Post on 13-Nov-2021
ANITA MARZZOCO
CARACTERIZAÇÃO DO GENOMA DE UMA AMEBA DE VIDA LIVRE (Acanthamoeba castellanii)
1974
Tese de Doutoramento
Univetsidade de São Paulo
Instituto de Química
Departamento de Bioquímica
Para Cristina de paiva Mendonça Pereira Antonio Lemos Pereira José Gaspar Marzzoco
fndic.e
P ' . , aglna
I ,
l?T' (.~ .f" F1 (~. j_ o • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • " " " " " " " " • • • • • 1
II • Al) .p ~ v i a t llr [{ s • • " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " ~ • 3
]IT f(( .~8. p;ertte s " " " " " " " " " " " • " " " . " " " " " " " " " " . . " " " " " " .. '-I·
IV • lntroduç ~o
1. Acanthanweb8 casteLLanii .................. 5 2 . Organi zação do r-;enonw PI1I e ll Cêll' i c:tos ....... q
? Caractel'i 7.,ação elo genoma ele A. caste lJ;.8J:!.ii 24
V • Métodos
1. Crescimento ele A. castellanii ••.•.•••••••• 30
2 " En. cis1.~amento""""""" .. """"""""""""" .. """".".. 32 3. Germinação (Excistamcinto) .•..•..•••••••.•• 33 4. I so lamento ele n~cleo s de trofozoito ••••••• 33 5. Controle da pureza das preparaç5es de
, nu-
cleos" •• " ••• " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " • " • " " .35 6 ..
f nosagem ele RNA, DNA e pro!:;e1.na em n~cleos
e homogenata".""""""""""""""""""""""" •• "". 36 7. Ensaio da atividade de RNA . polimerase
(E e C .2.7.7.6) • " " " " • " " " " " " " .#" . " " " " " " " " . " . . . 3 7 8 . Purificação de mi tocônelrias. • • • . . . • . . . . . . • 38
~ ( ~ . Extraçao de DNA........................... 3 J
100 Centrifugação em gradientes de CsCl ••••••• 40
11. Fragmentação de DNA....................... 41
1 2 . Avaliaç ão de peso molecular •.•.••••.•••••• 41
1 3 . Renaturação de DNA........................ 42 lA. Curvas de desnaturação térmica (Determina-
çao de T ) ••• .••.•••.•........••....•..•.•• 14-3 m
VI . Resultados
1. Curva de crescimento...................... 44
2 . Encistamen to induzido .......•...•......•• o
) . I solamento de l1úcleo s ••••••..........•••••
! ~. Composição quími c a de núcleos i so lados ••••
L') . Atividade de RNA polimerase (E . C. 2 07.7.6)
e m n6cle os i so lados .............. . ....•..•
4-6
L{-7
51
51
P; . agU1R
6. Extração de DNÃ ••••••••••.••... ., •••. o........ 53 7. CentrifUgação em gradientes de Cs C1......... 55 8 . Perfil de fus ão do s componentes ' do DNA de
trofozoitos ••.•.................•..... • •• li. 66
9. Rena turação de DNA.............. . ........... 70
VII • Discus são
1. I s olamento de núcleos......... . ........••••
2. Extraç ão de DNA •..•....•......•...•...••••••
3. Caracterização do DNA de trofozoitos
a) DNA total ................... ti ••••••••••••
b) TINA nuclear e c omponente maior •••••••••••
c) mA mitocon dria1 e comp onente menor .•••••
4. Análi s e das condi ç õe s de r enaturação ..••••••
86
87
88
90 91 96
VI I I. Res1lIllo........................................ 99
IX Bi l)] iografia. • . • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • • • 100
1
I. Prefácio
Este trabalho foi realizado sob a orientação
segura e eficiente do Prof. DI'. Walter Colli e contou
com a colaboração de várias pessoas as quais agradeço
imensamente :
Dro Antonio Sesso - microscopia eletrônica
Aparecido M. 'Pinto - assist~ncia t~cnica
DI'. Bayardo B. Torres - leitura do manuscrito
Carmen M. Pinto - assist~ncia t~cnica
Dra. GláHcia M. Santelli - microscopia de fase
Dra. Godeleine Fonty (Laboratório do DI'. G. Bernadi ,Ins'
titut de Biologie Mol~culaire, Fac. des Science:
de Paris) - ultracentrifugação analítica
Dra. Helena Li Chum - análise da cin~tica de rena turaç ão
Dra. Janne Balsamo - análise da cinética de renatlU'ação
João . Luiz Musa - fotografias
Prof. Dro Jos~ Ferreira Fernandes adaptação
regime de pós-graduação.
Dra. Lor Cury - microscopi"a eletrôni c a
t '. Lucy Bouque ' - graflcos
Dr • . Luiz Longhi - microscopia eletrônica
ao novo
Dra. Marilda Guedes - análise estatistica dos dados
Masuko Yokoyama - particip ação na fase inicial do traba
lho
DI'. Roberto V. Santelli - ensaio de RNA polimerase
Agrade ç o, aino a , ao pessoal do Bloco 10 (t~r
reo e su perior), e spe cialmente aos co legas do nosso la
boratório, sempr e disposto s a prestar qualql1er h .po de àu
x ilio :
2
Bianca Zingales
Clara Carnio l
Júlia M. Alves
Marinei. F. Gonçalves
M1llla C. Andery
Neemias de Castro
Shigueko 8omohara
Os bacteriófagos T7
e fd; foram gentilmente
cedidos pelos Drso M. Oishi e Lo Day, respectivamente.O
inóculo inicial de Acanthamoeba caste llanii, linhagem
Neff, foi uma doação do Dr. M. Rabinovitch.
Este trabalho foi re a lizado com o apolo fi
nanceiro da F~mdação de Amparo à Pesquisa do Estado de
são Paulo e Conselho Nacional de Pesquisas.
.3
11. Abreviaturas
DMA = ácido desoxirribonucleico
GC fração molar de guanina e citosina do ácido nucleic
AT fração molar de adenina e timina do ácido nucleico
T = temperatura de fusão do DNA m
Cot = produto da concentração de DNA (moles de nucleotí
dios.l-l ) pelo tempo (segundos) de incubação
RNA = ácido ribonucleico
rRNA = RNA ribossômico
mRNA RNA mensageiro
rDNA = cistrons complementares a RNA ribossômico
RNase = ribonuclease
DNase = desoxirribonuclease
Tris = tris(hidroximetil) aminometano
EDTA = ácido etileno diamino tetracético
SDS
TCA
PCA =
SSC = ppo =
dodecil sulfato de sódio
ácido tricloroacético
ácido perclórico
NaCl 0,15 M; citrato de sódio 0,015 M, pH 7 2 ,5-difeniloxazol
popop = 1,4-bis-2-(5-feniloxazolil)-benzeno
Pvp' = polivinil pirrolidona
4
111. Re a gentes
Além das drogas relacionadas abaixo, utiliza -
vam-se sempre reagentes de grau analfticoo
DROGA
Proteose-pept ona
Extrato de levedo
Citrato férrico
Silicone
Triton X-lOO
PVP
RNas e
a-amilas e
Ditiotreitol
Actinornicina D
Rifampicina
PPO
POPOP Nonidet P-40
Hidr5xido de hiamina
Tween 80
Fenol
3H- UTP
CsCl (l1 grade Ali)
Pronase
2-desoxi-D-ribose
D-ribose
Albumina sérica bovina
PROCEDÊNCIA
Ox oid Ltd.
Difco Lab.
BDH Chem. Ltd.
CJay-Adams, Inc.
Ga lbiochem
Calbiochem
Sigma Chemo Comp.
Sigma Chem. Comp.
Sigma Chem. Comp.
Calbiochem
Ciba-Geigy
Galbiochem
Ca lbiochem
Shell do Brasil S .A.
Packard Inst. Co., Inc.
BDH Chem. Ltd.
Mallinckrodt Chem. Works
New England Nuclear Co.
Calbiochem
Calbiochem
E. Merck A.G. Darmstadt
E. Merck A.G. Darmstadt
Sigma Chem. Comp.
5
!V li Intl'bduçao
1. Acanthamoeba castellanii
o protozoário em estudo denomina-se Ácantha
moeba castellanii (Douglas; 1930), linhagem Neff e per
tence à família das Hartmannelid~e, que compreende cerca
de trinta espécies provenientes do desmembramento de um
grupo de amebas denominadas anteriormente "limax"(Vicker
man ; 1962). À taxonomia das amebas apresenta inúmeras
dificuldades e a ameba em questão, durante algum tempo;
foi referida ha literatura como Acanthamoeba ~. Segundo
Volkonsky (1931), Adam (1964) e page (1967), várias deno
minações referem-se à mesma espécie: Acanthamoeba caste-
11anii, Àcanthamoeba ~., Hart~annella rhysodes, Hartma
nnella culbertsoni e Hartmannella castellaniio
A. castellanii foi descoberta por Castella
ni (1930), como contaminante de culturas de Cryptococcus
pararoseus e foi assim denominada por Douglas (1930). Po~ teriormente, a ameba foi isolada de diferentes fontes:so
los úmidos (Singh, 1949; Neff, 1957), -água doce (Page,
1967) e culturas de tecidos (Jahnes et aI., 1957; Moore e Hlinka, 1968). Demonstrou-se claramente sua patogenici
dade em macacos e camundongos (Dunnebacke e Williams
1967; Culbertson et aI., 1958, 1,959). Vários autores sugerem que a ameba seja o agente etiológico de várias do
enças respiratórias do homem, além de meningoencef81ites
(Wang e Feldman, 1961; Patras e Anduj ar , 1966; Armstrong
e Pereira, . 1967; Carter, 1968; Cerva e Novak, 1968).
A divisão celular da ameba segue o curso
de uma mitose típica, evidenciando-se a existência de 40
cromossomos (Volkonsky, 1931; Singh., 1952). Todavia, po
de-se induzir experimentalmente a divisão celular sem mi
t ose nuclear (amito s e): o núcleo único interfásico é par~
6
tilhado entre as células filhas que sobrevivem por ape
nas 48 horag (Band et aI., 1970). A ameba é tipicamente
uninucleada (Bowers e Korn, 1968), mas indivíduos mul
tinucleados podem aparecer sob determinadas condições
de cultura (~ames e Byers, 1967; Band et aI., 1970;Band
e Ma chemer, 1963~. Portanto, a divisão citoplasmática
pode ser separada da di visão nuclear mitótica, fazendo
com que a ameba se torne um sistema útil para o estudo
de problemas de divisão celular (Band e MOhrlok,1973 a;
1973 b). Band e Mohrlok (1973 b) demonstraram que as
fases de mitose e síntese de DNA, duravam, respectiva -
mente, 24 e 20 minutos. Resultados semelhantes foram
obtidos em Physarum (Nygaard et aI., 1960) e ouriço do
mar (Hinegardner et aI., 1964).
!. castel1anii pode ser cultivada, sob
condições axênicas, em vários meios líquidos (Neff et
aI., 1958; Band, 1959, 1962), com temperatura ótima o ~ -entre 25 e 30 C. Nessas condiçoes, o tempo de geraçao
varia de 12 a 18 horas (Neff et aI., 1964 b). O cresci~ mente pode ser obtido em meio basal mínimo (Adam, 1959;
Stark, 1966). Cresce também em placas sobre culturas de
bactérias ou fungos, permitindo a obtenção de clones e
reconhecimento de mutantes pela morfologia da colônia
(Jensen e Duhes, 1962; Upadhyay, 1968).
Culturas agitadas ou estacionárias em meio
líquido apresentam curvas de crescimento onde não se
verifica uma fase de "lag". As fases (exponencial e es
tacionária) da curva de crescimento são determinadas
principalmente, pelo nível de oxigênio dissolvido no
meio (Neff et aI., 1958; Band, 1959; Byers etal •• 1969) • . Sob determinadas condições ambientais, a
ameba sofre um processo de diferenciação que cuimina
com a forma ç ão de um novo tipo celular, o cisto. O en
cistamento pode ser espontâneo ou induzido. O encista -
menta espontâneo oCorre em culturas agitadas ou estaci~
nárias, em condições de alta densidade de células. A
indução do encistamento é obtida através do emprego de
t écnic as de substituiç ão de meios, ou seja, as amebas
s ão t rans fe rida s d e um me io nut riente rico par a lOO meio
7
salino, deficiente em font e s de carbono ou nitrog~nio
(Griffiths e Hughes, 1969). O encistamento também po
de ser obtido em placas de agar não nutriente, conten
do taUl' ina e cloreto de magnésio (Raizada e Krishna
Murti, 1971). Encistamento adequado requer oxig~nio ,
presença de {ons cálcio e magnésio e baixa concentra
ção de células (Band, 1963; Griffiths e Hughes, 1968).
As fases do encistamento espontâneo ~ in
duzido são praticamente as mesmas, mas a indução pro
porciona encistamento em massa (ac ima de 95%, após 20.
horas de indução) e sincronizado (Neff et al.,1964 b).
O trofozoito, envolto por uma membrana plasmática(Korn
e Wright, 1973), diferencia-se em uma célula viável e
extremamente resistente (Adam, 1964; Neff et al.,1964
b), protegida por uma parede celular química e
turalmente complexa. A parede, cuja composição
estru-t •
qUllll1:,
ca ainda não foi totalmente e1ucidada, contém, como
elemento predominante, celulose (Tom1inson e Jones,
1962; Neff e Benton, 1962; page, 1967; Tomlinson,1967;
Neff e Neff, 1969), além de proteína (Neff et aI.,
1964 a; Bowers e Korn, 1969) e mucopoliss ,acarídios
(KriShna Murti, 1973).
O eno istamento ocorre em condições onde
a célula não dispõe de qualquer suprimento exogeno e
os componentes da parede não estão presentes no trofo
zoito. Evidências citológicas (Bowers e Korn, 1969) e
bioqu{micas (Neff e Neff,1969;Griffiths e Hughes,1969;
Weisman et alo, 1970) indicam que a celulose é sinteti
zada "de novo", às expensas de glicogênio que consti
tui o material de reserva do trofozoito (Stark, 1966).
A atividade de 8-glicana sin~etase não é detectável
no trofozoito (Potter e Weisman, 1971).
A produção de moléculas exóticas no en-.' - , clstamento e acompanhada pon outras alteraçoes metabo-
licas (Weisman e MooTe,1969; Krishna Murti, 1973) e
morfológicas (Vickerman; 1962; Bowers e Korn, 1969;
Pasternak et al., . 1970); além do término do crescimen
to celular (Neff et aI., 1964 b; Stevens e Pachl.er,
1973 b).
8
As a lte r a ç ões n o n í ve l de macromoléculas
que o c orrem no f im da f a s e logar í t mic a , ant e s do au
me n t o da p rop orç ão de cisto s , p ode m ser c orre l a ciona
d as com evento s ligado s ao enc i stamento. Células em
fa s e e s tacion ária po s suem metade d a quan t idade de DNA
ve r i f icada durant e a f ase logarítmica (Byers et aI.,
1969 ), fenômeno e s se qu e coinc ide' com a diminuição da
v e locidade de síntese de DNA (Rudick , 1971). A que da
de 50% no conteúdo de DNA por célul a p oder ia s er ex- '
plicada; admitindo-s e que a maioria das amebas ,em f a
se logarítmica contive sse a quant idade de DNA d a fas e
G2 e q u e o cic lo de dupli c a ç ão celular f osse inibido . '. . ~
durante a fa s e estaclon a r la, no per lodo G1 , ou na
transiç ão entre o s pe r íOdO S G1 e S . Es s a h i p ótese foi
reforçada pelos tr ab a lhos de ,Neff e Ne f f (1969 ), Ru
dick (1971) e Band e Mohrlok (1973 b), que demonstram
que o períOdO 'G2 cons titui cerca de 80% do ciclo de
divisão celular. Situa ção semelhante foi verificada em
Amoeba proteus .. (Goldstein e Prescott, 1967). A conclu ....
são adicional desses trabalhos é que a indu ção do en
cistamento dependeria da reduç ão da quantidad'e de DNA
por célula e que inibidore s de sínte se de DNA induzi
riam o encistamento. Por outro lado, outros autore s
(Griffiths e HUghes, 1969 ; Rai z ada e Krishna Murti,
1971), verificam inibi ç ão do encistamen t o por e s s es
me smo s agentes . Expe rimen to s recentes (Roti Roti e
Steven s , 1973), demons tram também que , durante o en
cistamento, ocorre degradaç,ão de DNA s i nte ti z ado du
rante a f ase de cre s cimento exponenc ial.
Os dado s r e ferente s à s íntese de RNA du
rante o encistamento são igualme~t e c ontrad itórios.Pa-
ra: algmls autores, o apa recimento de compostos pecu-
liares ao cisto, seria uma indicação da nece s sidade de , c , c slntese de novas mole cuIas de RNA e protelna. Realmen-
te, Rudi'ck e Weisman (1973 a), verificam um aCÚmulo
de RNA durante as primeiras 12 horas após indução.pos
terior mente, a síntese de RNA é interromp i da e 95% do
RNA sintetizado inicialmente é degrad ado . Stevens e
Pachler (1973 a; b) apresentam resultado s opos tos, de
monstrando que um acúmulo de RNA não é i l"1 d i spe.ns ável
9
para a indução e que o RNA d€ gradado é constituído por
espécies sintetizadas ante s do encistamento. Segundo
esses autores, a induç ão da diferenciação estaria inti
mamente relacionada com os eventos moleculares que regu
lam a divisão celular, já que o encistamento (espontâneo
ou indu,zido) ocorre sempre em condições que determinam
a inibição do crescimento.
Finalmente, o AMP cíclico parece estar re-
lacionado com a indução do encistamento (Raizada e
Krishna Murti, 1972 a)~ O AMP mimetiza a ação de tauri
na e cloreto de magnésio (Raizada e Krishna Murti, 1972
b), que ativariam lma adenil ciclase ligada à ~embrrula. O aumento resultante da concentração intracelular de
AMP cíclico, causaria a ativação das enzimas de síntese
de celulose e mucopolissacarídios da parede do cisto
(Krishna Murti, 1973).
Os cistos, quando transferidos para meio
de crescimento, podem germinar (Griffiths e Hughes,1968)
A ameba sai por um dos ostíolos presentes na parede do
cisto e, a não ser pela formação desse pequeno orifício,
a superfície do cisto permanece inalterada após o excis
tamento (page, 1967; Chambers e Thompson, 1972). O ex-
cistamento parecle não ser sincrônico e a extrusão da
ameba é inibida por actinomicina D e cicloheximida, en-
quanto que inibidores de síntese de DNA não afetam O'
processo (Mattar e Byers, 1971)0
2. Orgamização do genoma .em eucariotos
DNA, cuidadosamente isolado de células ou.
tecidos, é constituído por moléculas bicat~nárias, deno
minadas "nativas". A dupla hélice da molécula nativa po
de dar origem a fitap separadas, com estrutura desordena
da, através da ação de agentes químicos ou físicos que
determinam o rompimento das forças que mantêm a dupla
hélice. Esse proces'so de dissociaç~o (ou desnaturação)é
acompanhado por mudanças nas propriedades físicas do
DNA: viscosidade, hipocromicidade, rotação óptica, den-
10
sidade etc. A transição entre o estado nativo e desna
turado é abrupta, semelhante à fusão de um cristal,. o
que det erminou a caracterização do processo pela tem ....
perat1..1ra média da transição (Tm). A largura da transi
ção depende da origem do DNA, ou seja, DNA de vírus,
bactérias e vertebrados, apresentam intervalos de tran
sição crescentes . Sob condi ç ões adequadas·, as fi tas
complementares dissociadas podem formar moléculas es
táveis com e s trutura helicoidal semelhante à nativa
por um processo denominado renaturação àu reàssociação
(Marmur e Doty, 1961). t pos s ível também verificar in
teração entre fitas de RNA e DNA, desde que existam
sequências de bases complementares nos dois ácidos nu
cleicos, permitindo a formação de híbridos RNA-DNA.
A velocidade de renaturação depende da
colisão de sequências de nucleotídios complementares e
a r eação obedece cinética de segunda ordem em concen
tr aç ão de DNA (Marmur et aI., 1963; Britten e Kohne,
1967; Thrower e Peacocke, 1968; Wetmur e Davidson,
1968). O processo de renaturação pode ser acompanhado
de diversas mane~ras, sempre dependendo de alguma di
ferença físicE\. fiÍ cilmente detectável entre o DNA des
naturado e renaturado. Assim, é possível acompanhar a
reassociação de DNA pela determinação da queda de ab
sorbância a 260 nm durante a reação (Wetmur e David-
son, · 1968), pela recombinação de fragmentos de DNA
desnaturado com DNA de alto peso molecular fisicamente
imobilizado em agar (Bolton, 1966) ou pela fração de
DNA reassociado que se liga a colunas de fosfato de
cálcio (hidroxiapatita) em diferentes tempos de rea
ção (Britten e Kohne, 1967).
A velocidade da , reação ' de renaturação
determinada pe la concentração das sequências de
, e ,
nu-
cleotídios presentes . Cons iderando-se diversos orga
nismos, o DNA daquele com genoma maior, certamente
conterá um número maior de sequências de nucleotídios
diferentes. Assim sendo, a velocidade de reassocia
ção fornece uma medida do tamanho do genoma de um or
ganismo, desde que se jam mantidos constantes todos os
demais fatores que inf luem na reação (temperatura , for-
11
ça iônica, pH, viscosidade do solvente, tamanho dos frag
mentos e teor de GC do DNA). -Realmente, o tempo necessário para a obtenção de 50% de renaturação é inversamente proporcional ao tamanho do genoma (conteúdo haplóide de
, f i) " . ( DNA por celula ou partlculade Vlrus de bacterlas e V1-
rus (Britten e Kohne, 1967)0 No caso dos organismos superiores, imaginou-se, inicialmente, que o tamanho do _ geno~
ma levaria a uma grande diluição das sequências individuais de nuc1eotídios e haveria, portanto, grande redução na velocidade de reassociação, quando comparada com a velocidade característica de DNA de bactérias. De fato,
experiencias iniciais não conseguiram evidenciar renaturação de DNA de timo de boi (Marmur ' 'e Doty, 1961). Posteriormente, através do ,emprego da técnica DNA-agar, verificou-se que DNA de organismos superioresreassociava ef~ tivamente, formando moléculas duplas específicas ( Hoyer et a1., 1964). A explicação mais plausível para esse fato, até então inesperado, deveria se relacionar com a concentração de sequências capazes de, renaturar, ou seja., o genoma de organismos superiores conteria populac:;ões desequências de n'ucleotídios semelhantes ou idêntieas (sequências repetidas ou reiteradas). Todos os organismos superiores analisados até hoje, contêm DNA -repe,ti
do em proporções que variam, por exemplo, de 20% em ouri
çO ' do mar a 80% em salmão e trigo (cf. Britten, 1970). Alista de organismos que possuem DNA reiterado aumenta mui to'; se forem considerados os trabalhos realizados inici -almente, que utilizavam condições de ,reassociação ( tempo de incubação e concentração -de DNA) que permitiam somen
te a renaturação de DNA repetido. A renaturação do -DNA de organismos mais sim
ple's como por exemplo Eseherichia 'coli, segue cinética ideal de , se'gunda ordem, obtendo-se -uma curva hiperbólica
com o decurso do tempo. A renaturação ,de DNA de organis -mos superiores apresenta ,uma -curva muito alargada, indicando a existência de componentes com velocidades de renat'ur,ação diferentes o Uma fração do DNA de organismos superiores (DNA "Único"), renatura com a velocidade previs- '
~ ta segundo o tamanho do genoma, por exemplo, em mam1feros, cerca de 600 vezes menor que a do DNA de E. coli. Assim'
12
sendo, para DNA de bactérias e vírus e a fração de DNA
"Único " de organismos superiores , a complexidade cinéti
ca é igual i complexidade de sequ~ncia, ou seja , a quan
tidade de sequências diferentes em uma determinada amos~ tra de. DN,A. • . É geralmente expressa em nv.mero de pares de
nucleot1dios ou nÚmero de daltons e corre sponde ao ter
mo li complexidade " , definido p or We tmur e Davidson (1968). A complexidade cinética traduz, portanto , o tamanho do
genoma de um organismo e mostra uma -relação linear com
a velocidade de reassociação (Britten -e Kohne, 1967; Wetmur e Davidson, 1968). A determinação da complexidade
cinética do DNA Único é prejudicada pela delimitação in
certa da fração Única e repetida de um DNA, que depende
do critério de prAcisão de pareamento estabelecido du
rante a medida da velocirtade de reassociação (Britten,
1971). Apesar da maior parte do genoma bacteriano
ser cons tit u:tda por se quenc ias que não se repetem (se
quências "únicas "), foi demonstrada a exis tência de uma
pequena fraç ão de DNA com baixa frequência de reiteração,
responsável pela síntese de rRNA (Kohne, 1969), além de
cópias múltiplas de DNÁ epissômico (Chiscon e Kohne,
1970) . A definição de eucariotos e procariotos,ba
seada principalmente na existência ou não de um núcleo
verdadeiro; delimitado por uma membrana nuclear, p ode
a partir do estudo da- reassoc iação de ácidos nucleicos,
ser formulada em outrôs termos: o DNA de procariotos é
do tipo não repetit,:i!vo (exceto por peguenasquantidades
de DNA ribossômico e epissômico), enquanto que o DNA de
eucariotos é constituído por sequências repetidas e se
quencias "Únicas".
Uma famflia de DNA reiterado pode ser ca
racte rizada pelo nÚmero de membros (frequência de rei
teração), grau -de semelhança entre os elementos compo
nentes e pe la complexidade cinética.
A v e locidade de reassociação das famílias
de sequências repetidas e s tudadas varia de 30 (DNA de
ouriço do mar, Britten et a I., 1972 ) a 107 vezes (DNA
de cobaia , Southern, 1970) maior que a ve lo c idade de
13
reassociação de um DNA único. Esses da.dos ilustram a di .... versidade de frequências de reiteração encontradas hos organismos áuperiores.
A precisão do pareamento entre sequências repetidas reflete o grl;lu de homologia existente entre as sequências e pode ser medida pela estabilidade t~rmica do par reassociado. Verifica-se um largo espectro de estabiiidades t~rmicas, incluindo valores de T de 1
· m a400 C abaixo do T~ de um DNA perfeitamente pareado. O grau 'de -precisão de pareamento ·das sequências ' reiteradas -é fundamentalmente determinado pelas condições de incubação: temperatura mais alta e força iônica mais baixa requerem .maior 'precisão no pareamento, que re .... sulta na formação de uma molécula dupla mais estável (Britten e Kohne; 1968; Rice e paul; _ 1972). Nas reações
entre TINAs de espécies diferentes, qu~do se pret~nde e~ tudar homologias .entre fami1ias de mA reiterado, há maior discriminação _em températuras mais elevadas ( Martin e Hoyer, 1966).
