
O
O
O
O1b
O
O
O
O1a
O
O
O
O1b
O
O
O
O1b
O
O
O
OH33C16
NaH33C16Br 2aTBAIEtOH
NaH oder KOtBuH33C16I 2bTBAITHF
3b
O
O
O
OH33C16
Abb. 11: Alkylierung unterschiedlicher Malonsäureester.
Die Alkylierung des gewählten Malonsäurebenzylethylesters 1b und des Malonsäure-tertiärbutylethylesters 1c erwies sich als weitaus schwieriger als erwartet. Die bekannte Alkylierungsmethode unter Verwendung von Toluol als Lösungsmittel führte in beiden Fällen
Synthetischer Teil 18
zu einer intermolekularen Umesterung. Ethanol führte sogar zu vollständiger Alkoholyse. Wie
in der Literatur49 beschrieben, kann diese Reaktion, im Gegensatz zur Veresterung, durch
Basen katalysiert werden. Der sehr reaktive Malonsäurebenzylethylester 1b konnte im basischen Reaktionsmilieu relativ leicht umestern. Im Allgemeinen findet eine Umesterung,
genau wie die Verseifung, umso leichter statt, je einfacher die Ester gebildet werden. Sie ist
stark vom Lösungsmittel, der elektrophilen Aktivität der Carbonylgruppe und von sterischen
Faktoren abhängig.
Die Ester der sterisch anspruchsvollen tertiären Alkohole sind nicht durch Veresterung von
Carbonsäuren darstellbar. Mit steigender Raumfüllung des Alkohols sollte die Fähigkeit zur
Veresterung und Umesterung somit erschwert sein. Die Ergebnisse widersprachen jedoch
diesen bei normalen Carbonsäureestern allgemeingültigen Aussagen. Entweder lag der
Grund für die Umesterung beim Malonsäuremolekül selbst, oder bei den verwendeten
Lösungsmitteln. Die elektrophile Aktivität der beiden Carbonylgruppen schien sich
gegenseitig im besonderen Maße zu steigern, was zu einer erleichterten Umesterung auch
der sterisch anspruchsvollen Ester führte. Durch seine hohe Siedetemperatur erleichterte
Toluol die Umesterung zusätzlich. Im Rahmen weiterer Untersuchungen zur Alkylierung der
gemischten Malonsäureester 1b,c ergab sich, dass bei der Verwendung von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel die Umesterung bei der Monoalkylierung weitgehend unterdrückt werden
konnte. Zur weiteren Optimierung der Reaktion wurden als Alkylierungsmittel reaktive
Alkyliodide 2b eingesetzt. Diese konnten durch Finkelstein-Reaktion50 aus den entsprechenden Alkylbromiden 2a dargestellt werden. Zur Deprotonierung eignete sich neben Natriumhydrid auch sehr gut Kalium-tert.butylat. Aufgrund der Probleme, die sich bei
der Bisalkylierung der Malonester bezüglich einer selektiven Synthese unterschiedlicher
Esterkomponenten ergaben, wurde ein neues Konzept verfolgt, bei dem eine zweite lipophile
Kette über eine Säureamidstruktur eingeführt werden sollte.
6.3. Malonsäuremonoamide In einem weiteren Schritt sollte eine Estergruppe der Malonsäure mit unterschiedlichen,
langkettigen primären Aminen zum Malonsäuremonoamid umgesetzt werden. Die direkte
Aminolyse der Carbonsäureester erschien als sehr einfache Methode und lässt sich in der
Regel bereits unter relativ milden Bedingungen durchführen. Leider konnten bei den
durchgeführten Synthesen auch nach mehreren Stunden keine Umsetzungen festgestellt
werden. Es kam lediglich zu den schon bekannten Umesterungen.
Es gibt jedoch eine Vielzahl weiterer Methoden um N-substituierte Amide zu synthetisieren.
Diese verlaufen immer über eine freie Carboxylfunktion. Deshalb erfolgte zunächst die
Synthetischer Teil 19
Monoverseifung der Alkylmalonsäureester 3a-c zu den Monoestern 4a,b. Die Hydrierung von 3b an Pd/C 5% gelang in einem Schritt und erfolgte nahezu quantitativ. Bei den alkalischen Verseifungsreaktionen musste in einem zweiten Schritt die Säure aus ihren Salzen
freigesetzt werden. Dies erfolgte unter Eiskühlung mit verdünnter Salzsäure.
3b 3c
4a 4b
O
O
O
OH33C16
O
O
O
OH33C16
H2Pd/C 5%EtAc
1. KOH/H2O2. HCl/H2O
O
O
OH
OH33C16
O
O
O
OHH33C16
3a
4a
O
O
O
OH33C16
1. BaOH/H2O2. HCl/H2O
1. KOH/H2O2. HCl/H2O
Ausbeute 40% Ausbeute 90%O
O
OH
OH33C16
Abb. 12: Verseifungsreaktion unterschiedlicher Alkylmalonester.
Bei der Hydrolyse von Malonsäureestern ist die erste Estergruppe nach Breslow51 leichter
hydrolysierbar als die zweite. Um daher auch aus dem Diethylester 3a den entsprechende Halbester 4a zu erhalten, wurde auf eine in der Literatur beschriebene Methode zurückgegriffen, bei welcher der Dimethylester mit der für eine Halbverseifung berechneten
Menge Bariumhydroxid umgesetzt wird52. Bei der Verwendung von Kaliumhydroxid anstelle
von Bariumhydroxid konnten die Ausbeuten um einiges gesteigert werden, so dass dieses
Verfahren auch aufgrund seiner sehr einfachen Durchführung zur Methode der Wahl bei der
Darstellung von Halbestern wurde. Auch Verbindung 3c konnte unter Erhalt der Tertiärbutylesterstruktur mit Kaliumhydroxid verseift werden. Die Kaliumsalze ließen sich gut
absaugen und somit von nicht umgesetzten Diestern abtrennen. Das Waschen des
Rückstandes mit Ether lieferte diesterfreie Produkte. Der in der Mutter- bzw. Waschlauge
enthaltene Diester konnte erneut eingesetzt werden. Nach dem Ansäuern des Kaliumsalz-
Niederschlages und Extrahieren mit Ether befanden sich lediglich die Halbester 4a,b in Lösung. Nach dem Einengen und der Umkristallisation aus Heptan wurden die Halbester
DC-rein erhalten. Destillation und aufwendiges Chromatographieren entfielen somit.
Auf direktem Wege ließen sich die freigesetzten Säuren 4a,b nicht mit langkettigen Aminen 7a,b umsetzen, weil hierbei die erwartete Salzbildung einsetzte. Außerdem ist die Carbonylaktivität der Carbonsäuren nur sehr gering.
Synthetischer Teil 20
O
O
H33C16OH
O R1
O
O
H33C16Cl
O R1
O
O
H33C16N
O
R2H
R1
SOCl2
7a/7b/TEACHCl3
DCCCCl4
O
O O
C16H33C16H33
OO
OO R1R1
7a/7bCCl4
O
O
H33C16N
O
R2H
R1
EEDQ, 7a/7bEtOH
O
O
H33C16N
O
R2H
R1
4a,b
5 6a,b 8a,b,c,d
8a,b 8a,b,c,d
O
O
H33C16OH
O R1
O
O
H33C16OH
O R1
4a,b4a
O
O
H33C16N
OH
R2H
9a,b
8a,b: 1. KOH/EtOH 2. HCl/H2O
8c,d: H2SO4, EtOH
8a,b: 1. KOH/EtOH 2. HCl/H2O
8a,b: 1. KOH/EtOH 2. HCl/H2O
8c,d: H2SO4, EtOH
O
O
H33C16N
OH
R2H O
O
H33C16N
OH
R2H
9a,b 9a,b
4a R1= CH3CH24b R1= (CH3)3C
5 R1= CH3CH2 6a R1= CH3CH2
6b R1= (CH3)3C 7a = C16H33NH27b = C8H17-CH=CH-C8H16NH2
8a R1= CH3CH2, R2= C16H33
8b R1= CH3CH2, R2= C8H16-CH=CH-C8H17
8c R1= (CH3)3C, R2= C16H33
8d R1= (CH3)3C, R2= C8H16-CH=CH-C8H17
9a R2= C16H339b R2= C8H16-CH=CH-C8H17
Abb. 13: Kupplungsreaktionen der Carbonsäuren zum Amid.
