Post on 07-Apr-2016
Cincinnati Children's Hospital Medical Center Universidade de Brasília
Brasília - 2005
Atresia das vias biliares extra-hepáticas:Expressão gênica em um modelo experimental
Autora:Elisa de Carvalho
Orientador:Luiz Alberto Simeoni
Co-orientador:Jorge A. Bezerra
I - Introdução
AVBEH: principal indicação de transplante hepático
AVBEH: 50% dos transplantes hepáticos pediátricos
BALISTRERI, W. F. et al. Biliary atresia: current concepts and research directions. Summary of a symposium. Hepatology 23, 1682-1692 (1996).
Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é responsável por essa monta de indicação para o transplante.
AVBEH: principal indicação de transplante hepático
Hipertensão portalCirrose biliar
Varizes esofagogástricasHiperesplenismo
AsciteInsuficiência hepática
Síndrome hepatopulmonarSíndrome heparorrenal
AVBEH
Colestase
Complicações da portoentorostomiaComplicações da
doença Colangite
Progressão da hepatopatia?
Terapêutica: portoenterostomia
Evolução pós-portoenterostomia
Diagnóstico tardio
?Etiopatogênese
Injúria durante o desenvolvimento dos ductos biliares (primeiro trimestre)
Defeitos na morfogênese: Genes da lateralidade INV CFC1 ZIC3 Má-formação da placa ductal JAG 1 HNF-6 HNF-1β HLA
Artéria hepática Canal pancreatobiliar
AVBEH (embrionária)
AVBEH
(perinatal)
Reovírus Rotavírus Citomegalovírus
Resposta TH1 Células T CD8+
Células NK Macrófagos
Ácidos biliares tóxicos
Desenvolvimento do fígado e vias biliares
Predisposição genética
Fatores ambientais (infecção viral)
Disfunção imune no neonato
Fatores anatômicos Toxicidade
Auto-imunidade
20 %
Embrionária
80 %
Perinatal
Etiopatogênese
Histologia das vias biliares
Obstrução progressiva
das VBEH
Modelo animal: AVBEH
Camundongos Balb/c
Rotavírus rhesus do grupo A
PHILLIPS, P. A. et al. Chronic obstructive jaundice induced by Reovirus type 3 in weanling mice. Pathology 1, 193-203 (1969).
SCHMELING, D. J. et al. Experimental obliterative cholangitis. A model for the study of biliary atresia. Ann. Surg. 213, 350-355 (1991).
RIEPENHOFF-TALTY, M. et al. Group A rotaviruses produce extrahepatic biliary obstruction in orally inoculated newborn mice. Pediatr. Res. 33, 394-399 (1993).
PETERSEN, C. et al.
New aspects in a murine model for extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 32, 1190-1195 (1997).
Modelo animal: AVBEH
Camundongos Balb/c
Rotavírus rhesus do grupo A
Indução: AVBEH
Carga viral
Idade do animal
Via de inoculação
106 PFU/mL
< 12 horas
Intraperitoneal
Modelo animal: bem estabelecido, como
adequado para pesquisas experimentais relacionadas
à atresia.
Modelo animal: AVBEH
Camundongos Balb/c
Rotavírus rhesus do grupo A
RRV
Inflamação e fibrose obliterante
Fator inicial:
Infecção
Expressão gênica
As modificações da expressão gênica comandam os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o a lesão inicial.
Hipótese do estudo
Genoma
Ativação ou desativação reacional de genes
Reprogramação da função celular(Estimulação ou inibição de processos biológicos)
Inoculação de RRV
Fibrose progressiva com obliteração das VBEH
II - Objetivos
Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das vias biliares extra-hepáticas, em modelo experimental de AVBEH, nas diferentes fases da
evolução dessa doença.
Objetivo geral
Identificar os genes ativados e os desativados, nos camundongos infectados pelo RRV, em relação ao grupo controle, nos diferentes
estágios da obstrução biliar.
Avaliar os processos biológicos que se correlacionam ao desenvolvimento da atresia das vias biliares extra-hepáticas.
Identificar e analisar as vias moleculares que regulam o dano celular e a obliteração das vias biliares extra-hepáticas.