A complexidade das familias de DNA reiterado pode -ser avaliada a partir da sua velocidade de reas-
; so ciação. -A complexidade cin~tica é -uma medida operacio~ nal -que pode ser -obtida por comparação com a renaturação de :-um DNA. -padrão" como 0 de ·E. coli, com tamanho de geno ma -bem estabt-lecido ' (Cairns, 1963) e fornece uma medi-... da- do comprimento da sequencia que foi originàlmente re-pliéada para -for~ar ' a familia deDNA ·reiterado. Entretan to, há uma certa imprecisãe na interpretação da complexi dade cinética de -uma famllia de DNA reiterado, em vir~ude - do_ efeito do graU de semelhança entre os . membros componentes, sobre a velocidade de reassocl.ação.Britten. e Bonner (1971-) verificaram que o pareamento imperfeito, devido a presença de bases não complementares, reduz. a velocidade de reassociação, pode:q.do afetar significativa mente a int-erpretação de medidas de frequência de . repetição ou grau de homologia entre espécies. Estudos paralelos -de· Southern (1970) e Sutton e McCallum (, 1971 ) ) demonstrar-am -igualmente, guea velocidade de reassociapão ' de sequências -Se'IDelhantes - mas· não idênticas forn:e-y . , ,
ce uma medida superestimada do comprimento r eal da uni~
14
dade de repetição. Na maioria dos eucariotos estudados, pode-se
distinguir duas classes de DNA reiterado (Britten e Kohne, 1968): DNA altamente repetido ou de "seqúência-simples " (Walker, - 1971) e DNA de repetição "média" ou "intermediá ... -ria" •
Os TINAs satéli tes são, provávelmente, ~s melhores exemplos de famílias de sequências de nucleotídios altamente repetidos. O satélite de camumdongo foi descri -to em 1961 por Kit (1961) e Szybalski (citado em Walker, 1971); independentemente; como um componente menor, que se separa da banda principal do DNA em gradientes de clo-reto de césio; em virtude de diferenças no conteúdo de GC. ~ encontrado em todos os tecidos,inclusivé em células em -cultura de tecido de várias linhagens de camundongo (Kit, 1961); representando 10% do genoma. Renatura com velocidade muito grande (Waring e Britten, 1966) e a CUTva de - renaturação se superpõe -à uma curva ideal de segunda ordem, com uma inclinação qUe indica ausência de heterogeneidade interna. O DNA satélite nativo apresenta uma banda _unimodal e estreita em gradientes de CsCl, indicando que ocorre em longos segmentos de DNA, cada um contendo um gr~de número de ele~entos repetidos semelhantes (Walker, 1971). Baseados na relação linear entre o inverso do tamanho do genoma e a velocidade de reassociação, Waring e Britten (1966), propuseram que o saté1it-e -deveria ser oons
f 6,. t 1 t -ti tUldo por cerca de 10 coplas extremamen e - seme han es de um segmento de aproximadamente--300 nucleotídios de comprimento. Por -outro lado, Southern (citado em Br itten; 1971), através da análise parcial -da sequ~ncia de bases, sugeriu que osatél-±te de -oamundongo poderia ser _ formado por uma unidade - de repetição- muito pequena, da ordem de
10 a -12 -nucl-ebtídios, extremamente modificada ao longo da evoluçã~. Britten -(197l), analisando os -dados obtidos por Southern, concluiu que se a -repetição interna de um frag -mento - curto .realmente eJÇis tiu, -ela não -é mais detectável cineticamente, podendo evidenciar-se- apenas a repetição principal do DNA satélite. Todavia, a i.nt-erpretação desses result ados torna-se cada -vez mais difícil, levando-se em cons ideração a de-scoberta de- outros satélites em mamíferos
15
(Southern, . 1970) e Drosophila (Peacock et al.~ 19 73
Gall et aI.; . 1973) que, segundo a análise da estrutura
primária e ação de enzimas de restrição (Southern e
Roizes, 1973), parecem ser constituídos pela repetição . t t
de .segmentos contendo 5 a 7 nucleotldlOS. Portanto, a
sequência original dos DNAs satélites parece ser muito
pequena, -mas a introdução de mutações ne s.sa sequencia,
faz com que ela se comporte,durante a reassociação,co
mo se f6sse muito mais lon~a.
O DNA satélite de vários eucariotos parece
estar sempre associado ~ fração heterocromática (Yasmi
neh e Yunes, 1970). O emprego da técnica de hibridiza -
ç ão de -ácidosnucleicos "in situ" (Jone s , 1970;Pardue
e Gall, L969), permitiu demonstrar DNA altamente repe
tido associado aos centrômeros de cromossomos metafási
cos, nucléolos e grânulos de cromatina de núcleos in
terfásicos. As sequências satélites são geralmente en-. ~ , .
contradas nas regloes heterocromatlcas dos cromos somos,
com exce ç ã o do cromossomo Y de camunciongo (Pardue e
G~11, . 1970) e de algumas esp~cies de Drosophila (Hennig,
1972). Rudkin (1969) demonstrou que, durante a forma
ção de núcleos poli tênicos, há uma sub-replicação da he
terocromatina 'em relação ~ replicação de regiões eucro
máticas . ConBequentemente, o DNA satélite não é replic~
do durante a formação dos cromossomos pOlitênicos, ou,
pelo menos, não ~ r eplicado proporcionalmente ao res
to dO ' genoma (Gall et aI., 1973). Em células de camun
dongo, com divisão sincronizadaj o satélite é sintetiz~
do na fase S tardia, enquanto que as frações do genoma
ricas em GC, são repli c adas logo no início. Esses da
dos concordam com a localização heterocromática das se
quências satélites, já que a heterocromatina é . replica
da t ardiamente durante a fase S (Walker, 1971)0
A simplicidade de sequência dos DNAs saté
lites., sugere que elE;:s não possam funcionar como genes
estruturais, apesar de Skinner e Kerr (1971) terem pro
p osto que o satélite AT de caranguejo · fôsse . o responsá
vel pela s íntese de uma proteína específica. O satélite
de c amundongo não"é transcrito (Flamm et aI., 1969) e
a anál i se da sequencia de bases do satélite a de co-
l6
baia ( Southern, 1 970), mostra que vários dos possíveis
co dons são "non-s ense " , tornando pouco provável que
es sas sequêll'cias se j am traduzidas em proteína.
Em vários organismos s uperiore s', exis te uma
fração do DNA altamente reiterado que mimetiza o compor-
tamento de moléculas bicatenárias, a p ós incubação em
condiçõe s que não permitem reassoçiação por colisão bi
molecular (Davidson et al., 1973). Es se tipo de DNA com
renaturaç ão "instantânea" (ou "espontânea"), possui me
tade de s uas -bases pareadas e encontra-se - dis tribuido
ao longo do genoma, mostrando 11ma certa dependência na
composição de bases das regiões adjacentes (Bonner,1973).
Ex i stem evidências de que se relacionem topogràficamente
com DNA reiterado, pois ocorre m com alta frequência no
satélite de camundongo (Flamm et al., 1969 ). A- renatura
Çãb espontânea poderia resultar da exis t ência de "cross-
1inking" (A1berts e Doty, 1968 ; Mulder e Doty, 1968) ou
de sequências parcialmente complementares ao longo da
mesma fita de DNA (Flamm et al., 1969 ; Britten e Smith,
1970; Bonner, 1973).
O segundo tipo de DNA reiterado encontrado
nos eucariotos; é definido por critérios cinéticos e,ex
'ceto alglIDs caso B especiais (Corneo et aI., 1970), só
pode ser isolado como Uma fração de DNA reassociado.Essa
fração renatura mais lentamente que as sequências sat~...,..
lites, mas mai s depres s a que s equências que ocorrem uma
ou poucas vezes no genoma. O DNA de "repetição interme -
diár'ia" ( ou DNA Uin termediário "), contém as sequencias
que hibridizam com RNA em experimentos que empr8gam bai
xa concentração de ácido s nucleicos. De fato, as expe
riência s de hibridização r e alizadas inicialmente, devi
do - às condições de incubação empregadas, mediam somen
te à homologi-a entre sequências de RNA e s equências de
DNA repetido (Me11i e Bishop, 1969; Britten, 1970 ).
As s equências com reiteração intermediária, . '. "".' . ao con trarlo das sequencJ_a.s satell tes, parecem estar
dispersas ao longo do ~enoma ( Britten e Smith, 1 970),em
regiões de eucromati na e he_terocromatina (Pardue e Gall,
1969; John et al., 1969 , Jones e Robertson,1970; Hennig
17
et aI., 1970 ), sendo representadas em t e cido s . polit~ni
cos (Gall et aI.; 1971). Os c~strons para rRNA e tRNA
pertencem à fração de DNA "intermediário".
O número de cistrons ribo.ssômicos aumenta
ao longo da escala evolutiva, paralelamente ao aumento
do genoma dos organismos. Valores máximos de multiplici
dade são encontrados em ovócitos de insetos e anfí
bios, como consequ~ncia de processos de amplificação gi
nica (Birnstiel et al.,197l). Os trabalhos iniciais co~
Xenopus (Brown e Gurdon; 1964) e Drosophila (Ritossa e
8piegelman, 1965), serviram de suporte para a identifi
cação do organizador do nucléolo como o locus para os
cistrons ribossômicos redundantes (Gambarini, 1972),
posteriormente confirmada por hibridização "in situ"
(Pardue et aI., 1970). Como os cistrons de rRNA em eu
caridtos são intensamente agrupados e, geralmente, pos
suem alto teor de GC, podem aparecer como satélites em
gradientes de CsCl, facilitando o seu isolamento. Em
bactérias', a obtenção de rDNA é dificultada pela pre
sença de sequ~ncias espaç adoras c om compo s i ç a o de ba
ses median a. Entretanto , Kohne (1969) e Col1i e Oishi
(1970), conseguilram o isolamento de rDNA de ~. coli e
Bacillus subtil~s re s pectivamenteo
Na maioria dos eucariotos e s tudados, os
cistrons para rRNA 188 e 288, são intercalados por se~
qu~ncias reiteradas com alto teor de GC, denominadas se
quências espaç adoras (Birnstiel et aI., 1968; BroWn e
Weber, 1 968). O rDNA contém, adicionalmente, uma fra
ção que é transcrita e posteriormente perdida, duran
te o processamento do rRNA (Loening et aI., 1969). As
sequ~nci?-s espaçadoras não são transcritas (Hallberg e
Brown, 1969) e sua função é desconhecida. ~ ' A
OS genes que codificam para RNA ribossdmi-
e
et
co 58 e RNA de transferência tambem sao relterados
intercalados por sequências espaçadoras (Birnstiel
aI., 1971). Ao contrário dos cistrons de rRNA 188 e
do nucléolo
Wimber, 1971 ;
288, não estão confinados ao organizador
(Wimber e Steffensen, 1970; Steffe:nsen e
Pardue et aI., 1973).
18
A transcriçao de DNA reiterado foi demons
trada em outros casos, onde as sequências repetidas es
tavam r8presentadas em RNA estritamente nuclear (Melli
e Bishop, 1969, 1970; Melli et aI., 1971; Balsamo et
aI., 1973) e em RNA mensageiro de histonas (Kedes e
Birnstiel, 1971). A cinética de renatu:cação em diferent·es
eucariotos demonstra que, em todas as espécies estuda
das, há uma fração considerável de DNA "Único" que con
tém, provàvelmente, a maior parte dos genes estruturais.
Modificaçóes da técnica de hibridização RNA-DNA, per
mitem estudar a expressa0 de sequências"únicas" de DNA
(Melli et aI., 1971; Gelderman et aI., 1972; Firtel et
aI., 1972). Estudos recentes de Paul et aI. (1973), Bi~ shop e Freeman (1973) e Crippa et alo (1973), indicam
que os loci responsáveis pela transcrição de rnRNAs bem
caracterizados (rnRNA de hemoglobina de pato e camundon
go e mRNA de polissomos de nêurula de Xenopus), perten
cem à fração de DNA "único". Além disso, os resultados
sugerem que esses RNAs mensageiros possuem, na extremi
dade 5', sequências rei'te:çadas, transcritas do .DNA in
termediário, al~m do segmento de poli-A na extremidade
3' . Ás experiências de renaturação de DNA de
organismos superiores, empregando fragmentos de dife~·
rentes tamanhos, indicam conclusões gerais sobre o
arranjo das sequências: ao longo da maior parte dd ge-
noma, as sequências únicas se alternam com as
cias repetidas (Davidson et aI., 1973; Graham
1973) .
A
sequen-
et aI.,
Atualmente, a hipótese mais aceita sobre a
organização do DNA cromossômico de eucariotos, propõe
que cada cromossomo contenha uma Única molécula bicate
nária de DNA (cfo Swift, 1973). Os cromômeros, identifi
cados com as bandas dos cromossomos pOlítênicos, ~
sao
considerados como as menores unidades estruturais. várias evidências sugerem que sàmente uma função genéti
ca seja associada a cada bandã que, porém, contém mui
to mais DNA que o necessário para codificar umamolécu-
19
la de prote{na de tamanho médio. Realmente, d núcleo de
muitos organismos superiores parece conter DNA que, apa
rentemente, não é funcional. Em Drosophila, uma fração
razo~vel do crom8mero pa~ece não ser essencial para o
desenvolvimento de um caráter fenotlpico (Sorsa et aI.,
1973). 'l'homas (1970) sugere que a estrutura do
cromômero e o ' problema do excesso de DNA poderiam ser
explicados se se postulasse que os crom8meros f8ssem
constituidos por famllias de repetiç5es ' id~nticas enfi
leiradas, conforme originalmente proposto por Callan
(1967). O suporte experimental para essa hipótese, ori
ginou-se de trabalhos de 'l'homas et aI. (1970), que ob
servaram ao microscópio eletrônico, a formação de cir
culos estáveis após tratamento de DNA nativo com exonu
cle~se, ou depois da renaturação de DNA desnaturado. ( A ,.... ~ • A. ." . '
fOrJ rlaçao de clrculos serla consequencla da eXlstenc19 de
sequências idênticas ao longo da molécula de DNA~ Po s te
riormente, 'l'homas et ~l. (1973), confirmaram a homolo
p.;ia exist ente entre essas sequências , através da verifi
ca ç ã o da grande estabilidade térmica da r egião dupla
que determina a formação do círculo • . Portanto, segundo
eSBa hipótese, cada locus gênico dos eucariotos o ciorre -
rta como uma série linear de sequências id~nticas. Essa
teoria contraria a exist~ncia, cada vez mais comprovada,
de sequ~ncias "únicas" no DNA de eucarioto s . Provàvelmen - ~ ' . '\. , .. te, a formaçao -de clrculos e devlda as sequencias com
repeti çao grande ou intermediária, intercaladas entre
as sequ~ncias únicas • .A produção de circulos não deve
ser considerada como evid~ncia para a exist~ncia de
uma estrutura básica de repetições em todos ' os cromôme -
ros de um cromossomo. Em alguns casos especiais, como
os loci que codificam para histona, podem ocorrer re-
giões de genes e s truturais repetidos, conforme proposto
por 'l'homas (1970). Apesar da quant idade de informações acumu
ladas s obre a e strutura e distribuição das sequências
re i tA r adas , nada se sabe s obre o mecanismo molecular
que .poderia Griar esse tip o de sequ~ncj a, nem s obre s ua
20
possível função biológica. Segundo Walker (1971), a pre
sença de sequências repetidas proporcionaria uma certa
vantagem sel,eti va aos cromossomos, porque há evidências
que, durante a meiose, o comportamentó dos cromoSSomos
seja a.:(etado p e la natureza e quantidade da heterocromati
na adjacente aos centrômeros. Todavia, atualmente, pro
cura-se atribuir um papel de regulação ao DNA reiterado.
A maioria dos modelos propostos para a or
ganização dos cromossomos de eucariotos enfatiza a ne
cessidade de sítios de contrple adjacentes aos genes es
truturais , tendo em vista a "i~terdispersão" de DNA "úni
co" e J'epetido. Os sítios de controle seriam constituI-
dos por sequências reiteradas o
··Trabalhos de difração de raios X demons-
tram que a estrutura se cundária do DNA varia com a com
posiçao de bases: DNA muito rico em AT parece não ado
tar a configuração B característica para DNA com teor
baixo ou moderado de AT (Bram, 1971). Em Drosophila, sa
téli tes com razões de bases diferentes, são sub-replica
dos diferencialmente durant e a politenizaçao. Gomo a es-
trutura secundária do DNA é uma função da sua composi-
ção de bases, postula-se que os satélites e outras se
quênc ias repetidas apresentariam conformações diferentes
que permitiriam g reconhecimento por proteInas regulado
ras e a não replicação de segmentos específicos do genq
ma (Blumenfeld e Forrest, 1972)0
Britten e Davidson (1969 ) e Georgiev (1969)
s u gerem Que o DNA intermediário seja re s ponsável pela
regulação da dif erenciação. Os primeiTos supõem Que mo
léculas de RNA exclusivamente nuclear seriam o produto
de genes reguládore's que nfão seriam traduzidos. No mode
lo de Georgiev, o RNA nuclear de alto peso molecular cog
teria a informação para a síntese de proteínas regulado
ras, semelhantes aos repressores . bacterianos. A demons
tração da transcriç~iO de sequências intermediárias em
moléculas de RNA exclusivamente nuclear e o comprimento
das se Quências únicas e repetidas intercaladas, sao con
sistentes com o modelo de Britten e Davidson(1969).Crick
(1971), base ado na hipótese formulada por esses autores,
21
elabora um modelo que distingue duas classes de DNA:
DNA globular, com função de controle e uma fração me
nor de DNA ~ibroso, que codificaria a síntese de pro
teínas. Os sítios de controle conteriam regiões não pa
readas, provàvelmente de poli A, que poderiam reagir
com outras regiões semelhantes pertencentes a uma ban
da da mesma cromátide. Essa situação deveria ser encon
trada nas sequências satélites altamente repetidas da
heterocromatina próxima aos centrômeros. Esses sítios
seriam os mediadores do alinhamento das bandas dos cro
mossomos politênicos. Segundo Paul (1972), regiões de
nucleoprotetna --densamente enovelada (correspondentes ao
DNA "globular" de Crick, 1971) se alternariam com re
giões de nucleoproteína menos compacta. Proteínas não
histônicas se ligariam a sitios múltiplos no DNA("adress
sites") e causariam um desdobramento parcial da nucleo
proteína, possibilitando a ligação de RNA polimerase a
sítios promotores adjacentes. Os "adress sites" seriam
formados pelas sequências repetidas.
A análise da reassociação das sequências
de nucleotídios encontradas nos roedores (Flamm et aI., 1969; Hennig e Walker, 1970; Rice, 1971a,b; - Rice e
Straus, 1972) e em outros grupos de animais (Britten e
Kohne, 1967; Brttten e Smith, 1971) e plantas superio -
res (Bolton; 19b6) permite definir afinidades taxonômi
cas através da homologia genética ao nível molecular e
estabelecer possíveis relações evolutivas o Uma fração
do DNA intermediário dos eucariotos é comum a espécies
relacionadas e produz moléculas duplas homólogas ou he
terólogas com baixa estabilidade térmica, sugerindo um
certo grau de divergência entre as sequências repetidas.
O rDNA constitui um grupo muito especi~l
de sequências com repetição intermediária. Ao cont;,rá-
rio do resto do genüma, os cistrons ribossômicos de
bactérias e eucariotos hibridizam com DNA heterólogo
formando m01éculas duplas perfeitamente pareadas(Birns
tiel et al~, 1971). Enquanto essas sequências foram
extremamente conservadas ao longo da evolução, o DNA
e s paç ador, não trans crito, mostra grande divergencia
me s mo em espécies do mesmo gênero, como no caso de Xe
nopus laevis e mulleri -( Brown et aI., 1972).
22
A constância das sequências ribossômicas
contrasta com a granel e variabilidade do s satélites ,
que parecem ser especificos para cada espécie ( Flamm
et aI ., 1969 ; Rerulig ' e Wa lker, 1970; Britten e Smith ,
1 971; Ri c$ e Straus , 1972 ). Saté lites do grupo de
Drosophila virilis (Gall et aI., 1973), ao contrário
do satélite de camundongo e do satélite ;:1 de co-
baia, são muito homogêneos. Os satélites mais recen
tes originaram- se por 'uma única substituição de base
em cada sequência repetida. No , caso dos saté lites, a ~ -. , N
seleçao nao poderla ser r esponsavel pela conservaÇao; .' A. _ ....
Ja que essas sequenclas nao sao, aparentemente, trans-
critas ou traduzidas. Atualmente , propõem-se mecanis
mos para a manutenção da homogene idade dessas sequên-
cias, os quais impediriam o aCÚmulo de mutações e tam
bém explicariam a introdução de mudanças regulares de
bases, conforme verificado nos satélites de algumas es
p~cies de Drosophila (Gal1 et aI., 1 973) .
A formação das famílias de DNA reiterado
é explicada por dois mecanismos. Southern (1970), su
gere que a estrutura atu.al do satélite (l de cobaia po
deria ser resultante ds duplicações sucessivas , de uma
sequência ancestral , e introduç~o posterior de muta
ções. Os satélites do grupo virilis exemplificam o ti
po de sequência postulada como precursora dos satéli
tes de camundongo e de cobaia.
A ocorrência escassa de DNA com baixa
frequência de reiteraç~o sugeriu a Britten e Kohne
(1968 ) que a duplicação ao acaso não poderia produ
zir o padrão de frequê,ncias de repetição encontrado
nos eucariotos. Aparentemente, certas sequências se
riam favorecidas pela duplicação que ocorreria atra
vés de "replicação saltatória". Segundo esse mecanis
mo, uma - sequência original de DNA seria, subitamente,
ao longo da evolução , replicada muitas veze s , forman
do uma famí~ia de sequências idênticas. Os membros '
dessa família sofreriam mutações e translocações para
outros segmentos do cromossomo ou para outros cromos
somos, originando uma família de sequências semelhan
tes, mas não idênticas. Posterior divergência faria
com que n ão fôsse mais. possív.el detectar homologia eg
t r e es sas se'quências que se riam indistinguíveis da
23
sequência original de DNA. O pro cesso de formação de
uma família seria muito rápido em relação à velocida de
de mutação. A idade de uma família pode ser estimada
através da div ergência entre seus membros. Segwldo o
modelo da repli c a ç ão s al t atória, novas famílias esta
riam constantemente s urgindo ao longo da evolução. Fa
mílias originadas recentemente, como os s a t élites, se
riam limitadas sàmente a , uma e s pécie e seus membros se
riam pràticamente iguais. Uma família formada há mui
to tempo; seria encontrada atualmente em e s pécies dis
tàntes e haveria grande divergência entre seus membros.
A razão entre a quantidade d e DNA não homólogo entre
duas e s pé cies e o tempo desde a diver gê nc ia de s s as es
pécies, fo r nece uma medi da da velo ci d ade de introduç ão
de n ov as famílias de DNA repe tido no genoma. Es s a velo-
cidade s e r e fer e s àmente à s famílias que foram fixa-'. '" . das no genoma da especle e nao deve ser lnterpretada cb
mo a velocidade de crescimento do genoma, porque mui- '
tas famílias podem não ter sido fixadas e nada se sabe
sobre a v e locida d e de perda de DNA durante a evoluç ão
d e uma espé c ie • . Outros mecanismos para cres'cimento do
genoma como poliploidia ou politenia, tenderiam a au-
mentar ' a co n tribUição devida a eventos saltatórios
(Kohne, 1971). A reassociaç ão de DNA pode, port,anto, ser
utilizada para e s tudar o grau de ' divergência evolutiva
entre vár ios si s temas biológicos, permitindo e stabele -
cer uma correlação com os dados paleontológicos. Os re
sultado s su~erem que, durante o processo de replicação,
ocorrem alteraç ões gen,éticas (II rep licação saltatória ll)
com v e locida de sufici e n temente g rande par a serem de t e c
tadas contra Um IIbackground" contínuo de mudanç as qu e
envolvem um único p ar de bases (Kohne et aI., 1971)!" ,A análise da sequência de aminoácidos de
p rot e{ n as h omólogas de e s pécie s diferente s , permite a
valiar a ve J...ocidade de s ub s tituiç ão de .aminoácidos. A
comparaç ão .entre a ,velo cida de de evolução de proteínas
e DNA ( La ird et aI.; 1969 ) fo r n e c e : re s ulta do s de di
f í c il i nte r pretaç ã o, p orqu e não s e c OILhe ce a fraç ão do
DNA de orga n i smo s s uperi or e s que codifica para proteí-
24
na. Grande parte do DNA analisado p ode não ter expres s a0
genética e, consequentemente, não ter s ido conservado.
Po r , outro l ado , as proteínas estudadas geralmente têm
funções ce lulares e specíficas, ou seja , são genet icamen
te . importante s e aptas a serem cons ervadas (Kohne et
al., 1971 ).
3 . Caracterizaç ao do genoma de A. castellanii
o princípio biológico da continuidade ger
minal exclui a po ss i bilidade de que a diferenciação en
volva distr ibuição diferencial de DNA entre tecidos ou
células em diferentes estágio s de diferenciação. Aplica
ções de té cnicas de hibridização RNA-DNA, . permitem iso
lar as sequências de DNA expressas em RNA. O conhecimen-
to da fração de DNA expresso tem s i el.o utilizado para
detectar amplificação gênica em tecidos adultos ou fe
tai s (Kohne e Byers , 1971 ) e os resultados obtidos ex
cluem a existêncla de amplificação, pelo ménos , em lar
ga escala . Além disso, a análise da atividade gênica ao
l ongo da ontogênese demonstra que todas a s sequências de
DNA estão igualmente representadas em todos tecidos adul
tos, embrionários e transformad os de mamíferos (Bolton,
1966 ). Por outro lado , a população de moléculas de RNA
de diferenT.e s órgãos adultos e fetai s diferem na quali
dade e na quantidade. A medida que ocorre a diferencia -
ção de larvas de Xenopus , verifica- se que o RNA produzi
do cada vez mais S6 assemelha ao RNA da larva totalmente
desenvolvida (Bo l ton , 1965) . Esses resultados corrobo
ram a idéia fundamental de que a diferenciação i mplica
na atividade diferenc ial do genoma , através da produç ão
de populaç õe s di st intas de moléculas de RNA (Jacob e
Monod , 1963) . Todavia, em certos organismos como ~-cosciara e S~iara , há evidências de rep licação
cial do genoma (Breuer ' e Pavan , 1955 ; Crouse
1968 ; Meneghini et a l., 1971) . A partir dessas
:iiferen -
e Keyl,
evidên-
~ ia8 , formulou- se a h ipótese de que a a l teraç ã o do po
tencj.a l genético d os seres v i vos , f~cilment e dete c t ada
25
em alguns organismos, poderia constituir um mecanismo
genérico de citodiferenciação (Pavan, 1965)0 Entretan
to, a amplificação gênica, como mecanismo do desenvol
vimento, talvez seja restrita a situações onde grande
quantidade de um produto gênico específico seja neces
sária, como" na ovog~nese de anfíbios (Birnstiel et
aI., 1971) e insetos (Gall et aI., 1969;Lima-de-Faria,
1973), oU ' na "magnificação" de rDNA em mutantes "bo
bbed" de Drosophila (Ritossa, 1972)0 Entretanto, a
descrição de mecanismos sofisticados de citodiferencia
ção mostra que as generalizações devem ser analisadas
criticamente. Em certos organismos, verifica-se elimi
nação seletiva de cromatina (cfo Balsamo, 1972) ou de
DNA altamente repetido, como acontece am Ascaris (Mbdak, 1973)0 Durante a formação do macronúcleo de ci
liados (Prescott e Krishna Murti, 1973), há destrui-
ção de 80% do DNA e as novas moléculas são sintetiza
das a partir de pequenos fragmentos restantes de DNA,
que cont~m todas as informações necess~rias para a ma
nutenção, crescimento e divisão das c~lulas. Trabalhos antigos sobre a diferenciação
de Ao castellanit (Volkonsky, 1931),mostraram que, lo
go no início do encistamento, havia uma expulsão par -
cial de cromatina .periférica para o citopla~ma adjaceg
te ao núcleoo O material foi caracterizado como DNA,de . -
vido à reaçi!o de Feulgen positiva. Em vistos mais ve-
lhos, ' essa zona desaparecia, devido à migração do áci
do nucleico para a membrana externa do cisto o Observa
va-se, também, a saída de grânUlOS basófilos do nucléo .-lo, que se acumulavam inicialmente no nucleoplasma prQ
ximo à membrana nuclear e depois migravam para o cito
plasma, onde desapareciam gradativamente.Posteriormen
te, através de micros copia eletrônica, Bowers e Korn
(1969) verificaram que o volume nuclear diminuia 40%
durante o encistamento: no início do processo, o
cleo tornava-se lobado, formando pequenos botões
, nu-
que
pareciam não conter material nucleolar. Grande parte
dos botões era inco~porada em autolisossomos, caracte
rísticos de células yncistautes. Além disso, parte
do material densamente corado do nue1.éolo, parecia se
d i spersar no nucleoplasm a e seu de stino posterior era
26
difícil de ser -dete rminado morfológicamente • . O decr~s -
cimo nucleolar; igual a 75% durante o encistamento (Ray
e Hayes, 1954), era paralelo à expulsão de cromatina.
