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Citometría de Flujo: Clínica, Investigación,
Gastroenterología y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.
Concepción, Noviembre de 2003
Citometría de Flujo
Clínica Investigación
Cáncer
Gastroenterología
Flow Cytometry Publications/year
YEARS
00
300300
600600
0 13 28 79113
223
480611
811940
2,332
1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1991 19921989 1990 1993 1994
(*) Data taken from Medline search using the keywords: “flow Cytometry”(November 09th: 22:30 hrs)
1995 1996
3,483
3,479
1999: 4.2561998: 3.8891997: 3.613
2002: 5.3232001: 5.0252000: 4.771
2003: 3.974 (*)3345
2899
Papers 2,713
2,4452700
2400
21002100 1,855
180018001,494
15001500 1,232
1,07812001200
900900
¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??
La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición simultánea de
múltiples características físicas y químicas de células en
suspensión”
¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA
CELULA?
1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad
interna.3.- Evaluación de características químicas:
• Fluorocromos
• Anticuerpos conjugados con fluorocromos
FACS: Fluorescence activated cell sorter
Relative Sizes of Biologicals
AmoebaLymphocyte
S.aureus5-8 µm
1 µm
15-30 µm
Flow Cell
Injector Tip
FluorescenceFluorescencesignalssignals
Focused laserFocused laserbeambeam
Sheathfluid
PMT
PMT
PMT
PMT
DichroicFilters
BandpassFilters
Laser
1
2
3
4
Flow Cytometry OpticsFlow Cytometry Optics
Flow cell
ANTICUERPOS MONOCLONALES
• Gran disponibilidad comercial
• Gran variedad de fluorocromos
• Precios accesibles• Pedidos vía Internet• Gran Calidad
FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS
Fluorescein (FITC)EmissonExcitation
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Wavelength300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Rel
ativ
e In
tens
ity
Protein
Phycoerytherin (PE)Excitation Emisson
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Protein
Propidium IodideEmissonExcitation
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Rel
ativ
e In
tens
ity
DNA
CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO
PREPARACIONDE LA MUESTRA
OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR
CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOPREPARACION DE LA MUESTRA
Procedimiento St.:• 100 µL de sangre total • 10 µL del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT • Añade el lisador • Leer en un citómetro de flujo
PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA
• CALIBRACION• ADQUISICION• ANALISIS
FITC Fluorescence
Mo1
CD4 CD8
CD8
CD45
leu11a
CD20 Tube
ID
FORMA DE PRESENTACION DE DATOS
• Histograma• Gráfico de Puntos (Dot Plot)• Gráfico de Contorno (Countour
Plot)• Gráfico Isométrico (3D)• Gráfico de Densidad (Density Plot)
Citometría de flujo: mediciones
“GATE”
LM
G
SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN
Density Dot Plot Contour Plot
Color of dots can give indication Identify subpopulationsof frequency of events with proper contour lines
HISTOGRAMA(Un Parámetro)
coun
ts
Autofluorescenciay/o
control isotipo
M1
0 FL1
One parameter frequency histogram
# of events forparticular parameter
establish regions and calculate coefficient of variation (cv)cv = stdev/mean of half peak
ESTADISTICA DE CUADRANTES
(Dos Parámetros)
Autofluorescenciay/o
control isotipo
FL2
0 FL1
ESTADISTICA DE CUADRANTES
(Dos Parámetros)
+,-
4
+,+
2
-,+
1FL
2
-,-
3
0 FL1
CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES
• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . .
• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología
EVOLUCION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Inmunología Celular
Aplicaciones enPatología
AnticuerposMonoclonales
Citometría deFlujo
CITOMETRIA CLINICA
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS
• Linfocitos T totales :CD3(+)• Linfocitos T Helper :CD3(+)CD4(+)• Linfocitos T Sup/Citot :CD3(+)CD8(+)• Linfocitos B :CD3(-)CD19(+)• Linfocitos Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)
• Relación Linfocitos T CD4/CD8
Infección VIH-SIDA
File: 111.003Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12430Total Events: 15000
Quad Events % Gated % TotalUL 20 0.16 0.13UR 1496 12.04 9.97LL 2028 16.32 13.52LR 8886 71.49 59.24
RELACION CD4/CD8 = 0.17File: 111.004Acquisition Date: 23-Apr-Gate: G6Gated Events: 12512Total Events: 15000
Quad Events % Gated % TotalUL 600 4.80 4.00UR 8866 70.86 59.11LL 1499 11.98 9.99LR 1547 12.36 10.31
EXAMEN RESULTADO RANGO REF ERENCIA
LEUCOCITOS TOTALES 8.500 x m m 3
LINFOCITOS ABS OLUTOS 2.295 x m m 3
LINFOCITOS T (CD 3) 1.91683.50
x m m 3
% 59.4 - 84.6 %
LINFOCITOS B (CD 19) x m m 3
% 6.4 - 22.6 %
LINFOCITOS T (CD 4) 12.04276
%x m m 3
28.5 - 60.5 %
LINFOCITOS T CIT/S UP (CD 8) 70.861.626
%x m m 3
11.1 - 38.3 %
RELACION T CD 4 / CD 8 0.17 1.2 - 2.1
CELULAS LINFOIDES NK(NATURAL KILLER)
x m m 3
%
INFECCION VIH SIDA
ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38
• El aumento en la expresión de moléculas CD38 en LT CD8 es un fuerte indicador pronóstico de progresión hacia SIDA y muerte.
• Superior a:• Rto. LT CD4• Marcadores solubles• Combinación HLA-DR+ CD38+
J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997Cytometry 26:1-7, 1996Cytometry 33:115-122, 1998
INFECCION VIH SIDA
GIORGI et al.
• Carcaterizaron el número de moléculas CD38 en LT CD8:
1.- < 2.470 =======> PROGRESOR LENTO2.- 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO3.- 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO4.- > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO
• Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3 años
Cytometry 33:123-132, 1998J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997
Copyright Dennis Kunkel
Copyright Dennis Kunkel
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS
“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías
resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos
celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”
HEMATOPOYESISSTEM CELL
CFU-MLCFU-GEMM
LINFOCITO B LINFOCITO TCFU
ERITROIDEMEGACARIOCITO
CFUBASOFILO
CFUEOSINOFILO
CFU-GM
ERITROCITO BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO
CFU-L
PLAQUETAS MONOCITO
RETENCION DE ANTIGENOS
• Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados
CD19 CD19
Transformación
MalignaCELULA
PRE-B NORMALCELULA
LEUCEMICA
CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg
•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
•LMA : -LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)
Características normales
• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda
Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II:Común)
• Paciente sexo femenino• 78 años• Sangre periférica • WBC:169.000.
Sugerente de una Leucemia Promielocítica Hipogranular M3 HLA-DR (-)
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
Cellular Function
• Phagocytosis• Killing index of phagocytes• Intracellular cytokines• Calcium flux• Oxidative burst• Membrane potential
Phagosome
O2
O2-
H2O2
NADPH + H+
NADP+
HMP
NADPHOxidase
GSSG
GSHGR GP
H2O2SOD
O2-
H+
H2O
Catalase
H2O + O2
PCB
SOD
PCB(Reduced GSH level)
PKC(PMA)
?
?+
O2-
OH.
Lipid Peroxidation
Phospolipase A2 activityLeukotrienes
H2O2
Human Neutrophil
Stimulant
PCB
DCFH-DA DCFH DCFDCF
COOHH
Cl
O
O-C-CH3
OCH3-C-O
Cl
O
COOHH
Cl
OHHO
Cl
O
COOHH
Cl
OHO
Cl
O
Fluorescent
Hydrolysis
Oxidation
2’,7’-dichlorofluorescin
2’,7’-dichlorofluorescin diacetate
2’,7’-dichlorofluoresceinCellular Esterases
H2O2
DCFH-DA
DCFHDCFH--DADA
DCFHDCFH
DCF
H OH O2 22 2Lymphocytes
Monocytes
Neutrophils
log FITC Fluorescence.1
1000100101
0
20
40
60
coun
ts
PMA-stimulated PMNControl
80
• Adulto normal• No estimulado :• Estimulado con PMA :
25.86 %76.98 %
Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado
Estimulado
Estallido respiratorioCaso clínico:
• Paciente de sexo femenino• 8 años• Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus.• Granulomas fríos en cara y piernas• Déficit parcial de IgA.
• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos.
• Inicio de terapia antibiótica con claritromicina 250 mg/12 hrs por 30 días.
• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos, post terapia.
DCFA DCFADespués de terapia antibiótica
Estallido respiratorio en Granulocitos
No estimulado: 33.35 %
Estimulado: 42.66 %
No estimulado: 68.97 %
Estimulado: 57.48 %
DCFA DCFA
DCFA DCFA
DCFA
Estallido respiratorio en Monocitos
No estimulado: 25.97 %
Estimulado: 57.06 %
No estimulado: 76.26 %
Estimulado: 76.81 %
Después de terapia antibiótica
DCFA
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio,
fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo.
Bacterias: Uso de Microesferas (beads)
*
*+
Anti Ig humana conjugada
*
Ag
+bead
Suero paciente
Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806Cytometry 1994;18:103-108
CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer
• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes
• Cáncer de Esófago• Linfoma
ζCD3 CHAINS EXPRESION IN PERIPHEREAL T LYMPHOCYTES OF PATIENTS WITH
ADENOMATOUS POLYPS OF THE COLON
(*) Castillo JL2, Kawaguchi F.1,2, Venegas O.1,2, Castillo M.1,2, Madariaga J.1,2, Ortiz C2 ,
Riquelme F.2, Yañez CG.2, Vega E.2,.
(1) Medicine Faculty, University of Concepción, Chile. (2) Flow Cytometry and Gastroenterology Unit,
Worker Hospital, Concepción, Chile.
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous
polyps of the colon
• Total T lymphocytes :CD3(+)
• T Helper lymphocytes :CD3(+)CD4(+)
• T citotoxic lymphocytes :CD3(+)CD8(+)
• B lymphocytes :CD3(-)CD19(+)
• Natural Killer (NK) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)
• T CD4/CD8 ratio
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ANTIGEN/MHCANTIGEN/MHC
CD4CD4
TCR/CD3TCR/CD3
ζ ζ CHAINSCHAINSLckLckPTK PTK SrcSrc
ZAPZAP--7070
ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
• Low ζCD3 expression in:• Colon cancer • Prostate cancer • Renal cells cancer
• Related:• Disease stages • Prognosis• Death
• Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).• Healy C. et al . Cytometry 32:109-119 (1998).
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
• It has been proposed that the determination of ζCD3 expresion y tumoral and peripheral T lymphocytes, may be a neoplastic disease progresion marker.
Matsuda M. et al . Int. J. Cancer:61,765-772 (1995).Healy C. et al . Cytometry 32:109-119 (1998).Nakagomi H. et al. Cancer Research 53, 5610-12,1993.
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
Objetive: Evaluate the expression of ζCD3 chains in periphereal T lymphocytes by flow cytometryin patients with colon polyps
Patients: 24 reference subjects 19 Patients with adenomatous polips of the colon (APC) 10 Patients with hiperplasic polyps (HP) 5 Patients with recurrent oral thrush (ROT)
Sample type: Periphereal blood
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
APCn = 19
HPn = 10
ROTn = 5
Controln = 24
19.558(P=0.000)
72.948(P=1.000)
88.640(p=1.000)
87.291% LT ζ(+)
77.726(p=1.000)
16.404(p=0.000)
88.814(p=1.000)
% LCD4 ζ(+) 87.019
17.903(p=0.000)
69.601(p=1.000)
90.601(p=1.000)
87.823% LCD8 ζ(+)
Percentage of ζCD3 expression in T lymphocytes. p<0.05
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
ζCD3 chains expression in periphereal T lymphocytes of patients with adenomatous polyps of the colon
Conclusion:
1) The diminution of ζCD3 expression is related with the APC in patients without antecedents of any others neoplasia.
