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Année 2018/2019
Bernard CARCYLaboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire, Faculté de Pharmacie, Université
Montpellier
CM: LES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES
HUMAINES: APPARITION, DIAGNOSTIC ET
APPROCHES THERAPEUTIQUES
- CHAPITRE IV -
APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
DFGSP2
Module SB2
UE11 : Biologie Moléculaire et Cellulaire
I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)
II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES
III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)
IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation
- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)
- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)
- Transformation bactérienne
- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)
- Banque d’ADN
B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE
1/ Production de protéines thérapeutiques recombinantes
- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)
- par des animaux ou végétaux transgéniques
2/ Production de protéines thérapeutiques in situ
les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)
- les vecteurs viraux
- les vecteurs non viraux
3/ Le clonage reproductif et thérapeutique
4/ Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9
2.1/ Thérapie génique (ADN médicament)
2.2/ Injection ADN nu
ADN
pUC
AmpR
Vecteur
Sélection
Ligature
Transformation
1- Clonage d’un seul fragment d’ADN (gène) 2- Clonage de n fragments d’ADN
(banque d’ADN d’un génome)
2- Fragmentation du
génome entier (n
fragments d’ADN)1- Sélection d’un
gène d’intérêt (1
fragment d’ADN)
Cellule hôte
Amplification d’un
gène (ou de n
gènes) après
fragmentation du
génome
Sous-clonage(changement de vecteur)
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II (Appliquées à l’extraction, la manipulation et le clonage moléculaire
d’un gène ou d’un génome; transfert de gène ou transgénèse)
• Extraction des Acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
• Séparation électrophorétique (classique ou PFGE) des acides nucléiques
et visualisation
• Fragmentation de l’ADN (enzymatique par ER ou mécanique par
shotgun)
• Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN sur un
vecteur)
• Vecteurs de clonage (plasmide, BAC, rétrovirus)
• Transformation bactérienne
• Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant
(-complémentation)
• Banques d’ADN
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE II (Appliquées à l’extraction, la manipulation et le clonage moléculaire
d’un gène ou d’un génome; transfert de gène ou transgénèse)
1- Extraction des Acides nucléiques
Poly(A)CAP
5’
5’
5’
3’
3’
3’
AUG Stop
Brin codant
Brin non codant
exon1 exon2 exon3
exon1 exon2 exon3
exon1 exon2 exon3
ADNg (gène dans un génome eucaryote: intron + exon +5’ NC et 3’NC)
ARNm mature :
-1 seul cadre de
lecture ouvert
(Open Reading
Frame=ORF)exon1 exon2 exon3
exon1 exon2 exon3
ATG Stop
ADNc (ADN complémentaire)
copie ADN double brin issue
d’un ARNm mature)
introns
Traduction
Transcription/maturation
Rétrotranscription
Nter CterTraduction
protéine
*Quelques généralités (ADNg ou ADNc, ARNm)
N
Cellule nucléée
Tampon de dissociation des protéines
(détergents)1
ADN (µg)ARN totaux (µg)
+ Inhibiteurs RNases
endogènes
Extraction des AN (Ex: phénol) 2
Précipitation des AN (Ex: Alcool + sel) 3
Dosage/Pureté/intégrité des AN (spectro.) 41 DO260nm
= 50µg/ml
ADNdb
1 DO260nm
= 40µg/ml
ARNsb
DO260nm
DO280nm1,8 < < 2 Pureté
* Principe général d'extraction des acides nucléiques (ADN et ARN)
1- Extraction des Acides nucléiques
Purification des ARNm sur colonne d’affinité (via une séquence oligodT)