Chang e Hume s (1962) isolaram um fator
·transferI vel para células humanas em cultura de tecido,
denominado "lipovl~us". Trabalho s posteriores (Chang
let al., 1966), 'sugeriram que O"lipov:trus': era transpor
tado por uma célula amebóide, capaz de transferI-lo pa
ra célUlas humanas crescendo "in vitro", por um meca
nismo desconhecido que exigia o contato entre as célu
las. O fator trans ferIvel sofria replicação na célula
hospedeira, caus~ndo alterações nucleares ' (degradação
de DNA), produção de antIgenos especificos e lise celu
lar. A injeção intracerebral das células amebóides com
seu fator transferIvel, em macacos, causava encefalite.
As células amebóides foram, então, identificadas como
Hartmannella rhysodes (Acanthamoeba ~.). A observação
direta do efeito patológico ' dessas amebas e a demonstr~ ção, por imunofluorescência, de antIgenos das amebas
~as células hospedeiraé (Liu e Rodina, 1966),sugeriram
que Acanthamoeb~ transportava ·um fator transferivel,de
riatu:r'eza desconJb.ecida. · lto e colaboradores (1969) pos
tularam que o fator trB.nsferIvel poderia ser o respon
s~vel por parte da incorporação citoplasm~tica de timi
dina tritiada verificada ánteriormente (Chang et aI.,
1966). An~lise estrutural fina, através de autoradiog;~ fia em trofozoitos de Acanthamoeba (Ito et alo, 1969)
demonstrou incorporação ativa de .timidina tritiada no
ci toplasma, enquant.ó que a marcação nuclear era relati
vamente limitada: cerca de 32% -da radioatividade era
encontrada no citoplasma é o número de grãos contados
sobre o plasmalema ·era três vezes maior do que sobre
as mitocôndrias. A linhagem de Acanthamoeba utilizada
por Ito et ül. (1969), foi propagada durante anos em
culturas axênicas, tornando, portanto, pouco prov~vel
que os corpúscu.los citoplasm~ticos resultassem da in
trodução de microrganismos exógenos. Em duas linhagens
de Naegleria gruberi, ameba de -solo relacionada taxo
nômicamente 'com A. easte'llanii, foi demonstrada a exis
tência de partícula.s seme lhantes a vIrus ao microscópio-
27
eletrônico~, capazes de infectar células de embrião de
galinha; ocasionando lise e liberação de maior quanti- ' dade de mate'rial ,infectante (Dtumebacke e Schuster, 1971). Em Acanthamoeba, os corpúsculos citoplasmáticos contendo DNA poderiam ser elementos genéticos normais do ·genoma da ameba, endosimbiontes facultativos ou parasita~ intra-celulares como v::trus defec~ivos ou epis-somos (Ito et aI., 1969). A existência provável dess'es elementos serelaclona com a verificação anterior de um fator transfer::tvel .nessa li:nhag·em.
A descrição da expulsão de cromatina e a presença de endósimbiontes citoplasmáticos podem, de alguma maneira, estar relacionadas. Nos estágios iniciais do encistamento, verifica~se o aparecimento de autolisossomos no c'i toplasma, contendo mitocôndrias, grâ
nulos de glicogênio etc. (Bowers e Korn, 1969). Os cistos apresentam agregados de restos citoplasm~ticos
aderidos à camada externa da parede do cisto, sugerindo que o conteúdo dos .autolisossomos seja des.earregado na paredeem .formação (cf. Bowers e Korn, 1969)-. Autó ... lisee . excreção de componentesci toplasmátic.os e nucleares são consistentes com o apar~cimento de prote!nas, ·aminoácidos e ribónucleot::tdeos no meio de cultura
de células encistantes (Griffiths e Hughes, 1968). O material excretado contém; ao microscópio eletrônico , , . partículas semelhantes a vírus (Bowers e Korn, 1969).
Fenômeno semelhante à liberação de CTomatina ·em A. castellanii, foi verificado durante a ovo-
A • A
gene'se de lnsetos do genero Acheta, conforme . trabalhos recentes de Lima-de-Faria e colaboradores (cf. Lima-deFaria·, 1973). Durante a meiose, nesses organismos, há
amplificação ' de certos cromômeros . que liberam as ,
co-pias amplificadas no nucleoplasma. Subsequentemente , esse DNA se dirige para as proximidades do envelope nuclear e força sua passagem para o citoplasma, ficando envolvido .poruma ·parte da membrana nuclear.Através de hibridização "in. situ" , demonstra-se que a maior parte do' material amplific?-do é formado po·r cistrons
ribossômicos. O DNA migra para o citoplasma acompanha -
do por , grande quantidade de RNA. Os dois tipos de áci-
dos nucleicos
mando grandes
transferência
28
permanecem associados no citoplasma, for
particulas de fUnção desconhecida. Essa
de complexos DNA-RNA também foi verifica-
da em outras espécies de insetos (Jaworska, citado em
Lima-de-Far ia, 1973) e rato (Izquierdo e Vial, 1962; Szollo s i, 1965, citados em Lima-de-Faria, 1973).
O encistamento em amebas pode ser consi,de
rado como um processo de diferenciação celular típica,
não complicado por processos sexuais (Neff et aI.,
1964 a). Muitos sistemas biológicos têm sido explorado~, na tentativa de elucidar os eventos metabólicos que
determinam a regulação do crescimento e diferenciação c~
lular. O encistamento pode constituir um sistema útil
para o estudo da morfogênese celular, já que os tipos
celulares envolvidos são distintos estrutural e quimica
mente e o processo pode ser . acompanhado sob condições
experimentais bem definidas. Apesar de representar um exemplo de diferenciação de protozoários, pode servir
como um modelo simples para a compree~são do desenvolvi-
mento de sistemas evolutivos mais complexos, com os
quais compartilha caracteristicas comuns (Krishna Murti,
1971; Stevens e fachler, 1973 a).
Ass~m, .a simplicidade relativa do sistema
de A. castellanii, a facilidade de ser cultivada axêni
camente em larga escala e a possibilidade de ser encis~
tada sincronicamente, motivaram o estudo da diferencia -
ção dessa a meba. Tendo em vista as mudanças nucleares
paralelas ao encistamento, a idéia inicial deste traba
lho era analisar o padrão de sequências de DNA nas duas
fases do ciclo de vida do protozoário. O objetivo era
explorar as interaçbes 'entre os ácidos nucleicos do cis
to e trofozoito, atra~és da homologia entre seus DNAs.
E$peculações como essas poderiam fornecer resultades in
teressantes sobre o papel biológico das diferentes fami
lias de DNA-presentep nos organismos superiores; já que
a diferenciação da ameba envolve, provavelmente, perda
de parte do material genético o A carac~erização do DNA
de trofozoito sugeriu :vários problemas que ' passaram, en
tão, a , ser estudados. PadronizO,u",-'se um método de iso
lamento de núcleos dessa ameba (Marzzocoe Oolli, 1974)
29
e de extração de TINA de trofozoitos e cistos. A análise
do DNA de trofozoitos quanto ao comportamento em gra
diente s de densidade, perfil de desnaturaç ão e renatur~
ção, forneceu resultados que podem se relacionar com
a descrição citológica de dorpúsculos citoplasmáticos
contendo DNA CIto et al.,1969) e com a extrusão de DNA
para o citoplasma CBowers e Korn, 1969). Deste modo,
o trabalho a ser descrito representa a caracterização
parcial do DNA de trofozoito e uma análise preliminar
do DNA de cisto. Os resultados obtidos poderão, futura
mente; servir para o estudo da homologia existente en
tre esses ácidos nucleicos, o que poderia ser útil pa
ra uma melhor compreensão da diversificação gênica du
rante o ciclo de vida de um organismo superior relati
vamente simples.
v. Métodos
1. Cresci~ento de A. caste11anii
a) Meios de crescimento
° crescimento da ameba foi testado em dois
meios de cultura, resultantes de modifica~ões dos meios
descritos por Neff (1957) e Band (19 ~-)9)e A composição
dos meios empregados, denominado s A e B era a seguinte:
Meio A Meio B
proteose-peptona - 0,75% p r ot e oBe-peptona - 1,5%
extrato de levedo - 0,7S% glicose - 1,0%
glicose - 1,5% NaC1 - 2mM
MgS04 - lmM " MgC12 - 0,015mM
CaCl'2 - 0,05mM CaC12 - 0,02mM .\
KH2P04 - 2mM . FeS04 - O,OlmM
citrato férric.o - O,lmM Na2HP04 . - lmM
KH2P04 - lmM
Os dois meios continham ainda, as seguin-
tes vitaminas: tiamina (lmg/l), biotina (0,2mg/l) e vi
tamina B12 (1 )1g/1) •
A preparação dos meios de cultura seguia o
procedimento descrito abaixo, necessário para evitar a
formação de resIduos i~solúveis, ricos em nitrogênio, a
pós a autoclavagem. ·
. 0 meio, com pH igual a 7,0, não contendo gli
cose e vitaminas, era fervido durante 20 minutos. Após
resfriamento, as vitaminas eram adicionadas e o meio
filtrado através de papel de filtro fino. ° lIquido tran§.
parente resultante era distribuído em frascos de cultura
e autoclavado a 1200 C, "lkg/cm2 , durarite 30 minutos. An-
tes do inóculo, glicose 50%, autoclavada à parte, era
31
adicionada assepticamente, no volume adequado~ Em al
guns casos , adi cionava-se 100pg/ml de penicilina e es-
treptomicina, previamente esterilizadas por
em filtros Millipore GS autoclav~dos.
passªgem
b) Tratamento dos frascos de cultura
As amebas aderem firmemente a superf!cies,
o que dificulta a obtenção de dados quantitativos so
bre o crescimento. O uso de vidraria tratada com sili
cone evita esse problema, sem causar nenhum dano às cé
lulas (Neff et aI., 1958). Os frascos de cultura, lim
pos e secos, eram siliconizados com uma solução 5% de
silicone e secos a 2200 C por cerca de 16 horas o
c) MétOdos de cultura
A cultura era sempre feita a 2800, de di~ Versas maneiras:
Culturas estacionárias: as amebas eram
crescidas em cu~turas rasàs, obtidas com erlenmeyers
contendo um v?lUille de mpio igual a 1/5 da capacidade
do frascoo Esse tipó de cultivo era utilizado para ma
nutenção de cul t .uras-estoque.
Culturas agitadas: amebas cultivadas em
erlenrneyers, mantendo a mesma relação de volume (5:1),
eram incubadas em agitadores New Brunswick, com veloci
dade em torno de 100 rpm. O crescimento em pequena es
cala, podia ser obtido por incubação de pequeno volume
de meio (cerca de 2 m1), em tubos inclinados sob agita
çao o
Cultura em larga escala: para a obtenção
de grandes quantidades de ' células, adotaram-se difer.en-
tes processos de cultivo: crescimento em frascos de
12 1, contendo 1 1 de meio, incubados estaticamente
crescimento .3egundo Adam et al~(1969), onde a aeração
era obtida colocando-se frascos ' de 3 a 6 1, contendo
imã, sobre agitadores magnéticos e' cul ti vo em fe rmenta-
32
dor (New Brunswick Sci. Co. Inc.), com uma dorna de
8 1, contendo 5 1 de meio, aeração d~ 2 1 de ar por mi
nuto e agitação de 80 rpm.
d) Determinação da velocidade de crescimen
to '
° crescimento era medido pelo nÚmero de
células por ml de meio, por tempo de cultivo o ° número .
de células era determinado por contagem de amostras tri
plicatas em câmara tipo Neubauer (Resistance, Germ).Al
ternativamente, o crescimento era determinado pela ab
sorbância a 600 nrn, em um espectrofotômetro Coleman Jr.
11, utilizando-se . frascos de cultura com um tubo de en
saio adaptado lateralmente.
e) Manipulaç ão de culturas
As operações, após autoclavagem dos fras
cos, eram realizadas em câmara assepticao ° controle de
contaminação das culturas era realizado por pré-incuba
ção dos frascos estéreis a 37°C, 16 horas; verificação
de crescimento bacteriano por adição' de alíquotas do
meio de crescimento em caldo glicosado, incubado a 0-. . 37 C por 16 horas e coloraçao do melO de creSClmento
estéril pelo método de Gramo
20 Encistamento
° enc~stamento era induzido por remoça0
das células do meio de crescimento, lavagem e transfe
rência para um meio de encistamento semelhante ao des
crito por Neff et aI. ( 1964 b) , com a seguinte
composiç ão: KCI 100 mM; MgS04 8mM; CaC12 0,4mM; NaHC03
ImM e tampão Tris-HCI 20 mM, pH 9,0. ° meio de encista-
mento era autoc]avado nas mesmas condições que o
de cresc imento e todás operaç ões eram realizadas
ticamente o Células de culturas agitadas em f as e
rítmica tardia, eram coletadas por centrifugaç ão
meio ,
assep-
loga
( 800xg,
·~3
10 m1.n.) e lavadas três vezes com meio de encistarnento. ~ ~eguida, as c~lulas eram suspenAas em meio de êhci8~ tt\m~nto. ao nível de 105 cé1ulas/ml e :i.ncubadas â
28°0 ~ob agitação, durante 20 horas. A ~~lgção entre dá pa.oidáde dd frasco e volume de tneio era igual à 5t1, O~ cistos, suspensos em me i o de enc istamento, eram 9S-· tCCe.d09 g 4°0.
1!:ncistamento espontâneo podie ser obtiao êtil culturatl agitadas que, após âtingirem Uma densidade de aproxim~damente lxl06 células/rol, começavam a encistar ilssincrônicamente.
3. Germinação (Excistamento)
Os cistos eram centrifUgados e três vezes com meio de crescimento (lOOOxg, 10
lavados
tnin.·) i sob condiçbes assépticas. Os cistos lavados , eram, en-tão; inocu1aaos ao nível de 5x103 organismos/rol, em me·io de crescimento f e cultivados sob agitação a. 28°C • Â germinação era acompanhada durante 8 horas~ retirando-se a1íquotas (intervalos de 30 min), que erâm observadas ao microscópio de fase pâra verificàção do apa~
redimentb de amebas livrES nO meio.
4. I,sólB:IApnto de p:~.cleos de trofozoi "bOIS
.. nu-1'0-
Vários métodos para purificaç~o de c1eos, utilizando meios aquosos de homogenização, raro testados. Segue-se uma descrição sucinta de m~todo:
oS.da
a) Método de Chauvea~ et aI. (1956): o procedime~ to adotado era semelhante ao descrito originalmente par~ f!gado de rato.
b) Método que emprega o detergente Nonidet P-40: as células eram sedimentadas e lavadas com sacarose
0,25M; GaC12 3 mM e Tris-HCl 0?05 M, pH 7,4. Em seguida, as células eram suspensas na mesma solução contenao detergente e agitadas em agitador magn~tico por 10 a 30 t11H ILl.to8 e. 4°00 Foram testadas várias CQncentra-
31+
ç~es do detergente, variando de 0,5 a 5 ,0%.
c) Método de Stevenson (1967), modificado: a 1i-
se celular era obtida por suspensão das
méios hipotônicos (NaCl 0 ,05 M, CaC12 1
0,1% (v/v) de Tween 80.
células em
mM) , contendo
d) Homogenização de células em um aparelho Vir
tis, modelo 45: Foram testados diferentes meiQs de' ho~
mo genização, cont~ndo oU não d~tergehtes e v~ride ' ~em~
pos e velocidades de agitação.
, e) Rompimento de células' por ultra-som: ,
celulas
lavadas e suspensa's em sacarose 0,25 M" contendo CaC12
3 mM' e Tris-HCl 0,05 M, ,pH 7,4, eram submetidas a di
ferentes tempos e intensidades de sonicação em um apa~
relho modelo Wl85D da Heat-Systems Ultrasonics, Inc.
f) Método de Schneider e Hogeboom (1950), modi
ficado: cet'r.a de 3xl08 células eram centrifugadas (800
xg , 10 min.) e lavadas com sacaro s e 0, 25 M; MgC12 lmM ~
suspensas em 0,5 ml de pacarose 0,88 M; Mg012 lmM e
for çadas através de uma agulha hipodérmica 25-8, por
20 vezes. ° precipitado obtido por centrifugação do
homogenato a 800xg, durante 10 minutos, era lavado
duas vezes com a. sacaros e mais concehtrada e suspenso
em 1 rol da ínesma. saluç.ão. A 'fração nuclear impura era
colocada sobre 10 ml de sacarose 2,4 M, contendo
MgC1 2 lmM e centrifugada a 28000 rpm no rotor 50 Ti da
ultracentrífuga Spinoo, durante 1 hora.
g) Método de' Hymer e Kuff (1966), modificado: a
modificação introduzida refere-sé à homogenizaçãc que
era obtida por passagem em agulha hi podérmica 25-8, em
vez de empregar um homogenizador tipo Potter-Elvejenem.
h) Método de Blobel e Potter (1966), modificado:
o precipitado de núcleos impuros era obtido pelo méto -
do (f). A purificaçáo posterior dos núcleos era feita
conforme descrito por Blobel e Potter (1966).
i) Método de Rozijn e Tonino (1964): o método foi
testado sem nenhuma modificação considerável.
j) Método adotado rotineiramente (Marzzoco e
Colli, 1974):
Os núcleos eram sempre isolados de célu
las em crescimento exponenc ial. Todas as etapas do iso-
')/
l a mento eram r eali z adas entre O P. h OO .
Cer c a de 3xl 08 c élul as e ram coletadas por
(~e ntri fuga r; ã o (nOOxg , 10 mi n.) e l av ad.as com NaCl
0i14 M~ Em .geguida, d e t e rminava-se o pe s o úmido de células . Às c élulas eram s u spensas e m 1 ml de uma solu
Ça0 (me i o PVP), com á seguin te compo s ição: polivinil
p -irrol idona 8% ; MgC1 2 lmMi CaC12 2mM; KCl 2 mM e Tris
RCl 0, 05 M, pH ~,4. As c~lul as e r a m rompidas por passagem em
seringa com agulh a hip o d érmica nº 25-8, por 15 a 20 ve-
ze s . O hOTtlo genato era diluído c om meio PVP contendo
sacarO ~3 e 0 , 6 M, até concentração :final ele 25% (peso úmido ini c i a l / v o lume). O h omo gen 3.to diluído era centrifu
g ado a 700x g por 10 min uto s . O pre c ipitado obtido er~
sus penso em um volume conh ecido de meio PVP-sacarose
0, 6 Mo
A purificação dos núcleos era obtida
c entri fugação em gr adiente s descontínuos de tneio
por
1?VP~
conten do diferentes concentrações de .sacarose. Os gra
dient e s tinham a seguinte composição do topo ao ftlndo:
0,3 ml de sacarose 1,2 M; 0,7 fil de sacarose 1,5M; 0,7 ml
de sac arose 1,8 M ~ 2,] ml de sacarose 2 i O M. A amostra
(0,7 ml). contendo os núcleos era cuidadosamente coloca
da no topo do gradiente e centrifugada no rotor SW 65-Ti
da ultracentrífuga Spinco L3, a 50000xg, por 1 hora 'l.
4°C. Para volumes maiores, utilizava-se o rotor SW 25.1,
mantendo as mesmas proporções relativas de soluções de
sacarose. Depois da centrifuga~ão, o material se distri-'" . , buia em tres bandas · sobrenadantes constlt1udas por frag-
mentos de membranas de tamanho variado e um precipitado
que continha os núcleos.
Os núcleos eram suspensos em meio PVP-saca
rose 0,6 M, eentrifugados a 700xg por 10 minutos c fi
nalme nte ressuspensos na mesma solução o
50 Controle da pureza das preparações de
núcleos
a) Microscopia de f ase : o s núcleos isolados
e ram roti ne i r ame nte anal i sados, a o ~lcroscópio de fase ,
6
qu.ant~o 8 sua i ntegr i rlane morfológica e aus ência de célu
las int e iras ou fragmentos de membranas contaminantes .O , d; , 1 . · numero .e nUtCleos e celu as J_nte1ras era det e:rminado
por cont ~gem em eâmara d'e NeubRuer . Para isso 4 as prepa
raç5eA erR~ ~oranas com lmR soluç~o n8 Giemsa JO% em sa
carOS8 0; 25 M; MgC12 1 ruM. b) Micr oscopia eletrônica: 0 ,8 precipitados
de núcleos ~l'al11 fixldo s , durante '+8 horas , em glutaral -
detdo 1 , 5% ; em tampão fosfato de sódio 0, 22 M~ pH '7 ; 2 •
Os fragmentos eram, então, transferidot3 para uma sol u
ç~o de Os 04 1% e, em següida para uma solução de acet ffi
to de nranila 0,5%, onde permaneciam por 3 e. 12 horas re s pec f:i vRmenb'l. A de s i fl rataqão ArR COJl(tuzida atrflv~s
de uma série p;radativa oe soluções de etanol. Os nú-cleos fi xaoos e de s irlratadoE~ erRm embe"b i.doR em Ara.ldite
e cortedos em um ultra-illiGrótomo Porter-Blrun MT-l. As
secçõe s ohtiàas , com cerca tie 90 nm de espe ssUra, eram
coradas em acetato de uTé3nila ~% e citrato de
2 , 6% e eXRminact8s em um mi croscópio e letrônico
EM9 S-2.
chumbo
Zeiss
6. :posagem de RNA; UNA e pl'otelna em
~leo~ e homogenato.
; nu-
A composi ção qUlmlca de núcleos e homogena~
tos, e ra analisada através do método de Schmidt~Thannhau
ser; conforme . descrito por Munro e Fleck (1966 ). Segue -se uma de scrição sucihta do procedimento adotado para o fracionamento das ~reparações de núcleos e homogena
tos. 1mostrRstriplicatas eram precipitadas no
gelo, durante , 20 min~, com concentração final de paA igUal· a 0,4 No O' preeipitado obtido por centrifuga.ção a .
10000xg , 10 mini, era lavado duas 'vezes com PCA 0,4 N • O material áci'do-insolúvel era suspenso em NaOH 0,33 N
e · incubado durante 1 hora a 37<:'C. ° digesto alcalino era acidifi cado com PCA (concentração final de 0,4 N) e man-
tido no gel o por 20 ·min . O prec i pi tado obtido por cen.,.
t ri f u ga ção ( l OOOOxg , 10 min o), era lavado com PCA 0,4 N.
37
RNA era dosado no s obrenadante e DNA no precipitado.
O precipitado obtido por acidificaç;o do
dige s to alca'lino . era dis s olvido em NaOH 0, 33 N, a 37°C, por 20 mine e dosado quanto . ao teor de DNA~ se~ gundo o método de Ceriotti (1952). O padr;o utilizado
era 2-desox i-D-ribo s e.
RNA era dosado no digesto alcalino com
o reagente de orcinol (bische , 1955), empregando DNri
b ose COIDO padr;o. . t A dosagem de protelna e r a feita nas pre~ - . ; -paraçoes de nucleos e homogenatos nao fracionados~ de
acordo com o procedimento de Lowry et aI. (1951). Al
bumina sérica bovina 'era empregada como padrão nas de
terminações.
7. Ensaio da atividade de RNA
se (E.C.2.7.7.6)
polimera-
Os núcleos utilizados para a determinaç;o
da atividade de RNA polimerase, foram lavados por cen
trifugação (800xg, 10 rrdin.) e suspensos em sacarose
0;25 M; MgC12 ·1 mM e Tris-HCl 10mM, pH 7,4.
A mástura de incubação 'para o ensaio en-
zimático tinha· p- segulnte composiç;o~ 10 )lei/ml de
3H- UTP ( 11,7 Ci/mM); ATP 1 mM; GTP 0,4 mM;CTP 0;4 mM;
DTT 4 ' mM; KCl . 20 mM; MgC12 4 mM; NaF 4 mM e Tris-HCl
0,1 M, pH 7,6 0
A reaç;'o era iniciada pela adição de uma
al!quota da suspensão de núcleos contendo l5pg de DNA.
A incubação era ~eita a 30o C, sob agitação o A reação
era paralizada por adição de 10 volumes de pirofosfa-
to de s ódio em TCA 20% e 200)1g de a lbumina para fac i
li..tar a precipitação, obtida por manutenção dos ,tubos
durante 45 mino no gelo • . Os ·precipitadosrecolhidos
por centrifugação a 10000x g, por 15 mino, eram lava~
dos com pirofosfato de sódio 0,05 M em TCA 10% e de
pois com etano l 95%, contendo acetato de ' sódio 1%. Os
precipitados eram hidrolizados com KOH 0,3 N por 1 ho
ra a 37°C . O h idrolizado era acidificado com TCA até
38
concentração final de 10% e centrifugado (lOOOOxg, 10 mina)~ A radioatividade incorporada em RNA era deter
minada no sobrenadante, constituído pelo material ácido-insõlúvel; . e sensível à hidrólise alcalina. O prow
cedimento . adotado reduz a radioatividade 'Ibackground" & cerca de 4,5% da radioatividade incorporad~ · em RNA, após 30 minutos de incubação. Alíquotas (50 )11) do $0-
brenadante eram colocadas sobre filtros Whatman GF/A. que eram secos e contados em frascos cqntendo 10 ml de líquido de cinti1ação; contendo: hidroxi1-hiamina 0,5%
(v/v); 4 g/l de PPO; 100 mg/l de POPOP e tolueno q.s.p. À radioatividade era determinada em um cintilador Beck man LS-250, com eficiência de contagem de aproxlmada -mente 37%.
Farale1amente, a atividade de .RNA polimerase dos núcleos isoladps, foi analisada em presença de actinomicina D e rifàmpicina, ao nível de 8}lg por.
ml da mistura de incubação.
8. Purifipação de mitocôndrias
Todas as opera.çoes eram realizadas entre
O e 4 0 0. Células em fas:e exponencial de crescimento ,
eram sedimentadas e lavadas com 'sacarose 0,24 M;MgC12 10 mM; KC1 10 mM e Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 por centrifugação a 1000xg durante 10 mine As células, suspensas em três volumes da mesma sacarose, contendo EDTA
5 mM em vez de MgC12 10 mM, ,eram homogenizadas em um homogenizador tipo Dounce (10 movimentos)o A extensão
do rompimento celular era acompanhada · ao · microscópio de · fase. O homogenato era centrifugado 10 minutos a
900xg' e o sobrenadante obtido era centrifugado a 10000xg por '20 ·min. Os precipitados compactos obtidos eram submet~dos a dois ciclos adicionais de centrifuga çãe diferencial. A suspensão final ' de' mitocôndrias ,ao
. '. - , , IDlcroscoplO defase, nao apresentava nucleos ou celu-las inteiras. A mesma ·contatação era feita ao microsc2 pio eletrônico onde, tOdavi·a, era possível verificar a presença de fragmentos de membranas contaminantes.