Objetivos específicos
III - Métodos
Estudo experimental, randomizado e controlado.
Desenho do estudo
Injeção intraperitoneal: 20 μL de soro fisiológico 0,9%, primeiras 24 horas de vida.
114 camundongos Balb/c: menores que 24 horas de vida filhos de mães negativas para o RRV
injeção intraperitoneal: 1,5 x 106 UFF de Rotavírus rhesus do grupo A (20 μL) primeiras 24 horas de vida
Grupo A (modelo animal de AVBEH): 63 camundongos
Grupo B (grupo controle): 51 camundongos
Excluídos: animais do grupo A que não desenvolveram AVBEH.
03 amostras RNA: Microarranjos
03 amostras RNA: RT PCR
03 amostrasHistologia: VB
102 Camundongos Balb/c (< 24 horas de vida)
Inoculação intraperitoneal com RRV
Inoculação intraperitoneal com SF 0,9%
Grupo A: 51 camundongos(modelo animal de AVBEH)
Grupo B: 51 camundongos(grupo controle)
Clínica: peso, icterícia, colúria e acolia fecal Laboratorial: bilirrubinúria
Anestesia: Microdissecção e ressecção das vias biliares
Retirada de dois fragmentos hepáticos
Animais sacrificados com:
03 dias de vida: subgrupos A1 e B1
07 dias de vida subgrupos: A2 e B2
14 dias de vida subgrupos: A3 e B3
Amostra 01
Dia 3
Amostra 01
Dias 7 e 14
RT PCR: teste de maior acurácia para determinação da expressão gênica.
GeneChip: permite a avaliação do transcriptoma (perfil de “funcionamento” de todos os genes em um momento específico -
níveis de mRNAs dos genes expressos) em um único ensaio.
Avaliação da expressão gênica
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Novas tecnologias
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Várias seqüências de nucleotídeos (representando todo o genoma) são depositadas em uma superfície de vidro (o chip) e
cada oligonucleotídeo configura uma sonda para um gene específico.
RNA
LipídeosCarboidratos
Proteínas
Homogeneização e lise celular (TRIzol)
Fase da separação (fenol/clorofórmio)
Precipitação (isopropanol)
RNA
RNA
Extração: RNA das vias biliares
TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA
Qualidade do RNA
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Local de origem do sinal de fluorescência e a intensidade deste identifica o gene em questão e seu
nível de expressão.
Unidade de expressão: pixel
Quantificação do sinal de fluorescência: sistema GeneChip®
Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring
Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring
Avaliação conjunta dos resultados de todas as amostras.
Comparação entre os grupos experimental e controle.
Avaliação estatística.
Classificação dos genes em funções biológicas (Gene Ontology).
Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos
NormalizaçãoGrupo experimental X Grupo controle(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
GeneSpring
O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um valor relativo (ou normalizado) em relação ao controle.
Primeira etapa:Média de todos os sinais da expressão gênica.Este valor é dividido por cada um dos sinais individualmente. Objetivo: evitar valores extremos.
Segunda etapa:As amostras do grupo controle foram usadas como valor basal. A intensidade do sinal de cada gene no grupo experimental foi dividida pelo valor do mesmo gene no grupo controle, o que foi realizado separadamente para os dias 3, 7 e 14.
Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos
NormalizaçãoGrupo experimental X Grupo controle(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
Seleção dos genes(Anova p < 0,01)
Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controleGenesativados ou desativados < 2x em relação ao controle
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos
NormalizaçãoGrupo experimental X Grupo controle(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
Seleção dos genes(Anova p < 0,01)
Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controleGenesativados ou desativados < 2x em relação ao controle
Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixelsem pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo
(Diagrama de Venn)
GeneSpring
Reclassificação dos genes(PubMed, GeneCard, UniGene, Gene, GeneBank)
Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos
NormalizaçãoGrupo experimental X Grupo controle(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
Seleção dos genes(Anova p < 0,01)
Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controleGenesativados ou desativados < 2x em relação ao controle
Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixelsem pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo
(Diagrama de Venn)
Seleção dos processos biológicos (Anova p < 0,05)
GeneSpring
Validação dos resultados do GeneChip
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
RT PCR: Quantificação do número de cópias
Sinal de fluorescência: SYBR Green
Curva de amplificação da RT PCR com várias amostras
Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT
Quantidade de cópias inicial da amostra
Fluo
resc
ênci
a em
itida
Região da linha de base
Número de ciclos
Amostra: sem DNA
CT
Linha que delimita o nível de detecção do
sinal de fluorescência
ThresholdAmostra
Platô
Cálculo da expressão gênica
Gene padrão: 18S. Animais do grupo experimental e do controle.