2) There are significant differences in ζCD3 expression between the APC and HP groups (p<0.05).
3) The diminution of ζCD3 in periphery may be suggestive of the APC in absence of any othersneoplasia.
Grant U. Concepción N°: 99.085.025-10.
CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer
• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes
• Cáncer de Esófago• Linfoma
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINALEspectro de presentación.
Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa
Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal
Inflamación persistente y/o recurrente
GranulomatosaCongestión ulcerativa
Cáncer
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Enfermedad de CrohnColitis ulcerosa
Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):
• Células epiteliales C.P.A.
• Macrófagos Moduladores
• Linfocitos: TCD4 Perpetuación
Induction and Modulation of Gastrointestinal InflamationFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.
Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal
• Antígenos luminales actúan como gatillantes• Epitelio intestinal:
• Permeabilidad aumentada• Secreción de citoquinas• Actúa como CPA
• Macrófagos de la lamina propia:• Perpetúan proceso inflamatorio
• Predisposición genética
ENFERMEDAD DE CROHN COLITIS ULCEROSA
Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon
Afecta a todo el tracto digestivo
Inflamación superficial de la mucosa
Proceso transmural y granulomatoso
Presencia de pseudopólipos
Compromiso de mucosa discontinuo
Colon normal
CrohnCrohn
C.U.
Macrófagos intestinales:
• Están localizados en la región subepitelial de la mucosa.• Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares
de la lamina propia. • Detección de su fenotipo:
• Inmunohistoquímica• Citometría de Flujo
• Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos encontrados en mucosa de EII y en personas que no la presentan
Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44
Pacientes:
UNIVERSO (n=70)
SOSPECHA CLINICA (+)ENDOSCOPIA (+) (n = 52) GRUPO
TESTIGO(n = 18)
HISTOLOGIA NO ESPECIFICA
(n = 38)
EII POR BIOPSIA (n = 14)
Método
Dgto. de EII: Clínico, endoscópico
e histológico Grupo de EII
Controles clínicos regulares Grupo testigo
Criterio de Exclusión
Consentimiento informado
Endoscopía
HLA-DRCD33
CD16CD33
Materiales y Métodos
Biopsia2 x 2 mm Disgregación
mecánica
30` oscuridad
FACSCalibur Software Cell-Questv.3.3
Mínimo de 10000 eventos
Pacientes según fenotipo HLA-DR en MI y diagnóstico de EII
Fenotipo MIEII-CH
100 (14)
0 (0)
100 (14)
p<0.001
Testigo
11.11 (2)
88.89 (16)
100 (18)
Total
65.71 (46)
34.29 (24)
100 (70)
HLA-DR(+)
HLA-DR(-)
Total
Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.001
HNC
78.94 (30)
21.06 (8)
100 (38)
p<0.001
Subtotal
84.61 (44)
15.39 (8)
100 (52)
p<0.001
Sospecha Clínica
HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica
Fenotipo MIEII-CH
85.71 (12)
14.29 (2)
100 (14)
P>0.05
Testigo
55.55 (10)
44.45 (8)
100 (18)
Total
74.28 (52)
25.72 (18)
100 (70)
CD16 (+)
CD16 (-)
Total
Pacientes según fenotipo CD16 en MI y diagnóstico de EII
HNC
78.94 (30)
21.06 (8)
100 (38)
p<0.05
Subtotal
80.76 (42)
19.24 (10)
100 (52)
p<0.05
Sospecha Clínica
HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación Histológica
Chi Cuadrado con corrección de Yates p < 0.05
Especificidad
88.9
88.9
88.9
VPN
66.7
66.6
100
VG
85.7
82.0
93.7
Sospechaclínica
HNC
EII-CH
Indices de validación para HLA-DR en EII
Sensibilidad
84.6
78.9
100
VPP
95.7
93.7
87.5
HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global
Especificidad
44.4
44.4
44.4
VPN
44.4
50.0
80.0
VG
71.4
67.85
62.5
Sospechaclínica
HNC
EII-CH
Indices de validación para CD16 en EII
Sensibilidad
80.8
78.9
85.7
VPP
80.8
75.0
54.5
HNC: Histología no concluyenteEII-CH: EII con confirmación HistológicaVPP: Valor predictivo positivoVPN: Valor predictivo negativoVG: Valor Global
CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer
• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes
• Cáncer de Esófago• Linfoma
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
•Tejido fresco o congelado.