39
9. Extração de DNA
° método descrito a seguir era utilizado, com as ,devidas adaptações,para extrair DNA celular total, nuclear e mitocondrial de trofozoitos e DNA total de cistos.
Todas as operações eram realizadas entre ° - - . ° e 4 O~ A preparaçao em questao era lavada com NaOl
0,14 M, 'por centrifugação. () material centrifugado era, pesado e · suspenso em um meio de extração contendo die
tilditiocarbamato de sódio 0;3 M e fenolftale!na difosfato 0,015 M, pH 7,5, na proporção de 811 (v/w). Adicionava-se SDS até concentração final de 2,5% (w/v) e a suspensão era homogenizada manualmente em genizador tipo Potter-Elvejehem. ° lisado era do com i~al volume de uma mistura contendo 3 de fenol e 1 parte de meio de extração (v/v) 30 min o à temperatura ambiente. As soluções de
um homoextra!partes
durante fenol
e meio de extração eram preparadas imediatamente antes de usar. Após a extração fenólica, a emulsão , era centrifUgada (lOOOOxg, 15 min.) e a fase aquosa, extremamente viscosa, era removida e precipitada COm 2 volumes de etanol. ° precipitado fibroso, contendo os ácidos nucleicos era cole.tado com a ajuda de um bastão de vidro em rotação. Os ácidos nucleicos eram dissolvidos . em sse, num volume igual ao da fase aquosa da extração com fenol e incubados a 37°0 com RNase P8.E; creática (150 pg/ml, 1 hora) e pronase (500 pg/ml, 3
horas). ambas previamente aquecidas a 80°0 por 15 minutos. Adicio~almente, o DNA · era tratado com a-amil~
se (200 pg/ml , 2 h. a 37°e), previamente analisada quanto à cont aminação por DNase. Seguia-se nova desproteínização, agora com fenol 88% (v/v),colltendo 0,1% de hidroxi-quinolina. A fase aquosa era precipitada
com 2 volumes de ·etanol. ° DNA obtido ·era dissolvido em 0,1 sse e precipitado com isopropanol, conforme descrito por Marmur (1961), Finalmente, . o DNA er~ submetido a extensa diálise contra 0,1 8S0.
40
10. Centrifugação em gradientes de CsCl
~) Centrifugação preparativa
As preparações de DNA e r am adic ion almen
te purificadas ou fracionadas em diferen tes c omponen
tes, por centrifugação em gradientes de Cs Cl. O pro
cedimento adotado era o seguinte: CsCl sóli 'io era a
dicionado a 3,5 ml de solução de DNA cont endo 1 a 20
unidades de absorbância ( 260 nm) em 0,1 SSC ou Tris
HOl 0,01 M, , até ser obtida uma densidade inicial de
11725 g/cm3. A densidade d a soluç ão era determin ad a a
partir do índice de refraç ão (Ifft et aI., 1961). A
solução era distribuída em tubos de nitrocelulose,
preenchidos com óleo mineral (Sigma). A centrifugaçã0
era feita no rotor SW 50.1 da ultracentrífuga Spinco
t o --3, a 38000 rpm e 25 C. Cerca de 40 fraçoes com 8
gotas cada uma, eram recolhidas por punção no fundo
do tubo, convenientemente diluídas com tampão e ana
lisadas quanto à absorbância a 260nm. A linearidade
do gradiente era verificada através do índice ' de re
fração das fraç6es não diluídas o As frações com ~l
ta absorbância eram reunidas e dializadas contra o
mesmo tampão. O DNA era coletado por centrifugação n o
rotor 50 Ti da Spinco L-3, a 40000 rpm, 4 0 C, durante
cerca de 20 horas.
Em alguns experimentos, as frações d,os
gradientes eram analisadas quru1to ao teor de hexoses
e desoxirribose, determinado segundo os mé todos des
critos por Mockrash (1954) e Giles e Myers (1965),
respectivamente o Os padrões utilizados nas do s agens
eram D-glicose e 2-desoxi-D-ribose.
b) Centrifugaç ão analítica (de termin a ç'ão
da densidade de flutuaç ão)
As s oluç6es de DNA e r am previa mente dia
lizad as c ontra NaCl 0,01 M e centrifugadas a 8000xg
durante 45 mi n u to s .
Amostra s de DNA contendo cerca de 3 pg,
41
eram centrifugadas a 44000 rpm, durante 21 horas a 25°C, em gradiente de CsCl ( p inicial = 1~700 g/cm3), con-
·tendo DNA do fago 2C de Bacilus . subtilis ( p = 1,742 g/cm3) como padrão de densidade. As análises -eram rea-lizadas em uma ultracentrífuga Spinco, modelo E, equipada com um sistema padronizado para a medida da absor
ção no ultravioleta, um monocromador e um. "scannér lí ·ele trônico. A densidade de flutuação era calculada segun-
_do Vinograd e;Hearst (1962), a partir da densidade de referência -(1,742 g/cm3 ) e expressa em termos da densidade inicial da solução, à pressão atmosférica.
11. Fragmentação de DNA
Para a obtenção de fragmentos de DNA de
baixo peso - molecu~ar, utilizava-se um Omni-Mixer da· Sorvall Inc. t equipado cóm um "micro-attachment" , ope-
o -rando a O-C. Cerca de 3 ml de ·soluçao contendo 100 pg de DNAJml, eram agitados durante 30 minutos, com o dial na posição 8.
12. Avaliação de peso moleeular
a) DNA nativo
O peso molecular (PM) era avaliado a partir da velocidade de sedimentação, determinada por centrifugação zonal em gradientes lineares de sacarose. O padrão de PM utilizado era o TINA do fago T
7, marcado
com 32p.
As amostras -de DNA eram , cuidadosamente co
locadas sobre 25 ml de um gradiente de sacarose 5 a 20%, contendo NaCl 1 M; EDTA 1 mM· e Tris-HC1 lOmM, pH 7,.8 (gr~diente neutrd) ou -NaGl 0,9 -M;EDTA 1 mM e NaOHO,l M (gradiente alGalino) e centrifugadas a l8000 . rpm no rotor SW 25.1 (Spinco L-3), por 16 horas a 40 C. Frações de aproximadamente 1 ml eram coletadas
a partir do fundo do tubo e analisadas quanto à absorbância· a 260nm· e radioatividade. A radioatbri dade era determinada por cintilação líquida na s olu~~o descrita
4 2
por Bray \1960), em um cintilador Beckman LS-250o
O PM do DNA nativo (gradientes meutro s )
era det erminado con~orme sugerido por Burgi e Hershey
(1963) e o PM do TINA mon ocatenário (gradiente s alca-
linos), através da equação proposta por
(1965).
b) DNA fragmentado
Studier
o peso molecular de DNA fragmentado conf orme descrito no item 11, era avaliado a partir da
velo c idade de sedimentação em gradientes lineares de
sacarose 5 a 20% em SSC. O DNA era desnaturado com ál-
50.1 cali, neutralizado e centrifugado no rotor SW
(Spinco), a 45000 rpm, durante 4 horas a 4 0 C.
° DNA utilizado como referência era o
DNA do fago ' fd (circular, monocatenário), que, nas
condições utilizadas, ' comporta-se corno uma molécula
linear com S20
0 = 24,48 (Colli et al., 1971). As ,w . constantes de sedimentação obtidas eram relacionadas
ao s pesos moleculares dos DNAs, através da equação
proposta por Eigner e Doty (1965).
O procedimento empregado para a fragmen
tação de TINA · prolduz:la sempre uma população homogênea
de moléculas, c?nforme sugerido pelos perfis de ab
sorbância dos gra.dientes de sacarose, caracterizados
por uma distribuição unimodal e gaussiana.
1 3 ) Renaturaç ão de DNA
A renaturação de DNA era medida pela
queda de ab sorbância a 260nm (Wetmur e Davidson,1968),
determinada em um e s pectrofotômetro Zeiss PMQ 11. A
temperatura das soluções de DNA, contidas em cubetas
de quartzo com tampa 1e t~flon, era mantida constan
te por circulaç ão de água proveniente de uni banho Co
lora (NB-36252 , Germany), termostatizado a 600 C. As
amo stras ' de TINA em NaCl 1 M, eram desnaturadas por ad,!
ç ão de 0 , 05 par t es de NaOH 1 N e, depois de 15 min.
neutrali z a i a s com igual volume de NaH2P04 2M. As so-
43
luções utilizadas para a désnaturação e neutrali~ação eram mantidas a 600 0 e adicionadas ao DNA contido na cubeta do espectrofotômetro com o auxilio de uma seri~ gá térmostatizadá.
As experiências de renaturação empregavam sempre, preparações d~ TINA fragmentado conforme descri to no f tem 11. A tabelá 6 (ResUltados) mostra os ~alo~ res de PM de algumas preparações de DNA.
14. Curvas de desnaturação térmica (Determinação de T
tri).
A determinação de T. foi realizada de a-m
cardo com o método de MandeI e Marmur (1968), utiliz~ do o mesmo equipámento descrito para as experiências de renaturação. A temperatura era medida através de um termômetro especialmente adaptado para ficàr imerso e~ uma solução de referência. Os diferentes TINAs estavam dissolvidos em 0,1 -SSG e todos os dados eram caÍ' rigidos para expansão térmica.
VI. Resultados
1. Curvas de Crescimento
o crescimento foi testado em dois
d.e cultura (A e B), sob diferente,s condições de
méios
aera-
ção (culturas agitadas e e s tacionárias). A figura 1 mos
tra os resultados obtidos. O crescimento em meio A é ligeiramente mais acentuado, tanto em culturas estacio
nárias, como àgitadas. Culturas estacionárias caracte
rizam-se por crescimento máximo de cerca de 4xl05 cé
lulas/ml, atingido em torno do l8º dia de cultivo , Nes
sa oca sião, a maioria dos organismos apresenta
esférica e há baixa porcentagem de cistos. Nas
ras agitadas, a fase logarftmica é mais longa,
ro máximo de células/ml é maior (2-7xl06 ) e,
o
a
forma
cultu-,
nume-
par-
tir do 8º dia de cultivo, inicia-se o encistamento em f ,
massa das amebas. O nlvel de celulas presentes na fase
estacionária é maior em culturas ag~tadas crescendo em
tubos inclinad0s (maior aeração), do que em erlen-
meyers. Conforme verificado por outros autores ( Byers
et aI., 1969), o crescimento parece ser determinado pe
la quantidade de oxigênio dissolvido no meio.
As curvas de crescimento determinadas por " . contagem do numero de celulas por ml de melO de cultu-
ra (Figura la) apresentam uma fase de crescimento expo-
nencial e uma fase estacionária. A aparente fase de
"lag"verificada quando o c rescimento é medido por absor
bância da cultura a 690nm (Figura IA), pode ser expli
cada pela r e lação nao linear existente entre absorbân -
cia e nº de células/ml (rabela 1).
Para a obtenção de grandes quantidades de
células, adotou-se, rotineiramente, a utiliz ação de
fermentador. Nessas eondi ç ões, as curvas de ,crescimento
obtidas são semelhantes às curvas de culturas agitadas
em erlenmey e r s, mostradas na Figura la.
107,. 45
E "-
106
tn lOS j 3 'w u
w c
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103, , , , 100 200 300
HORA 5 DE CUL T I 'VO
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0,4 <t:
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ex: ~ 0,2 m I -~
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0.1
100 200 300 HORA S DE CULT IV O
Figura 1 - Crescimento . de A. castellanii em diferentes condições de cultura. O crescimento foi medido por contagem do número de células por ml em câmara de Neubauer (gráfico a) ou por determinação da absorbância a 600 nm (gráfico A). Os resultados são a média de duas experiências. No gráfico a, os círculos e triângulos indicam, respectivamente, o crescimento de culturas agitadas e estacionárias em erlenmeyers.O crescimento foi determinado em meio A (símbolos va-zios) e t;ni meio B (símbolos c heios). Os círculos cheios interrompidos re:j2resentam tuna Cl..1.I'va de crescimento em tubos SO'O agitaçao, contendo meio Bo O gráfico A mostra o crescimento de culturas agitadas em meio A.
46
Tabelg 1 - Relação entre absorbância a
600nm e número de organismos por ml em culturas de trofozoitos de A. castellanii
nº de células/ml .1600
1, 2xl06 0,245
4;6xl05 0,155
2,3xl05 0,125
1,4xl05 0,120
5,4xlO 4 0;115
3,OxlO 4 0,115
2,lxl04 0,115
3,2xl03 0,115
Os dados foram 0btidos com suspensões de cé l ulas de uma ' culturR. em fase logarítmica, diluídas com meio de crescimento estéril (média de três determinações). O número de organismos/ml foi , medido por contagem em câmara de Neubauer; a absorbância foi determinada em um espectrofotômetro Coleman Jr. 11.
2 0 Encistamento induzido
Obtinha-se, em média, 96% de encis tamen -" 1\.. . to, des d.e que o numero de celulas por ml fosse l.gual
ou inferior a 105 • Densidade maior de células impedia o encistamento o Os cistos ob t idos eram viáveis , conforme demonstrado pela germinação observada depois de 5 horas de incubação em meio de crescimento. O, excistamento foi acompanhado ao microscópio de fase, tendo sido pos s íve l constatar a s afda da ameba por um dos os tíolos da par e de do cis t o que permanebe i ntacta no final do proce sso.
47
3. Isolamento de núcleos
A I , N
malor parte . dos .metodos testados nao produz.1.a lise celular adequada. O método de Blobe1 e
Potter (1967) modificado, proporcionava Um homogenaio contendo baixa porcentagem de células inteirlis e p-úeleos aparentemente integros. Todavia, não foi possíve1 . obter purificação dos núcleos por ultracentrifuga~ ção. A adoção do método descrito por Rozijn e Tonino
(1964), sem modificações, produzia homogenato com grande número de células intactas. O procedimento adotado rotineiramente (Marzzoco e Col1i, 1974) é uma modificação desse método e permite obter isolamento e purificação de núcleos em espaço de tempo relativa -mente curto (90 minutos após homogenização). A homoge-. - , , . . nlzaçao das celulas por passagem em serlnga com a~~-
lha hipOdérmica, constitui um método eficiente, já que a porcentagem de células intactas na fração nu-ctear era em torno de ~%. A fração nuclear impura, resultante da cehtrifugação em baixa velocidade do homogenato. é altamente pUTificada por .ultracentrifugação em gradientes desco.nt1nuos de soluções -concentradas de
sacarose. A pureza das preparações de núcleos era ver! ficada por microscopia óptica e eletrônica. A figura 2 mostra o aspecto da suspensão final de núcleos iso-
. " A. ·' ladOs, onde e posslvel observar a ausenCla de celulas inteiras e fragmentos de membranas o Micrografias- eletrônicas (Figura 3), mostram núcleos intactos, envolvidos por um ·envelope duplo, . com ribossomos -aderidos à membrana externa .• Nucléolos grandes e densos, que são
característicos dessa espécie, também podem ser vis
tos. O grau de pr e s ervação estrutural mantido pelos
núele-osisolados é constatado por comparação com micrografia de núcleos "in situ", conforme ilustrado na figura 3. Os meios de extração utilizados contêm 8% de -polivinil-pirrolidona, necessária para manter a integridade dos núcleos durante o isolamento (Rozijn e Tonino, 1964). O meio de homogenização conté~, adicio
nalmente, baixa concentraç ão (0,02%) do detergente Tri
4(3
ton X-IOO, que acelera a lise celular e propicia me
lhor dispersão dos componentes celulares liberados,
além de ser um inibidor de DNase (Hymer e KUff,1966) .
O rendimento de núcleos é de aproximadamente 80% con
forme avaliado pela recuperação de DNA (Tabela 2).
Figura 2 - Aspecto de uma preparaçao de
núcleos de trofozoitos de ~. castellanii, suspensos
em meio PVP-sacarose 0,6 M ao microscópio de fase. , _ • H ,
Os nucleos es tao lntactos e nao se observam celu -
las inteiras ou fragmentos de membrana. Aumento
2560 vezes.
49
(a)
(b)
Figura 3 - Micrografias de núcleos de A. castellanii. A vreparação do material para microsco pia eletronica esta descrita em Métodos. A foto (a)m9stra o grau de ~re servação estrutural mantido pelos nucle o s i s olados, como pode ser observado por comparaç ã o c om a ap a rência dos núcleos "in situ", mostrada na foto (b). Os aumentos das fotos (a) e (b) são respecti vamente i guai s a 14000 e 10000 vezes. -
Núcleos
Homogenato
Tabela 2 - Composição química -de núcleos isolados de trofozoitos
de Â. castellanii
TINA RNA p.roteína RNA
mg % mg % mg % TINA
0,1151:0,032 20,5 0, 0232:0,005 4,1 0,422±0,029 75,4- 0,2
0,1431:0,015 0,64 , 2 ,18±O, 26 9,8 20,0:!:1,1 89,6 15 ,3
Proteína
DNA
3 , 7
140,3
Os nÚmeros se referem a núcleos isolados de 1 ml de homogenato 25% (w/v). Os resultado s para
1 ml de homogenato são incluídos para comparação. Valores médios de triplicatas de 4 experimeg
t os independen tes são dados ± o desvio padrão.
51
L~. Composição química de núcleos isolados
A tabela 2 mostra os resultados relativos
ao tecr de DNA, RNA e proteína, no homogenato e nú-
cleos purificados. Os resultados mostram que 80% do
DNA do homogenato foi recuperado no precipitado de nú
cleos. As preparações de núcleos utilizadas para o es
tudo da composição química também foram analisadas qu~ " , to ao numero de nucleos por ml, Rtraves de contagem em
A • '. camara de Neubauer ao mlcroscoplO de fase. Com esses
resultados e os dado s da tabela 2, foi possível ava-. . - '. , . .
llar a compOSlçao medla por nucleo, que era 19ual a
38;8; . 2,1 e 10,6 pg de proteína, RNA e DNA, respectiva
mente.
5. Atividade de RNA polimerase(E.C.2.7.7.62,
em núcleos isolados
A figura ~ mostra os resultados da
tica da reação catalisôda pela RNA polimerase da
. , Clne-
fra-
ção nuclear. Nas condj)ções de incubação adotadas, a v~
locidade da reação diminui logo ap6s os primeiros 5 mi
nutos de incubqção.A velocidade inicial de síntese de
RNA nos núcleos isolados, conforme avaliada pela incor
poração de UMP em RNA, era igual a 83 picomoles de UMP/
min/mg de TINA a 300 C. Essa velocidade, todavia, pode
estar um pouco subestimada; já que nãe foi considerada
a possibilidade da existência d.e um II poo lll endógeno de
UMP,que poderia influenciar os Eesu1tados nas condições
de ensaio empregadas. Conforme esperado para uma
reação TINA-dependente, a adição de actinomicina D, ao
nfvel de 8 )1g/ml, reduza incorporação de radioativida
de em ·RNA de cerca de 80%. Por outro lado, rifampicina,
conhecido inibidor Je síntese de IDJA bacteriano ( di
Mauro et aI., 1969) e mitocondrial (Mukerjee e Goldfe -
der, ' 1973), não teve nenhum efeito na enzima nuclear
da ameba. Os resultados estão resumidos na tabela 3.
lOO
" " 200 rb .-
IC
~ a.. u
52
10 20 30
Tr:MPO (min)
Fi€~a 4 - Cinética de incorporação de
UMP~3H em núcleos isolados de trofozoitos de A. cas
tellanii. A radioatividade TCA precipitável e sens:t
vel à hidrólise alcalina foi determinada conforme des
crito em M~todos. O nº de cpm/ml da mistura de incu
baçã o é registrado em função do tempo de reação a
300 C.
53
Tabela 3 - Efeito de antibióticos na rea
ção catalizada pela RNA polimerase de núcleos isolados
de A. castellanii.
Adições
actinomicina D
rifampicina
cprn/mg de DNA
(xlO-6 )
5,32 0,96
5,72
% de inibição
82
zero
Condições de ensaio descritas em Métodos. Resultados
obtidos por incubação durante 10 minutos a 30o C. A con
centração de antibióticos testada foi de 8pg/ml.
6. Extração de DNA
° DNA total ~e trofozoitos, obtido pelo
procedimento descrito em Métodos (Marzzoco e COlli,
1974), apresenta espectro de absorção característico
ilustrado na figura 5. Inicialmente, o DNA não era tra
tado com a-amilase (Adam et aI., 1969), fornecendo
um espectro de absorção atípico; provàvelmente devido à
contaminação por glicog~nio, conforme sugerido pela
comparação entre o espectro de absorção de DNA não tra
tado com a-amilase e glicog~nio comercial, no ultra
violeta (Figura 5). O glicog~nio utilizado (Sigma), f'oi
analisado quanto ao teor de hexoses (reação de antro
ma), DNA (Reação de difenilamina), RNA (reação de orci
nol) e proteína (reação de Folin-Ciocalteau). Os resul
tador obtidos mo s tram que a preparação de glicog~nio
é realmente pura, contendo baixa porcentagem de protef
na (0,3%) e ácidos nucleicos (cerca de 0,1%) contaminan
tese
54
0,6.
- , <[ • • Z
,
Jf\ • e DA , • , ,
<[ fi -~D,3
.c:{
Dl o:: 00,2 1Il m <[
200 250 300 ONDA (nm) COMPRIMENTO DE
.- » Dl Vl
1.0~ m 1>-
o,s?5 l>
o o
Q4 ~ z o
Q,2-
Figura 5 - Espectro de absorção de DNA total de trofozoitos tratado ou não c om a-amilase e de glicogênio comercial ( Si gma). A c oncentração de DNA tratado com a - ami lase (círculos ch e i os ) e DNA não t ratado (círculos v azios, linha ponti l hada ), conforme avaliado pe l ~ absorb~nci~ ~ 260~, era igu~l a 22pg/ ml . A concentraçao de gJ l cogenl o (clrcul os vaZl OS , linha cheia), determinada p or reação com antrona, era i gual a 3 mg/ml. As soluções eram feitas em 0, 188C e a absorbância no ultra-vio l eta medida em um espectrofotômetro Zeiss PMQ 11.
'55
o DNA nuclear também apresentava razões
de absorbância típicas: 230/260 nm = 0,435 e 280/260
nm = 0,534.
o peso molecular do DNA nativo, uti1izag
do-se DNA radioativo do fago T7
como padrão, variava
de 8 a 12 xl06 daltons (gradientes de sacarose neu
tros). Em gradientes alcalinos, obtinha-se um valor
de peso molecular próximo à metade do peso molecular
do DNA nativo.
7. Centrifugação em gradientes de CsCI
a) TINA total de trofozoitos
À análise do perfil do DNA total de tro
fozoitos em gradientes de densidade preparativos, su
geria, inicialfuente, a presença de dois satélites com
densidade menor que o componente principal, conforme
evidenciado na figura 6B. O satélite menos denso, si
tuava-se na mesma região de densidade que glicogênio
comercial (Sigma) (Figü.:ra 6A). As frações ip.dicadas
pela barra presente na figura 6B, foram reunidas e
submetidas à centrifugação analltica em gradientes de
CsCl. O 'perfil obtido (Figura 6b), confirma a exis-
tência de dois satélites: um com densidade igual a
1,692 g/cm3 e outro com densidade igual a 1,670 g/cm3 •
Esta última banda tem um comportamento anômalo, já
que absorve radiaçãO' de ' 320nm (Figura 6a). Na tentati
va de elucidar a natureza dessa banda, foi feita a do
sagem de desoxirribose (reação de difenilamina) e he
xoses (reação de antrona), em cada fração de gradien
tes preparativos de DNA total tratado ou não com a
amilase. A figura 7 mostra os resultados obtidos. A
banda anômala (componente menos denso), não contém
DNA ( Fi gura 7A), mas contém grande quantidade de hexo
ses , de acordo com a reação fortemente positiva com
o reagente de antrona. Essa banda é composta provàvel-. "". , ( " ....
mente por glicogenlo, porque e sens lvel a açao de
amilase , que el imina o material antrona-positivo (Fi-
0,1
E c o oD
'" <{
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1,8
56
DE NSIDADE (q /cm 3 )
1,7
I ~~
1,6
~ 10 20 30 40
~ da FRACÃO
1,692 1,717
DENSIDADE (g / cm3 )
1,742
Figura 6 - Perfil de absorbância de DNA to
tal de trofozoitos de A. caste llanii e glicogênio comeE
c ial, ap ós centrifugação em gradientes de CsCl. As fi-
guras A e B mostram os resultados obtidos com gradiente s
prep~rativos contendo 2 mg de gl icogênio (Sigma) e
146 p g de DNA to t a l respect i vamente . As fi guras a e b
mostram o perfil a 320 e 260nm,obtido por cent~ifugaç~o
analí tica das fraç õe s do gradientes·o indicados pela bar
ra hori zontal que foram reunidas e dializadas contra
NaCl 0 , 01 M. Condi ç õe s de centrifugaç ~o descritas em
Métodoso Na f igura b, o pico com dens i dade igual a
1, 742g/cm3 , re f ere - se ao DNA do fago 2C , u~ilizado co
mo mar cador o
57
0,2 A
A 1\ I 0,1
0,5 ~ ••••• ••••••••••••••••••• 4 R i'i-············ 1,0+0,0 fij lrl
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I~ ~I ' 10 20 30 40
Li: Nº da FRAÇÃO fT1 ;;u
rn >< -o:: o tD o B lrl o Vl rn 0,1 lJ1 rn lJ'l fT1 « 'O,S --
••••••••••••••••••• • •••••••• 1,0 + 0,0
CXJO 000 0Cb0
Dt:ro 0,5
(~:pocJ!lxtl:txfJX'ocxf~Jbo~ 00" ' , ' I , , 0,0 I 10 20 30 ~O
NQ da FRAÇÃO
Fi gura 7 - Centrifugaç ão de DNA total Je trofozoitos de Ao castellanii em gradientes de CsCl . As figuras A e TI mostram os resu ltados da medi da de absorbância a 260nrn (círculo s cheios ) , dosagem com di-fenilamina (círcul os vazios) e d osagem com antrona (círculos vazios pontilhados) , nas fraç õe s de gradientes contendo DNA total tratado ou não com a- amilase re specti y amente o Condiç õe s de centrifugar; ão d e:'3 cri-tas e m Metodos o
,59
gura 7B) e As outras d uus bandas ob se rvadas s ão reaJ_men
te constituídas por DNA, conforme evidenciado pela su
perpo s i ~ ão do perfil de absorbância a 2GOnrn e abs fl !'ba.n
cia de desoxirribose, medida pela reaç ão c om dife rü lami
na (Figura 7A e B). Além disso, o tubo do gradiente de
CsCl contendo DNA não tratado com u-amilas e, apre s en -
ta uma banda opalescente que é eliminada por tratamento
com u .... amilase (Figura 8).