Expressão de um gene
Expressão do gene no grupo experimental Expressão do gene no grupo controle
Quantidade de cópias do gene-alvoQuantidade de cópias do gene padrão
Variação da expressão
Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7):
Fígado e árvore biliar extra-hepática
Especificidade dos microarrranjos:
árvore biliar extra-hepática
Validação: RT PCR
IV - Resultados
Outros estudos: 67% a 86%Petersen C et al., 1997; Czech-schmidt G et al., 2001;
Shivakumar P et al., 2004
AVBEH: 51 camundongos (81%)
63 camundongos
Incidência de AVBEH: animais infectados por RRV
Evolução da infecção pelo RRV
Icterícia
Colúria
Acolia fecal
Ausência:
Quadro diarréico
Humanos: diarréia importante (O'ryan M. et al., 2005)
Animais mais velhos: ausência de icterícia (Feng N. et al., 1994)
X
AVBEH: quadro clínico
RRV: tropismo pelos colangiócitos
Brevidade cronológica
Camundongos
Não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal
RRV: tropismo único pelas células do epitélio biliar neonatal
(Shivakumar et al., 2004)
De modo similar em humanos:
Atresia é observada apenas em lactentes nos primeiros três meses de vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou em adultos.
BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J. Pediatr. 106, 171-184
(1985).
BEZERRA, J. A. & BALISTRERI, W. F. Cholestatic syndromes of infancy and childhood. Semin.
Gastrointest. Dis. 12, 54-65 (2001).
Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce
Pode desempenhar um papel importante na história natural dessa doença.
Aspecto macroscópico das vias biliares extra-hepáticas
Vesícula biliar distendida . Vesícula biliar pequena e contraída.
Vias biliares de aspecto normal. Vias biliares estreitas e fibrosadas.
Grupo experimental
Grupo controle
Avaliação histológica das vias biliares
Barra preta: 100 μm
Dia 3 Dia 7 Dia 14
Dia 14Dia 3 Dia 7
Peso médio dos camundongos
Peso médio dos camundongos relacionado aos dias seguidos à inoculação com SF0,9% ou RRV, com p < 0,01 dos dias 7 a 14.
SF 0,9%
RRV
* * * * * * * *
Fenótipo da AVBEH em crianças
Modelo animal:
Idade
Sinais clínicos
Aspectos macroscópicos
Histologia
Evolução
Hipodesenvolvimento:
Redução da ingesta alimentar
Esteatorréia
ss
Grupo experimental
Dia 3 Dia 7 Dia 14
Grupo controle
Avaliação histológica do fígado
Dia 3 Dia 7 Dia 14
RRV (vias biliares e tecido hepático):
identificado nos animais sacrificados com 7 dias
RRV (vias biliares e tecido hepático):
Não foi isolado naqueles sacrificados com 14 dias.
Papel do vírus
Efeito citopático direto do vírus
Potencial papel dos processos imunes na evolução da doença.
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental
biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
MACK, C. L. et al. Armed CD4+ Th1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine
biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200-209 (2005).