*Extraction/Purification des ARNm
ARN totaux purifiés
ARNt
ARNr
(A)n3’
ARNm5’
2
Colonne de billes
couplées à
séquences
polydT = (dT)n
(dT)n
(A)n
(dT)n
(dT)n
(A)n
(dT)n
(A)n
(A)n3’
ARNm5’
3Hybridation des ARNm
Par séquences poly(A)n
Elution des ARNm
1
ARNm purifiés
Tampon de
force ionique
ELEVEE
Tampon de
force ionique
FAIBLE
1- Extraction des Acides nucléiques
(A)n3’5’
ADNc
copie entière
ARNm purifié
ARNm/ADNc
5’ AAAA-3’
polyT(18)
5’ AAAA-3’
5’ AAAA-3’
5’ AAAA-3’
dNTP
dNTP
TTTT-5’
3’ TTTT-5’
3’ TTTT-5’
5’ AAAA-3’
3’ TTTT-5’
Hybridation
Ex: Synthèse d’ADN par la technique de cassure à la Rnase H
Rétrotranscription
Cassure ARNm
Polymérisation ADN
Transcriptase
reverse
RNase H
ADN
Polymerase
1
2
3
4
*Synthèse d'ADNc
1- Extraction des Acides nucléiques
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation
-- Migration dans un champ électrique du pôle – vers le pôle +(l’ADN est chargé – en raison des groupements phosphates)
- dans un seul champ électrique si fragments < 20kpb (migration dans une seule
direction)
- dans plusieurs champs électriques d’orientation variable (champs pulsé)
si fragments >20kbp (ex: migration bidirectionnelle en zig-zag)
- Séparation des fragments en fonction de leur taille:
- le plus souvent dans un gel d’agarose (gel horizontal de 0,6 à 2%) selon la taille des
fragments à séparer ou à visualiser (Ex: Southern blot, analyse de fragments PCR)
- dans l’acrylamide si petits fragments (<100pb) ou si besoin d’être très résolutif
dans la séparation de fragments (Ex: séquençage de l’ADN; détection de mutation par méthodes
dérivées de la PCR)
- La coloration des AN s’effectue par ajout d’un intercalant de l’ADN
(ATTENTION: si bromure d’éthidium (BET) comme intercalant de l’ADN; toxique) et leur
visualisation sous les U.V.
*Quelques généralités:
Gel 1% d’agarose
Electrophorèse en Champ pulsé
Electrophorèse classique
puits de dépôt de
l’échantillon d’ADN
à analyser
Fragment d’ADN
2 orientations
de migration
1 orientation
de migration
*Electrophorèses classique (ADN ou ARN) ou en champ pulsé (ADN)
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation
*Séparation électrophorétique d’ARN totaux
Contrôle de la
qualité de
l’extraction des
ARN totaux d’un
tissu (en vue
d’une purification
des ARNm) par
visualisation de
l’intégrité des
ARN 28S et 18S.
ARNm
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation
-
+Fragmentation d’un génome
par des enzymes de restriction
(Ex: Southern blot)
Génome digéré par
différentes ERÉtalons de
PM
E E
E E
EE
E
EADN
génomique
purifié
Digestion par une ER
*Séparation électrophorétique de fragments d'ADN issus d'une
fragmentation du génome par une enzyme de restriction (ER)
2- Séparation électrophorétique des Acides nucléiques (AN) et visualisation
Le gel d’agarose permet d’analyser la
fragmentation de génomes entiers
par des enzymes de restriction (ER)
dans la perspective:
-d’identifier un gène dans un génome
et d’étudier son organisation
génomique (simple copie, multicopie)
par hybridation moléculaire
(Southern blot)
3- Fragmentation de l’ADN
ADN génomique purifié
COUPURE MECANIQUE
(coupure aléatoire = shotgun)
COUPURE ENZYMATIQUE PAR LES
ENZYMES DE RESTRICTION
(coupure à des sites définis)
E E
E E
EE
E
E
La plupart des génomes sont beaucoup trop grands (>109pb)
pour être analysés en un seul morceau. Il faut les fragmenter
*Méthodes de fragmentation de l'ADN
=> Quelques généralités sur les ER:
définition : Endonucléases d’origine procaryotique coupant de manière définie
et reproductible l’ADN double brin quelle que soit son origine.
Action: Réduisent de manière reproductible un génome entier à une série de
fragments caractéristiques d’un ADN donné.