Figura 8 - 'F ')t :ogra fi a de g~ adientes
DNA total de trofozoitos, centrifug ad os conforme
cr i to e m Métodos. O tubo da direi ta c on tém ~l\! A
d e
des---nao
t ratado com a-amilase '3 apre s ent; a uma b anda cl a:t:'a
que de s aparece após t ra tamento c om u-ami lase ( t ubo
d a e squerda).
r-
Portanto, o DNA total de trofozoitos apresenta um componente maior (84% do DNA celular total) e
um componen t e menor (16%), com densidades respectivamen te iguais a 1,717 e 1,692 g/cm3 • Os perfis do DNA to: tal em gradiente preparativo e analítico de CsCl podem ser vistos nas figuras 9b e 9B, respectivamente.
b) DNA nuclear de trofozoitos
O perfil do DNA nuclear, fragmentado até peso molecular igual a 6xl05 daltons, tem uma distribu,! ção unimo daI em gradientes de CsCl (Figura 9a), caracterizado por densidade igual a 1,717 g/cm3 (Figura 9A). Esses resultados indicam claramente a origem nuclear do componente maior do DNA total (Figura 9B).
c) DNA mitocondrial de trofozoitos
O DNA de mitocôndrias isoladas conforme descrito em MétOdOS, foi purificado por fracionamento
em gradientes de CsCl (Figura lOA). O perfil de sedimeg tação obtido em gradientes analíticos (Figura 10B),mos
tra a existência de uma Única banda, com densidade de flutuação igual a 1,692 g/cm3 •
d) DNA total de cistos
o perfil do DNA de cistos em gradientes de CsCl (Figura lIA), mostra a presença de dois componen
tes com densidades · idênticas a dos componentes do DNA to
tal de t rofozoitos: 1,717 e 1,692 g/cm3 (Figura llB). O componente maior representa aproximadament e 93% do DNA celular t ot al e o componente menor 7%.
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-E c o ..o N -c::(
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CD a:: \5 o U)
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OENSIDA DE (g/cm3 ) W 1,7 1,& r----- --T
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J'ft l l ..... ~
10 20 · 30 40
~ da fRAÇÁO
A
I cCle u Z ~ tIl a:: o U)
a:J c::(
1,692 1,7171,742 DENS I OADE (gA:m3 )
Figura 9 - Centrifugação em gradientes de
CsCl de DNA total e nuclear de trofozoitos. As figuras
a e b mostram os resultados de gradientes preparativos
contendo , respectivamente, 157)1g de DNA nuclear frag -
mentado (PM = 6xl05) e 109 pg de DNA total nativo. O
perfil de A260 após centrifugação isopícnica e as den
sidades obt i das são apresentadas na figura A ( DNA nu-
clear) e figura B (DNA total). DNA marcador de fago 7-
2 C tem densidade igual a 1,7Lj2 g/cm./ o
1 ~ «(
~ c~
~ ú"I CD C[
119 -U Z
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m o:: o li') Dl C[
A 0.2
0.1
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62
DENSIDADE (Q/cm3)
1,'õ 1,7 1,5 i
10 20 ~ ~
Nº ~ F"RACAO
\142 1,111 tJt NSIOADt (q/c,"~)
Figura 10 - Centrifugação de DNA mitocon
drial em gradientes de CsCl. A figura A mostra o per-
fil de abs orbância de 60)1g de DNA, fracionado por
centrifugação em gradiente preparativo. A barra indi
ca as frações que f oram reunidas, dializadas contra
NaCl 0,01 M e submetidas à centrifugação anal:ttica,cu
j o traçado fotoelétrico póde ser visto na figura B. A
contaminação por material com densidade igual a
1,717 g/cm3 é muito baixa. ° marcador de densidade é o DNA do fago 2C ( p = 1,742 g/cm3 ) o Condições de cen
trifugação descritas em Métodos.
, é Ü z:
fllt m a: ~ UJ ~
0,4
1 ~ o,~
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c ~ 0,2
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"-1 0.1
B
A
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63
tJt NSI[)AtJt (Q' Gm3) ~ 1J 1!
~ .1J 40
~ttJ "RAÇ~O
\711 OE:NSIOADE (g/cm3 )
1,7~ 2
Figura II - Gentrifugação de DNA total
de cistos de A. castellanii em gradientes de CsCl.Os
picos obtidos por centrifugação preparativa de 34,~g
de DNA (Figura A), são caracterizados pelos valores de
densidade de flutuaqão mostrados no perfil fotoelétri
co obtido na centrífuga analíti~a (Figura B). DNA de
fago 2C (p = 1,742 g/cm3 ) é o marcador utilizado
Maiores detalhes em Métodos o
64
e) DNA total de trofozoitos em diferentes
estágios de crescimento.
A figura 1 2 mo s tra o perfil, em gradien
tes de CsCl analíticos do DNA de c élulas em fase l oga
rítmica precoce (12A), mediana (12B) e tardia ( 12C ).
Aparentemente, há urna variação da fração do DNA celu
lar representada pelo componente menor. A tabela 4 re
sume as características de cada fase da cultura quan-·
to à densidade de células, número de cistos e porcen
tagem do componente menor.
Tabela 4 - Variaç ão da porcentagem do
componente menor do DNA total de trofozoitos em dife
rentes fa s e s de crescimento.
Etapas da Nº de células % de c i s - % do compo-
fase log por ml tos nente menor
Preco ce 4xl04 zero 4
Mediana 5xl05 1 16
Tardia lxl06 11 6
o nº de cél/ml e a % de cistos foram determinados por
contagem em câmara de Neubauer . As etapas da fase lo
garítmica foram delimitadas de acordo com as cUrvas
de crescimento de culturas agitadas em erlenmeyers
(Figura l)e As porcentagens do componente menor, em
relaç ão ao DNA total, foram obtidas a partir da área
dos p i cos obtidos por centrifugação em CsCl ( Figura
1 2 ). Os resultados representam a média de dois expe
rimento s isolados.
c{
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<c:t co a: o V)
co c:t
65
A
8
c
1,692 1/17 1,742 DE NSIDA D E (g/cm~
Figura 12 - Traçado do registro fotográ
fico obtido após centrifugação analftica em gradien
tes de CsCl de DNA t 'otal de trofozoi tos em diferentes
fases de crescimento. As figuras A, B e C, represen
tam, respectivamente, os resultados obtidos com DNA
de células em fase logarítmica precoce, mediana e
tardia o DNA de fago 2C ( p = 1,742 g/cm3) é o mar
cador de densidade utilizadoo Condições de centrifug~
ção descritas em MétodoBo
66
8. Perfil de fusão dos componentes do DNA
de trofozoito
à) DNA tota.l
A figura 13 mo s tra a desnaturação do DNA
total, onde a transição ocorre ao longo de um grande
intervalo de temperaturas. A primeira derivada do per-
fil de fusão (Figura l3A), confirma a e xistência de
dois componentes, caracterizados por valores de T - m iguais a 75,5°C ' (componente maior) e 63 0 C (componente
menor). A determinação do Tm foi feita para os dois
componentes, após fracionamento por centrifugação em
gradientes de CsCl.
b) Componente maior do DNA total e DNA
nuclear
A transição em torno do T é abrupta (Fi~ m -ra l4a) e a curva derivada (Figura l4A) mostra um pico
gaussiano. O valor médio de T é igual a 75,5°C. O DNA m -nuclear apresenta comportamento idêntico ao componente
maior (ver figura 14).
c) Componente menor e DNA mitocondrial
O componente menor (Figura 15 A e B), -nao
apre s enta uma curva derivada simétrica,distinguindo-se
três componentes com Tm em torno de 6 2 ; 65 e 75°C. A fi
gura 15 A mostra, ainda, a curva derivada do perfil de
fusão do TINA mitocondrial, também plurimodal, mas que
não se superpõe à curva derivada do componente menor.
67
1,3-
E a r:: co ~
~
<t > i= 1.2 <t ...J Ui o::
<t u z
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1,_ 50 60 70 80 90
TEMPE.RA1'LJRA (OCI
I f A
A I
0,10
Y
0,05
50 50 70 80 90 TEMPERATURA (OC)
Fi gura 13 - Curvas de desnaturação termi0a
do DNA tot .::ü de trofozoitos, em 0,188C ( 24 pg/ml). A
fi gu r a ~ mo s tra a variação de absorbância relativa
( corrigida para expans ão térmica), em função da tempe
ratu r a d a s olução. A figura! mostra a curva diferen -
cial de fusão, onde a ordenada (Y) indica a variaç ão da
% de hipercromicidade por grau:
(Atl - At2 )/(AIOO - A25
)
Y (tI - t 2 )
onde Atl , At2 , AIOO e A25 são as absorbâncias medidas
nas temperaturas tI' t 2 , 100 e 25° C, respectivamente.Os
valore s na abc i ss a são i guai:3 a t~ +t2/2. As absorbâncias
f or8JTl det e r minadas em um e s p e c.trofotôme tro Zeiss PMQII,
c(1 JJfo rme descrit:J em Méto doso
Gn
R I
',3 E t: o lO N
4 > ;:: t? ~ . IX
<t w z '4 fi Cl: ',1 o V1 m <t
'04. • n - t::= '5(} 60 70 80 90
TEM PE R A T U R 1\ (0 C )
0,15.' ------------
II
0,10
y o
lI,fI ~)
50 60 70 80 90 TEMPE RA TURA (OC)
Figura 14 - Perfil de fusão do DNA nuc l e a r e componente maior do DNA to~al de trofozoito s , em °11 SSC. Os valore s de absorbanc~a relativa . das s oluçoes de DNA nuclear (18 pg/ml, c l rculos che lo s ) e componente maiS?r (?O p g/ml, ~ círcu~os vazi oR), eOErigidos para expansao terml ca , sao reglstrados em fun ç ao da temperatur a da s oluç ão (Figura a). A figura A mostra a curva der ivada da desnaturaçao , onde a ordenada ( Y) repre sent a o incremento em absorbância rel a tiva por grau . No eixo das abcissas estão i ndicadas as temperaturas m~dias do s i n t e r val os . Para maiore s detalhes , ver legenda ela fi e;ur8. 13 .
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~
E c
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t-<t ~ w o::
<t 1,1 u z «[ (]) o:: o lfl (]) <{
1,0 50
O/lOr A
y UOS
69
60 70 80
TEMPERATURA (Oel
90 TEMPERATURA (OCl
Figura 15 - Perfil de desnaturação térmica do componente menor do DNA total de trofozoitos (14 pg/ml) , em 0,1 SSC. A figura a representa a variação de absorbância relativa, corrigida para expansão de volume, em função da temperatura. Na curva diferencial de fusão (Figura A), as ordenadas indicam a variação da % de hipercromicidade por grau. Os valores em abcissas referem-se à temperatura média dos inter -valos considerados. A figura A mostra, ainda, os resultados obtidos com uma preparação de DNA mitocondxial (13pg/~1 , circulos vazios), que exibe comportamento heterogeneo, como o componente menor (circulos cheios). Maiores detalhes na legenda da Figura 13.
'70
A tabela 5 resume algumas característi -
cas do DNA de trofozoitos.
Tabela 5 - Propr i edades físicas dos c ompo
nentes do DNA de trofozoitos de A. castellani~.
DNA Densidade T % GC m (g/cm3 ) (oC) (densidade ) (T ) m
Total
componente maior 1,717 75,5 58,2 52 ,7
componente menor 1,692 63,0 32, 7 22,2
Nu clear 1 ,717 75,5 58,2 52 , 7
A determinação de densidade e T est~ descrita em M~m todos . A % de GC ( fraçáo molar) foi calculada a par-
tir da densidade ou T (em 0, 1 SSC) de cada DNA, sem gundo as equ ações empíricas de MandeI et aI. ( 1 968 ) e
MandeI e Marmur ( 1968 ) .
90 Renaturação de DNA
Os resultados obtidos através da análise
espectrofotométrica da cinética de renaturação, p odem
ser analisados segundo a equação proposta por Wetmur
e Davidson (1968 ) :
1 -4 1
A - A 2,04 x 10 k 2 t +
0,36A 00 00
Aro = absorbânc i a do DNA nativo (260nm)
A = absorbânci a em tempo t (segundos)
k 2 = constante de segunda ordem
Nessa equação, o fator de hipercromici dade
(aumento de absorbância devido à desnatur~ção), conside-
'71
rando- se um erro experimental de 5%, é dado por:
A o Aoo 0,36 Aoo
Ao = absorbâncj a do DNA desnaturado
Portanto, colocando- se em um gráfico, os
valores dos inverso s da hipercromi c idade re s idual
(l/A-Aoo ), em função do tempo de reação, obtem-se uma
linha reta. O coeficiente angular da reta, dividido por
( 2 ,04xlO- 4 ), forne ce o valur da constante de segunda
ordem (k2 ).
A raúí.o entre as velocidades de renatura
ção de dois DNAs com o mesmo peso molecular, ob
tido por métodos de fragmentação semelhantes , é inver
samente proporcional à r~z ão entre o peso molecular das
mo léculas de DNA não fragmentado (complexidade). Assim,
a comple x idade de um DNA pode ser obtida a partir da
determinação experimental da constante de velocidade de
renaturação desse DNA e de outro DNA com complexidade
conhecida , nas me s mas condições de i~cubaç ão (Britten
e Kohne, 1967; Wetmur e Davidson, 1968)0 DNAs de bac-
tér ias ou viru8 são cineticamente homogêneos, ou seja,
sua renaturação é r epresent:{da por uma única reta. A
renaturação de DNAs het e ro gêneos, · como ocorre nos or
ganismos superiores, fornece uma curva de renatur~ção
complexa que pode ser sub dividida em retas que represeg
tam a renaturação de diferentes familias de DNA.
Neste trabalho, a reação de renaturação
foi acompanhada pela queda da absorbância a 260nfi. As
cons tantes de velocidade de renatur ação dos diferentes ·
componentes do DNA da ameba, foram calculadas a par
tir do coeficiente angular das r e tas obtidas em gráfi
cos do tipo sugeriHo por Wetmur e Davidson (1968), mos
trados nas figuras 16-19. As retas apresentadas repre
sentam as retas médias obtidas por um conjunto de pon
to s experimentais submetidos à análise de regressão linear, em um calculador Hewlett-Packard, modelo 9820A.
O programa de r egressão linear foi gentilmente cedido
pela Dra . Helena Li Chum. O coeficiente de variância
eLo des vio padrão da inclinação e d.o intercepto das re-
72
tas era , em média, 5% e 0,4%, respectivamente. O coefi
ciente de correlação médio era igual .a 0,98. Os valo
res de coeficiente angular e linear das retas médias
for am submetidos ao teste t de Student, mono caudal , e
foram con!3iderados significativos . .... .
nas 23 exper1enC1as
de renaturação consideradas o
O padrão utilizado nas medidas de rena tu-
ração foi o DNA de E. coli, que é um DNA - -- homogêneo , constituído predominantemente por sequências únicas e
com comple~idade bem estabelecida (Cairns, 1963). A
figura 16 mostra a renaturação do DNA de E'. coli, re
presentada, conforme e sperado , por uma única reta. A
mesma figura mostra a renatur~ção do DNA celular total
de trofozoitos de A. castellanii , que exibe comporta-
mento h e terogêneo. A curva de rena turrtção desse DNA po
de ser dividida em 4 secções, indicando a presença de
4 familias de DNA com diferentes velocidades de renatu
ração. A contribuição de cada fração pode ser calculada
por extrapolaç ão da reta que repre s enta a fraç ão de re
naturaç ão mais lenta, ao valor de l/A-A"" em tempo ze
ro de reação (Wells e Birnstiel, 1969). O inverso des se
valor fornece a hipercromicidade devida à fração len-
ta. O mesmo procedimento é adotado para as outras · fra-
çoes. Comparando-se o valor obtido para cada fr~ão
com o valor de hipercromicidade total (A -A = 100%) ., o ""
é possivel calcular a porcentagem do genoma correspon -
dente a cada família de DNA. Por analogia com as famí -
lias do DNA de outros organismos superiores (Britten et
aI., 1972), as famílias de DNA da ameba foram denomina
das de "rápida", "inte.rmediária", "lenta" e "única",ad
mitindo~se que a fração que renatura mais lentamente
seja constituída por DNA "único". Os valores médios
de p orcentagem obtidos para as famílias do DNA total
for am respectivamente de: 86; 7,5; 4 e 2,5%0 Após longos pe r íOdOS de incubação, quan-
do a maior parte das sequên oias com renaturação r~pi
da já reagiu, a inclinação d a ·c urva de r enaturação re
presenta , efetivamente , a fr ayã o de DNA com renaturação
mais lenta (DNA "único")o Go mo e s sa fração representa a
4,0
8 l5 <t
~II
<t
3,0
2,9
I~ 2,8 .-, <t
2,7
2p ro
73
25
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• 15 ti l>~
B
10
5
5 10 15
TEMPO (segundos" 10-3 )
2 ~
TEMPO (seg4nQos x lri3 )
Figura 16 - Renaturação do DNA total de
trofozoitos de !. castellanii (~9jlg/ml) e DNA de ~. ~li (32jlg/ml), em NaCl 1 M a 600 C. Os valores do inverso da hipercromicidade residual são medidos em função do tempo de reação Q Aw e A representam, respectivamente, a absorbância a 260nm, das soluções de DNA nativo e DNA parcialmente renaturada em diferentes tem
pos de reação. DNA de ~. coli (círculOS cheios,ordenada do lado direito), mostra a relação linear esperada e
DNA total da ameba (círCUlOS vazios,ordenada do lado esquerdo) comporta-se heterogênearnente. Porcentagens do genoma da ameba são obtidas a partir dos interceptas das diferentes secções da curva de reassociação,obtidos por regressão linear. A metade inferior da figura representa, em escala aumentada, os dados relativos à parte inicial (tempo de incubação de zero a 3x10-3 seg.)da rea ção de renatul' llç ão do DNA total da ameba.
7Lj-
maior parte do genoma (86%) , pode-se assumir que o k 2 aparente , c alculado a partir da inclinação final da
curva de r en'aturação (Figura 16, 4~ reta do DNA total;
Tabela 6), aproxima- se muito da constante verdadeira
de segunda ordem para. o DNA de renaturação mais lenta
(DNA "úni c o ") .
Tabe l a 6 - Cin~tica de renaturaç~o de di-
ferentes frações do DNA total de trofozoitos de !. castel l anii .
DNA Pe so Mol ecular x 105 k2 (daI tons)
componente menor 5,4- 23 ,5 6 ,7 0, 68
rrii t ocondri a l 4, 9 5,2 0, 69
componente maior 15 , 4 0,109
n u clear 6 , 2 0,118
total (4ª reta) 10,7 0,09
E. coli 9,5 5,74
Os DNAs foram dissolvidos em NaCl 1M e incubado s a
60 oC. A cinética de renaturaç~o foi analisada pelo m~todo ó ptico e as constantes aparentes de ve l ocidade
cal culadas segundo Wetmur e Davi dson (1968). Os valo
res de k 2 (média de 3 determinações), fora-m normali za
dos p a ra PM = 9 , ) x 105 daI tons (Wetmur e Davids on ,
1968 ). ° pe s o molecular foi determinado conforme des -'t M't· - 1 ) crl o em e odo s o Unl dades de k 2 = moI. seg. l •
75
o cálculo das constantes de velocidade
das famíliap de renaturação mais rápida, é prejudica
do pelo nÚmero relativamente grande de componentes ,
de modo que a renatur :-tção de cada família é afetada
pela renaturA.(;.ão da outra o Além disso, quando se ana
lisa a renaturaç ão das famílias que reagem inicialmen
te, a contribuição de hipercromicidade de cada fra
ção está sendo constantemente alterad~ pela fração
lenta, presente em todas as , fases da renaturação.Quag
do apenas dois componentes estão presentes, pode-se
cons eguir uma aproximação do valor de k 2 verdadeiro
para a fração "rápida", através do método de corre
ção sugerirro por Wetmur (1967) e Wells e Birnstiel
(1969)0 Balsamo (1972 ) sugeriu um método de correção
adequado para a de t erminação do k2 verdadeiro quan
do exi s tem tres famílias com velocidades de renatura
ção diferentes. A superposição das retas na renatura-
ção do DNA total da ameba dificulta o cálculo das ,
cons tantes aparentes e b numero de componentes observa
do impede a aplicação dos métodos de correção cita-
dos.
Uma melhor resolução entre as retas po
de ser obtida at'ravés éla renaturação dos dois compo -nentes do DNA total da ameba, isolados em gradientes
de CsCl.
A figura 17 mostra o perfil de renatura
ção do componente menor do DNA total de trofozoitos
que apresenta um comportamento cinético heterogêneo ,
com tres velocidades de renaturação diferentes, ca
racterizadas pelos val.ores de k 2 aparentes citados na
tabela 6. O componente maior (Figura l8)comporta-se
como um DNA muito homogêneo, não apresentando sequên
cias com renaturação rápida. O valor médio da cons
tante de segunda ordem para a reação observada, en
contra-se na tabela 6.
DNA de núcleos isolados apresenta carac
terísticas derenaturação pràticamente iguais às do
componente maior (Figura 18 é Tabela 6). A comparação
entre a porcentagem do genoma, perfil de renaturação
e valores de k 2 do componente maior, DNA nuclear e
76
10,0
9,oL ~
IJ 8,0 -, <1
7,0
6,0 500 1000 1500 2000
TEMPO (segundos)
12
11 ~~
_11'~t 0 -----0 ~ ~ o
/ÕO
<{ 8
7 6
5 10 15 20 TEMPO (segundos}(1Õ3 )
1:i'igura 17 - Renaturação do componente me-
nor d o DNA t o tal de trofozo i tos de A. castellanii.
O compone n t e menor f o i i s olado por centri fugação em
gradientes de CsCl, d i ssolv ido em NaCl 1 M e incubado
a 6 0 0 C. A me tade i nferi or da figura repre senta a rea
ção em tempos mai ores de i ncubação , mostrando apenas
as retas da fi gura superior que mostra , em escal a au
mentada , os d a dos para, os primei ros 2000 seg o de rena
tur~ç ão . As constru1tes aparentes (k2 ) s ão calcul adas a
parti r do coefic i en te angular das tres retas obtidas
por regressão linear • As abrevic-l. '.; õe s empregadas são
as mesmas da Fi gura 1 6 0
~,6
~,5
4,4
J ~,3 _I, <t 4,2
4)
77
0..//1 o ----..-..--............... •
~-1'
4.0 r J I
3,9 10 20
TEMPO (segundos x lÕ3) 30
Figura 18 - Renaturação do DNA "Único" de
trofozoitos de A. castellanii. O componente maior
(54 pg/ml), purificado em gradient{~ s de CsCl e o DNA
nuclear (53jUg/ml) foram dissolvidos em NaCl 1 M e in
cubados a 600 C. Os círculos vazios e cheios representam
a renaturação do componente maior e DNA nuclear respec
tivamenteo A construlte de segunda ordem (k2 ) foi calcu
lada s e gundo Wetmur e Davidson (1968), a ·partir da in-. - , .. - . . c llnaç ao da reta medla obtlda por regressao llnear. Pa-
ra maiores detalhes , v e r legenda da Figura 160
78
~ reta do DNA total, indica qUê em~eB componentes se
referem à fração do DNA da ameba que apresenta renatura . -ção mai8 lenta (fração "única"). A partir do valor da
const~nte de renaturação do DNA d.e ~. coli, renaturado nas mesmas condições, é posslvel estimar a complexida-de do DNA nuclear (fração "única"), por comparação ~om o genoma de ~. cOli, igual a 2,7xl09 daltons (Cairns,
foram 1963). Para isso, os valores de k 2 observados normalizados para o mesmo peso molecular, através equação proposta por Wetmur e Davidson (1968), que
da
de-monstra a proporção existente entre a raiz quadrada do peso molecular e a constante de segunda ordem. Â partir do valor médio de k2 ,determinado para a fração "única" (0,106), a complexidade do DNA nuclear de A. castellanii pode ser estimada em 1,46xlOll daltons~
À renaturação do DNA de mitocôndrias tam-, ' . A • A • bem e heterogenea t mostrando a eXlstencla de duas fra-
ções (Figura 19), com velocidades de renaturação definidas por constantes aparentes, cujos valores estão na Tabela 6. Esses resultados indicam que o componente menor do DNA total não é exatamente idêntico ao DNA de mitocôndria que não contém as sequências de renaturação ffrápida'~ mas contém as sequências ,de renaturação "inter
mediária" e "lénta". As constantes verdadeiras para as diferen
tes famllias presentes no TINA mitocondrial e componente menor poderiam ser obtidas através' da aplicação dos métodos de correção mencionados anteriormente ( Wetmur,
1967; Wells e Birnstiel, 1969; Balsamo, 1972), desde que a fração "lenta" apresentasse características cinéticas de DNA uúuico lJ
• Entretanto, os resultados obtidos (localização mitocondrial, valor de k2 apareniie e porcentagem do genoma), podem ser interpretados supondo-se que essa fração do DNA f6sse constituída por sequências com baixa frequência 'de repetição. Esse resultado torna muito difícil o cálculo do k2 verdadeiro e, consequentemente, da complexidad.e cinética das famílias do componente menor e DNA mitocondrial, a partir de gráficos do tipo sugerido por Wetmur e Davidson (1968). ,
13 <l
17
16
-11 <t 15
14
79
'3~r~ __________ L-__________ ~ __________ ~ ____________ ~ __________ ~
'5 10 15 20 25 TEMPO (5II!gUIldos II 1(P)
Figura 19 - Renaturaç§o do DNA mitocon
drial de trofozoitos de A. castellanii. TINA -de mitucôndrias isoladas conforme descrito em Métodos, foi dissol'vido em NaCl 1 M (18 pg/ml) e reassociado a 60°C. O k 2 aparente das duas retas componentes foi de terminado a partir do coeficiente angular obtido por regressão linear. As abreviações empregadas são as
mesmas da Figura 16.
80
Todavia, os resultados de cin~tica de re
naturação J\odem ser apresentados de maneira mais con
veniente, cvnforme sugerido por Britten e Kolme (1967), o que cons titui um método alternativo para a determi -
nação da complexidade cinética e tem a vantagem de
permitir a comparação entre reaçÕes com concentraç~es
diferentes de DNA, al~m de mostrar claramente se o # '" - • " • DNA em estudo e homogeneo ou nao. Neste tlpo de grafl-
co (Figuras 20 e 21), a fração de DNA reassociado
(A ~A/A -Aoo ) é colocada em função do logaritmo do o o produto da concentração inicial de DNA pelo tempo de
reação (log Cot). Os valores de "Cot" são expressos em
moles de nucleotidios por litro por segundos (mol.seg.
1-1). Cot igual a 1 resulta da incubação por 1 hora de
DNA em uma concentração de 100 pg/ml. Nesse tipo de
gráfico, uma reação ideal de segunda ordem fornece umq
curva sim~trica, cuja parte central se ajusta a uma re
ta. A inclinação dessa reta é estimada pela razão en
tre os valores de Cot que a linha intercepta no iní
cio e fim da reação e serve como diagnóstico na deter
minação do grau de homogeneidade do DNA. Para uma rea
ção ideal. a razão é próxima de 100 (2 unidades de
log de Cot); se a razão for maior do que 100, a reação
é heterogênea, isto é, espécies com velocidades de
renaturação diferentes estão presenteso
Britten e Kolme (1967) desenvolveram e
quações que permitem analisar a cin~tica de renatura -
ção, cons iderando Cot como o parâmetro que controla a
velocidade da reação. No caso de DNA único, o Cot ne
ce ssário para 50% de reassociação (Cot l / 2 ), é propor
cion al ao tamanho do genoma (G):
G (1) Cotl / 2 ::::
K
A constante de proporcionalidade (K) "e
avaliada pela medida, em condiç~es id~nticas, da velo
cidade de reassociaç ão do DNA de um organismo com ge
n oma con hecido, s em rep ~ tição significativa.