Nach der Säurechlorid-Methode wurde der Malonsäuremonoethylester 4a zunächst in das reaktive Säurechlorid 5 überführt, und dieses dann mit Hexadecylamin 7a oder Oleylamin 7b umgesetzt. Die Darstellung von 5 aus den Halbestern erfolgte durch Umsetzung mit Thionylchlorid und bereitete keine Schwierigkeiten. Die Aminolyse der Acylhalogenide wurde
unter Eiskühlung und Zusatz von Triethylamin als säurebindendem Mittel durchgeführt. Das
entstandene Amid 8a fiel aus und konnte abgesaugt werden. Um von ebenfalls entstandenem Triethylaminhydrochlorid abzutrennen, wurde der Rückstand mehrmals mit
Synthetischer Teil 21
Wasser gewaschen, dann im Exsikkator getrocknet und aus Aceton umkristallisiert. Im
Gegensatz dazu konnte das wesentlich besser lösliche Produkt 8b aus der Umsetzung mit Oleylamin 7b nicht umkristallisiert werden, so dass eine säulenchromatographische Aufreinigung erforderlich war. Für die weiteren Umsetzungen sollte sich die höhere Fluidität
dieser Verbindung jedoch als sehr vorteilhaft erweisen. Neben der Darstellung der Amide
über die entsprechenden Säurechloride kam auch das energiereiche Säureanhydrid 6 unter Verwendung der Carbodiimid-Methode zum Einsatz. Hierbei erfolgte die Überführung der
Säure in sein Anhydrid mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) unter Abspaltung von N,N´-
Dicyclohexylharnstoff53. Bei der Verwendung von Tetrachlormethan als Lösungsmittel konnte
dieser durch einfaches Abfiltrieren leicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Das in
Lösung vorliegende Anhydrid wurde bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden Amin
versetzt und, um die Ausbeute zu verbessern, mit weiterem DCC versetzt. Nach einer
Reaktionszeit von etwa 5 Stunden war die Bildung des Amides praktisch abgeschlossen.
Auch bei dieser Reaktion erhielt man das Produkt nahezu DC-rein und es konnte durch
einfache Umkristallisation oder Chromatographie weiter aufgereinigt werden. Als weitere
recht interessante Möglichkeit wurde ein Kupplungsreagenz verwendet, welches bei der
Knüpfung von Peptidbindungen Anwendung findet. Die Pseudobase EEDQ erlaubt es,
Aminosäuren in einem Schritt mit hohen Ausbeuten und ohne Racemisierung miteinander zu
kuppeln54,55. Mit großem Erfolg konnte dieses Reagenz auch bei den dargestellten Amiden
verwendet werden. Eine Suspension aus Halbester, Amin und Reagens in abs. Ethanol
wurde für 24 Stunden bei 50 °C gerührt. Wiederum konnte das Produkt, nach Aufarbeitung,
zur Aufreinigung aus Aceton umkristallisiert oder chromatographiert werden. Es gelang
weiterhin die Halbester 4a,b mit den entsprechenden Aminen sowohl nach der Carbodiimid-Methode als auch unter Verwendung von EEDQ zum Amid umzusetzen.
Mit den vorgestellten Methoden wurden die gewünschten Produkte in guter Ausbeute und
Reinheit erhalten. Die Synthesen ließen sich mit geringem präparativen Aufwand
durchführen, wobei die Umsetzung mit EEDQ als Einstufenreaktion durchgeführt werden
konnte. In einem weiteren Schritt wurde die am Molekül verbliebene Esterstruktur zu den
Carbonsäuren 9a,b hydrolisiert. Dies erfolgte im Fall der Ethylester 8a,b im stark alkalischen Milieu durch Kaliumhydroxid. Die freien Carbonsäuren 9a,b wurden aus dem entstandenen Kaliumsalz durch Zusatz der äquivalenten Menge Salzsäure freigesetzt. Die Hydrolyse des
Tertiärbutylesters erfolgte unter Verwendung von verdünnter Schwefelsäure. In beiden
Fällen und sowohl bei der Verbindung mit der gesättigten 9a, als auch der ungesättigten 9b Kette konnte das Rohprodukt aus Heptan umkristallisiert werden. Dies stellte eine sehr
effiziente Methode der Reinigung dar. Die weiter herabgesetzte Löslichkeit der Verbindung
mit der gesättigten Kette 9a erwies sich für weitere Umsetzungen jedoch als erschwerend.
Synthetischer Teil 22
6.4. Malonsäurediamide Die erhaltene, freie Carboxylfunktion wurde in einem letzten Schritt mit unterschiedlich
strukturierten Aminen zum Amid gekuppelt. Die Amine sollten nach Möglichkeit, unter
Umgehung einer eventuell auftretenden Schutzgruppenproblematik, direkt mit der Säure
umgesetzt werden. Es wurden die Amine 14a-c als hydrophiler Bestandteil der Lipide ausgewählt. In Erwartung ähnlicher Erfolge wurden die schon angewandten Methoden zur
Amidknüpfung genutzt. Leider blieben die Ergebnisse weit hinter den Erwartungen zurück.
Lediglich die Carbodiimid-Methode erwies sich in modifizierter Variante als hinreichend
sinnvoll. Im Gegensatz zu der oben beschriebenen herkömmlichen Überführung der Säure in
ihre Anhydride mit DCC erfolgte nun die Aktivierung mit N-Hydroxysuccinimid/DCC und
anschließender Umsetzung mit Amin56, wie sie auch schon Schmidt57 erfolgreich genutzt hat.
Eine mögliche, direkte Aminolyse des ursprünglichen Ethylesters führte auch bei hohen
Temperaturen in keinem Fall zum gewünschten Umsatz. Die Überführung der Carbonsäuren
in die entsprechenden Säurechloride durch Thionychlorid konnte aufgrund der starken
Zersetzungserscheinungen des Malonsäuremonoamides keine Verwendung finden. Selbst
das bisher mit einigem Erfolg eingesetzte Kupplungsreagenz EEDQ führte nur zu sehr
geringen Umsetzungen. Da die Malonsäurediamide 15a-f aber die vorerst letzte Stufe dieser Synthesestrategie sein sollten, wurden weitere Untersuchungen zur Amidknüpfung
durchgeführt. Die sogenannte Azolid-Methode58,59,60 stellte sich als eine sehr
vielversprechende Möglichkeit heraus. Bei der Umsetzung der Carbonsäure 9a,b mit der äquimolaren Menge N,N´-Carbonyldiimidazol bei Raumtemperatur in Tetrahydrofuran bildete
sich intermediär ein energiereiches Säureimidazolid 11a,b, das mit dem entsprechenden Amin leicht zu dem betreffenden Amid reagierte. Nach Aufarbeitung und
säulenchromatographischer Aufreinigung wurde das finale Produkt in moderaten Ausbeuten
erhalten. Dies war Grund genug, weitere Kupplungsreagenzien zu testen. BOP stellte ein
weiteres aus der Peptidsynthese sehr bekanntes Reagens dar61,62. Die Carbonsäure
reagierte mit BOP unter Bildung eines sehr reaktiven Phosphoniumsalzes 12a,b, welches unter den gegebenen Bedingungen zu einem Benzotriazolylester weiterreagierte. Die Amine
waren nukleophil genug um sowohl mit dem Zwischenprodukt, als auch dem weniger
reaktiven Benzotriazolylester 13a,b unter Ausbildung einer Amidbindung zu reagieren63. Bei Raumtemperatur wurden zu einer Lösung der Säure, des entsprechenden Amins und BOP in
Methylenchlorid einige Tropfen Triethylamin als Hilfsbase hinzugefügt. Die Reaktion setzte
praktisch sofort ein und war dünnschichtchromatographisch verfolgt, nach 4 Stunden
abgeschlossen. Im Falle der gesättigten Malonsäurediamide 15a-c konnte das erhaltene Rohprodukt durch Umkristallisation aus Heptan gereinigt werden.