ER de type II : une fois la séquence reconnue, l’enzyme coupe l’ADN double brin au niveau
du site de reconnaissance. Il en existe des centaines (commercialisées).
nomenclature des ER de type II:
Escherichia coli Ry13
Genre
Espèce
Souche EcoRI (première découverte)
EcoRV (cinquième)
3- Fragmentation de l’ADN
*Les enzymes de restriction de type II
=> les sites de reconnaissance des ER de type II:
EcoRI
- séquences palindromiques:
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
- les flèches indiquent le site de coupure sur les 2 brins
NspIV5’-GGNCC-3’
3’-CCNGG-5’
N signifie A,C,G ou T
- séquences courtes (entre 4 et 8 pb)
- la spécificité de reconnaissance des séquences est le plus souvent absolue
mais pas toujours:
5’-GGCC-3’
3’-CCGG-5’HaeIII
3- Fragmentation de l’ADN
*Les enzymes de restriction de type II
=> Analyse de la méthylation de l'ADN par des isoschizomères :
HpaII
quand une base peut être méthylée par une méthylase bactérienne,
elle est repérée par une astérisque:
5’-CC GG-3’
3’-GG CC-5’
-des isoschizomères sont 2 enzymes de restrictions qui reconnaissent
une même séquence mais une des enzyme est sensible à la méthylation
(ne coupe pas si méthylée). L’autre enzyme coupe l’ADN qu’il soit méthylé ou pas.
HpaII et MspI5’-CCGG-3’
3’-GGCC-5’
3- Fragmentation de l’ADN
*Les enzymes de restriction de type II
=> Les différents types de coupure des ER de type II:
HaeIII
- Libération d’extrémités franches (blunt or flush ends):
5’-GGCC-3’
3’-CCGG-5’
- Libération d’extrémités cohésives (décalées ou protrusives):
EcoRI5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
5’-GG CC-3’
3’-CC GG-5’+
- 3’ cohésives: - 5’ cohésives:
5’-G AATTC-3’
3’-CTTAA G-5’+
5’-CGATCG-3’
3’-GCTAGC-5’
5’-CGAT CG-3’
3’-GC TAGC-5’
PvuII
+
3- Fragmentation de l’ADN
*Les enzymes de restriction de type II
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)
*les 2 ADN sont coupés par une même ER
1
2
ADN LIGASE: enzyme qui
assure la formation d’une
liaison phosphodiester entre
une extrémité 3’OH et 5’P
de 2 désoxyribonucléotides
=> Après ligature, l’ADN1
se retrouve entre 2 sites
de restriction reconstitués
par complémentarité des
extrémités
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)
*les 2 ADN sont coupés par une même ER
SCM= Site de clonage de l’ADNc
-Digestion du plasmide par ER
- Déphosphorylation des extrémités (phosphatase alcaline)
-ligature de l’ADNc au vecteur par ADN ligase
ETVecteur
recombinant
(R)
Vecteur non
recombinant
(NR)
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)
*L’efficacité de ligature d’un ADN sur un vecteur n’est jamais de 100%
=> tout clonage nécessitera un système de discrimination (= sélection)
pUC
AmpR
ori
pUC
AmpR
ori
pUC
AmpR
ori
ER
ER
- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de
clonage d’un ADN sur un vecteur)
1- ligature de 2 ADN coupés par
la même ER :
- que les extémités libérées soient
franches ou cohésives, on pourra
toujours ligaturer ces 2 ADN
(avantage).
- on reconstitue le site de restriction
initial sur la molécule chimère
(avantage) :
=> donc possibilité de le ressortir du
vecteur1 pour le ligaturer sur un autre
vecteur (sous-clonage)
- L’ADN cloné sur le vecteur se
retrouve entre 2 sites de restriction
identiques :
=> l'ADN peut être cloné dans 2
orientations (inconvénient si objectif
est de produire une protéine
recombinante)
2- ligature de 2 ADN coupés
par des ER différentes:
=> si coupures franches:- on pourra toujours ligaturer les 2
ADN
- Cependant on ne reconstitue pas
les sites de restriction initiaux sur la
molécule chimère (inconvénient).