Infiltrado linfocitário periductular
Predomínio: linfócitos TH1 e CTLs. SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary
atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
Transcriptoma das vias biliares
849 genes
Transcriptoma das vias biliares(45.101 genes transcritos)
Anova p < 0.01Genes ativados ou desativados < 2x ou > 2x
Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels
Seleção dos processos biológicosAnova p < 0,05
E
e
Alto
Baixo
3SF 3RRV 7SF 7RRV 14SF 14RRV
Árvore genética: GeneSpring
359 genes
Dia 3:ImunidadeEnzimas
Proteínas estruturaisTransporte
Transcrição e tradução
Dia 7:ImunidadeEnzimas
Proteínas estruturaisApoptose
Transdução de sinais
Dia 14:ImunidadeEnzimas
Proteínas estruturaisTranscrição e traduçãoTransdução de sinais
498 genes
Ativados:310 genes
(62%)
Reclassificação funcional dos genes(PubMed, UniGene, Gene, GeneCard, GeneBank)
Dia 3 Dia 7 Dia 14
ll
Dia 3 Dia 7 Dia 14 Genes ativados
Transdução de sinalApoptose
Transcrição e traduçãoTransporte
Proteína estruturalEnzima
Imunidade
Imunidade: três etapas da pesquisa.
Maior número de genes ativados: processos imunes no dia 7.
Classificação funcional dos genes ativados nos dias 3, 7 e 14.
Imunidade
Dia 3
Imunidade adquirida
Fase precoce da lesão biliar (dia 3)
Imunidade inata
Imunidade inata
Células fagocitárias (neutrófilos e macrófagos)
Frações do complemento
Ativação macrofágica
C1R
Ativação da cascata de complemento
Tyki
TAP2, TAPBP PSMB8
Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
TAP2, TAPBP PSMB8
H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10
Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
TAP2, TAPBP PSMB8
H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10
Imunidade celular
Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
LY6A
Etapas da imunidade adquirida
Ativação dos linfócitos
LY6E
Dias após a exposição ao antígeno
IRF9
IFIT1
Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT
i) Processamento e apresentação do antígeno
ii) Aumento da expressão do MHC da classe I
iii) Fatores reguladores dos interferons
iv) Estimulação dos linfócitos T
Imunidade adquirida: dia 3
Imunidade celularImunidade humoral
BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).
Imunidade
Dia 7
Imunidade inata: complemento
C1Qα, C1Qβ
C3αR1
C1R – Dia 3
FcγRIIIA (CD16)
Célula NK
Célula NK
ativada
FcγRIII (CD16)
Citotoxicidade mediada por anticorpos
Ac liga-se ao antígeno na superfície do patógeno
Receptores Fc (NK) reconhecem os Ac
Sinalização para célula NK matar a célula-alvo
A célula alvo morre por apoptose
Catepsinas
Biossíntese do MHC da classe II
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+
IFNG
BROOME, U. et al. Different expression of HLA-DR and ICAM-1 in livers from patients with biliary atresia and Byler's disease. J. Hepatol. 26, 857-862 (1997).
FENG, J. et al. The aberrant expression of HLA-DR in intrahepatic bile ducts in patients with biliary atresia: an immunohistochemistry and immune electron microscopy study. J. Pediatr. Surg. 39, 1658-1662 (2004).
KOBAYASHI, H. et al. Hepatic overexpression of MHC class II antigens and macrophage-associated antigens (CD68) in patients with biliary atresia of poor prognosis. J. Pediatr. Surg. 32, 590-593 (1997).
Expressão anômala do MHC da classe II nos ductos biliares: lesão progressiva
TCRB-V13
Sinapse imunológica
Redistribuição dos receptores
e seus ligantes
Receptores das células T e seus ligantes
Reconhecimento do antígeno
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
Sinapse imunológica
Redistribuição dos receptores
e seus ligantes
Receptores das células T e seus ligantes
Reconhecimento do antígeno TCRB-V13
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
LFA1
Moléculas de adesão intercelular
DILLON, P. W. et al. Differential expression of the major
histocompatibility antigens and ICAM-1 on bile duct epithelial
cells in biliary atresia. Tohoku J. Exp. Med. 181, 33-40 (1997).
DAVENPORT, M. et al. Immunohistochemistry of the liver
and biliary tree in extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg.
36, 1017-1025 (2001).
Moléculas de adesão: papel significativo na
reação inflamatória na atresia biliar, por
ocasionarem atração, retenção e ativação
dos leucócitos circulantes.
Determina a atividade de sinalização das cinases da família Src.