Synthetischer Teil 23
NNH2
H2N NH2H2N N
NH2
NH214a 14b 14c
10a, 11a, 12a, 13a R1= C16H3310b, 11b, 12b, 13b R1= C8H16-CH=CH-C8H17
15a R1= C16H33, R2= (CH3)2N(CH2)2NH
15b R1= C16H33, R2= H2N(CH2)2NH
15c R1= C16H33, R2= [H2N(CH2)2]2N(CH2)2NH
15d R1= C8H16-CH=CH-C8H17, R2= (CH3)2N(CH2)2NH
15e R1= C8H16-CH=CH-C8H17, R2= H2N(CH2)2NH
15f R1= C8H16-CH=CH-C8H17, R2= [H2N(CH2)2]2N(CH2)2NH
H33C16
O
O
N
OH
HR1
9a,b
10a,b 11a,b 13a,b
14a/14b/14c
15a-f 15a-f15a-f
DCCN-HydroxysuccinimidCH2Cl2
R1N
H
O
C16H33
O
N
O
O
14a/14b/14c
R1N
H
O
C16H33
O
R2
CarbonyldiimidazolTHF
R1N
H
O
C16H33
O
N
N
14a/14b/14c
R1N
H
O
C16H33
O
R2
BOPTHF
R1N
H
O
C16H33
O
NN
N
R1N
H
O
C16H33
O
R2
12a,b
R1N
H
O
C16H33
O
O PN
N
N
Abb. 14: Darstellung der Malonsäurediamide.
Die Reaktionsbedingungen waren sehr mild, die Reaktionsführung war denkbar einfach und
auch die Aufreinigung der in guten Ausbeuten erhaltenen Produkte erwies sich in den
meisten Fällen als einfach und schnell. Die Malonsäurediamide 15a-f standen nun als Substanzen für die Gentransfektion zur Verfügung.
Synthetischer Teil 24
7. Darstellung von Gemini-Lipiden als Transfektionslipide
7.1. Gemini-Lipide Gemini-Lipide stellen eine relativ junge Klasse von Verbindungen dar64. Es handelt sich
hierbei um amphiphile Moleküle mit zwei hydrophilen Kopfgruppen und zwei lipophilen
aliphatischen Ketten, die durch einen starren65,66,67 oder flexiblen68,69,70 Spacer
(Abstandshalter) miteinander verbunden sind.
polare Kopfgruppe
polare Kopfgruppe
Spacer Lipophiler Bereich
Abb. 15: Allgemeiner Aufbau von Gemini Lipiden.
Das Gemini-Design erlaubt es, durch unterschiedliche Synthesestrategien, einen sehr
großen Pool an Verbindungen darzustellen71,72,73,74. Dies sollte intensive Untersuchungen zur
Strukturaktivität ermöglichen75,76,77,78. Der zentrale Spacer kann von jedem beliebigen System
mit zweifacher Symmetrie abgeleitet werden, oder selbst durch Verknüpfung zweier
ausgesuchter Moleküle synthetisiert werden79. Im Gegensatz zu den entsprechenden monovalenten Substanzen verfügen Gemini-Lipide über eine wesentlich höhere
Oberflächenaktivität, die nicht nur der Verdopplung der Eigenschaften „normaler“ amphiphiler
Moleküle entspricht80. Dies macht diese Verbindungsklasse für naturwissenschaftliche
Anwendungen besonders interessant. Ihre Verwendung auf dem Gebiet der Gentransfektion
sollte Fortschritte in Effizienz und Handhabung erbringen81. Aus diesem Grund wurden neue
Substanzen synthetisiert82, die das Spektrum der schon bekannten Verbindungen erweitern.
Um eventuelle Toxizitätsprobleme zu minimieren, basierten die dargestellten Verbindungen
auf natürlich vorkommenden Untereinheiten, so dass sie nach Möglichkeit biologisch
abbaubar sein sollten.
7.2. Gemini-Lipide ausgehend von alkylierten Malonsäureestern Aufgrund der vorliegenden Erfahrung dienten als Ausgangsverbindungen wiederum die
homogenen und gemischten Ester der Malonsäure. Diese wurden einer Alkylierungsreaktion
mit langkettigen Alkylhalogeniden unterworfen.
Synthetischer Teil 25
Im Anschluss daran wurden die Monoalkyl-β-dicarbonylverbindungen 3b,c über Spacer durch eine Bisalkylierungsreaktion miteinander verknüpft. Bei den Alkylierungsreagenzien
handelte es sich um die unterschiedlichen Dihalogenide 16a,b,c.
3c 16a/16b/16c 17a,b,c
O O
C16H33
O
OH +
O OO
OR1
H31C15
O O
O
O
C15H31
I R1 I
NaHTBAITHF
3b 16a 17d
O O
C16H33
O
OH +
O OO
OR1
O OO
OC15H31H31C15
I R1 I
NaHTBAI
THF
16a R1= (CH2)416b R1= CH2(C6H4)CH216c R1= (CH2)2O(CH2)2
17a R1= (CH2)417b R1= CH2(C6H4)CH217c R1= (CH2)2O(CH2)217d R1= (CH2)4
Abb. 16: Verknüpfung von alkylierten Malonsäurederivaten.