4- Ligature de 2 ADNs différents (dans une stratégie de clonage
d’un ADN sur un vecteur)
=> Si coupures cohésives :- on ne pourra ligaturer ces 2 ADN que si 1
des 2 sites est contenu dans l’autre, par
complémentarité des
désoxyribonucléotides
dans la région simple brin.
(inconvénient).
5- Vecteurs de clonage
Définition : c’est un système qui permet le transfert, l’expression et la réplication d’un ADN
étranger dans des cellules-hôtes (en vue d’un clonage d’ADN, d’une transgénèse, d’une
thérapie génique, d’un séquençage, etc…).
Choix du vecteur de clonage: Le choix d’un vecteur pour une opération de clonage dépendra
de l’ADN étranger à insérer (compatibilité de taille et d’extrémités) et de l’application
(cartograghie et séquençage de génome, expression de protéine thérapeutique dans une
bactérie, thérapie génique,…)
*Généralités
Quelques
vecteurs de
clonage:
(*) Les vecteurs dont on parlera en DFGSP2, notamment les plasmides
Propriétés générales des vecteurs de clonage
-Réplication autonome (ori), le plus stable possible et sa présence ne doit pas perturber la
cellule hôte
-présence de marqueurs de sélection (gène de résistance aux antibiotique, gène lacZ,…)
qui permettront de différencier des bactéries porteuses d’un vecteur recombinant ou non
recombinant (par colorimétrie ou sur antibiotique).
-doit posséder un SCM (site de clonage multiple) constitué d’une succession de site unique
de coupure par des enzymes de restriction. Ce SCM est l’endroit où l’ADN à cloner sera
inséré. Le SCM est localisé dans un marqueur de sélection.
-doit être facilement isolable sous forme pure et en quantité illimitée
- le plus petit possible (favorise insertion d’ADN plus grands, manipulation plus facile,
augmente le nombre de copie par cellule car plus facile à répliquer)
*Généralités
5- Vecteurs de clonage
- ADN double brin extrachromosomique
-d’origine procaryotique
- existe naturellement dans les bactéries (=
1ère génération)
- il en existe maintenant de nombreux artifiels
(2ème et 3ème génération)
Couramment utilisés dans les stratégies de
clonage simple (en vue de production de
protéine recombinantes, pour le séquençage
d'un gène , pour la sélection d'un gène dans
une banque d'ADN, etc)Cliché D. Dressier
*Les plasmides
Caracéristiques générales
5- Vecteurs de clonage
Exemple d’un plasmide artificiel
de 3ème génération
Caractéristiques
majeuresdu plasmide
pBluescript:
-1- Présence d’un site de
clonage multiple (SCM =
MCS ou polylinker)
-2- Présence de
promoteurs (T3 ou T7
ou SP6,…) de part et
d’autre du SCM
- Présence de marqueurs
de sélection:
-Présence d’un gène
de résistance à un
antibiotique
-Présence du gène
lacZa (peptide de
lagalactosidase)
1
2
3
431
2
4
lacZa
*Les plasmides
2
=> couramment utilisé pour la sélection colorimétrique
de vecteurs recombinants (Cf TP BioMol1)
5- Vecteurs de clonage
- Succession de site de
restriction unique
- nombre et séquence des
sites de restriction variable
d’un plasmide à l’autre
- plus il contient de site de
restriction et plus il sera
facile de cloner n’importe
quel ADN
-Le SMC est inséré dans
un marqueur de sélection
SCM1
lacZa
C’est l’endroit où on ouvre le vecteur par une enzyme de restriction
pour y cloner 1 ADN étranger (d’extrémités et de taille compatibles)
1*Les plasmides
Le SCM:
5- Vecteurs de clonage
=> localisation des séquences
promotrices de part et d’autre du SCM
(donc de l'insert)
=> serviront de régions d'hybridation
d'amorces (PCR, séquençage, production
d'ARNm à grande échelle)
Les séquences promotrices 2
2
2
2
2
*Les plasmides
Faciliteront l’analyse des vecteurs
recombinants et de l'ADN cloné
(insert)
5- Vecteurs de clonage
Serviront à la sélection des bactéries recombinantes d’intérêt (avec vecteur recombinant
portant le gène d’intérêt cloné)
Les marqueurs de sélection:
(Ex: pBluescript ; Cf TP1 BioMol)
-gène lacZa (peptide
de la -galactosidase)3
4
Elimination des
bactéries non
transformées
3
Discrimination colorimétrique des
bactéries transformées (via
mécanisme d’-complémentation)
contenant soit :
- un plasmide recombinant (blanche)
- Un plasmide non recombinant (bleue)
4
gène de résistance
à un antibiotique
*Les plasmides
5- Vecteurs de clonage
6- La transformation bactérienne
Objectif : Consiste à faire entrer le plasmide recombinant (porteur du gène
d’intérêt) dans une cellule hôte (bactérie le plus souvent car simple d'utilisation) où
il pourra se répliquer (en grande quantité et sera clonal)
=> Ce n'est pas un phénomène naturel donc :
- on devra fragiliser la paroi bactérienne pour faciliter l'entrée du plasmide (=
bactéries compétentes)
- on utilisera des méthodes physico-chimiques (choc thermique de 0->42°C, choc
électrique=électroporation) pour faire entrer l'ADN plasmidique
=> L' efficacité de la ligature ADN/plasmide n'étant pas de 100 %, on n'aura
également pas d'efficacité de transformation de vecteur recombinant de 100 % (des
bactéries ne seront pas transformées et parmi les bactéries transformées on aura
des bactéries transformées par un vecteur non recombinant et d'autres par un
vecteur recombinant).
=> Il faudra donc un système de sélection double capable de discriminer à la fois :
- les bactéries transformées des bactéries non transformées (via gène de résistance à
un antibiotique)
- les bactéries transformées par un vecteur recombinant ou non recombinant (via
du gène lacZa)
*Généralités
6- La transformation bactérienne
Bactéries
(Escherichia coli)
Bactéries compétentes
ADN bactérien
Paroi bactérienne
intacte
Paroi bactérienne
fragilisée
* Préparation de Bactéries compétentes
paroi fragilisée
(par CaCl2 par exemple)
pour faciliter l’entrée du
vecteur
=> Bactéries aptes à recevoir de
l’ADN étranger
6- La transformation bactérienne
Bactéries compétentes
(Escherichia coli)
* Transformation des bactéries compétentesRésultat de la ligature
ADN/vecteur
Bactéries transformées
(L’efficacité de ligature d’un ADN
sur un vecteur n’est jamais de
100%)
Méthodes physico-chimiques:
Choc thermique (0=>42°C) ou
électrique (électroporation)
=> L’efficacité de la transformation n’est jamais de 100%
Bactéries non
transformées
Bactéries
transformées
Recombinantes
à sélectionner
Biologie et Multimédia -
Université
Pierre et Marie Curie
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
* L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
* L'opéron lactose bactérien (Cf Cours Bactériologie)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
-galactosidase
Peptide
- dans OPERON LACTOSE BACTERIEN :
-Gène lacZ présent
sur un vecteur
- LORS OPERATION CLONAGE MOLECULAIRE:
Enzy-
Enzy+ (substrat: X-gal)-complémentation
gène lacZ
Peptide Enzy-
On restaure l’activité enzymatique lors d’une association
Enzy+(substrat: lactose)
*Le mécanisme d' -complémentation
-Gène lacZ présent
sur le génome
bactérien lac- des bactéries
à transformer:
(-> par contre l’activité enzymatique ne sera pas restaurée si modifié par
insertion d’un gène dans lacZ (=> plus d’association
=> par contre l’activité enzymatique n’est pas restaurée si modifié par
insertion d’un gène (plus d’association
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
*Le mécanisme d' -complémentation
PAS de -galactosidase
(Enzy-)
=> PAS de -galactosidase donc
=> PAS d'activité
enzymatique (Enzy-)
=>-galactosidase
AVEC activité
enzymatique (Enzy+)
association
PAS d'association RecA sélectionner
Transformation
bactérienne
(en présence
X-gal/IPTG/Ampicilline)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
Blanche (Enzy-), AmpS
Bleue (Enzy+), AmpR
Blanche (Enzy-), AmpR
3 phénotypes
distincts
DONC REC
différentiable
des deux
autres types
A sélectionner