QMando um~ f amília de DNA formada por
uma sequência de nucl€ot~.d i o s repetida x. vezes esti-1
ao
00.1 o c:{
o e lrl 1I1
~Q2 a::
c:{
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81
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loq cot
Figura 20 - Renaturação de diferentes preparações de DNA. A reassociação (NaCl 1 M; 60QO), foi medida espectrofotometricamente, pela hipocromicidade de senvolvida a 260nm. A fração de DNA reassociado-(Ao-A/Ao-A <lO ) é colocada em função do logaritmo do produto da concentração de DNA (00) expressa em . moles de nucleot:f.dios/l, pelo tempo de incubação (segtmdos) (Britten e Kohne, 1~68). A ordenada no lado direito do gráfico, refere-se a renaturação do DNA de E. coli (li-
t ) -, ----nha cheia, clrculoa vazios e a da esquerda a renatura-ção do DNA total (linha cheia, circulos cheios) e nuclear (linha pontilhada, círculos cheios e vazios) de trofozoitos -de A. c a stellaniL A curva de reassociaç ão do DNA nuclear {linha pontilhada), ilustra o efeito da conc entração de DNA na velocidade da reação: circulos vazios, 53 J-lg/ml e círculos cheios, 39 "ug/ml. As setas no eixo das abcissas indicam os valores de Cot onde metade do DNA deveria reassociar de acordo com vários graus de r epetição. Concentração de DNA de E. coli e DNA total == 33 pg/ml.
0,0
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82
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log coi
Figura 21 - Renaturação do DNA reiterado de A. castell~nii. As condições de incub ação e outros detãlhes sao os mesmos da Figura 20. O perfil dê reassociação do DNA de ~. coli (linha cheta, escala da direita), ilustra a heterogeneidadx cinetica dos outros dois DNAs. O Cot(1/2) para as tres secções distintas da curva de reassocieçf:io do componente menor (círculos cheios) e para as duas retas do DNA mitocondrial (círculos vazios), foi calculado segundo Britten e Kohne (1967 ), considerando como padrão o Cot(1/2) do DNA de E. coli renaturado nas mesmas condições. Os valores m~ dios obtidos estão resumidos na Tabela 70 A concentra= ção do DNA mitocondrial e componente menor são re spec-ti VameJlte iguais a 26 e 16 p g/mlo .
83
ver pre s ente , o Cot necessário para 50% de renaturação da família é reduzido na proporção do grau de repeti -ção. Nessas condições, quando se e studa a reassociação de DNA não fracionado, a equação (1) deve ser modific.§! da e a frequência de repetição (x.) de um DNA rapida -
1
mente renaturado pode ser calculada a partir da se-guinte equação:
G (2) cotl / 2 K x.
1
Portanto, para calcular a frequência de repetição, deve-se conhecer o genoma do organismo em estudo.
A equação (2) · contém as relações necessárias para a interpretação de medidas de velocidade de reassociação de DNA repetido" Se uma fam!lia de sequências repetidas está contida . em uma fração C;l do
DNA total, a concentração efetiva muda e a equação (1) não pode ser aplicada. Nesse caso, o Cotl / 2 para uma determinada famllia de DNA reiterado deve ser multiplicada pela fração que ela representa do DNA total ( a ). A complexidade cinética (N) da família é obtida pela equação:
N = Cotl / 2 a K (3)
Conllecendo.:..se a e N, pode-se calcular a frequência de repetição do DNA ràpidamente reassocia
do: a G (4) x. =
1 N
A reação de neassociação do DNA de E. ~li (Figura 20) segue uma curva sigmóide com inclinação
característica para uma reação homogênea de segunda
ordemo A determinação do Cot l / 2 desse DNA fornece um ponto de calibração ladequado, conforme discutido acima. Por outro lado, a heterogeneidade cinética do DNA total, verificada nos gráficos (Figura 16) segundo We1 mur e Davidson (1968), é claramente confirmada pela C1l.-rva de reassociação ilustrad,élflq figura 20.
O DNA nuclear H~r'8 .c:J enta uma cinética de
SL~
l'enH:tul'a ç.ão (Figura 20) caracter1.stica para sequênciRs
que aparecem uma única vez no genoma, apresentando bai
xa porcentagem de renat1JJ'açã.o J;10 intervalo de valores
de Cot empregado s (cerca de 10%). A reação de reassocia
ção obedece cinética de segunda ordem como pode ser ob
servado .pelQs dois conjuntos de pontos mostrados na fi
gura 20.
Tabela 7 - Propriedades cinéticas das fra
çoes de DNA reiterado de trofozo itos de A. (,as te1lanii
DNA Cotl / 2 Complexidade A
Frequencia
observado cinética de reite-
(daltons) raçao
componente 0;011 1, 5xl06 2,Sx103
menor 0;11. 2·4x107 , 2 ,Sxl02
0,70 2 ,Sx108 45
mitocondrial O;OS 1;7xl07 3,4x102
0,60 2,4xlO 8 52
A renatuI'élção (NaCl 1 M, 60°C), foi anaJisada pela queda
de absorbâncie a 260nm. Os valores médios (3 determina .
ções ) de complexidade cinética e frequência de reitera -
ção foram calculados conforme sugerido por Britten e
Kolme (1967), por comparação com o cot l / 2 do DNA de
( ) 9 . . :§. coli 0,5, com genoma igual a 2,7xlO d lCalrns ,
1963 ). Cot l / 2 é o produto da concentração de DNA (moles
de nucleotidios/l), pelo tempo (seg1Jlldos) necessário pa
ra 50% de reassociação.
A análise da curva de reassociação do com
p one nte menor do DNA total (FigUJ'H 21) , . indica conside
rável b ete ro geneidacleno gr au de repe t ição das sequên
e i as de nucleot1.di os. Pode-s e distinguir três frações,
co m carac t er1. st; i cas mo stradas na Tabela 7. A comp1exida
8S
de cinética e frequência de reiteração de cada fração
foram calculadas conforme descrito acima, por compara
ção com os dados obtidos para o DNA de ~. coli, rena
turado nas mesmas condições. A renat'IT~ção do DNA de
E. col~ e do componente menor resultam na recuperação
de aproximadamente 80 e 50% da hipocromicidade ini-
cial re s pectivamenteo
O perfil de renaturação do DNA mitocon --
drial (Figura 21), mostra a existência de duas .fra-
ções com complexidade cinética e frequência de reite
ração semelhantes ~s frações do componente menor com
velocidade de renaturação "intermediária" e "lenta"
(Tabela 7). A porcentagem média de renaturação do DNA
mitocondrial é igual a 40%.
VII .. Discussão
. , 1. Isolamento de nucleos
'. , ~,
Varlos metodos para extraçao de nucleos,
utilizando meios aquosos de homogenização (ver Méto
dos)f foram testados, sem obtenção de resultados sa
tisfatórios. O procedimento descvito (Métodos), permi
tiu o isolamento de núcleos com baixa contaminação por
material citoplasmático ou células intei~as (Figura
2). Os núcleos isolados eram, aparentemente, intactos
(Figura 3a), mantendo a subestrutura nuclear observa
da "in vivo" (Figura 3b). O métodos empregado propor
cionava resultados reprodutíveis, conforme pode ser
julgado pelos valores de desvio padrão obtidos na de
terminação da composição química de diferentes prepa
rações (Tabela 2).
A demons tnação da atividade de RNA poli
merase (E.Co2.7.7.6), mostrou que os núcleos, além
d e estruturalmente intactos, eram fisiológicamente a
tivos. A reação catalisada pela enzima nuclear .era
DNA-dependente, conforme demonstrado pelo efeito da
adição d~ actinomicina D (Tabela 3). Rudick e Weis
man (1973a), demonstraram que trofozoitos de A. cas
tellanii apresentam duas atividades distintas qe
RNA polimerase-DNA-dependente , fração I e 11, sAndo
que ambas requerem magnésio e manganês para atividade
máx ima o A fração I era inibida por cicloheximida e a
fraç ão 11 por rifampicina e a-amanitina. A inibição
da fraç ão 11 por ri f ampicina só era obtida com al
tas concentrações da droga (200 pg/ml), ao contrário
do que acontece em Amoeba proteus, onde 70% da stn
tese de RN.A é inibida por concentrações da ordem de
O,lpg/ml (Tautvydas, 1971). Os resultados aqui des
critos (Tabela 3), indi c am que núcleos isolados de
!. castellanii, apresentam atividade de RNA polimera
se-DNA-depen dente , que não é inibida por rifampicina
na conc entr a ç ão te s tada (8 pg/ml)o
87
As micrografias eletrônicas (Figura 3)
mostra m que o proces s o de isolamento não remove a mem
brana nuc lear externa com ribo s somos aderidos, que po
deriam ser considerados como uma forma de contaminação
citoplasmáticao A membrana nuclear externa pode ser
removida opcionalmente (Blobel e Potter, 1966)0 Toda
via, esse procedimento apresenta vantage~s e desvanta
gens que devem ser consideradas em cada caso especifi
co. Para os objetivos do trabalho aqui descrito, a re
moção de traçqs do retículo endoplasmático das prepa
rações de núcleos foi considerada irrelevante o
A análise de ácidosnucleicos em protozoá
rios é dificuldade pelo fato de que poucas espécies
são cultiváveis axênicamente (MandeI, 1967)0 ° número
de espécies examinadas é pequeno e pouco repre s entati
vo, especialmente no caso das amebas. Os resultados de
composição qufmica de núc.leos isolados de A. castella
nii (Tabela 2), mostram que as ' razões RNA/DNA e pro
tefna/DNA são muito próximas das razões determinadas
para núcleos de fígado de rato (Blobel e Potter,1966)
e sig:p.ificantemente diflerentes das descritas para le
vedo (Rozijn e Tonino, 1964) e !. proteus (Tautvydas,
1971). Em !. castellanii, o teor médio de DNA por nú
cleo, foi avaliado em 10,6 pg (Resultados,item 4) •
Esse valor é intermediário entre os valores de 3,5 " e
13,6 pg, determinados, respectivamente, para Euglena
gracilis (MandeI, 1967) e Tetrahymena piriformis (Man
deI, 1967), mas, sem dúvida muito menor que os dados
para as amebas gigantes, como A. proteus ( Tautvydas ,
1971) e Paramecium au.I:elia (Isaacks et alo, 1973),res
pectivamente iguais a 34 e 51,2 pg por núcleo. Deve
se levar em consideração que o conteúdo de DNA por nÜ
cleo obtido pela análise química de núcleos isolados ,
repre senta um valor médio (Mirsky e Ris, 1951)0 A com-~ , .
paraçao des s es valores medlos demonstra o grau de he-
terogeneidade existente entre microrganismos eucario
tos, no que se refe re ao conteúdo de DNA por nttcleo.
20 Extração de DNA
Vários autore s (Kirtikar et aI., 1967 . ,
,
88
MandeI, 1967; Adam et aI., 1969), encontraram dificuld~
des na extração de DNA de !. castellanii e de outras
amebas. O procedimento adotado (Métodos) é um~ combina
ção dos métodos de Kirby (1962) e Adam et alo (1969)
descritos, respectivamente, para extração de DNA de
ovos de Drosophila e DNA celular total de trofozoito"S
de A. castellaniia Ao contrário do método de Adam et ..... .
alo (1969), o DNA é obtido a partir da fase aquosa da
extração com fenolo A metodologia adotada permite a re
cuperação de grandes quantidades de DNA altamente poli
merizado, com peso molecular uniforme, conforme avalia
do pelas bandas estreitas obtidas em gradientes de den
sidade. O DNA obtido era cons tituído por moléculas na
tivas que, quando desnaturadas, apresentavam o efeito
hipercrômico esperado. Além disso,os valores de peso
molecular obtidos em gradientes de sacarose neutros e
alcalinos, indicavam ausência significativa de que-
bras em uma Única fita de DNA. O espectro de absorção
(Figura 5), apresentava razões de abs.orbância:! caracte -
rísticas de DNA puro (Marmur, 1961)0
3. Caracterização do DNA de trofozoitos
a) DNA total
O UNA celular total de trofozoitos é cons
tituído por dois componentes com densidade de flutuação
igual a 1,717 g/cm3 (componente maior) e 1,692 g/cm3
(componente menor)o A contribuição de cada componente
é re s pectivamente igual a 84% e 16%, conforme avaliado
a partir do traç ado fotoelétrico de DNA total centrifu-
gado em gradient es de CsClo Um outro satélite menos
denso ( p = 1,670 g/cm3), foi observado em algumas pr~ paraç ões de DNA total que, quando centrifugadaa em gra
dient e s preparativos de CsCl, apresentavam uma banda
muitb nítida e opalescente na região de equilíbrio do
DNA. Os re sultados obtidos quanto à caracterização des~
se material, indi cam que ele sejaéons tituído por gli
cogênio, já que apre s enta te s te positiv o com o reagente
de antrona, sensibilidade à di~estão por a-amilase,
89
densidade de flutuação- semelhante à de glicogênio comer
cial (cf. Mandel et ale, 1968), precipitação com eta
nol e nature za não-dializável. Apesar de não apresentar
absorção máxima na região ultra-violeta do espectro, o
polissacarídeo causa disper s ãe de luz suficiente par~
afetar o espectro de absorção das preparações de DNA
(Figura 5). Conclusões semelhantes foram relatadas por
outros autores, que verificaram a presença de bandas
satélites de glicogênio (Brunk e Hanawalt, 1966) ou de
outros pOlissacarfdios (cf e Mandel et al., 1968), em
gradientes isopicnicos de CsCl. Portanto, componentes
desse tipo devem ser analisados com cuidado, para que
nao possam ser interpretados, errôneamente, como
lites de DNA ricos em AT (Rosenkranz e Carden,
1967).
saté-
111 ,
A análise da incorporação de timidina-3H em material ácido-insolúvel (não descrita neste traba
lho), demonstra que a vAlocidade de síntese de DNA di
minui muito durante a fase estacionária, conforme veri
ficado anteriormente For Rudick (1971)0 Entretanto, a
síntese dos dois componentes parece ser afetada dife-
rencialmente. A proporção do componente menor varia
sensivelmente ao longo da curva de crescimento, apreseg
tando um valor máximo de 16% do DNA celular total na
fase log mediana (Tabela 4)0 Fenômeno semelhante foi
descrito para o DNA mitocondrial de levedo (Moustachi e
Williams~n, 1966), apesar de existirem controvérsias a
esse respeito (Fukuhara, 1969). A porcentagem do compo
nente menor no DNA de cistos (7%) é semelhante ao va
lor apresentado por cu.lturas em fim de fase log (6%), quando se inicia o encistamento em massa das células.A
redução da proporção do componente menor no DNA de cis
to poderia, pelo menos em parte, ser atribuída à au~ólise de mitocôndrias, que são incorporadas em autoliS0-
ssomos durante o encistamento (Bowers e Korn, 1969). A
atribuição de um significado fun.cional à variação da
proporç ão do componente menor é dificultada pela exis
tência de diferente s fraç ões de DNA com densidade mé
dia i gual a 1, 692 g/cm3• Para efeito de padronização
todas as experiênci as aqui descritas, empregam DNA ex-
90
traído de células em fase log mediRna.
A renatuTação do DNA total de troLozoitos
apresenta características cinéticas comuns à maioria
dos eucariotos estudados (Britten e Kohne, 1967). A
curva de reassociação se estende por várias unidades
de log de Cot, sugerindo a existência de vários com
ponentp.s com diferentes velocidades de reassociaç ão
(Figura 20). A distinção entre as diferentes famílias
é dificultada pelos valores semelhantes das velocida
des de reassociaç ão. Foi possível obter urna aproxima -
ção através da aplicação da equação ( 2 ), (ítem 9, Re
sultados), para calcular o valor de Cot l / 2 correspon -
dente a vários graus de re i teração o Quando uma escala
de sses valores é marcada no diagrama de log de Cot
(Figura 20), obtem-se a delimitação do intervalo de
frequências de repetição exi stentes . O perfil de reas
sociação obtido nas condi ç ões de incubação adotadas
(NaCl 1M; 600 C), sugere que 14% do DNA seja constituí
do por sequências com frequência média de reiteração
igual a 1000 Estudo da cinética de r eassociação das
frações isoladas fornece urna visão mai s detal~ada do
espectro de s equências repetidas do DNA total.
b) DNA nuclear e componente maior
A comparação entre os resultados obti-
dos com o componente maior do DNA total e DNA isolado
de núcleo s de trofozoito (Tabelas 5 e 6), demonstram
a identidade entre essas duas espécies de DNA o
O alto grau de homogeneidade das sequên
cias de bases do DNA nuclear é claramente evidenciado
pe lo comportame r'i to em gradientes de CsCl, desnatuI'ação
térmica e renaturação. O perfil de fusão é caracteriz~
do por uma transição abrupta, mostrando um pico gaus
siano nas curvas derivadas de desnaturação(Figura 14).
Não for am observados satélites em gradientes de CsCl
de DNA nuclear nativo ou fragmentado, obtendo-se
pre, apenas uma banda estreita (Figura 9A). O DNA
sem-, e
c inéticamenbe homog&neo , apresentando uma única reta
em gráficos do tipo ·· suger i do por Wetmur e Davidson
91
(1968) (Figura 18). Assim sendo, a proporção de sequências reiter~das no DNA nuclear é muito reduzida e a maior parte das sequências do DNA total com renaturação rápida deve ter localização citoplasmática. o DNA nuclear seria compos t o principalmente por sequências ~nicas que renaturam com um k2 igual a 0,106 l.mol-l •
-1 d 1 'd d . ~t' seg ,que correspon e a uma comp eXl a e Clne lca de 1,46xlOlld. A complexidade analltica do DNA huclear , determinada por análise qulmica de núcleos isolados (10,6 pg de DNA/núcleo), apesar de ser um valor medio, aproxima-se da complexidade determinada por metodos cin~ticos (l,46xlOlld). A discrepância entre esses valores poderia indicar a presença de uma pequena quantidade de sequências reiteradas no genoma nuclear, n~o
detectadas pelas técnicas e condições de renaturação em pregadas. Realmente, uma certa porcentagem de
... sequen-
cias com repetição intermediária deve estar presente no
DNA nuclear, já que na maioria dos eucariotos estudados, sequências desse tipo parecem estar dispersas ao longo do genoma (Britten e Smith, 1970). Em protozoários, a infor,mação existente é muito escassa, ea ameba repre -sentaria um exemplo de eucarioto com proporção muito baixa de sequências reiteradas com localização nuclear.
A proporção de DNA nuclear (86%) obtida por extrapolação a tempo zero de reação (Wetmur, 1967 '; Wells e Birnstiel, 1969), em gráficos lineares de renaturação (Figura 16), concorda estreitamente com o valor obtido a partir da área das curvas de sedimentação em gradientes analíticos de CsCl (84%, Figura 9B).
v . - ~ Os graflcos de rellaturaçao construl.dos se-gundo Britten e Kohne (1967), mostram que não há contaminação de TINA nuclear com DNA repetido (Figura 20), confirmando o perfil unimo daI observado em gradientes de densidade (Figura 9A) .
c) DNA mitocondrial e componente menor
O DNA extraído da fração mitocondrial apresenta dens i dade de flutuação idêntica à do componen
te men or do DNA t otal (1, 692 g/cm3). As mitocôndrias
92
nao foram tratadas com DNase e o DNA mitocondrial esta
va consideràvAlmente contaminado por DNA nuclear (Figu
ra 10A). Todavia, purificR.ção por centrifugação em gra
dientes de CsCl, resultou em grande redução da conta
minaçao por DNA nuclear (Figura lOB), representada por
moléculas altamente degradadas, conforme mostrado pelo
perfil largo e achatado na região de den.sidade igual a
1,717 g/cm3 • Bohnert (1973) obteve resultados seme-
lhantes, verificando um enriquecimento
menor em preparações II1itocondriais.
O componente menor do DNA
do componente
total apresenta
uma transição térmica complexa, que sugere uma análise
mais detalhR.da, através da primeira derivada das cur
vas de fusão (Figura 15A)o A transição térmica é excep
cionalmente larga e assimétrica. A característica mar
cante é que essas curvas não apresentam uma distribui -
~ão gaussiana, ao contrário do DNA nuclear o A an~lise
d.e :3sas curvas mostra um componente principal com T m
Am torno de 620 C e dois componentes de menor importân -
cia com Tm de 65 e 750 C aproximadamente. A presença de
um componente com T semelhante a 75°C, poderia indi-m
car contaminação por DNA nuclear. Todavia, as prepara -
ções de componente menor, quando centrifugadas em · gra
dientes de CsCl, apresentavam um único pico estreito ,
com densidade · itwal aI, 692 g/ cm3 o Adam e colaborm:lores
(1969) também observaram a presença, no componente me
nor, de uma espécie de DNA com T semelhante ao do JNA m nuclear.
A curva de desnaturação do componente me
nor reflete a presença de segmentos de DNA com composi
ções médias de b a ses bastante diferent8s. ~ provável que
a heterogeneidade seja intramolecular e não intermolecu
lal:' l conforme sugerido pela banda Única e simétri0rt 1b
servada em gradientes de CsCl. Essa interpretação (Ber
nardi et alo, 1970), explica a diferença entre os valo
res de porcentagem de GC calculados a partir do Te m densidade de flutuação do componente menor do DNA to-
tal (Tabela 5)0 Não foi feita uma análise exaustiva do
perfil de fusão do DNA mitocondrial que , todavia, tam
bém apresenta caracteristicas compatíveis com uma com,-
93
posiç;o heterog~nea. A heterogeneidade de composiç;o
de bases não é muito comum em organismos eucariotos do
tipo selvagem, apesar de ter sido descrita para DNA
de cloroplastos de Chlamydomonas (Wells e Sager,197l),
DNA de cinetoplastos de Trypanosoma cruz i (Riou e Pao
letti, 1967) e DNA mitocondrial de algumas linhagens
"petite" de levedo ( Bernardi et aI., 1970). O arranjo
das frações com diferentes razões de bases no DNA mi
tocondrial, pode ser extrapolado a partir das curvas
derivadas de desnaturaç;o e perfil de sedimentaç;o em
gradientes de CsCl. Se essas regiões fôssem muito dis
tanciadas, o perfil obtido após centrifugaç;o isop!cni
ca seria constitu!do por várias bandas, ou, pelo me
nos, por uma banda muito alargada. Todavia , obtinha
se sempre, uma única banda, caracterizada pela largu
ra esperada segundo o tamanho do DNA utilizado (Vino
grad e Hearst, 1962). Os resultados, portanto, suge
rem que essas regiões heterog~neas são pequenas e dis
persas ao longo do genoma (Wells e Sager, 1971).
Conforme discutido anteriormente (ítem 9
de Resultados), é posslvel avaliar o conteúdo informa
cional (complexidade de sequ~ncia. ) de um DNA, através .. , . -,
de estudos de clnet~ca de renaturaçao. Os calculos se-
rão simples sàmente se o DNA em questão apresentar com
portamento homogêneo como o DNA nuclear ou o DNA de
E. coli, que serviu de padr;o nas experi~ncias de
reassociaç;o. No caso do componente menor ou DNA ·de
mitocôndrias que se comportaram heterogêneamente, a
avaliação da complexidade a partir da determinação das
constantes de velocidade é prejudicada pela renatura
ç;o precoce das famílias de DNA reiterado. Além dis so,
quando uma família de sequ~neias repetidas é isolada
do resto do DNA, ela reassocia mais rapidamente, em
virtude do aumento relativo na sua concentração.Nesse
caso, o Cot l / 2 obser~ado nos gráficos de log de Cot,
devem ser multiplicados pela fração do DNA original
representada pela famflia de sequências repetidas, ob
tendo-se o valor de Cot l / 2 "puro" (Firtel e Bonner,
1972), ou seja, o Cot1 / 2 que seria obtido se o DNA
fôs se cons titufdo sàménte pela fração em estudo. As
tabelas 6 e 7 re s umém os resultados de cinética de
94
reéiL-l f! oc iéi (; ão de várias frações de DNA, levando-se em
cons:Uleração as limitações discutidas. Os resultados
obtidos indicam que o DNA reiterado de trofozoitos a-
presenta três famílias distintas, definidas por fre-
quências médias de reiteração características para fa
mílias com renaturrrção "rápida" (3xl03 ), "intermediá -
ria" (3xl02 ) e "lenta" (50). O ... lÚInero de famílias com
diferentes velocidades de renaturação encontradas no
DNA mitocondrial e componente menor, corroboram a
existência de três fa~ílias de sequências reiteradas
sugeridas pelo perfil de renaturação do DNA total (Fi
gura 16). Além disso, os valores de frequência de rei
teraçao das famílias pre s entes no DNA mitocondrial e
componente menor (Tabela 7), situam-se dentro do in
tervalo de frequência das sequências reiteradas do
DNA total, calc·ulado a partir da complexidade do TINA
nuclear (ver escala de valores de Cot l / 2 calcu l ad.os
segundo diferentes graus de reiteração na Figu ra 20 ).
A compara <; ão entre os valores de cO lllplex~
dade cinética e frequência de reiteração (Tabela ·7) e
k2
aparente (Tabela 6) , sugere que o DNA mi tocondrial
contém as famílias com renaturação líintermediáriaít e
"lentat~ enquanto que a fração "rápida' deve ter origem
citoplasmática e xtramitocondrial.
Assim, o DNA mitocondrial seria constituí
do por um componente principal com velocidade de rena
turação compatível com uma complexidade cinética de
2,6xl08d"(fração "lenta") e por outro componente com
genoma próximo de 2~lxl07 d (fração "intermediárial! ),
que representa 35% do genoma mitocondrial, conforme e~
timado a partir da hipocromicidade devida a cada fra-
ção (Wetmur, 1967). Bohnert (1973), demonstrou que
35% do DNA mitocondrial era formado por círculos aber
tos, com um contorno médio de 12,8 um, que correspon -
dem a um PM de 2,77x107 d, valor esse comparável à complexidade cinética do componente mais rápido dO
DNA mitocondrial ( 2 ,lxl07 d). Portanto, é provável que
as moléculas anal is~das ao microsc6pio eletr&nico re
presentem as s equências de bases detectadas nas expe
riências de r en ât uraç ão aqui descritas o Adicionalmen -
95
te, Bohnert (1973) descreveu a exis tência de molécul as circulares maibres, ~ol~culas lineares e mol~culas colabadas cujo comprimento não pode ser medido, o que impede a comparação com os resultados cin~ticos.
A fração intermediária corresponde a 6xl09 d (4% do genoma da ameba), enquanto que a fra-ção lenta equivale a 1,3xlOlO d (7,5% do genoma). A, diferença entre a complexidade analítica e a complexida -de cin~tica indicaria, então, que os componentes do DNA mitocondrial estariam presentes, respectivamente; em cerca de 300 e 50 cópias por genoma nuclear.
O DNA mitocondrial de !. castellanii, como acontece em outros microrganismos eucariotos estudados, é constituído por mol~culas maiores que o DNA mitocondrial de c~lulas de animais vertebrados (Sager, 1972). Os dados obtidos são semelhantes aos valores de tamanho e conteúdo informacional determinados para TINA de cloropastos de algas e plantas superiores e DNA mitocondrial de plantas superiores (Sager, 1972). O comportamento cin~tico heterogêneo mostrado pelo INA mitocondrial de !. castell~ii, foi igualmente verificado em DNAs citoplasmáticos de mitocôndrias (Wells e Birns
tiel, 1969) e clorapastos (Wells e Birnstiel, 1969 Wells e Sager, 1971), que apresentavam um componente com renaturação rápida, presente em muitas cópias e um componente principal caracterizado por uma frequên -cia de reiteração menor.