Generell war damit zu rechnen, dass diese Reaktion nur unvollständig erfolgt, da die Acidität
der Monoalkyl-β-dicarbonylverbindungen geringer ist, als die der unsubstituierten
Grundkörper. Außerdem ist bekannt, dass die Reaktionsfähigkeit der Alkylierungsreagenzien
mit sinkender Bindungsstärke des Halogenatoms abnimmt49. Da Iod im Vergleich zu Brom
die bessere Abgangsgruppe bei C-Alkylierungsreaktionen darstellt, wurden die
entsprechenden Bis-Iodide verwendet. Die für das Gemini-Design erforderliche Verknüpfung
sollte nach Möglichkeit in einer Stufe durchgeführt werden. Um den Anteil an nicht
verbrückten Nebenprodukten möglichst gering zu halten, wurde deshalb der alkylierte
Malonester im molaren Verhältnis zwei zu eins mit den entsprechenden Dihalogeniden
bisalkyliert. Die Überführung der β-Dicarbonylverbindungen in ihre Salze erfolgte
üblicherweise mit Natriumhydrid oder Kalium-tert.butylat in absolutem Tetrahydrofuran. Wie
erwartet, erfolgte die Bildung der Produkte nur sehr langsam, so dass Reaktionszeiten von
bis zu 20 Stunden in Kauf genommen werden mussten. Möglicherweise führte dies im Fall
der gemischten Ester zu der schon bekannten Umesterung. Neben nicht verbrückten
Substanzen wurden bei den Produkten mit Benzylesterstrukturen 17d alle theoretisch
Synthetischer Teil 26
möglichen Umesterungsvarianten erhalten. Dies konnte durch massenspektroskopische
Untersuchungen belegt werden. Weitere Untersuchungen hinsichtlich
Deprotonierungsreagenz, Lösungsmittel und Alkylierungsmittel bestätigten die Tendenz zur
Umesterung und führten zu keinem einheitlichen Produkt. Eine Zweitalkylierung von
Malonsäurebenzylethylester 3b war aus diesem Grund nicht realisierbar. Interessanterweise ließ sich der alkylierte Malonsäure-tert.butylethylester 3c relativ glatt bisalkylieren. Es erfolgten auch Umesterungsreaktionen welche jedoch vermieden werden konnten, wenn die
Aufarbeitung des Reaktionsansatzes unmittelbar nach der etwa zehnstündigen Reaktionszeit
erfolgte. Dies führte zu einem höheren Anteil an Monoalkylierungsprodukt, das jedoch relativ
einfach säulenchromatographisch abgetrennt und für weitere Reaktionen eingesetzt werden
konnte. Ohne Probleme ließ sich der Malonsäurediethylester 3a zu den entsprechenden Geministrukturen umsetzen.
3a 16a
17e
1819
H
C16H33
OO
O
O+ I (CH2)4 I
NaHTBAITHF
(CH2)4
OO
O
O
O OO
OC15H31H31C15
1. KOH/H2O2. HCl/H2O
(CH2)4
HOHO
O
O
O OHOH
OC15H31H31C15
150-200 °C-CO2H33C16
HOO
(CH2)4C16H33
OHO
H33C16
ClO
(CH2)4C16H33
ClO
20
SOCl2
14b/TEACHCl3 H33C16
NO
(CH2)4C16H33
NOH2N N 2
H H
H
21
Abb. 17: Darstellung von Dihexadecyloctandiamid.
Eine selektive Hydrolyse konnte bei ihm jedoch nicht durchgeführt werden. Deshalb wurden
in einer Reaktion alle vorhandenen Esterstrukturen verseift. Die vollständige Hydrolyse
erfolgte nur sehr schwer. Sie erforderte lange Reaktionszeiten, hohe Temperaturen und stark
alkalische Reaktionsbedingungen. Die Tetracarbonsäure 18 wurde aus dem entstandenen Kaliumsalz durch Zugabe von Salzsäure freigesetzt und aus Heptan umkristallisiert.
Weiterhin wurden diese Verbindungen trocken und bei hohen Temperaturen decarboxyliert,
Synthetischer Teil 27
so dass die nahezu DC-reine Dicarbonsäure 19 zurückblieb. Der Mechanismus der Decarboxylierung wird im Kapitel 8 näher erläutert.
Bei den gemischten Estern 17a,b,c konnte eine selektive Hydrolyse durchgeführt werden. Die Tertiärbutylester blieben unter den alkalischen Bedingungen der Verseifung stabil. Die
Carbonsäuren 22a,b ließen sich durch vorsichtige Zugabe von verdünnter Schwefelsäure aus ihren Salzen freisetzen.
17a,b
O OO
OR1
H31C15
O O
O
O
C15H31
1. KOH/H2O2. H2SO4
O OHO
OR1
H31C15
O O
O
OH
C15H31
22a,b
BOP14aTHF
O OR2
OR1
H31C15
O O
O
R2
C15H3123
22a R1= (CH2)4 (wurde nicht mit 14a umgesetzt)22b R1= CH2(C6H4)CH2
23 R1= CH2(C6H4)CH2, R2= (CH3)2N(CH2)2NH
Abb. 18: Darstellung der Amide.
Als potentielle DNA-Bindungsstellen sollten in einem weiteren Schritt unterschiedliche Amine
eingeführt werden. Bei der Dicarbonsäure 19 gelang dies recht einfach nach der Säurechlorid-Methode. Bei dem gemischten Ester 22b wurden die bekannten Kupplungsreagenzien zur Knüpfung von Amidbindungen verwendet. Aufgrund der sterischen
Hinderung durch die Tertiärbutylesterstrukturen gelangen die Umsetzungen jedoch nur
schlecht und erfordern für die Zukunft weitere Untersuchungen. Polyamine ohne
Schutzgruppen ließen sich gar nicht einführen. Laut Massenspektrum wurden die
gewünschten Produkte erhalten, aufgrund der geringen Unterschiede der Rf-Werte war eine
säulenchromatographische Auftrennung jedoch nicht möglich. So konnten die Verbindungen
lediglich mit einem Amin erfolgreich umgesetzt werden, wenn auch nur mit geringen
Ausbeuten.
Synthetischer Teil 28
8. Darstellung von α-verzweigten Säureamiden als Transfektionslipide
8.1. α-Verzweigte Carbonsäuren
Eine sehr einfache Methode zur Darstellung der hydrophoben Einheit von
Transfektionslipiden führte über langkettig α-verzweigte Carbonsäuren. In Analogie zu bereits publizierten Arbeiten83,84,85 wurde die Einführung von Alkylverzweigungen
unterschiedlicher Kettenlänge in die 2-Position langkettiger Carbonsäuren über eine
Zweitalkylierung der entsprechenden Monoalkylmalonester 3a,d,e durchgeführt. Die Einführung von Alkylsubstituenten in die 2-Position von Carbonsäuren über die
entsprechenden Dianionen ist ebenfalls beschrieben worden86. Aufgrund der gesammelten
Erfahrungen in der Arbeitsgruppe, wurde die Methode über eine Zweitalkylierung
favorisiert87. Die Hexadecylmalonsäurediethylester sind durch Monoalkylierung von
Malonsäurediethylester sowie durch Kondensation von Carbonsäureestern und
Oxalsäureestern zugänglich88,89. Wie in der Literatur90,91,92 beschrieben, entstanden bei der
Monoalkylierung der Malonsäurediethylester auch Dialkylmalonsäurediethylester als
Nebenprodukte, deren Bildung sich nicht unterdrücken lässt. Deshalb wurden die
langkettigen Alkylmalonester im Anschluss an die Alkylierung destilliert, um sie in
ausreichender Reinheit zu erhalten. Da die Acidität der synthetisierten Monoalkyl-β-
dicarbonylverbindungen geringer ist, als die der unsubstituierten Grundkörper und die
Dialkyl-β-dicarbonylprodukte unter den allgemeinen Bedingungen der Alkylierungsreaktion
(alkoholisches Alkalialkoholat) leicht solvolytisch zu spalten sind93, mussten definierte
Reaktionsbedingungen für die Zweitalkylierung eingehalten werden. Auch die Ausbeuten
waren in hohem Maße vom Lösungsmittel, dem Deprotonierungsreagenz und dem
Alkylierungsmittel abhängig. Aus diesem Grund wurden Toluol bzw. Xylol als Lösungsmittel
mit hohen Siedepunkten verwendet. Die Deprotonierung der Alkylmalonsäurediethylester
erfolgte mit Natriumhydrid. Eine Alkylierungszeit von 12-16 Stunden erwies sich als optimal.
Die nach der Aufarbeitung erhaltenen rohen Dialkylmalonester 24a,b,c wurden nicht destillativ gereinigt, sondern gleich durch alkalische Hydrolyse mit Kaliumhydroxid verseift.