*Phénotypes bactériens en présence d'X-gal/IPTG/Ampicilline
X-gal (5-Bromo 4-chloro 3-indolyl bD galactopyranoside)
(SUBSTRAT incolore)
Bromo-chloro-indol
(BLEU)
-galactosidase
NORMALE
Protéine codée
par l’ADNc
Peptide Rec Peptide
Colonies bactériennes
BLANCHES
(PAS d’-complémentation)Colonies bactériennes
BLEUES
(-complémentation)
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
*Rôle de l'X-gal (en présence d'IPTG)
Association PAS d'association Rec
=> C'est le SUBSTRAT (incolore) de la -galactosidase dans ce système de sélection
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
*Rôle de l'IPTG (Isopropyl D thyogalactopyranoside)
=> analogue non métabolisable du lactose qui induiera la synthèse du peptide ou Rec
TRANSCRIPTION/TRADUCTION
BLOQUEE
Cas 1: Absence d’IPTG Cas 2: présence d’IPTG
TRANSCRIPTION/TRADUCTION
OUVERTE
23
4
6
5
1
7
Culture sur boite de
pétri LB+Ampicilline
+ IPTG et X-galColonie bactérienne
blanche : n bactéries
transformées par le même
vecteur recombinant
Prélèvement et
Multiplication en
culture liquide + Ampi
Extraction du plasmide
(miniprep)
Analyse de l’insert
*Sélection d’un clone à analyser:
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
1- Clonage d’un fragment d’ADN unique 2- Banque (clonage de n fragments d’ADN)
*Succès du clonage (nombre de clones à obtenir):
23
4
6
5
1
7
23
4
6
5
1
7
Tous les clones blancs
contiennent le même insertLes clones blancs 1, 2, 4, 6 et 7
peuvent contenir des inserts différents
1 CLONE BLANC SUFFIT > 95% BLANCS
7- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur
recombinant (-complémentation)
8- Banques d’ADN
Une banque d’ADN (library) : correspond à un ensemble
de clones cellulaires (bactéries, levures,…) où chaque
cellule renferme un exemplaire différent d’ADN
recombiné à un vecteur.
La construction d’une banque : dépendra de ce que l’on recherche
- ADN génomique
- exons, introns, séquences régulatrices des gènes
- tout type cellulaire (exception : cellules de l’immunité)
- ADNc (complémentaire)
- exons des gènes
- il existe une spécificité tissulaire
=> Une banque d’ADN contiendra donc, sous forme morcelée,
l’ensemble de l’information génétique (ADNg ou ARNm matures via
ADNc) d’un individu telle qu’elle existe dans son génome.
*Généralités
Ex:
n BACTERIES RECOMBINANTES CONTENANT
UN SEUL PLASMIDE RECOMBINANT
ADNc1 ADNc2 ADNc5ADNc4ADNc3 ADNcn
pUC pUC pUC pUC pUC pUC
AmpR
Clonage dans vecteur plasmidique au niveau de lacZ
Transformation bactérienne
8- Banques d’ADN
*Exemple de construction d'une banque d'expression plasmidique
8- Banques d’ADN
*Stockage des clones d'une banque
Exemple : Stockage des
1536 ADN plasmidiques
extraits des 1536 clones
bactériens d'une banque
sur un filtre de Nylon
(chaque clone est déposé
en duplica)
Clones bactériens
Sur plaques 96puits
(ou 384 puits)
Clones bactériens
Sur boite de pétri
ADN plasmidiques
extraits des Clones
bactériens
sur plaques 96puits
(ou 384 puits)
Exemple : Banque de 1536
clones bactériens (16
plaques de 96 puits
(ou 4 plaques de 384 puits)
8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque
=> Consiste en la sélection
d'un clone parmi un ensemble
de clones que constitue la banque
Criblage par PCR à l'aide d'un couple
D'amorces spécifiques d'un gène:
20
réactions
PCR
permettent
l’analyse
de
96 clones
8 Réactions
PCR sur
des mélanges
de lignes (12
clones/ligne)
12 Réactions
PCR sur des
mélanges de
colonnes (8
clones/colonne)
AB
CD
EF
GH
=> Clone positif en position F4 sur la plaque 96 puits
8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque
Criblage par PCR:
8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque
Criblage par PCR (localisation de 2 gènes dans la banque):
8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque
Criblage par hybridation moléculaire
À l'aide d'une sonde
hybridation avec une