A análise das tabelas 6 e 7, sugere que o componente menor do DNA total, de localização cito-plasmática, contem uma fração de DNA de origem extramitocondrial, presente em aproximadamente 3xl03 cópias. Esse DNA poderia ser análogo, em céLulas superiores,aos epissomos bacterianos, ou então, demonstraria a existêg cia de organismos simbiontes, sugerida anteriormente por Ito ~t aI. (1969). Esses autores postularam que os corpúsculos citoplasmáticos contendo DNA, identificados por autoradiografia, seriam constituídos por vírus defectivos ou epissomos. A complexidade cin~tica determinada para a fração rápida do DNA da ameba -(1,5xl06 d) , exclui a possibilidade de que os simbiontes possam ser
96
bactél'ias ou micoplasmas, concordando com as observações
citológicas anteriores CIto et aI., 1969). A natureza extracromosomal desse DNA sugere que uma pequena fra-ção do genoma (2,5%), não estaria submetida ao controle de replicação normal, formando múltiplas cópias, cada vez que o genoma da ameba sofresse duplicação. A autonomia genética dessas partículas seria melhor evidenciada, através da determinação do grau de multiplicidade em di
ferentes estágios de crescimento de culturas de amebas (Chiscon e Kohne, 1970). Qualquer que seja a origem fi
logenética dessas partículas, elas poderiam representar A , •
outro exemplo de um fenomeno comum entre os protozoarlos; conforme discutido por Soldo e Godoy (1973), quesalientam a vantagem seletiva da existência de muitas cópias para a manutenção da continuidade genética em um ambien
te intracelular. Por outro lado, a existência de um DNA ci
toplasmático extramitocondrial ~oderia ser relacionada com a extrusão de DNA nuclear para o citoplasma, des-
crita anteriormente (Bovlers e Korn, 1969). A natureza e destino do DNA liberado são desconhecidos .• A caracteriza
ção desse DNA poderia f{)lrnecer resultados interessante s , já que fenômenos semelhantes foram verificados apenas durante a meiose, envolvendo sempre a amplificação de
cistrons ribossômicos (Lima-de-Faria, 1973). Se o DNA citoplasmático, detectado nas experiências de renatura
ção fôsse de origem nuclear, dificilmente conteria informação ~ara a síntese de rRNA, já que os cistrons ri-bossômicos, na maioria dos eucariotos estudados, têm densidade de flutuação maior que a do DNA nuclear (Birn~
tiel et aI., 1971). Sem dúvida, a atribuição de uma função à fração rápida do DNA total de A. castellanii, re
quer maior investigação.
4. Análi1se das condições de renaturação
o grau de precisão de pareamento quências de nucleotídios é determinado pelas de incubação, ou seja, o tamanho da fração de
das se-condições DNA que
reassocia, varia ·com o "critério" estabelecido durante a
97
experiência realizada para estudar esse DNAs Como a re
associaç~o ~ acelerada em soluç6es de alta força i3ni
ca (Wetmur e Davidson, 1968), adotou-se, rotineiramen -
te, NaCl 1 M como meio de incubaç~o e temperatura igual a 600 C. Segundo Rice e Paul (1972), essas condi
ç6es de incubaç~o evitam a formação de hfbridos instá
veis e n~o especfficos, apesar de constitufrem um cri
tério n~o muito rfgido de renaturaç~o. A adoç~o de tem
peratura mais alta ou força i3nica mais baixa durante H •• . _ ,
a renaturaçao, determlnarlam a formaçao de moleculas d~
pIas, contendo menor proporção de bases mal pareadas •
Todavia, experiências de renaturaç~o empregando DNA
dissolvido em SSC, forneceram resultados idênticos aos
descritos neste trabalho, possibilitando a conclusão de
que as regi6es de homologia detectadas eram relativamen
' te extensas.
As condições de inc~baç~o adotadaspermi
tiram evidenciar a heterogeneidade desequências de ba~
ses do DNA mitocondriaJ de A. castellanii, evidenciada
pelas caracterfsticas do perfil de renaturação e desna
turaç~o térmíca. Estudos mais detalhados das curvas de
fusão, permitir~Q estabelecer uma posslvel correlação
entre as regiões de heterogeneidade local observadas na
desnatUl~aç~o e as fam!lias com diferentes velocidades
de , renaturaç~o.
Entretanto, a complexidade cinética , das
famllias de DNA reiterado deve ser interpretada critic~
mente, já que o "critério" adotado permite a reassocia
ç~o de sequências semelhantes, mas n~o idênticas, que
poderiam reduzir a velocidade de reas'sociaç~o (Bri tten
e Bonner, 1971), fonnecendo uma medida aumentada do
comprimento das s'equências que se repetem (Southern,
1970). Deve-se" também, levar em consideração que as
moléculas de DNA reassociado poderiam conter regiões
não pareadas (Britten e Kohne, 1967), se as sequências
repetidas ocorressem em segmentos de DNA muito meno
res que os fragmentos de DNA utilizados nas experiên
cias (Tabela 6). O tamanHo dos fragmentos de DNA e os va
lores relativamente baixos de Cot empregados, não per-
98
mitem excluir a existência de uma pequena porcentagem
de DNA Úni c o no genoma mi tocondrial, nem a presença de
uma bai xa porcentagem de sequências reiteradas no DNA
nuclear.
As constantes de segunda ordem obtidas não
foram corriginas quanto ao teor de GC, porque bá evi
dências c ontraditórias sobre o seu efei t .O (Wetmur e
Davidson, 1968; Gillis et aI., 1970). Além disso, no
caso do DNA mitocondrial 8 componente menor, a heteroge
neidade de composição de bases impos s ibilitaria essa ...
correçao.
Em resumo, as medidas de frequência e p~
porção de DNA "Único" e reiterado de !. castellani:l,re
presentam um número mínimo de componentes do genoma,já
que a família de reiteração intermediária poderia con-
ter outros componente s não individualizados
de estudos de cin~tica de reassociação.
, atraves
VIII. Hesumo
o t rabalh o descreve um método para i s ola
mento d e núcleos morfologi camente intactos e fisiologi
camente ativos, além da c ara cterizaç ão parcial do
DNA de Acanthamoeba cas tellanii (linhagem Neff).
o DNA celular total de trofo zoitos con-
tém quatro famílias com diferentes velocidades de re
naturação. A fração com renatur ação mais lenta (DNA
"único"), corresponde ao DNA nuclear ·(86% do genoma)e
apresenta características cinéticas compatíveis com
uma complexidade de sequência i.gili.al a · l,46xlOll dal
tons. O DNA reiterado (14% do genoma); . compreende três
fam1.lias de sequências de nucleotídios, denominadas
"rápida", "intermediária" e "lenta", com complexidade
cinética re s pectivanlente igual a 1,5xl06 ; 2,lxl07 e 8 . 3
2,6xlO daltons, pre s entes em aproximadamente 3xlO ,
3XI02 e 50 cópias. As famílias de DNA reiterado têm
localização predominantement.e citoplasmática, sendo
que as famílias "intermediárias" e "lenta" fazem par -
te do genoma mitocondri a l. O comp ortamento cin~tico he
terogêneo do DN.A mito c oYJdrial e sua complexidade asse
melham-se aos d~do s existente u para outros microrgani,ê.
mos eucariotos. A constatação de uma espéCie de DNA
extramitocondrial pode ser relacionada com a descri
ção ant erior de corpúsculos citoplasmáticos contendo
mA ou com a extrusão d.e cromatina para o citoplasma ,
verificada no início do encistamento.
O DNA de trofozoi tos também foi caracteri
zado quant o ao padrão de sedimentação em gradientes de
densidade, desnat~ação t~rmica e composição de ba
ses. O DNA celular Gotal apresenta dois componente s .em
gradiente s de CsCl, caracterizados por densidade de fl~
tuaç ão iguais a 1,717 g/cm3 (comp onente maior) e
1,692 g/cm3 (componpute menor). O perfil de fusão do
DNA ini tO G.'.ondrial sugere heterogeneid ade de composição
de bases o
IX. Bibliografia
1. Adam, K.M.G. (1959) - "The growth of Acanthamoeba
sp. in a chemically defined medium". - J. Gen.
Microbiol. 21, 519-529.
2. Adam, K.M.G. (1964) - "A comparative study of Hart
mannellid arnoebae". - tI. Protozool. 11, 423-430.
3. Adam, K.M.G.; Blewett, D.A. e Flamm. W.G. (1969 ) -r"I'he DNA of Acanthamoeba sp.; a method for its
characterization". - J. Protozool. 16, 6-1-2.
4. Alberts, B.M. e Doty, P. (1968) - 1I0haracterization
of a naturally occuring cross-linked fraction of
DNA. I. Nature of ~ross-linkageflo - J. MoI. Biol.
32, 379-403.
5. Armstrong, J .A. e Pereira, M.S. (1967) - r'Identifi
cation of Ryan virus as an amoeba of the genus
Hartmannella fl • - Brit. Med. J. 1:, 212-214~
6. Balsamo, J. (1972) - flOaracterísticas fisicas e
funcionais do DNA r eite rado de Rhynchosciara ~
rican8 fi •• - Tese de Doutoramento, Instituto de ( . ~
QUlmlca, U.S.P., Sao Paulo.
7. Balsamo, J.; Hierro, J.M. e Lara, F.J.S. (1973)-"Transcription of repeti tive DNA s equences in
Rhynchosciara salivary glands fl • - Oell Different.
~, 119-130.
8. Band, R.No (1959) - flNutritional and related biolo
gica l studies on the free-living soil amoeba
Hartmamlella rhysodes 11. - J. Gen. Microbiol. 21, 80-95.
9. Band, R.N. (1962) - flThe aminoacids requirements
of the soil amoeba Hartmannella rhysodes". - J.
Protozoolo 2, 377-379.
]()l
10 0 BRJlcl, P . No (19G3 ) - IIE xtrinsj. c. r e quireTlJ eJ1t s for
eneys 1-; a tioI.l by tbe soil amoeha Har GW 8.nnel1a rhy
s odes Ir . - J" Proto zoal. 10, 10J.-10 r;.
11" Band, R.N e e Macheme l' , O. (1 9G3 ) - "Environmentéll incluction of multinuc l e ate Hurtmannel1a rhys,o
de s ". - Exp . Oel l Re s . 31, 31-38 .
1 2 . Band, R.N e e Mohrlok, SO (1973 a) - 1I0bservations
on indueed amitosis in Acanthamoeba"o - Exp. Oell Res. 12, 327-337.
130 Band, R.N. e Mohrlok, S. (1973 b) - "The cell cyele and indueed amitosis in Aeélnthamoeba". - J. Prot o zool o 20, 65Ll--G57.
14. Band, R.N.; Mohrlok, S. e Rubin, R.W o (1970) - "S~
parate induction of ami t otic and mitotie divi
Aion in Acanthamoeba rhysodes". - Nature 227 ,
379-381.
15. Bernardi, G.; Faures, M.; Piperno, G. e Slonimski,
P.P. (1970) - "Mitochondrial DNA's from respira-
tcry-suffieient and eytoplasmic respiratory-
defficient mutan" yeast". - J o MoI. Biol o
23-420
48, -16. Birnstiel, M.L.; Ohipchase, Mo e Speirs, J. (1971)
"The ribosomal RNA eistrons"o - Progro Nueleic
Aci d Res o MoI. Biol. 11, 351-3890
17. Bi rns tie1, M.Lo; Speirs, J.; Purdom, lo; Jones, K. e Lo eni ng, E. (lC)68 ) - "Properties and composi
tion s oi' t l1e isol a t ed ribo s omal DNA satel1i te
of Xenopus laevi s "o - Nature 219, 454-463.
18 . Bishop, J .00 e Freeman, K.B. (1973) - "DNA sequen
ees neighboring the duek hemoglobin genes".
Oold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38; 707-
716.
102
19. Blobell, Ge e Potter, V.R" (1966) - "Nuclei from rat liver: iS01ation method. that combines purity with high yleld" .. - Science 154, 1662-1665.
20. Blumenfeld, M. e Forrest, H.S. (1972) - "Differential under-replication of satellite DNAs during Drosophila development". - Nature New Biol. 239,
170-172.
21. Bohnert, H.J. (1973) - i1 Circular mitochondrial DNA from Acanthamoeba castellanii (Neff strain)".-
Biochim. Biophys. Acta 324, 199-205.
22. Bolton, E.T. (1966) - "Nucleic acid interactions e
A molecular approach -to the study of genes and
their products". - Ca. Res. 26, 1964-1970.
23. Bonner, T.I. (1973) - "Instantaneous bindiro:g fractions of "mA". - Carnegie Inst. Wash .. Year Book 72, 204-207.
24. Bowers, B. e Korn,. E.D. (1968) - "The fine structure of Acanthamoeba castel1anii. I. fue tropho
zoite". - J. Cel1 Biol. 39, 95-111.
25. Bowers, B. e Korn, E.D. (1969) - "The fine structure of ;Acanthamoeba castellanii (Neff strain ). 11. Encystment". - Jo Cel1' Biol. 41, 786-805.
26. Bram, S. (1971) - "Secondary structure of DNA depends on base composition". Nature New Biol.
232, 174-176.
27. Bray, G.A. (1960) - "A simple, efficient liquid scintilation for counting aqueous solutions in
a liquid scintilation counter"o - Annal.Biochem.
1, 279-285.
280 Breuer, M.E. e Pavan, C. (1955) - "Behaviour of polytene chromosomes of Rhynchoschiara angelae at different stages of larval development" •
Chromosoma Z, 371-386.
103
290 Britten, R.J. (1970) - "Observed properties of re
peateri DNA sequences (apri1 1969)"" - Carnegie
Inst. ,Wash. Year Book 68, 376-378"
30. Britten, R.J. (1971) - "Sequence comp1exity, ki
netíc comp1exity and genetic comp1exity". - Car
negie Inst. Wash. Year Book 69, 503-506.
31. Britten, R.J. e Bonner, T. (1971) - "The effect
of sequence divergence on the rate -of reassocia
tion". - Carn eg=!-e Insto Washo Year Book .22., 373-374 • .
32. Britten, R.J. e Davidson, EoH. (1969 ) - "Gene regu1at ion for highel' ce11s: a theory". -'- Science
165, 349-357.
33. Britten, R.J. e Kohne, D.E o . (1967) - "Nuc1eotide sequence repeti tion in DNA". - Carnegie
Washo Year Book 65, 78-106õ
Inst.
34. Britten, R.J. e Kohne, D.E. (1968) - "Repeated nuc1eotide ~equences". - Carnegie Inst. Wash. Year
Book 66, 73-88.
35. Britten, R.J. e Rake, A.Vo (1969) - "Search for sa1tatory rep1ication". - Carnegie Insto W~sh.
Year Book ~, 325-3270
36. Britten, RoJ o e Smith, Jo (1970) - "A bovine geno-me"n - Carne gi.e Insto 'Washo Year Book 68,
386. 378-
3'/ . Britten, R .. J.. e Smith, JoFo (1971) - "Catt1e,sheep, and sate11ites". - Carnegie Insto Washo
Book 62, 506-j070
Year
380 Britten, RoJ.; Graham, D.E o e Henerey, M. (1972)"Se a-urchin repeated and sing1e-copie DNA". - Car
negie Inst. Wash. Year Book 1l, 270-2730
590 Brown, D.D o e GllI'don, J oBo (1964) - "Absence of ribos oma1 RNA synthesis in the anucleo1ate mu
tant of Xenopus 1aevis"0 - Proco Natn A.cad. Sci.
Wash o 51, 139-146.
104-
/~-o . Browtl . D.D. P. " Nplle r , CJi n (19G8 ) - Gene liriko r:t'
hy RNA-DNA hyhricli 7, ~lt -i oI1o 11 0 Arrangement ( , t.'
t rl.e r 8(b ln (1 ;~1l f; f';ene sequences for 288 and 18 ~ j
l' ih(wrnn;:1] _ Hl\l A"~ - .T. MoLo J ~ io l. 34, 681 -69'(.
LI-l . Brown , D.D~ ; Wen l::ink , PoCo e Jor(lé1 n, E. (19 '72 )
A compari s on 0f t h e ribosomal DNA ' s of Xenopus
1aevis e Xenopus mu11 eri: t h e e v olution of
tanrlem f2;8ne s ". - tI" MoI . Bio1. 63 , 5'7-73 0
4~ . Brun.k , C.F. e Hanawa1t , P . C. (1966 ) - "G1ycogen
satellite bands in isopynic CsCl gradients " ..
Exp o Cell Res . 42 , 4m)_L~08.
4 3 . Burgi , E. e Hershey , A.D. (1963 ) - "Sedimentation
rate as a me asuX' e (lf mole cul ar weight of DNA". -Biophys. J. 3 , 309 - 321.
L~4e Byers , T.J.; Rudick, Ve I •• e Ru d i ck , M.J. (1969)
" Cell size , macromolecu1 ar compos ition, nuclear
numbe r , o:x:ygen consumption anel cyst f ormation dl.l
ring two growth phas e s in unagi tated ctll tures of
Acanthamoe b a c aste ll anii". - ... T o Protozoo1. l:§,
693 - 699
45. Ca11an, H~G. (1967) - "The organi zation of genetic
units in chromosomes "o - Jo Cell Seio g, 1-7 .
46 . Cairns, J. (1963 ) - " The chromosorne of E. coli".
Cold Sprine; Harbor Symp o QU.an t" Biol. 28 , 4 3-
LI-6 0
l17" Carter , R. F o (1968 ) - "Primary amoeoic rneningoenc~
pha litis: clinicaI, pathological and epidemiolo
gical featur e!": of s i z cases ". - J. P a tho and
Bact o 96, 1-2 5 o
480 Castellani, A. (1930 ) "An amoeba growing in cul-
tUl'f!S of an yeas t" a - J" Tropa Medo Hygo 33 ,
160-1880
49 . (~! e rioti:;i, Go ( 1 'J 52 ) - "A lD icrochemi cal dete rm Ula -
tion of DNA". - Jo Biola Chem. 198 , 29'7- 30 3 ..
-
105
50. Cerva, L. e Novak, K. (1968) - IIAmoebic meningoencepha1itis~ sixteen i'ata1ities ll
• - Science, 1§Q, 92.
51. Chambers, J .A. e ,Thompson, J .E. (1972) - A scanning e1ectron microscopic study oi' the excystment pr 2 cess of !. caste11anii". - Exp. Ce11 Res. , 22, 415-421.
52. Chang, RoS. e Humes, Mo (1962) - "The bio10gic immuno10gic and physicochemica1 characterization of a transmissib1e agent capab1e of inducing DNA and thymine degradation in cu1tured human ce11s~
J. Exp. Med. 115, 937-957.
53. Chang, R.S.; Pan, I. e Rosenau, B.J. (1966) - " On the nature of the 1ipovirus ll
• - J. Exp. Med. 124,
1153-1166.
54. Chauveau, J.; Mou1é, Y. e Roui11er, C. (1956) "Iso1ation of pure and una1 tered li ver nuc1ei. Morpho10gy and biochemica1 composition". - Exp. Ce11 Res. 11, 317-3210
55. Chiscon, J.A. e Kohne, D.E. (1970) - "DNA sequences present as multip1e copies in E;o co1i". - Carnegie Inst. Wash. Year Book 68, 388-391.
56. Co11i, Wo e Oishi, M. (1970) - "A procedure for gene purification: the purification of the riboso -mal RNA genes oi' Baci11us subti1is as DNA-RNA hy
brids ll• - J. Mo1. Biol. 21, 657-669.
57. Colli, W.; Smith, I. e Oishi, M. (1971) - IIPhysical linkage between 5S, 16S and 23S ribosoma1 RNA genes in Bacil1us subti1is ll
• - J. MoI. Biol. .2§, 117-127.
58. Corneo, G.; Ginelli, E. e Po11i, E. (1970) - "Repe~
ted sequences in human DNA". - J. MoI. Biol. 48,
319-327.
59. Crick, F.H. (1971) - "General model for the chromosomes of higher organiBms". - Nature 234-, 25-27.
106
60 .. Crippa, Mo; Meza, I. e Dina, D. (1973) - "Sequen c e
arrangement in mRNA: presence of poly (A) and
i denti 'fication of a repetitive fragment at the
;; ' e n (l". - Cold Sprin g Harbor Symp . Quant. Biol.
38 , 933-942.
61. Crouse, H. e Keyl, H.G. (1968) - "Ex tra replications
in the "DNA puffs " of Sciara coprophila". - Chro
mo s oma 25, 357-364 0
62 . Culbe rtson, C.G.; .Smith, J .. W .. e Minner, J.R. (1958 )
- "Acanthamoeba: observations on animal pathogeni
city". - Science 127, 1506.
63. Culbertson, C.G.; Smith, J.W.; Cohen, H.K. e Minner,
J .R. (1959) - "Experimental infectl0n of mice.
and monkeys wi th Acantl1amoeba". - Am. J. Path. 35,
187-1930
64. Davidson, E.H.; Hougb, B.R.; Ame DFw n, C.S. e Britten
R.J. (1973) - "Gen eral interdis p e rsinn of repe-
titive with non-repetitive sequence elements in
t he DN A o f Xenopu s " o - ,To Mo I . Bi o lo 77, 1-23.
65. di Mauro, E.; Sriyde r, Lo; Marino, P.; Lamberti, A.;
Coppo, A. e Tocchini-Valentini, G.Po (1969)
"Rifamp icin sensitivity of the components of DNA ....
dependent RNA polyrneras e". - Na ture 222, 533-5370
66 .. Dische, Z. (1955) - "Color re ac tions of nucleic a
cids component s " ..... The Nucleic acids 1,285; Ed.;
Chargaff, E. e Davidson, J.N .. ; Academic Press ,
N. Y.
(~~ 7 . Do u g l élS , Mo (1930) - "Notes on the c las s ification
of the amoeba found -by Castel1an i in cu1 t ure s of
a y eas t-1ike fungu s ". - J. Trop. Me d . Hyg. 33, - --2 58- 259 0
6 8 . Dunnebacke , T.R. e Schuster, F.Lo (1971) - "lnfec -
ti ou s a gent from a free-living soil amoeba,Naegleria
gruberi". - S cience 174 , 516-518 .
107
690 Dunnebacke, T.Ho e Wi11iams, R.C. (1967) - "A re -
interpretation of the nature of "lipovirus" cy
topathogenicity". - Froc. Nat. Acad. Scio Wash.
57, 1363-1370 0
70. Eigner, J. e Doty, Po (1965 ) - "The native, dena
tured and renatured states of deo:x:yribonuc1eic
acid". - Je MoI. Bio10 12, 549-5800
710 Firtel, R.A. e Bormer, Jo (1972) - "Characterizat
ion of the genome of the ce11ular slime-mold
Dictyostelium discoideum". - Jo MoI. Bio1. 66,
339-361.
720 Firte1, R.A.; Jacobson, Ao e Lodish, H.F. (1972) -
"Isolation and hybridization kinetics of messen
ger RNA from the cellu1ar slime-mold Dictyoste -
lium discoideum". - Nature New Biol. 239, 225-
228.
730 Flamm, W.G.; Walker, F.MoBo e McCallum, Mo (1969)
"Some properties of the sing1e strands iso1ated
from the DNA of the nuclear sat e11ite of the
mouse (Mus muscu1us)1t o - J. MoI. Biol o 40, 423-
443.
74. Fukuhara, H. (1969) - "Relative proportions of mi~
tochondria1 and nuclear DNA in yeast under va
rious conditions of growth". - Eur o J. Biochem •
11, 135-139.
75. Gall, J.G.; Cohen, E.H. e Atherton, D.D. (1973)
"The sate11ite DNAs of Drosophila viri1is" •
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38, 417-
421.
760 Ga11, JoC.; Cohen, E.H. e Po1an, MoLo (1971) - lIR~
petitive DNA sequences in Dro sophi1a"0 - Chromo
soma 33 , 319-344 ç
770 Gall. JoGo; MacGregor , HoCo e Kidston, M.E.(1969)
"Gene amp1ification in the cocytes of Dytis cid
water beetles". - Chromosoma 26 , 169-187 .
108
78 . Gambarini, AeG. (1972 ) - "Estudos sobre os genes
re s ponsáveis pela síntese de RNA ribossômico em
Rhynchosciara". - Tese de Doutoramento, Insti -
tuto de Qufrnica~ D.S.P., são Paulo.
79. Gelderman, A.H.; Rake, AoV. e Britten, Ro J.
(1972) - "Transcription of Ylonrepeated DNA in
neonatal and fetal mice"o - Proc. Nato
Sci . Wash . 68, 172-176 .
Acad.
n() , Ge or giev, G.P. (1969 ) - "On the structural organi
zation of operon anr1 the regulation of RNA syn-
thesis in animal cells". - J o Theoret.
25 , 473-490 .
Biol.
81. Giles, K.W. e Myers , A. (1965 ) - "An improved
diphenylamine method for the estimation of deo
xyribonucleic acid". - Nature 206, 93"
820 Goldstein, Lo e Pres cott, D.M. (1967) - "Nucleocy
toplasmicinteractions in the control of .nuclear
reproduction and other cell cycle stages". - The
Control oE Nuclear Activity, 3-17; Edo: Goldstein
L., Prentice-Hall, Englewood Cliffso
83 . Graham, D.Eo; Neufeld, B.R. e Britten, R. J. (1973)
- "Interspers ion of sea-urchin repetitive and
nonrepetitive DNA sequences"o - Carnegie Inst.
Wash. Year Book 7 2 , 222-224~
84 . Griffiths, A.J. e Hughes, D.E. (1968 ) - "Starvation
anel encys tment of a soil amoeba Hartmanella cas
tellanii" - J~ Protozool. l :z , 673 -6770
85 0 Griffiths, Ao <J. '3 Hughes, D.E o (1969) - "The phy-
siolo f5"".f 01' encYstment of Har tmanella castellan,;já".
J o Protozool . 16 , 93-99.
860 Hallberg , R.L. e Brown, DoD. (1969) - "Co-ordinated
synthesis of some ribosoma1 protej.ns -and riboso -
ma l RNA in embryos 01' Xenopus laevis". - J. MoI.
Bio lo 46, 393-411.
.LU'j
87. Hennir';, W. (1972) - "Highly repetitive DNA sequen
(~ P.f'l i LI j;] U ~ gp.n()Jr.I'~ o f Drn s ophila hydei o I. Prefe
l 'l>.tlt i,é3l lo ca lizaLion in t h e X chromosomal hete
ro ch I'omatin". - J. MoI. Biol. 71, 407-417.
88. Hermig , W. e Walker, P.MoB. (1970) - "Variations
in the DNA from two rodent families (Cricetidael.
and Muridae)". - Nature 225, 915-919.
89. Hennig, W.; Hennig, I.e Stein, H. (1970) -peated sequences in the DNA of Drosophila
"Re-and
their localization in giant chromosomes il• - Chro
mosoma 32, 31-630
90. Hinegardner, R.T o ; Rao, Bo e Feldman, DoEo (1964)"The DNA synthetic period during early develop -
ment of the sea urchin egg". - Exp. Cell Res.
36, 53-61.
910 Hoyer, BoH o; McCarthy, B.J o e Bolton, E.T o (1964)-liA molecular approach in the systematics of
higher organisms". - Science ~, 959-967.
92. Hymer, W.C. e Kuff, EoLo (1966) - "Isolation of
nuclei from mamm.aliB.Il tissues through the use
of TritoTl X-I00". - J. Histocbem. Cytochem. l,g,
359-363.
93. Ifft, J.B.; Voet, D.H. e Vinograd, J. (1961) ilThe determination of density distributions and
dens ity gradients in binary solutions at equili
briwn in tho lütracentrifuge". - J o Phys. Chem •
65, 113E3-1 145.
940 Isaaks, RoE.; Santos, B,Go e Musil, G. (1973) "Studies on nuclei of Paramecium aurelia. I. Iso
lation and pu:rification by continuous ar dis
continuous sucrose gradient centrifugation and
bi ocbemi cBl composi tion 11 o - J. Protozool. 20, 4, 77-L~81 •
()~" T 1,0, Só j (~ll 8.ne; , H. S o e Pollard, ToD. (1969) - IICy_
[',() p l r\;-'. p ; i c ri i r; Lribut i on of DNA in a strain of
h él l' Lmanne llid amoeb a ll• - Jo Protozool o 16, 638-
64 5?