Die Freisetzung der Dicarbonsäuren 25a,b,c aus ihren Salzen erfolgte durch Salzsäure in wässriger Suspension. Durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln wurden die
Dialkylmalonsäuren DC-rein erhalten und anschließend zu den verzweigten
Monocarbonsäuren 26a,b,c decarboxyliert. Die Abspaltung von Kohlendioxid erfolgte zwischen 150-200 °C. Die Decarboxylierung ließ sich durch Säuren und schwache Basen
katalytisch beschleunigen. Diese Reaktion verläuft ähnlich dem cyclischen Mechanismus,
Synthetischer Teil 29
wie er bei den Esterpyrolysen formuliert ist. Es handelt sich dabei um die pyrolytische
Bildung eines Olefins, das aber in diesem Fall ein Enol ist und sofort in die energieärmere
Ketoform übergeht. Dünnschichtchromatographisch nachweisbare unverzweigte Säuren
konnten durch KOH-Extraktion leicht entfernt werden. Wiederum konnten die Rohprodukte
durch einfaches Umkristallisieren gereinigt werden.
H
H
OO
OO
R1
H
OO
OO
2a/2c/2dNaHTBAIXylol
R1
R1
OO
OO
1. KOH/EtOH2. HCl/H2O
R1
R1
OOH
OHO
R1
R1 OH
O150-200 °C
-CO2
2a/2c/2dNaHTBAIToluol
1a 3a,d,e 24a,b,c
25a,b,c26a,b,c
2a C16H33Br2c C14H29Br2d C18H37Br
3a R1= C16H333d R1= C14H293e R1= C18H37
24a R1= C14H2924b R1= C16H3324c R1= C18H37
25a R1= C14H2925b R1= C16H3325c R1= C18H37
26a R1= C14H2926b R1= C16H3326c R1= C18H37
Abb. 19: Darstellung der α-verzweigten Carbonsäuren.
8.2. α-Verzweigte Säureamide
R1
R1 OH
O
26a,b,c
26a R1= C14H2926b R1= C16H3326c R1= C18H37
SOCl2 R1
R1 Cl
O
27a,b,c
14a/14b/14c/14d/TEACHCl3
R1
R1 R2
O
28a,b,c,d,e,f
27a R1= C14H2927b R1= C16H3327c R1= C18H37
14a NNH2
14b H2N NH2
14c H2N NNH2
NH2
14d H2N NH228a R1= C14H29, R
2= (CH)2N(CH2)2NH28b R1= C14H29, R
2= H2N(CH2)2NH28c R1= C14H29, R
2= [H2N(CH2)2]2N(CH2)2NH28d R1= C14H29, R
2= H2N(CH2)4NH28e R1= C16H33, R
2= H2N(CH2)2NH28f R1= C14H33, R
2= H2N(CH2)4NH
Abb. 20: Darstellung der α-verzweigten Säureamide.
Synthetischer Teil 30
Um Amine als Kopfgruppen einzuführen, wurde auf die bewährte Kupplung zu Amiden
zurückgegriffen. Die α-verzweigten Säuren ließen sich durch einen Überschuss an
Thionylchlorid in die entsprechend reaktiven Säurechloride überführen. Die anschließende
Aminolyse war mit guten Ausbeuten verbunden. Die entstandenen Amide 28a-f konnten aufgrund ihrer kristallinen Eigenschaften aus Heptan umkristallisiert werden.
8.3. α-Verzweigte Säurediamide Die Verwendung der Diamine 14b,d als Spacer ermöglichte es, die Synthesestrategie erheblich zu erweitern. Es bot sich an, die freie Aminfunktion für weitere Umsetzungen zu
nutzen. Unter Verwendung einer Kombination aus DCC und 1-Hydroxybenzotriazol wurden
unterschiedliche geschützte Aminosäuren 29a-h gekuppelt94. Als Schutzgruppen eigneten sich die Benzyloxycarbonyl- und tert.-Butyloxycarbonyl-Reste sehr gut. Bei der
Benzyloxycarbonyl-Methode benutzt man als schützende Gruppe am Stickstoff den
Benzyloxycarbonyl-Rest (früher als Carbobenzoxy-Rest (Cbo- oder Z-Rest) bezeichnet48).
Zunehmende Bedeutung erlangt weiterhin der tert.-Butyloxycarbonyl-Rest (BOC-Rest) als
Schutzgruppe am Stickstoff. Im Fall der Aminosäure Lysin 29d wurden die N-Schutzgruppen durch Umsetzen mit Di-tert.butyldicarbonat erhalten95.
Nach erfolgter Amidbildung 30a-j ließ sich der Cbo-Rest durch katalytische Hydrierung leicht wieder abspalten, wobei Toluol, Kohlendioxid und das gewünschte Produkt entstanden. Der
tert.-Butyloxycarbonyl-Rest zeichnet sich dadurch aus, dass er mit starken Säuren
abgespalten werden kann. Die erhaltenen Produkte 31a-j mussten jedoch durch chromatographische Operationen aufgereinigt werden und ließen sich nicht umkristallisieren.
Das vorgestellte synthetische Schema ermöglichte es, auf einfachem Wege Lipide mit
unterschiedlichen Kopfgruppen, Spacer oder Kettenlänge zu synthetisieren.
HON O
O H
OZ-Gly-OH 29a
HON O
O H
O
Boc-Leu-OH 29b
DCCHOBTCH2Cl2
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Z-Gly)
30a
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Boc-Leu)DCCHOBTCH2Cl2
30b
+N
O
H27C13
H27C13H
NH2
28b
Abb. 21: Darstellung der α-verzweigten Säurediamide I.
Synthetischer Teil 31
NNH2
O
H31C15
H31C15H
N
O
H27C13
H27C13H
NH2
Boc-Gly-OH 29f
HON O
O H
O
N
O
H31C15
H31C15H
NH2
HON O
O H
O
S
Boc-Meth-OH 29c
HON O
O
O
H
N
H
O
O
Boc-Lys(Boc)-OH 29d
HON O
O
O
H
N
H
O
O
Z-Lys(Z)-OH 29e
Boc-Gly-OH 29f
HON O
O H
O
HO
ON
O O
Boc-Pro-OH 29g
HON O
O H
O
Boc-Gly-OH 29f
HON O
O
HOO
H
Boc-Thr-OH 29h
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Boc-Meth)
30c
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Boc-Lys(Boc))
DCCHOBTCH2Cl2
DCCHOBTCH2Cl2
30d
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Z-Lys(Z))DCCHOBTCH2Cl2
30e
DCCHOBTCH2Cl2
NN
O
H31C15
H31C15H
(Boc-Gly)
H
30f
NN
O
H31C15
H31C15H
(Boc-Pro)
HDCCHOBTCH2Cl2
30g
N
O
H27C13
H27C13H
N(Boc-Gly)
HDCCHOBTCH2Cl2
DCCHOBTCH2Cl2
30h
N
O
H27C13
H27C13H
N(Boc-Thr)
H
30i
DCCHOBTCH2Cl2
N
O
H31C15
H31C15H
N
H
(Boc-Gly)
30j
+
+
+
28d
28e
28f
N
O
H27C13
H27C13H
NH2
28b+
Abb. 21b: Darstellung der α-verzweigten Säurediamide II.