Sinapse imunológica
Redistribuição dos receptores
e seus ligantes
Receptores das células T e seus ligantes
Reconhecimento do antígeno
TCRB-V13
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
LFA1
Outro evento de sinalização intracelular é a fosforilação das tirosinas, por tirosinas
cinases da família Src.
CD45R
HCK
Sinapse imunológica
Redistribuição dos receptores
e seus ligantes
Receptores das células T e seus ligantes
Reconhecimento do antígeno
TCRB-V13
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
LFA1
CD45R
Componentes essenciais:
sinapse imunológica
Dia 7
Fundamental:ativação dos
mecanismos de sinalização intracelular na ativação da célula T
Regulam a produção de
citocinas.
Desenvolvimento das subpopulações das células T
Subpopulações: TH1 e TH2
Ativação das células T
Estágio inicial: diferenciação da
célula T
Polarização: citocina
Etapas do desenvolvimento
dos linfócitos.
IL2RG
Principal citocina:célula T naive.
Crescimento e diferenciação das células T.
Proliferação e a expansão clonal
das células T naive
A proporção relativa dessas subpopulações é o principal determinante das funções protetoras e das conseqüências patológicas da resposta imune.
Pergunta: predomínio TH1 ou TH2?
TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG
(D) Aumenta da expressão das moléculas do MHC das classes I e II.
Ações biológicas do interferon gama
(B) Nas células B, promove a troca do isótopo para anticorpos opsonizantes e fixadores de complemento.
(A) Ativação de macrófagos, que passam a apresentar maior atividade microbicida.
(C) Promove a diferenciação das células T CD4+ naive para a subpopulação TH1 e inibe a proliferação das células TH2.
TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG
Citocina: estabelece a presença de atividade das células TH1.
IFNG
Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT
CXCL10, TGTP, CXCL9, LY6C, IGTP, IFI1, IIGP1, SAMHD1, AIF1 e genes do MHC das classes I e II
STAT1
Aciona a transcrição dos genes induzidos pelos interferons.
Ativação temporal dos indutores do interferon em fases precoces da lesão biliar, seguida da expressão de uma rede molecular dirigida pelo interferon gama, que
conhecidamente polariza os linfócitos em um perfil pró-inflamatório TH1.
Dia 3
Fatores reguladores do interferon
(IRF7 e IRF9)
Dia 7
Interferon gama
Genes induzidos pelo Ifnγ
Via molecular com genes correlacionados
BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in children with biliary atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).
Aumento do interferon gama e do osteopontin, sinalizando a resposta TH1, bem como a desativação dos genes relacionados às imunoglobulinas.
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
Camundongos knock out para essa citocina importância do interferon gama no desenvolvimento da obstrução biliar.
Modelo animal
Crianças MACK, C. L. et al. Biliary atresia is associated with CD4+ TH1 cell-mediated portal tract inflammation. Pediatr. Res. 56, 79-87 (2004).
Perfil de citocinas característico da presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2, interferon gama, TNFα e IL-12.
MACK, C. L. et al. Armed CD4+ TH1 effector cells and activated macrophages participate in bile duct injury in murine biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200-209 (2005).
Aumento da produção do interferon gama pelos linfócitos TH1 e elevação do TNF-α produzido pelos macrófagos.
Papel do interferon gama na obstrução das vias biliares
Transcriptoma: dia 7
TNFRSF1β, TNFαIP2
Mediador da resposta inflamatória
Fagócitos mononucleares ativados, células T estimuladas por antígenos,
células NK e mastócitos.
IFNG
Enzima
Dia 7
Catepsinas
Biossíntese do MHC da classe II
Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+
CTSC, CTSS
Processamento do antígeno
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
Expressão coordenada de genes co-relacionados
Apoptose
Dia 7
GZMA
GZMB
Papel: CTLs
Mediadores da apoptose: exocitose de grânulos
Lise das células-alvo
CASP8
Mediadores da apoptose: mediada por FasL-Fas
Expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares pode participar da lesão progressiva dos ductos biliares intra-hepáticos após a portoenterostomia.
LIU, C. et al. Expression of fas ligand on bile ductule epithelium in biliary atresia--a poor prognostic factor. J. Pediatr. Surg. 35, 1591-1596 (2000).
Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
Imunidade
Dia 14
Silenciamento: diminuição dos processos imunes no dia 14
HAMP1 Maior ativação gênica
LCN2
Diminuem a disponibilidade de ferro e, por isso, além de agirem como fatores de defesa, também podem ser responsáveis pela
anemia da inflamação ou doença.
VAP1
Desativação: Recrutamento de linfócitos
CCL21A
Ativação: Metabolismo do ferro
Transdução de sinais
Dia 14
Silenciamento de genes
Transdução de sinais relacionados à imunidade
Fatores de transcrição das células T
RHOB
JUN
MAP2K5
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
FKBP5
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
Inibição química desse fator: preveniu a obstrução biliar secundária ao RRV.
FENG, J. et al. Rotavirus-induced murine biliary atresia is mediated by nuclear factor-kappaB. J. Pediatr. Surg. 40, 630-636 (2005).
NF-κB regula a expressão de muito genes relacionados à resposta inflamatória/imune.
Sinergismo com o STAT1: sinalização da resposta aos interferons.
Desativação das vias responsáveis:
Produção do AP-1
Ativação do NFAT
Via molecular coordenada por genes co-relacionados:
Proteínas estruturais
Matriz extracelularDia 7: FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGNDia 14: COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3
Exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática.
Desativados
Alta expressão: “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”.
CHEN, L. et al. Altered expression of genes involved in hepatic morphogenesis and fibrogenesis are identified by cDNA microarray analysis in biliary atresia. Hepatology 38, 567-576 (2003).
CHOE, B. H. et al. The pattern of differentially expressed genes in biliary atresia. J. Korean Med. Sci. 18, 392-396 (2003).
Pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar.
Microscópio de captura a laser de alta resolução.
Validação dos resultados dos microarranjos pela RT PCR
Curva standard: expressão gênica
Curva standard do gene Irf9
RT PCR: curva de dissociação
Curva de amplificação do gene Stat1, das 18 amostras
Resultados do RT PCR
Etapa Gene Descrição Variação*
Dia 3 IRF7 Interferon regulatory factor 7 45,2
Dia 3 IRF9Interferon dependent positive acting transcription factor 3 gamma 7,0
Dia 7 IGTP Interferon gamma induced GTPase 35,3
Dia 7STAT1
Signal transducer and activator of transcription 1
12,7
Dia 7 CXCL10 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 63,5
Dia 7 CXCL9 Chemokine (C-X-C motif) ligand 9 57,4
Dia 7 IFNG Interferon gamma 69,1
Genes escolhidos para validação dos resultados dos microarranjos:
IRF7, IRF9, IFNG, IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10
VariaçãoIRF7
(Dia 3)IRF9
(Dia 3)IFNG
(Dia 7)IGTP
(Dia 7)STAT1(Dia 7)
CXCL9(Dia 7)
CXCL10(Dia 7)
GeneChip 13 4.1 3.9 12.2 12.5 24.7 36.8
RT PCR 45.2 7.0 69.1 35.3 12.7 57.4 63.5
Quantificação da expressão gênica nos microrarranjos e na RT PCR
Diferença no grau de ativação:
A RT PCR apresenta maior acurácia e sensibilidade em relação aos microarranjos de oligonucleotídeos, tendo também maior reprodutibilidade.
DING, C. & CANTOR, C. R. Quantitative analysis of nucleic acids--the last few years of progress. J. Biochem. Mol. Biol. 37, 1-10 (2004).
Validam os obtidos nos microarranjos (GeneChip®)
Polarização para a resposta imune adquirida TH1.
Resultados da RT PCR
Confirmam a existência do circuito inflamatório associado ao interferon gama.
Especificidade dos microarrranjos
1,2
33,1
Fígado Vias biliares
*Citoqueratina-7 (KRT2-7): filamento presente nos colangiócitos
Em resumo...
Alvos de intervenção terapêutica?
Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
Lesão e na obstrução das vias biliares
Papel do sistema imune Interferon gama, TH1
Moléculas: sinapse imunológica
Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe II
Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe I
Aumento da expressão do MHC da classe I
Aumento da expressão do MHC da classe II
Fase precoce
Fase tardia
Ativação da cascata do complemento
Apoptose
Novos achados
Citotoxicidade mediada por anticorpos
VI - Conclusões
O transcriptoma da árvore biliar demonstrou a presença predominante de um processo pró-inflamatório, neste modelo experimental da atresia de
vias biliares extra-hepáticas, com ativação reacional de genes em períodos específicos da progressão do processo obliterativo.
Notavelmente, os animais portadores de AVBEH apresentaram ativação do interferon gama e a expressão seqüêncial de uma rede hierárquica de
genes relacionados à essa citocina, o que reflete um predomínio da resposta TH1.
A definição dos papéis de cada componente desse circuito inflamatório deve contribuir para a elucidação dos mecanismos etiopatogênicos da
AVBEH e para o advento de novas opções terapêuticas que influenciem na evolução da doença, no prognóstico do paciente e na necessidade do
transplante hepático.
Coletivamente, esses genes formam uma seleção transcricional altamente importante para a direção de estudos futuros, que possam explorar como
genes individuais ou grupo de genes relacionados entre si podem regular o início da lesão biliar, bem como a progressão para obliteração das vias
biliares.
A ativação de outros processos biológicos relacionados à apoptose, à cascata de complemento, à ADCC e aos fatores epigenéticos demonstra a presença dessas vias metabólicas durante o desenvolvimento da doença.
Elisa de Carvalho
Cong Liu
Pranavkumar Shivakumar
Gregg Sabla
Bruce Aronow
Jorge A. Bezerra
Autores
Se consegui enxergar mais longe
é porque estava apoiado sobre os ombros de gigantes.
Isaac Newton, Matemático Inglês.Obrigada!
USP18: imunidade inata. SLFN4: crescimento e desenvolvimento das células T. OASL2, OAS1G e OAS2: atividade antiviral, induzida pelos interferons. GBP1, GBP2 e GBP3: proteína ligadora de GTP com atividade GTPase, induzida pelo interferon gama durante ativação macrofágica. GZMA: apoptose. PSMB8, PSMB9 e PSMB10: processamento de antígeno para o MHC da classe I. SAMHD1: induzida pelo interferon, proteína de ligação ao GTP. CTSS e CTSC: proteólise, processamento do antígeno e geração de peptídeo para o MHC da classe II. CYBB, CYP1B1, CYBA, NCF1 e NCF2: complexo NADPH oxidase (fagocitose). PLA2G7: ativa os neutrófilos polimorfonucleares e aumenta a permeabilidade vascular. Atua na inflamação e na anafilaxia. Produzido por plaquetas, leucócitos e células endoteliais. HCK: membro da família Src da tirosina cinase, exerce papel na resposta imune inata e na sinalização para ativação do STAT 5. PTPRC (CD45R): pertence à família dos receptores da tirosina fosfatase, que desempenha papel na sinalização dos receptores dos linfócitos B e T. LYZS: tem função bacteriolítica, em tecidos e fluidos corporais. PTPN18: fosforilação de aminoácidos. Desfosforila a autofosforilada tirosina cinase.
Processos imunes – Enzimas – Dia 7
Papel da colestase: lesão histológica hepática
Ácidos biliares hidrofóbicos
Apoptose primária de hepatócitosPALMEIRA, C. M. & ROLO, A. P. Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids.
Toxicology 203, 1-15 (2004).
Institutional Animal Care and Use Committee of Cincinnati Children’s Hospital Research Foundation.