•Tejido fijado en formalina -desparafinado.
Concordancia : 90 %.
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
TEJIDO FRESCO
Ventajas :
- Células enteras ( ADN, Ags. de membrana y citoplasma ).- Menor debris ( mejor resolución del histograma ).
Desventajas :
- No es posible la localización histológica de áreasde interés.
- Proceso inmediato o congelación.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
TEJIDO FIJADO EN FORMALINA Y DESPARAFINADO
Ventajas :
- Selección histológica de áreas de interés.- Permite estudio retrospectivo en individuos de curso clínico conocido.
Desventajas :
- Núcleos “desnudos”.- Fijación en formalina o microondas.- Mayor debris.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR
• Se evalúa el contenido relativo de ADN en el núcleo de una célula normal o neoplásica.
• Se obtiene una estimación de las fases delciclo celular.
• Se utilizan sustancias fluorescentes que tiene afinidad con el ADN (PI, DAPI, BrEt).
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999 J.L.C.N.
CICLO CELULARCICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)
MITOSISM
1 hrG2(4n) G0 (2n)
9 hr
4 hrPost Síntesis DNA
10 hrs
Síntesis ADN S G1 (2n) Pre-síntesis ADN
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
4n2n
FASES G0G1
NU
ME
RO
DE
CE
LU
LA
S
HISTOGRAMA DE ADN OBSERVADO
FASE S FASES G2+M
CONTENIDO DE ADN
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
Histograma Diploide o “Normal”
Histograma Aneuploide
Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.
La ploidía del ADN se expresa como Indice de ADN ( IA ):
IA = G0G1 población en estudioG0G1 población de referencia
Población de referencia : tejido normal del cual se origina el tumor en estudio.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.
IA = 1 ADN diploide.IA > 1 ADN aneuploide.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
ANEUPLOIDIA
•Grado de malignidad
•Pronóstico
Invasión
Metástasis
Evolución natural
Respuesta a tratamiento
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ANALISIS CITOMETRICO DE TUMORES SOLIDOS
PROLIFERACION CELULAR
•Tiempo libre de enfermedad.
•Sobrevida.
Conferencia de Consensos en Citometría del ADNOctubre de 1992. Cytometry 14:471-7, 1993.
Proliferación Celular :
Fracción Fase S tiene valor predictivo positivo
S+G2M no debería usarse.
Fracción Fase S específica de células tumoraleses el parámetro citométrico más relevante como
factor pronóstico independiente.
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
Métodos de estudio para Proliferación celular
ESTUDIO DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR
• Estudio del comportamiento biológico de poblaciones celulares dentro de un tumor.
• Determinación de Fracción proliferativa (Fases S + G2M) de una población celular.
• Pronóstico y sobrevida de pacientes afectados de cáncer.
• Estudios de viabilidad.• Apoptosis.