Synthetischer Teil 32
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Boc-Lys(Boc))
30d
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Z-Lys(Z))
30e
NN
O
H31C15
H31C15H
(Boc-Gly)
H
30f
NN
O
H31C15
H31C15H
(Boc-Pro)
H
30g
N
O
H27C13
H27C13H
N(Boc-Gly)
H
30h
N
O
H27C13
H27C13H
N(Boc-Thr)
H
30i
N
O
H31C15
H31C15H
N
H
(Boc-Gly)
30j
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Z-Gly)
30a
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Boc-Leu)
30b
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
(Boc-Meth)
30c
H2, Pd/C
H2, Pd/C
HCl
HCl
HCl
HCl
HCl
HCl
HCl
HCl
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
O
NH2
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
O
NH2
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
O
NH2
S
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
O
NH2
NH2
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
O
NH2
NH2
NN
O
H31C15
H31C15H
H
O
NH2
NN
O
H31C15
H31C15H
H
O
HN
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
O
NH2
N
O
H27C13
H27C13H
N
H
ONH2
OH
N
O
H31C15
H31C15H
N
H
O
NH2
31a
31b
31c
31d
31e
31f
31g
31h
31i
31j
*HCl
*HCl
*HCl
*HCl
*HCl
*HCl
*HCl
*HCl
Abb. 22: Abspaltung der Schutzgruppen.
Synthetischer Teil 33
9. Darstellung hydrophober TRIS-Derivate als Transfektionslipide
9.1. Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS)
Als weiteres zentrales Grundgerüst kam im Rahmen dieser Arbeit
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) 33 zur Anwendung. TRIS wird in vielen naturwissenschaftlichen Bereichen als Puffersubstanz verwendet. Als dreiwertiger Alkohol
hat es strukturelle Ähnlichkeiten mit Glycerol 32.
OH
OH
OH H2N
OH
OH
OH
32 33
Abb. 23: Ähnlichkeiten zwischen Glycerol und TRIS.
Aufgrund seiner Eigenschaften wird TRIS darüber hinaus als Grundbaustein komplexer
Moleküle verwendet. Es dient zum Beispiel als Zentralbaustein für Fettsäurekonjugate96,97,98
oder Cluster Galactoside99. Die Hydroxylgruppen können acyliert oder alkyliert werden.
Durch die Äquivalenz der drei Hydroxylfunktionen kommt es bei der Synthese nicht zu der
Bildung von Strukturisomeren. Im Gegensatz dazu sind die Hydroxylfunktionen beim
Glycerol nicht äquivalent. Es können unterschiedlich alkylierte bzw. acylierte TRIS-
Verbindungen dargestellt werden, die über eine weitere funktionelle Gruppe verfügen. Auch
dies ist beim Glycerol nicht möglich. Zusätzlich stellt die Aminofunktion eine ideale Struktur
zur Knüpfung komplexer Moleküle dar 100,101.
N
OR1
OR2
OR3
XY
Abb. 24: Mögliche Strukturvariationen von TRIS.
TRIS ist einfach zu beziehen, kostengünstig, untoxisch und hat den Vorteil der großen
Akzeptanz in der pharmazeutischen Industrie.
Synthetischer Teil 34
9.2. Hydrophobe TRIS-Derivate Zur Darstellung von hydrophoben Verbindungen sollten langkettige Alkyl- bzw. Acylderivate
in das TRIS-Gerüst eingeführt werden. Im ersten Schritt musste die Aminofunktion vor einem
möglichen Angriff bei den folgenden Syntheseoperationen geschützt werden. TRIS wurde
mit N-(Benzyloxycarbonyl)glycin 29a unter Verwendung von EEDQ zum Glycinamidderivat 34 umgesetzt102. EEDQ wurde als Kupplungsreagenz eingesetzt, weil bereits Erfahrungen aus vorhergehenden Untersuchungen bestanden und sich der Reaktionsansatz sehr einfach
aufarbeiten ließ. Das Rohprodukt konnte mit Ether gefällt werden und ließ sich aus Methanol
umkristallisieren. Bei der weiteren Umsetzung von N-geschütztem TRIS mit langkettigen
Alkylbromiden wurden neben Mono- auch Bis- und Trisalkylierungen festgestellt, die sich
durch Chromatographie nicht trennen ließen. Dies wurde durch die Zunahme der
hydrophoben Eigenschaften der Zwischenprodukte während der Reaktion plausibel und
konnte auch schon von Adhikari100 beobachtet werden. Aus diesem Grund wurde die
Einführung weiterer Schutzgruppen erforderlich. Zur Blockierung von zwei
Hydroxylfunktionen ließ sich die aus der Glycerolchemie bekannte Ketalisierung nutzen103.
1895 führte E. Fischer die Kondensation von Aceton mit cis-Diolen in die
Kohlenhydratchemie ein. Im alkalischen Medium, wie es etwa bei Alkylierungsreaktionen der
Fall ist, sind Ketale beständig.
3329a 34
3537
O NOH
O
H O
H2N
OH
OH
OH
+O N
N
O
H O OH
OH
OHH
EEDQEtOH
AcetonCuSO4p-TsOH
O NN
O
H O O
OH
O
CH3CH3
H
O NN
O
H O O
O
CH3CH3
HO tert.-Butanol
36 BrKOtBu
TBAI
Abb. 25: Darstellung des Glycinamid-Derivates.
Unter Verwendung von p-Toluolsulfonsäure als Katalysatorsäure und einem Wasser
entziehenden Mittel wurde das TRIS-Derivat 34 in absolutem Aceton zum Ketal 35 umgesetzt104. Das Rohprodukt konnte wiederum mit Ether gefällt und aus Petrolether
umkristallisiert werden. Das gewünschte Zwischenprodukt 35 wurde jedoch nur mit
Synthetischer Teil 35
schlechten Ausbeuten erhalten. Für eine Mono-O-Alkylierung wurde es in tert.-Butanol
suspendiert und in Gegenwart von Kalium-tert.butylat umgesetzt. Es kam spontan zur
Salzbildung. Die Alkylierungsreaktion war nach 4-6 Stunden unter Verwendung von
Tetrabutylammoniumiodid als Katalysator abgeschlossen. Es erschien daher unverständlich,
weshalb das Produkt auch diesmal nur in sehr geringen Ausbeuten erhalten wurde. Auch
wiederholte Versuche führten nicht zum gewünschten Erfolg. Möglicherweise wurde die im
Molekül vorliegende Ketalstruktur unter den Reaktionsbedingungen durch tert.-Butanol
gespalten, da sich Fragmente der ursprünglichen Ausgangsverbindungen detektieren ließen.
Auch die Variation von Lösungsmittel und Deprotonierungsreagenz, die bei den
Malonsäurederivaten bereits zum Erfolg führte, blieb ergebnislos. Auch wenn die
beschriebene Synthesestrategie aussichtsreich erschien, musste sie auf der Stufe der
Alkylierungsreaktionen abgebrochen werden. Aufgrund der zu Beginn erläuterten Vorteile
des TRIS-Moleküls musste eine alternative Schutzgruppenstrategie zur selektiven
Blockierung der Hydroxylgruppen entwickelt werden. Die Schutzgruppen sollten ohne großen
synthesetechnischen Aufwand in das Molekül eingeführt werden und dabei eine relative
Selektion der zu blockierenden Gruppierung gewährleisten. Die TRIS-Molekülstruktur
ermöglichte die Synthese von Oxazolidinen105. Diese erhält man durch Umsetzen von β-
Aminoalkoholen mit Aldehyden. Sie stellen cyclische Schutzgruppen dar, die ihre
Anwendung bei der Synthese von chiralen Aminen, Aminoalkoholen und Aminosäuren
findet106,107. Bei bestimmten Arzneistoffen wurden sie zusätzlich als sogenannte Prodrugs
verwendet108,109. Aus TRIS 33 und Benzaldehyd 38 wurde, wie bei Selambarom110 beschrieben, nach Erhitzen in Toluol am Wasserabscheider das gewünschte 5,5-
Di(hydroxymethyl)-2-phenyl-1,3-oxazolidin 39 synthetisiert.