110
96 0 Jacob, F. e Monod, J. (1963 ) - "Genetic repression,
a110 s t eric inhibition and cellular differentiat-
ion" 5 - Cytodifferent;intioYJ and Macromolecular
Synt"lles i s , 30-6L~ , Ed. Locke , M.; Academic Press,
N . Y .
97 . Jahnes, W.G.; Fullmer, HoW. e Li, C.P. (1957) "Free-living amoehae as contarninants on monkey
kidney tissue culture ". - Proc . Soc o Exp . Bio1.
Me <l. o 96 , 4-84-488 o
9~3 . ,James, r:I..'oE. e Byers , T. J o (1967) - "r:I..rhe induction
of multinuclearity in agitated and in aging cul
turef, oI Acanthamo eba sp o Neff". - J. Ce11
PhYt"d "ol. 22, 53-62 .
99. Jensen, T. e Dubes , G.Ro (1962) - "Cloning, tri-tration and differentiation of Acanthamoeba sp.
by p1ating". - J~ Parasito 48, 280-2860
100. John, H.A.; BirnstieJ, M.L. e Jones, K.W o (1969) -"RNA-DNA hybridization at the cytologica1 "leve1".
"Nature 223, 582-587.
101. Jones, KoW. (1970) - "Chromosoma1 and nuclear loc~ tion of monse satellite DNA in didividua1 ce11s".
Nature 255, 912-91 50
102 . Jone s , K.W. e Robertson, F.V/. (1970) - "Localiza -tion of nucleotide se quences in Drosophila and
mouse by "in s:Ltu" hybridizatioYJ of complementa
ry RNA" ...... Chromosoma 31, 331-3L~5 .
103, Kedes , L.H. ~ Birnstiel, M.L. (1971) - "Reiteration
and clustering of DNA sequences complementary to
histone messenger RNA" . - Nature New Bio1 . 230,
165-1690
104. Kirtikar, M.; Jensen, To e Meyers, Do (1967) - "Extraction of DNA from Acanthamoeba caste11aniil.l. -
J. Protozoo1. 14 (supp1o), 11.
111
105. Kit, S. (1961) - "Equi1ibrium sedimentation in density gradients of DNA preparations from animal
tissues". - J. MoL Biol. ,2, 711-716.
106. Kohne, D.E. (1969) - "Isolation and characterizat -ion of bacteria1 ribosomal RNA cistrons". - Oar
negie Inst. Wash. Year Book §1, 310-320.
107. Kohne, D.E. (1971) - "Pattern of DNA acquisition during evolution" ..... Oarnegie Inst. Wash. Year
Book 69, 485-488;
108. Kohne, D.E. e Byers, M.J. (1971) - "Studies on the expression, evo1ution and amplification of DNA sequences". - Oarnegie Inst. Wash. Year Book lQ, 376-378.
109. Kohne, D.E.; Ohiscon, J.A.e Hoyer, B.H. (1971) "Nucleotide sequence change in nonrepeated DNA during evolution". - Oarnegie Inst. Wash.
Book 69, 488-501. Year
110. Korn, E.D.e Wright, P.L. (1973) - "Macromo1ecu1ar composition of an amoeba plasma membrana". - J.
Bio1o Ohem. 248, 439-447.
111. Krishna Murti, O.R o (1971) - "Encystment of amoe-bae: an example fO ' single call differentiation".
Ourrent Sei. 40, 589-593.
112. Krishna Murti, O.R. (1973) - I!Biochemistry of amoebic encystment"o - Biochem. Soe. Transac. 1" 11040
113. Laird, O.D o ; McOonaughy, B.L. e McOarthy, B.J. (1969) - "Rate of fixation of nucleotideO ; ~ubstit:!:! tiOllS :1,1)., eyol-qtion ",. :- N..at;u:pe, .' ~ t- ~4;9~lti,Lf,i1 , ~
• ~ . , • • I ~ . t:', '! . ' (I 1 i 1 1140 Lima-de-Faria, A. (1973) - "The molecular organiza-
I . :
tion of the chromomeres of' Acheta ' involved in
ribol~~~~l pNA _ a~Ifl~~i,ca.t;~o~> ( li! qo~4, Sgt\:i,flg \ Har.,. bor Symp. Quant o Biol. 38, : 559-571. . f
• • " ;' , . \' · 'JI,: ,~j 'l~.~.(j l \l: i'~ , ·i( ) í~·
I - . :~.
112
115 . Liu, C. e Rodina, P. (1966 ) - "Immunofluorescent studies of human ce11 cultures and chick embryos inoculated with the ameboi d cell "lipovi
rus complex". - J. Exp. Med. 124, 1167-1178.
116. Loening, U.E.; Jones, KeW. e Birnstiel, M. (1969) - "Properties of the ribosomal RNA cursor in ' Xenopus 1aevis; comparison to precursor in ma.nuuals and plants". - J.
Biol. ~, 353-366.
L. prethe
MoI.
117. Lowry, O.H.; Rosebrough, N.J.; Farr, A. L. e Randall, R.J. (1951) - "Protein me aSUI' ements with the Fo1in-Phenol reagent". - J.Biol.Chem.
193, 265-275.
118. MandeI, M. (1967) - "Nuc1eic acids of Protozoa". Chemical Zoolog:y .!; 541-5'72; Ed.: Kidder, G.W.;
Academic Press, N.Y.
119 . MandeI, M. e MarmUl', J. (1968) - "Use of ultravio le t absorbance-temperature profi1e for determining the guanine p1us cytosine content of DNA". Methods in Enzymology XII B, 195-206; Ed,: Gro,ê. sman, ' L. H Mo1dave, K.;Academic Press. N.Y.
120e MandeI, M.; Schi1dkr aut, CoLo e Marmur,J. (1968)"Use of CsC1 density gradient fo r determining the guanine p1us cyto s irle content of DNA". Methods in Enzymo10gy XII B, 184-195; Ed.: Grossmru1, L. e Mo1dave,K.; Academi c N.Y.
Press,
121. Marmur, J. (1961) - "A proc e dure for the i s ola -ti on of DNA f rom rni c. ro orgaIJ isms". - J.
Bio l . ~ , 208- 216 0 Mo I .
1 22 . Marmur J . e DotY '1 P. (1961) - "Therma1 renatura -tion of deoxyribonucleic acid". - tT. MoI. Biol.
2" 58'}- 594 •
113
123 . Marmur , J.; Rownd, R. e Schi1dkraut, C.L. (1963) -"Denaturation and renaturation of deoxyribonuc1eic '=l.cid". - Pro gr. Nuc1eic Acid Res. MoI. Bio1. 1:. 231-300.
124. Martin , M.A. e Hoyer, B.H. (1966) - "Therma1 stabi lities and species specificities of reannea1ed
animal DNAs". - Biochemistry 2, 2706-2713.
125. Marzzoco, A. e Co11i, W. (1974) - "Iso1ation of nuc1ei and characterization of nuclear DNA of Acanthamoeba caste11anii". - Biochim. Biophys • Acta (aceito para publicação).
126. Mattar, F.E. e Byers;T.J. (1971) - "Morphologica1 changes and the requirements for macromo1ecu1ar synthesis during excystment of Acanthamoeba cas
tel1anii". - J. Ce11 Biol. 49, 507-519.
127. Me11i, M. e Bishop. J.O. (1969) - "Hybridization b etween rat 1iver DNA and complementary RNA". J. Mo. Bio1. 40, 117~136.
128. Me11i, M. e Bishop, J.O. (1970) - "Molecular hybridization between rat ·1iver DNA and comp1emen
tary RNA". - Biochem. J. 120, 225-2350
129 0 Me11i, Mo; Whitfie1d , Co; Rao, K.V.; Richar dson,M. e Bi shop, J.O. (1971) - "DNA-:-RNA hybridization
i :q. vas t DNA excess ". - Nature New Bio1. 231, 8-
120
130 . Meneghini, R.; Arme1in , H.Ao; Ba1samo, J. e Lara. F . J . S . (1971) - "Indicat i on of gene amp1ific8.tion
"in ·Rhyncosci ar a by RNA-DNA hybridi zation". - J.
Ce11 Bio1. 49 , 913- 916 .
131. Mir sky, A.E. e Ris , H. (1951) - "The deoxyribonu -c1ei c acid content · of animal ce11s and its 1ut i onary s i gnificance". - J. Gen. Phys io1.
451-Lj 62 .
evo-
34 -'
114
132 0 Mockrash , Lo C. (1954) - "Ana1ysis of heXO~3e phos
phates and s ugar mixtures wi th the anthrone 1'83 -
gent". - J. Biol. Che m. 208 , 55-590
1 33 . Modak ,. S . (19 73 ) - comunicação pessoal o
1 , 40 Moore, A.E. e Hlinka, J. (19b8 ) - "Hartmanhe 1 a sp .
(Acanthamo eba ) as a ti ssu e culture contaminant".
J. Nat. Ca. Ins to 40, 569- 581.
1 35 0 Mous tachi, E. e Wi11iamson, DoH. (1966 ) - "Phys io-
10 g i ca1 v ari at i oyu.i in satelli te c omponents of
yeast DNA detected by densj ty gradient centrifu-
gation". - Biochem. Biophys . Res. Commun.
56- 61. ~ ,
1 36 0 Muker j ee , H. e Goldfeder , A. (19 73 ) - "Purification
and propertie s 01' ribonucleic acid p olyme rase
from rat 1iver mitochondr i a ". - Biochemistry 11., 5096-5101.
1 370 Mu1der, C. e Doty, P. (1968) - "Re s idual activity
of denatuI'~~d tr an :3forming DNA of Haemophi1us
influenzae,: natura11y o ccurin g cros s-linked
DNA" o - J. MoI. Bio1. 32 , 4 25-435 ..
138 0 Munro, HoN o e F1eck, A. (1966 ) - "The dete rmination
of nuc1 e i c ac ids ". - Methods of Biochemica1 Ana
l ys i s 14, 113-176 .
1 39 . Neff, R.J. (1957) - "Pur i f i cation, axenic cu1tiva
tion and des cription of a so il amoeba , Acantha
moe ba sp .. ". - J. Protozool. ~, 176-182 .
140. Neff, R.J. e Benton, W.F. (1962 ) - "Lo ca1ization
o f ce11u10se in the cysts of ACill1thamoeba sp. ' .
J. Protozoo1 • .2 (suppl .), 11.
141. Neff , R. J o e Nefi'. RoH . (1969 ) - '''l'he b i ochemistry
of a mo e b i c encys tm en t " o - Symp . Soc . Exp. Biol •
23, 51- 8 1 ..
115
1~ 2 o Neff, R.J.; Benton, W.F. e Neff, R.R. (1964 a) "The (~omposition of the mature cyst wall of the
n oiJ aPlup-bR ACél.:nthamo eba Rp.". - J o Cell Biol • '-'7j ()h A ~, -." .
.LLJ:1j~ Nr:. ff, H.J.; NE~ff, H.H. e 'Paylor, R.Eo (1958)
"The II1l r.ril; :i on anc.l mp!:; aboli 8m of soil amoeba
ACéJ nthamo eba ~)p .". - Physiol. Zool. 31, 73-91 ~
l/J Ll. Neff, R.tT.; Ray, S.A.; BentcHl, WoF. e' Wilborn, M.
(1964 b) - "Ind,uction of synchronous encystment
(differentiation) in Acanthamoeba sp.". - MethorÍ!3 in Ce11 Physiology 1, 55-83; Ed.: Prescott, D.M.; Academic Press, N.Y.
145. Nygaard, O.F.; · GH.tte s , 8. e Rusch, R.P. (1960)"Nucleic acid met;abolism in a slime mold with
synchrollous mitosis". - Biochim. Biophys. Acta
38 -) f r~ ~06 _, Co .• , _ .. -) •
146. page, P.C. (196?) - "Re-definition of the genus Ac anLI H{ul o é~ba wi th description of three species".
J. Pro·tozool . l LJ:, 709-724.
147. Pardue, MoL. e 'Ga11, J.G. (1969) - "Molecular hy
bridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations". - Proc. Nat. Acad.
Scio Wash~ 64, 600-604.
148. Pardue, M.L. e Gall, J.G. (1970) - "Chromosomal locali~ationo.r' mouse satelli te DNA" o - 8cience
168, 1356-1378.
149. Pardue, MoLo; Brown, D.D. e Birnstiel, M.L o (1973)-"Localization of the genes for 58 ribosomal
RNA in Xenopus laevis". - Chromosoma 42,191-20}.
150. Pardue, M.L o ; GE~rbi, 8.8.; Eckhardt, R.A. e Gal1, J.G. (1970) - "Cytological 1ocalization of DNA
complementary to ribosomal RNA in polytene chro
mo sorne s of Diptera". - Chromosoma 29, 268-290.
116
151. PRsterIlak:, J.J.; Thompson, JaE.; Sc,huI t;z. , T.M.iC'i~l e
Zachariah, K. (1970) - "A scanning ele c. '(jron mi
croscopic stud,y of t he encystment of A(~m lthamoeba
caste llanii". - Exp. Oe 11 Re s. 60 , 290- ~)()8 .
152. Patras, D. e Andujar, J.J o (1966) - "Meningoenc(-"l.Jh~
li t i s (htl" t o lIart rn annella (Acan t h a moeba)". - Am.
J. Clin. Path. 46, 226- 23) ..
153. Paul, J. (1972) - "General theory of Ghrnm n some
structure and gene a c ti vation in eukaT' 'y o t; P~J " •
Nature 238, 444-446.
154. Paul, J.; Gi1mour, R.S.; Affara, N.; Birnie , l~. ;
Harrison, P.; He11, A.; Humphries, S.; Windas s ,J.;
e Young, B. (1973) - "rp]H::J g lolJill gp-np: stl'uct ure
and expression tr• - r:o lrl i,i l 'i'inC l1 a rb oI' : ~ ,ymp. Quant.
Bio1. 38, 885-890.
155. Pavan, C. (1965) - "Nuc1eic aci d metabolism in po-
1ytene CfITOmOSOme a n d the problem of differentia
tion". - Brook Haven Symp . OIl Biol o 18, 222-241.
156. Peacock, W.J.; Brutlag, D.; Gol flring , Eo; Appels,
R.; Hinton, C~W. e Linds1ey, D.L. (19 73) - "Th e
organization of highl:9" repeated sequences in
Drosophi1a mel~,oga.!i;, é.:r c.hromo s omes". - Co1 d
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38 ; 405- L-I-16 .
157. Potte r, J.L. e Weisrnan, R.A. (1971) - "Differentia
tion :ln Acantha.moeba: !3 -glucan synthesis d"t'ing
encystment". - Biochim. Biophys. Acta 237, 65-74.
1 58 . Prescott, D.M. e Krishna Murti, G. (1973) - "ChromQ
some structure in ciliated protozoans". - 001d
Spring Harbor Sympo Quant. Biol. 38, 609-618.
159. Raizada, M.K. e Krishna Murti, C.Ro (1971) - "Chan
ges in activity of certain enzym.es of Hartmarmel
la (Culbertson strain A-I) during encystment".
J. Protozool. 18, 115-119.
117
1600 Rai zada , M. K. e Kr i shna Murti, C.R. ( 1972 a) "'llran~1for rn 8.ti on of trophic Hartmannella culbert
sOlli i nto viabl p cysts by ~yc l ic 3 ' , 5' - ade
n Of .. d .. Jl (~ rnonophO Sp!late ". - J-. Ce l l Bio l o 52, 743-
7/'8.
1.. 6 l. Rai zada , M. K. e Kr i s hna Mur ti, C.R, (1972 b)
"Synthe s i s of RN A, pro tein, ce11ulbse and muco
polysaccharide and ch él.ngps i n the chemica1 com
pos i I:; ion of RRr t marulel1a cu1bertsoni during en
cystment undel' axenic conditions". - J o Protozoo1.
19 , 691-695.
162 0 Ray, D.L. e Haye s , R.E. (1954) - "Hartmanne11a ~
tronyxi s : a new spec i es of f r ee-1iving ameba. Cy
to10gy and 1ife cy cle ". - J. Morph010 95, 159 .
163 0 Rice , N. (1971 a) - "Di ffe r en ces i n tbe DNA of
c1os e 1y re1a t ed rodent s ". - Carnegie Ins t. Wash.
Ye a r Book 12, 3hh- 369 0
164 0 Rice, N. (1971 b) - "Thermal stabi1i ty of r e as s o
cia t e d r epeated DNA fr om r odent s ". - Carnegie
I ns t. Wash. Year Book 69 , 4-72-479 0
16 5 0 Ri ce , N. e Paul, P . (1 972 ) - "Re association of
s inf,1e-copy DNA s e quences ". - Car negi e I nst. Wash .
Ye a r Book 71, 262- 264 0
166 0 Ricp, N. e Straus , N. (1972 ) - "Evo1ution of re
pe ate d s e quences in t he genus -Mus". - Carnegie
Insto Wash. Ye ar Book 71, 265- 269 .
167 . Riou, G. e Pa ol etít i, C. ( 1967) - "Preparation and
prope r t i e s of nuc l f] a r ano.. sate1li t e deoxyribonu
eleie aeid of Trypano s oma eru zi". - J. MoI. Blvl.
28 , 3T?- 382 o
168 0 Ri t os sa , Fo M. (1972 ) - "Proeedur e fo r magnifieation
o f l ethal de l eetions of genes f or ribos oma1 RNA".
Nature New Biol. 240 , 109-1110
118
1Gge Ritossa, F.M. e Spie ge lman, S . (1965) - "Lo ca1i 7,ation of DNA complementary to ribosoma1 RNA in
the nuc1eo1us orgRni7.,er region of Drosophi1a me-
1anogas ter ll .. - Proc. NA.t . Acad . Rei. Wash . .22.,
737-745 .
170. Rosenkranz, H.S. e Carden 111, G.A. (1967) - "A non-nuc1eotido p01ymer found in the DNA of the
sand-d011ar Echinarachnius parma. I. I s o1ation ll.
Cana J. Bio chem.45 , 267-279 .
171. Roti Roti, L.W. e Stevens , A.H. (973) - 11 DNA
synthesis in growth and differentiation of Acallthamoeba caste11anii : effects of f1uorodeox;vuri-dine 11. - Fed. Proc. 32 , 616 ( abst .).
172 . Rozijn, Th. H. e Tonino, G.J.M. (1964) - Study on the yeast nuc1eus. I. The is01ation of nuclei".
Biochirn. Biophys~ Acta 91, 105-112 .
173. Hudick, V.L. (1971) - "Re1ationships between nuc1eic acid synthetic patterns and encys tment in
aging unagitated cu1tlITeS of Acanthamoeba
te11anii". - J. Ce11 Bi01. L~9, 498-506 .
cas-
174. Rudick, V.I,. e Weisman, R.A. (1973 a) - IIDNA-depeg dent RNA p01ymerase from trophozoytes and cysts
of Acanthamo eba caste11anii". - Biochirn. Biophys.
Acta 299, 91-102.
175.Rudick, V.L. e Weismàn, R.A. (1973 b) - "Effect of cyc10heximide on RNA p01ymerase specific activi
ty and encystment in Acanthamoeba caste11anii".
Nature 244, 220-222.
176 0 Rudkin, G.T. (1969) - "Non-rep1icating DNA in Dro.
sophi1a". - Genetics (Supp1.) 61, 227-238.
1770 Sager, R. (1972) - "Cytop1asmic genes and orga-1
ne11es".; Acadernic Press, N.Y.
178. Schneider, W.C. e Rogeboom, G.R. (1950) - "Intra -ce11u1ar distribution of enzymes. V. Further
studies on the distribution of cytochrorne C in
rat live r homogenate" . - J. Biol. Chemo 183,123-128 0
11()
l '/'L : ;"i nl': , HoN. (l()LI()) - II/]'he efr'ect of ar t ificial fer
(; j Ji. Z(~l'~,) A.llcl dUJlg OH t lte numbers of a moebae in
Ro t; h ({mf~ ted. soil s ". - ,J o Genn Mi crobiol" 3, 20't-
210 .
180 . Sing , B.N. (1952 ) - "Nuclear division in nine spe
cies of small free~living amoebae and its bea
ring on the classification of the order Âmoebi -
da". - Phil. Trans. Roy. Soe. Lond. B 236, 405-
461 0
181~ Skinner, D.M. e Kerr, M.S. (1971) - "Characteriza
tion of mitochondrial and nuclear satellite deo
xyribonucleic acid.s of five species of crustacea". Biochemistry 10, 1864-1872.
182. Soldo, A.T. e Godoy, G.A. (1973) " Molecular
complexity of Paramecium symbiont "Lambda DNA
evidence for the presence of a multiple copy ge
nome". - J. MoI. Biol. 22, 93-108.
183. Sorsa, V.; Green, M.M. e Beerman, W. (1973) - "Cytogenetic fine structure and chromosomal 10cali
zation of the white gene in Drosophila melanogas
ter". - Nature New Biol. 245; 34-37.
184. Southern, E.M. (1970) - "Base sequence and evolu .
tion of guinea-pig Cl -satelli te DNA". - Nature
227, 794-798.
185. Southern, E.M. e Roizes, G. (1973) - "The action
of a re s triction endonuclease on higher organism
DNA". - Cold Spring Harbor Symp. Quant o Biol. 38,
4 29--433.
186 . Stark, JoRo (1966 ) - "Some aspect s of carbohydrate
metabolism in Hartmannella cas tellanii". - Biocherr
J. 100, 24-25 P.
1870 Steffen~, en, D.M. e Wimb er, D.Eo (1971) - "Localizat ion of tRNA genes in the salivary chromosome s of
Dros ophila by RNA-DNA hybrit'l.ization" o - Genetics
6 () , 163-178.
120
188~ Stevens, A.R. e Pach1er, P.F. (19 73 a) - "RNA S;Y'11.
thesie ând turnover durlng density-inhibited
growth and encystment of Acanthamoeba caste11a
nii". - J. Ce]l Bio1. 57, 525-537.
189. Stevens, A,R. e Pach1er, P.F. (1973 b) - "RNA syn
thesis in density-inhibited growth and differen
tiàtion of Acanthamoeba". -. Fed. Proc. 32, 616
(abst.).
19O. Stevenson, I. (1967) - "A method for the iso1at i on
of ma<:ronuc1ei from Parame ci um a ur e Li a " J.
Proto zoo1. 14, 412-414.
191. Studier, F.W. (1965 ) - "Sedimentation s tudie s of
the size and shape of DNA". - J. Mol. BicH.
373-390.
11;
192 . Sutton. W.D. e McCa11um, M. (1971) ·- "Mismatching
anO. reassociation 1'ate of mous e sate11ite UNA". -
Nature New Bio1. ~~32, 83-85 o
193 0 Swift, H. (1973) - ('The organi zation of genetic
material in eucaryotes: .progress and prospects".
Gold Spring Harbor Symp. Quant. Bio1o 38, 963-
979.
194 . Tautvydas, K •. tT. (1971) - "Masp isolated ameba nu
c1ei. I. 1r:;olation proced.ur~~ and determi nation 01'
.macroITlo1 ecu1ar composition anO. RNA polymerase
activity". - Exp. Ce11. Res. 68, 299-308.
195. Thomas , C.A., Jr. (1970) - tl'I'he theory of the mas-
ter gene". - The Neurosciences: Second study
program, p. 973; ed.: Schmitt, F.O.; The Rocke
fe11er Univ. Press, N.Y.
196 . Thomas, C.A., Jr.; Hamkalo, B.A.; Mi sra , D.N. e
Le e , o. s . (1970) - "Cyc1izat i Ol I of e ukariotic
ele oxyri bonucle i c acid fragrneni;~3 ". - tI. MoI . Eiol.
51, 621-632 .
121
197. Thomas, C.A o , Jro; Pyeritz, R.E.; Wilson, D. A.;
Daneis, B.M.; Lee, C.S.; Bick,. M.Do; Huang,H.L.; e Zimm, B.H. (1973) -"Cyclodromes and palindro ... mes in chromosomes 11. - Cold Spring Harbor SymP.
Quant. Biol. 2§, 353-370.
198. Thrower, K.J. e Peacocke, A.R. (1968) - "Kinetic and spectrophotometric studies on the renatura
rion of DNA". - Biochem. J. 10<), 543-557.
199. Tomlinson, G. (1967) - "The glyoxylate ·pathway in
Acanthamoeba Sp". - J. Protozool. 14, 114-116.
200. Tomlinson, G. ~ Jones. E.A. (1962) - IIIsolation of cellulose from the cyst walls af a soil
ameba". - Biochim. Biophys. Acta 63, 194-200.
201. Upadhyay, J.M. (1968) - I'Growth and bacteriolytic activity of a soil amoeba Hartmannella glebae".
J. Bacteriol. 95, 771-774.
202. Vickerman, K. (1962) - "Patterns of cellular organization in Limax amOebê:l.8. An electron micros
copie study". - Exp. Cell Res. 26, 497-519.
203. Vinograd, J. e Hearst, J.E. (1962) - "Equilibrium sedimentation of macromolecules and viruses in a density gradient". - Fortschr. Chem. Org. Natstoffe 20, 372-420.
204. Volkonsky, M. (1931) - "Hartmannella castellanii Douglas et classification des Hartmannelles". -
Arch. Zool. Exp. Gén. zg, 317-339.
205. Walker, P.M.B. (1971) - "Repetitive , DNA in hi-gher organi@ms". - Progr. Biophys. Mol. Biol.
23, 145-190.
206. Wang, S.S. e Feldman, HoA. (1961) - "0currence of Acanthamoeba in ti~sue cultures inoculated with human pharyngeal .swabs". - Antimicrob. Agents Chemother. 1, 50-53.
1 ')" Lé.
207. Waring , M. e Britten, R.J. (lC)h6 ) - "Nuc leotide
8equel l(~ e repe ti tiOll. A rapidl;y reass oci ating
fract,ion of mouse DNA". - Scien08 1 54 , 791-
793.
208 . Wei smrul, R.A. e Moore, M.O. (1 ')6' )) - "Bead up
take as a tool for studying diffe~entiation in
Acanthamoeba". - Exp. Oe1] Res. 54, 17-22.
209. Weisman, R.A.; Spiegel, R.S. e McOauley , J. G.
(1970) - "Differentiat ion in Acanthamoeba:gly
cogen leveIs and glycogen s h;ynthe t8BP activity
during encystment"o - Bioehint. Biophys. Acta
201, 45-53.
210. Wells, R. e BirnstieJ, M.L. (1969) - "Kinetic cQlt1
plexity of chlorop1astal DNA and mitochondrial
DNA from higher plants"o - Bloehem. J. 11~ ,777-
786.
211. We11s. R. e 8ager, R. (1971) - II-Denaturation and
the renaturation kinetics of chloroplast DNA
from Chlamydomonas reinhardi". - J. MoI. Biol.
58, 611-622.
212. Wetmur, JoGo (1967) - "Studies on thekinetics of
renaturation of DNA". - Tese de Ph.Do , Califr
Inst. of Technology, California.
2130 Wetmur, J.G. e Davidson, N. (1968) "Kinetics
0:6 renaturation of DNA". - J. MoI. Biol. 31,
349-370.
214. Wimber, D.E. e Steffensen! DoM. (1970) - "Locali
zation of 58 RNA genes on Drosophila chromosomes
by RNA-DNA hybridization". - Science 170, 639-
6LJ 1.
21 7 . Yasmineh , W.G. e Yunis, <ToJ . (1970) - "Localiza ~
tion of mous e satellite DNA in constitutive he
terocbromatin ". - Exp. Oell Re s . 59 , 69-75.