Post on 07-Feb-2020
IBMR – LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES
Letícia Lopes Cabral Guimarães da Fonseca
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA CLÁSSICA E
MOLECULAR (FISH) EM PACIENTES COM SUSPEITA
CLÍNICA DE SÍNDROME DE PRADER-WILLI
Rio de Janeiro
2017
1
LETÍCIA LOPES CABRAL GUIMARÃES DA FONSECA
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA CLÁSSICA E
MOLECULAR (FISH) EM PACIENTES COM SUSPEITA
CLÍNICA DE SÍNDROME DE PRADER-WILLI
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
Curso de Biomedicina da IBMR/Laureate
International Universities, como parte dos
requisitos para obtenção do Título de Bacharel
em Biomedicina
Orientadora: Dra. Elenice Ferreira Bastos
Orientador: Dr. Maurício Cupello Peixoto
Rio de Janeiro
2017
2
LETÍCIA LOPES CABRAL GUIMARÃES DA FONSECA
CARACTERIZAÇÃO CITOGENÉTICA CLÁSSICA E
MOLECULAR (FISH) EM PACIENTES COM SUSPEITA
CLÍNICA DE SÍNDROME DE PRADER-WILLI
Trabalho de Conclusão de Curso
apresentado como requisito para obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina do Instituto
Brasileiro de Medicina de Reabilitação – Uni-
IBMR.
Aprovada em: 16 de Novembro de 2017
BANCA EXAMINADORA
Profª. Glaucia Vilar Pereira
Prof. César Carriço da Silva
3
Aos meus pais, Leila e Lenilson, por todos os
sacrifícios que fizeram por mim e ainda fazem,
desde antes de saberem da minha existência e
por me apoiarem em todos os momentos;
Ao meu irmão Leoni, que por mais que eu o
perturbasse, como uma boa irmã deve fazer,
sempre se mostrou muito orgulhoso das
minhas conquistas e abriu mão do que queria
para me ajudar, como um irmão maravilhoso
deve ser;
À minha filha Leila, que é o maior presente
que poderia receber e que, embora não
compreenda agora, me deu forças para seguir
em frente.
4
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Elenice, que me forneceu grande conhecimento, não somente no
campo da citogenética e soube me ensinar com muita paciência, mesmo quando apliquei a
técnica de bandeamento GTG em várias lâminas sem analisar se o tempo de tripsina estava
bom, em um dos primeiros dias do estágio.
Ao meu orientador Maurício, que eu apelidei carinhosamente de Malévolo, por ter
aceitado me orientar mesmo tendo 1001 funções na instituição e fora dela, sempre me
ajudando e me acalmando quando eu achava que não daria tempo de entregar no prazo ou
como deveriam ser aplicadas algumas regras no trabalho de conclusão de curso.
Aos meus colegas do Instituto Fernandes Figueira Carlos (que me ajudou demais,
tanto no laboratório, quanto fora dele), Ingrid (que embora eu tenha convivido pouco tempo,
se tornou uma ótima amiga), Vera (por quem tenho um carinho muito grande), Lúcia (que
sempre me ajudava quando eu precisava), Anna (que sempre me ofereceu ajuda e me fez
sentir melhor, mostrando que posso ser biomédica e mãe mesmo estando longe da prole), Cris
(com quem não convivi muito, mas que também sempre se colocou à disposição quando eu
precisasse), Leo (com quem tive o prazer de trabalhar, mesmo indiretamente, uma vez que
meu TCC está relacionado ao seu projeto), a Dra. Letícia Guida pela oportunidade de
participar do projeto de Prader e Dr. Juan Llerena (que, por mais que eu não tivesse tanto
contato, fez com que eu tivesse mais confiança quanto ao meu conhecimento).