H2N
OH
OH
OH
HN
O
OH
OH
O
H+ Toluol HN
O
O
O
C16H33C16H33
33 38 39 40
KOHH33C16Br 2a
Toluol
Abb. 26: Darstellung des 5,5-Di(hydroxymethyl)-2-phenyl-1,3-oxazolidins.
Dieses wurde in sehr guten Ausbeuten erhalten und ließ sich aus Essigsäureethylester
umkristallisieren. Durch den Schutz einer Hydroxy- und einer Aminogruppe und der damit
verbundenen Einführung eines aromatischen Restes wurde zusätzlich die Lipophilie erhöht.
Eine mögliche Bis-O-alkylierung sollte durch Verwendung von Natriumhydrid zur Bildung der
Alkoholate und Toluol als Lösungsmittel realisiert werden. Als Alkylierungsmittel wurde
Hexadecylbromid 2a verwendet. Die Gefahr der Stickstoffalkylierung wurde bei der Reaktion
Synthetischer Teil 36
als Nebenprodukt in Kauf genommen. Es wurde damit gerechnet, dass das Stickstoffatom
bis zu einem bestimmten Grad sterisch abgeschirmt war. Neben der N-Alkylierung kam es
jedoch auch zur unerwarteten Spaltung der Oxazolidinstruktur und im Folgenden konnten
diverse Alkylierungsprodukte detektiert werden. Somit wurde eine komplexe Erweiterung der
Schutzgruppenstrategie erforderlich. Seit langem ist bekannt, dass sich das Oxazolidin-
Ringgerüst regioselektiv spalten lässt110. Die während der C-O Spaltung intermediär
auftretenden Iminiumderivate weisen im Gegensatz zu den nach C-N Spaltung entstehenden
Oxocarbeniumionen eine höhere Stabilität auf. Eine mögliche stereoselektive Ringöffnung
der 5,5-Dihydroxymethyl-2-phenyl-1,3-oxazolidine 39 brachte für weitere Umsetzungen jedoch keine Vorteile. Deshalb wurde nach Pierce111,112 ein Mol TRIS mit zwei Mol
Benzaldehyd 38 umgesetzt, um die entsprechende 3,5-Diphenyl-1H,3H,5H-oxazolo-7a-(7H)-methanol-Verbindungen 41 zu erhalten.
33 38 41 42
4344
H2N
OH
OH
OH
O
H+ NO O
OH
Toluol Cl+
NO O
O
NHO OH
O
THFNaBH4/CF3COOH
NaHToluol
Ausbeute < 10%
KOtBuTHF
Ausbeute 80%
Abb. 27: Darstellung von 2-Dibenzylamino-2-benzoxymethyl-1,3-propandiol.
Bei der alkalistabilen Substanz war lediglich eine Hydroxylfunktion für weitere Umsetzungen
ungeschützt und konnte alkyliert werden. Auf dieser Synthesestufe wurde jedoch noch keine
Lipidkette eingeführt, denn das Endprodukt sollte mindestens über zwei lipophile Reste
verfügen. Die Einführung einer weiteren Schutzgruppe erfolgte nach dem Prinzip der
Williamson-Ethersynthese mit Benzylchlorid 42. Bei dem resultierenden TRIS-Derivat 43 waren alle vorhandenen funktionellen Gruppen durch Schutzgruppen für weitere
Synthetischer Teil 37
Umsetzungen blockiert. Das anfänglich ölige Rohprodukt konnte nach dem Abdestillieren
von überschüssigem Benzylchlorid 42 problemlos aus Heptan umkristallisiert werden. Die synthetische Darstellung der neuen Verbindung gelang sehr zufriedenstellend. Im weiteren
Verlauf der Mehrstufensynthese wurde die Verbindung reduktiv zum 2-Dibenzylamino-2-
benzoxymethyl-1,3-propandiol 44 umgesetzt. Unter den üblichen Bedingungen mit Natriumborhydrid konnte das Ringsystem nicht aufgespalten werden. Es kam erst zur
erwünschten Ringöffnung, nachdem Natriumborhydrid in einer vorgelagerten Reaktion mit
Trifluoressigsäure reagierte. Dabei war höchstwahrscheinlich BH3 als Lewis-Säure-Spezies
in situ entstanden. Es ist bekannt, dass die Bildung von Borhydriden nach folgender
Reaktion stattfindet113,114.
NaBH4 + CF3COOH CF3COO- Na+ + H2 + BH3
Abb. 28: Darstellung von Borhydrid aus Natriumborhydrid und Trifluoressigsäure.
BH3 ging aller Voraussicht nach als Lewis-Säure eine koordinative Bindung mit dem
Sauerstoffatom ein. Dies führte zu einer Schwächung der C-O Bindung und erleichterte
dadurch die reduktive Ringöffnung. Denkbar ist weiterhin auch die Protonierung der
Sauerstoffatome des Oxazolidin-Gerüstes durch Trifluoressigsäure und eine damit
verbundene Erleichterung der reduktiven Ringöffnung. Einen weiteren Punkt stellt die hohe
Affinität des Boratoms zum Sauerstoff dar. Dies kann an der Bindungsstärke von Bor-
Sauerstoff Verbindungen mit 808 kJ/mol verdeutlicht werden. Im Gegensatz dazu ist die
Bindungsstärke von Bor-Stickstoff Bindungen mit 380 kJ/mol wesentlich geringer115. Dieses
Ergebnis konnte durch bereits vorhandene Untersuchungen116,117,118 bestätigt werden, in
denen eine effektive Oxazolidinringöffnung die Gegenwart von oxophilen Katalysatoren
erforderte und erklärt die Regioselektivität der Ringöffnung. Das Produkt 44 wurde nach chromatographischer Reinigung mit einer Ausbeute von 80 Prozent erhalten. Verbindung 44 sollte als zentrale Zwischenverbindung mit langkettigen Alkylhalogeniden zur
Dietherverbindung 45 umgesetzt werden. Durch eine recht drastische Methode gelang es die Verbindung mit einem Überschuss an Hexadecylbromid 2a in Gegenwart von gepulvertem Kaliumhydroxid in abs. Xylol zum Dietherprodukt 45 zu alkylieren. Die so erhaltene Dietherverbindung wurde durch Flash-Chromatographie aufgereinigt.
Synthetischer Teil 38
44 45 46
NHO OH
O
NO O
O
H33C16 C16H33
NH2O O
OH
H33C16 C16H33Pd(OH)2/H2EtAc
KOHH33C16Br 2aXylol
Abb. 29: Darstellung alkylierter hydrophober TRIS-Derivate.
Dabei konnten neben überschüssigem Hexadecylbromid auch Hexadecanol und
Dihexadecylether als Nebenprodukte isoliert werden. Dies erscheint nachvollziehbar, weil in
Nebenreaktionen aus dem Alkylierungsmittel auch Alkohole, Ether und Olefine entstehen
können. Das Bromid wurde durch Hydroxidionen nukleophil angegriffen und es entstand
intermediär der entsprechende Alkohol. Dieser reagierte dann mit weiterem
Hexadecylbromid zum symmetrischen Diether. Es konnte sogar ein recht großer Anteil Ether
als Nebenprodukt isoliert werden.
NHO OH
O
Cl C15H33
O+ TEA
CHCl3
NO O
O
O
C15H31H31C15
O
NH2O O
OH
O
C15H31H31C15
O
Pd(OH)2/H2EtAc
44 47 48
49
Abb. 30: Darstellung acylierter hydrophober TRIS-Derivate.