sonde
Résultat : donne la
localisation du gène étudié
dans la banque d'ADN
Exemple : Banque de
1536 ADN plasmidiques
extraits des 1536 clones
bactériens d'une banque
sur un filtre de Nylon
(chaque clone est déposé
en duplica)
8- Banques d’ADN
*Criblage des clones d'une banque
Criblage par hybridation moléculaire
À l'aide de plusieurs sondes distinctes
Exemple : Banque de
1536 ADN plasmidiques
extraits des 1536 clones
bactériens d'une banque
sur un filtre de Nylon
(chaque clone est déposé
en duplica)
Sonde 2
Sonde 1
Résultats : Les gènes 1 et 2 sont localisés dans les
mêmes régions génomiques (organisation génomique en
tandem)
8- Banques d’ADN
* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage
=> les fragments d'ADN séquencés constituent des banques d'ADN (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)
8- Banques d’ADN
* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage
=> les fragments d'ADN séquencés constituent des banques d'ADN (de grands (vecteur de type BAC) ou petits (vecteur de type Plasmide) fragments)
8- Banques d’ADN
* Déchiffrage d'un génome entier par séquençage
Quelques objectifs d'analyse de Diversité chez les individus d'une même espèce
- mise au point de kits génétiques pour le grand public
(« médecine » prédictive ou personnalisée)
- étudier la relation facteurs
environnementaux, gènes
et maladies
- identifier les mutations
impliquées dans maladies
(entre autre)
I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)
II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES
III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)
IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation
- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)
- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)
- Transformation bactérienne
- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)
- Banque d’ADN
B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE
1/ Production de protéines thérapeutiques recombinantes
- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)
- par des animaux ou végétaux transgéniques
2/ Production de protéines thérapeutiques in situ
les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)
- les vecteurs viraux
- les vecteurs non viraux
3/ Le clonage reproductif et thérapeutique
4/ Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9
2.1/ Thérapie génique (ADN médicament)
2.2/ Injection ADN nu
I- POLYMORPHISMES DU GENOME HUMAIN ET PATHOLOGIE MOLECULAIRE (MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES)
II- MECANISMES ET CONSEQUENCES DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES HEREDITAIRES MONOGENIQUES
III- METHODES D’IDENTIFICATION DES MUTATIONS DELETERES A L’ORIGINE DES MALADIES GENETIQUES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (DIAGNOSTIC GENOTYPIQUE)
IV- APPROCHES THERAPEUTIQUES DES MALADIES HEREDITAIRES
MONOGENIQUES (TRANSFERT DE GENE)
A- LE CLONAGE MOLECULAIRE D’UN ADN D’INTERET SUR UN VECTEUR
- Extraction des acides nucléiques (ADN, ARNm, synthèse d’ADNc)
- Séparations électrophorétiques (classique ou PFGE) de l’ADN et visualisation
- Ligature de 2 ADN (dans une stratégie de clonage d’un ADN d’intérêt sur un vecteur)
- Vecteurs de clonage (plasmides, BAC, rétrovirus)
- Transformation bactérienne
- Sélection colorimétrique de bactéries contenant un vecteur recombinant (-complémentation)
- Banque d’ADN
B- APPLICATIONS THERAPEUTIQUES LIEES AU TRANSFERT DE GENE
- Production de protéines thérapeutiques recombinantes
- par des bactéries en fermenteur (tag (His)6 ou GST)
- par des animaux ou végétaux transgéniques
- Thérapie génique (ADN médicament)
- les différentes stratégies (in vivo ou ex vivo)
- les vecteurs viraux
- les vecteurs non viraux
-Clonage reproductif et thérapeutique
- Modifications du génome via approche CRISPR-Cas9