Avaliação do comitê de ética médica
Transporte
Dia 3
Transportadores de membrana (ATP8A1 e LAPTM4A)
Transportadores nucleares (XPO7 e NUTF2)
Metabolismo (STARD4)
Imunidade (TAP2)
Transporte de ânions (SLC4A2)
Transporte de cátions (ATP6V1B2)
Transporte de colesterol (APOB)
Transporte de aminoácidos (SLC1A4)
Ativados
Desativados
Controle da transcrição e da tradução
Dia 14
Fatores de transcrição: TCF21, MEIS1, PBX1, ZF, CEBPG, ZBTB20, JUN
Splicing do RNA: SFRS7
Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1
Desativados
RNA
LipídeosCarboidratos
Proteínas
Homogeneização e lise celular (TRIzol)
Fase da separação (fenol/clorofórmio)
Precipitação (isopropanol)
RNA
RNA
Extração: RNA das vias biliares
TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA
2,5 μg de RNATampãoDNase I
Água
PrimersNucleotídeos
Mistura: anelamentoRNase OUTTM
SuperScriptTM(transcriptase reversa)
TampãoAgentes redutores
Destruição do DNA
Desativa a DNase
AnelamentoDesfaz estruturas secundárias: RNA
Formação do cDNADestruição do RNA
Temperatura ambiente (15 min)
EDTA 25mM – 65°C (10 min)
70°C (10 min) - 4°C (1 min)
42°C (50 min) - 17°C (15 min) - 4°C (1 min)
Obtenção do cDNA de fita dupla
SupserScriptTM Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA)
RT PCR: Curva padrão
Amostra padrão (conhecida) Coeficiente de correlação: 1.000 Amostra em estudo (concentração desconhecida)
RT PCR: Curva de dissociação
Agilent 2100 Bioanalyzer
Qualidade do RNA
Controle da quantidade e da qualidade do RNA
Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer:Concentração do RNA (A260 x 4): > 2,5 μg
Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer:Pureza (260/280 nm): razão > 1,6
Enzima
Dia 3
Carboidratos (glicogênio): PYGB
Lipídios: LIP1
Transcrição: ATF5
HRMT1L2 (transcrição do STAT1)
Chaperona: PDIA3
Ciclo da ubiquitina: USP1 e USP7
OAS1G e OASL2
Enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetase: marcador da atividade dos interferons
Degradação do RNA viral
Processos imunes
Expressão gênica
Metabolismo
Enzima
Dia 7
HCK
Membro da família Src
Ativação do STAT5
Receptores do interferon I e ativação da via GAS
Enzima
Dia 14
Demonstrado previamente em análise de expressão de genes em fígado de camundongos adultos submetidos à obstrução crônica dos ductos biliares
extra-hepáticos.
CAMPBELL, K. M. et al. Transcriptional reprogramming in murine liver defines the physiologic consequences of biliary obstruction. J. Hepatol. 40, 14-23 (2004).
Ativado: GSTA2
Resposta da colestase crônica ou do estresse oxidativo persistente em estágios avançados da obstrução ao fluxo biliar.
Proteínas estruturais
Expressão diminuída ou ausente do gene VIL nas crianças portadoras de doenças hepáticas colestáticas progressivas.
PHILLIPS, M. J. et al. Abnormalities in villin gene expression and canalicular microvillus structure in progressive cholestatic liver disease of childhood. Lancet 362, 1112-1119 (2003).
Proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados.
SVIL (dia 14)
Desativados
VIL2 (dia 3)
Transdução de sinais
Dia 14
STAT5
Receptores do interferon I e ativação da via GAS
Transdução de sinais
Dia 7
STAT1: sinalização do interferons
ARHGDIB: sinalização mediada pela proteína Rho, crucial para a ativação da LFA1
CSF2Rβ1: estimula a produção de leucócitos
CEBPβ: ativa a transcrição de genes da fase aguda e participa nos mecanismos que controlam a transcrição dos genes induzidos pelo interferon
Vias moleculares relacionadas à imunidade
Controle da transcrição e da tradução
Dia 3
Replicação e no reparo do DNA: RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG
Controle do ciclo celular: NDN
Expressão gênica: Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1, SMARCE1. Controle pós-transcricional - splicing do RNA: RNPC2; - tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1; - ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1.
Processos imunes: HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1 IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos
Ativados
Desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A)Metilação do DNA (DNMT3A, CTCF).
O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia: pacientes portadores da forma embrionária. Estrutura da cromatina: SMARCA-1, HDAC3 e RYBP
ZHANG, D. Y. et al. Coordinate expression of regulatory genes differentiates embryonic and perinatal forms of biliary atresia. Hepatology 39, 954-962 (2004).
Desativados: fenômenos epigenéticos