Neben der Alkylierungsreaktion erfolgte auch eine Acylierung des Diols 44. Diese wurde mit Hexadecanoylchlorid 47 in Gegenwart von abs. TEA in abs. Chloroform durchgeführt. Das Rohprodukt 48 wurde chromatographisch gereinigt und in guten Ausbeuten erhalten. Die im Molekül vorhandenen Schutzgruppen sollten in einem weiteren Schritt hydrogenolytisch an
Palladium/Kohle entfernt werden. Bei den Etherstrukturen 45 konnten an Pd/C 10% in
Synthetischer Teil 39
Essigsäureethylester bei Zimmertemperatur und Normaldruck lediglich zwei
Benzylschutzgruppen abgespalten werden. Die Monobenzylaminstruktur blieb bei weiteren
Versuchen unter Normaldruck beständig. Auch bei den Esterstrukturen stellte sich nicht der
gewünschte Erfolg ein. Unerwartet waren die zahlreichen Umesterungsreaktionen, die auch
bei weiteren Untersuchungen nicht unterdrückt werden konnten. Recht gute Ergebnisse
erbrachte die Hydrierung der Etherverbindung an Palladiumhydroxid im Autoklaven. So
wurden nach 24 h bei einem Druck von 20 bar und leicht erhöhter Temperatur Ausbeuten bis
zu 50 Prozent erzielt. Die resultierende Verbindung 46 verfügte über eine freie Amin- und Alkoholfunktion. Die Anwendungsmöglichkeiten für dieses Lipid waren sehr vielfältig, ein
Hauptaugenmerk sollte jedoch auf die Synthese von Transfektionslipiden geworfen werden.
Durch die Einführung der N-blockierten Aminosäure Glycin 29a konnte gleichzeitig die Aminofunktion effektiv geschützt werden. Die Hydrierung der CBZ- Schutzgruppe konnte
unter Normaldruck an Palladiumhydroxid innerhalb von 4 Stunden durchgeführt werden. Die
Umsetzung verlief quantitativ und das Produkt ließ sich aus Ethanol umkristallisieren. Für
zukünftige Untersuchungen steht die freie Hydroxylgruppe als idealer Reaktionspartner zur
Verfügung.
NH2O O
OH
H33C16 C16H33O N
OH
O
H O+ NH
O O
OH
H33C16 C16H33
ON
O
O
H
EEDQEtOH
Pd(OH)2/H2EtAc
NHO O
OH
H33C16 C16H33
ONH2
29a46 50
51
Abb. 31: Amidkupplung und Abspaltung der Schutzgruppe.
Synthetischer Teil 40
10. Darstellung hydrophober Pentaerythritol-Derivate als Transfektionslipide
10.1. Pentaerythritol Pentaerythritol 52 kann aufgrund seiner chemischen Struktur sehr gut als funktionelle Ausgangssubstanz für Lipidsynthesen genutzt werden. Strukturell bestehen große Ähnlichkeiten sowohl mit TRIS 33 als auch mit Glycerol 32.
OH
OH
OH H2N
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
32 33 52
Abb. 32: Strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Glycerol, TRIS und Pentaerythritol.
Es handelt sich um einen vierwertigen, verzweigten Alkohol, der durch Einwirkung von
Calciumhydroxid auf Acetaldehyd und Formaldehyd in Form einer gekreuzten Cannizzaro-
Reaktion dargestellt wird. Pentaerythritol dient der Herstellung von Alkyd- und anderen
Polyesterharzen, sowie zur Verbesserung der Qualität trocknender Öle. Durch die
Veresterung des Alkohols mit einem Salpetersäure-Schwefelsäure-Gemisch entsteht
Pentaerythrittetranitrat. Hierbei handelt es sich um einen Sprengstoff (Nitropenta, PETN), der
als Gemisch mit Hexogen in organischen Bindemitteln unter dem Namen Semtex bekannt
ist48. Zudem handelt es sich beim Pentaerythrittetranitrat um eine pharmakologisch wirksame
Verbindung, die als so genannter Vasodilatator wirkt. Hierbei kommt es zu einer Relaxation
der glatten Muskulatur. Diese führt am Herzen zu einer Gefäßerweiterung und damit zu
einem verminderten venösen Rückstrom. Als Folge kommt es zu einer Abnahme der
diastolischen Wandspannung. Diese Faktoren sorgen für eine ökonomische Arbeit des
Herzens und manifestieren sich in einer Abnahme des Sauerstoffverbrauchs119.
Weiterhin wird Pentaerythritol als Ausgangssubstanz für diverse Makromoleküle120,121 und
zur Darstellung von Glykolipiden74 verwendet.
Synthetischer Teil 41
10.2. Hydrophobe Pentaerythritol-Derivate
Um Pentaerythritol als Ausgangssubstanz für Lipidsynthesen zu nutzen ist eine komplexe
Schutzgruppenstrategie erforderlich. Die im Molekül vorhandenen Hydroxygruppen lassen
sich selektiv durch Ketalisierung mit geeigneten Carbonylverbindungen schützen. Ketale sind
gegenüber alkalischen und oxidierenden Reagenzien sehr beständig, lassen sich jedoch im
sauren Milieu relativ einfach spalten. Um lipophile Reste in das Molekül einzubinden wurde
deshalb zunächst eine Benzylidenschutzgruppe eingeführt. Dieses Dioxanderivat stellt eine
seit langem bekannte Schutzgruppe für 1,2- und 1,3-Diole dar und ermöglicht im Fall des
Pentaerythrits eine selektive Bisalkylierung.
OH
OH
OH
HO
O
H
OH
O
HO
O+
O
O
O
O
C16H33H33C16
52 38 53
KOHH33C16Br 2aToluol
54
Abb. 33: Pentaerythritol mit hydrophobem Lipidanker.
Die Umsetzung des Alkohols 52 mit Benzaldehyd 38 zum Dioxanderivat 53 erfolgte in Gegenwart starker Säuren nach einer modifizierten Vorschrift von Issidorides et al.122. Neben
dem Schutz von zwei Hydroxygruppen wurde durch die Einführung eines aromatischen
Restes die Lipophilie des Moleküls erhöht. Dies sollte die sich anschließende
Alkylierungsreaktion erleichtern. Die Bis-Alkylierung des Pentaerythritolderivates erfolgte
nach dem Prinzip der Williamsonschen-Ethersynthese. Dafür wurde der Alkohol mit
gepulvertem Kaliumhydroxid in Toluol am Wasserabscheider unter Rühren gekocht. Zu
dieser Suspension wurde nach 45 min das Alkylhalogenid 2a getropft. Nach etwa 24 Stunden war die Alkylierungsreaktion quantitativ abgeschlossen. Im Vergleich zu Chierici et
al.74, dessen Methode NaH zur Bildung der Alkoholate vorsieht, konnte die Ausbeute durch
Verwendung von Kaliumhydroxid und Kochen am Wasserabscheider um ca. 20% gesteigert
werden. Als lipophiler Rest kam bei den Umsetzungen Hexadecylbromid 2a zur Anwendung, wobei auch die Möglichkeit zur Variation im lipophilen Teil des Moleküls gegeben ist. In
einem weiteren Schritt sollte die Acetalstruktur 54 selektiv gespalten werden, um eine freie Alkoholfunktion und eine Benzyletherstruktur zu erhalten. Der Benzylether stellt ebenfalls
eine gute Schutzgruppe für Alkohole dar, und lässt sich einfach und mit nahezu quantitativen
Ausbeuten hydrogenolytisch an Palladium/Kohle entfernen. Aufgrund der bereits
gesammelten Erfahrungen bei der Spaltung des Oxazolidin-Gerüstes wurde die reduktive