5
Do or do not. There is no try. (YODA, 1980)
6
RESUMO
A Síndrome de Prader-Willi (SPW) é uma doença genética multisitêmica caracterizada
por hipotonia infantil, obesidade, mãos e pés pequenos, criptorquidismo, hiperfagia,
envolvida com obesidade mórbida e déficit intelectual ocasionalmente. É causada por
alterações epigenéticas envolvendo a região 15q11.2 que leva à ausência da expressão gênica
do cromossomo paterno. Essas alterações podem ser consequências de pequenas ou grandes
deleções da região 1511.2-q13 do cromossomo paterno, dissomia uniparental materna ou
mutações monogênicas do centro de imprinting (CI). Apesar de possuir uma característica
clínica sugestiva, o diagnóstico genético é essencial. Atualmente, diferentes metodologias têm
sido aplicadas, a partir da Citogenética clássica (convencional e bandeamento GTG de alta
resolução), técnica de Hibridização in situ por fluorescência (FISH) utilizando sondas de
regiões específicas, assim como técnicas genômicas como Amplificação Multiplex de Sondas
Dependente de Ligação (MLPA), e métodos moleculares para detecção de alterações no
centro de imprinting. Todavia, nem todas as metodologias estão disponíveis nos centros
diagnósticos, especialmente do Sistema Público de Saúde (SUS). Identificar o impacto da
análise citogenética no diagnóstico dos pacientes encaminhados por suspeita clínica da
síndrome de Prader Willi no âmbito do SUS. Todos os 30 pacientes foram clinicamente
avaliados e encaminhados ao Departamento de Genética Médica (IFF/FIOCRUZ). Amostras
de sangue periférico foram enviadas para estudo de Citogenética clássica (bandeamento GTG)
e FISH (com as sondas SNRPN e/ou GABRB3), de acordo com os protocolos apropriados. O
cariótipo final foi estabelecido de acordo com o ISCN, 2016. A extração de DNA e estudo de
metilação foram feitos de acordo com o padrão. De todas as amostras investigadas, a análise
do bandeamento GTG foi feita 27 delas. Quatro apresentaram padrão sugestivo de deleção,
que foi confirmado por FISH, além de mais um detectado por esta técnica, considerando o
nível de resolução observado. Dezesseis casos foram simultaneamente avaliados pelas
técnicas GTG, FISH e análise de metilação. O estudo de metilação diagnosticou 43,75% dos
casos, sendo que 71,43% destes casos forem identificados por FISH como causadas por
deleção, próximo do número encontrado na literatura, em que a deleção pode ocorrer em 75%
dos casos. A análise citogenética obteve um pequeno impacto na identificação da etiologia da
SPW, corroborando para a existência de evento epigenético como a causa etiológica mais
provável.
Palavras-chave: SÍNDROME DE PRADER-WILLI. FISH. DIAGNOSTICO. IMPRINTING
GENÔMICO.
7
ABSTRACT
Prader-Willi Syndrome (PWS) is a multisystemic genetic disease characterized by
childhood hypotonia, obesity, small hands and feet, cryptorchidism, hyperphagia, evolving to
morbid obesity and occasionally intellectual deficit. It is caused by epigenetic changes
involving 15q11.2 region that lead to absence of gene expression of paternal genetic
contribution. These changes can be consequence of small or large deletions at 15q11.2-q13
region of paternal chromosome, maternal uniparental disomy or monogenic mutations at the
imprinting center (IC). Despite having a suggestive clinical characterization, genetic diagnosis
is essential. Nowadays, different methodologies have been applied, from classical cytogenetic
(conventional and high resolution GTG banding), Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
technique using region-specific probes, as well as genomic techniques such as Multiplex
ligation-dependent probe amplification (MLPA), and molecular methods for detection of
imprinting genomic defects. However, not all methodologies are available in the main
diagnostic centers, especially those linked to public health system. This study aims were
identify the cytogenetics analysis impact on the pacient’s diagnosis whom were forwarded by
SUS about PWS clinical suspect. All the 30 patients were clinically evaluated and followed
up at the Medical Genetics Department (IFF/FIOCRUZ). Peripheral blood samples were sent
to perform the classical cytogenetic study (GTG banding) and FISH (with SNRPN and/or
GABRB3 probes), according to appropriate protocols. The final karyotype is established
according to ISCN, 2016. The DNA extraction and methylation study were performed by
pattern. From the total of investigated samples, the GTG analysis was performed in 27 of
them. Four presented a pattern suggestive of deletion, which were confirmed by FISH, and
one more case identified by this technique, considering the level of resolution observed.