Aplicaciones:
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Determinación de parámetros de ciclo celular por Citometría de Flujo en pacientes con pólipos adenomatosos
de colon y en mucosa colónica normal.Resumen de las medias de fases de ciclo celular para grupo control y PAC
IDGrupo G0G1(%) G2M(%) Fase S(%) Fp
Control(n=21) 0.99 6.33 11.1188.88 4.77
PAC(n=60) 1.02 6.88 20.4679.53 13.58
0.0013 (*)p(<0.05) 0.0002 (*) 0.0027 (*) 0.0002 (*)0.0044 (*)
ID: Indice de ADN; FP = (Fase S +G2M)
File: C-A.001Source: COLONAnalysis type: Manual analysisPrep: Fresh/Frozen
DIPLOID: 100.00 %Dip G0-G1: 91.49 % at 51.25Dip G2-M: 1.69 % at 98.83Dip S: 6.82 % G2/G1: 1.93Dip %CV: 2.86
Total S-Phase: 6.82 %
Debris: 4.90 %Aggregates: 0.73 %Modeled Events: 20660RCS: 17.549
Channels150
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Num
ber
Mucosa colon normal
0
0 50 100 200 250
File: 102-A.001Source:ESTOMAGOCase: 7093Analysis type: Manual analysis
ANEUPLOID 1 : 72.38 %An1 G0-G1: 75.23 % at 83.39An1 G2-M: 3.27 % at 166.78An1 S: 21.51 % G2/G1: 2.00An1 % CV: 3.18An1 DI: 1.30
ANEUPLOID 2 : 27.62 %An2 G0-G1: 43.96 % at 101.50An2 G2-M: 5.69 % at 203.00 An2 S: 50.36 % G2/G1: 2.00 An2 % CV: 9.45
An2 DI: 2.01Total S-Phase: 29.47 %Modeled Events: 16036
Channels100 150
1200
900
Num
ber
600
300
0
0 50 200 250
MUESTRAS USADAS PARA ANALISIS DE PLOIDIA DE ADN Y CICLO CELULAR POR
CITOMETRIA DE FLUJO
I Suspensiones Celulares:• Líneas Celulares.• Sangre Periférica• Médula Osea• Fluídos con alta celularidad (Liq. ascítico,
peritoneal, etc.)II Tumores Sólidos:
• Tejido sólido• Aspirado Celular
III Tejidos Embebidos en Parafina
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Citometría de flujo enel estudio pronóstico del
Cáncer Gástrico Avanzado
Oscar Lynch, Jaime Madariaga, Fernando Kawaguchi,Juan Luis Castillo, Gabriel Astete, y Cols.
Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174
Resultados en Cáncer Gástrico Avanzado :
PLOIDIA
FASE S
Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174
Fase Ses un factor pronóstico independiente
en Cáncer gástrico Avanzado
Cuadernos Chilenos de Cirugía N°40, 1996: 166-174
CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer
• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes
• Cáncer de Esófago• Linfoma
ESOFAGO
• Mucina 1• Ciclo celular• Ploidía de ADN• p53
Carcinoma superficial de
células escamosas
Marcadores pronósticos
• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Int J Cancer 1999;84(3):251-7• Cancer 1999:85(11):2322-8
ESOFAGO
Otros marcadores biológicos:
• Ciclina D1• Rb• PCNA• E-caderina• TGF-α
• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Dig Dis Sci 2000 (5):864-9• Hum Pathol 1999 (9): 1087-92• Br. J Cancer 2000;82(4):865-70
ESOFAGO DE BARRET
• Ploidía de ADN• Ciclo celular• p53• PCNA• Ciclina E• Mucinas (MUC-2)• Ki-67
• Endoscopy 2001;33(1):1-7• Cancer 1999; 86(12):2597-601• Am J Gastroenterol 1999; 94(10):2829-33• World J Surg 2000; 24(1):72-7
CITOMETRIA DE FLUJO:Gastroenterología y Cáncer
• Inmunología y pólipos de colon.• Enfermedad Inflamatoria Intestinal.• Tumores sólidos:
• Ciclo celular y Ploidía de ADN.• Proteínas del ciclo celular• Oncogenes
• Cáncer de Esófago• Linfoma
LINFOMA
• Poblaciones Linfoides T• Poblaciones Linfoides B:
• Expresión de cadenas livianas tipo kappa• Expresión de cadenas livianas tipo lambda
• Ausencia de otros marcadores (CD5, CD10, CD34)
Helicobacter pyloriMALT
• Hematology 2001• BMC Gastroenterology 2 (WWW.biomedcentral.com/1471-230x/2/6)
¿?
Citometría de Flujo: Clínica, Investigación,
Gastroenterología y CáncerT.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.Laboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.
Concepción, Noviembre de 2003