Sixteen cases were simultaneously evaluated by, GTG, FISH and methylation techniques. The
methylation study confirmed the diagnosis in 43,75% of the cases, 71,43% of those cases was
identified by FISH as a deletion cause, close to the number finded on the literature, this
detection can reach 75%. The cytogenetics analysis got a small impact on PWS etiology
identification, contributing to the existence of an epigenetic event as the more probable
etiological cause.
Keywords: PRADER-WILLI SYNDROME. FISH. DIAGNOSTIC. GENOMIC
IMPRINTING
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1.Esquema das técnicas de obtenção de cromossomos e coloração....................... 14
Figura 2.Esquema da sonda utilizada para FISH –Sonda SNRPN.................................... 24
Figura 3.Esquema da sonda utilizada para FISH –Sonda UBEA3A................................. 24
Figura 4.Análise de bandeamento GTG apresentando região 15q11. 2 normal................ 27
Figura 5.Análise em alta definição sugerindo deleção da região 15q11. 2 l..................... 28
Figura 6.Análise de FISH normal...................................................................................... 28
Figura 7.Análise de FISH deleção..................................................................................... 29
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Casos investigados pelas técnicas de bandeamento GTG e FISH........................ 27
Tabela 2. Casos investigados pelas técnicas de citogenética bandeamento GTG e FISH,
e pelas técnicas de metilação PCR e HRM.
31
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CGH – Do inglês Comparative genomic hybridization - Hibridização genômica comparativa
DNA – Do inglês desoxyribonucleic acid - Ácido desoxirribonicleico
FISH – Do inglês Fluorescent in situ hibridization - Hibridização in situ por fluorescência
HRM – Do inglês High Resolution Melting - Análise da curva de dissociação em alta
resolução.
ISCN – Do inglês International System for Human Cytogenomic Nomenclature - Sistema
internacional de nomenclatura para a citogen humana
Mb – Megabases
MLPA – Do inglês Multiplex ligation-dependent probe amplification - Multiplex de sonda
dependente de ligação
MS-MLPA – Do inglês Methylation-specific multiplex ligation-dependent probe
amplification - Multiplex de sonda dependente de ligação sensível a metilação
PCR – Do inglês Polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase
SA – Síndrome de Angelman
SPW – Síndrome de Prader-Willi
SUS – Sistema Único de Saúde
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 12
1.1 CITOGENÉTICA CLÁSSICA ................................................................................ 12
1.2 CITOGENÉTICA MOLECULAR............................................................................ 15
1.2.1 Hibridização In Situ por Fluorescência - FISH................................................. 15
1.3 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS..................................................................... 16
1.3.1 Alterações numéricas .......................................................................................... 16
1.3.2 Alterações estruturais ......................................................................................... 16
1.4 SÍNDROME DE PRADER-WILLI ........................................................................ 17
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 20
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 20
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 20
3 METODOLOGIA ..................................................................................................... 21
3.1 TÉCNICA DE OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS METAFÁSICOS ................. 21
3.2 OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS PROMETAFÁSICOS A PARTIR DE
SANGUE PERIFÉRICO
22
3.2.1 Implante das culturas .......................................................................................... 22
3.2.2 Término das culturas .......................................................................................... 22
3.3 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS ........................................................................... 22
3.4 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTO ........................................... 23
3.4.1 Técnica de bandeamento GTG ........................................................................... 23
3.5 ANÁLISE CROMOSSÔMICA CLÁSSICA............................................................ 23
3.6 TÉCNICA DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU POR FLUORESCÊNCIA (FISH) ....... 23
4 RESULTADOS .......................................................................................................... 26
5 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 30
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 33
REFERÊNCIAS........................................................................................................... 34
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 CITOGENÉTICA CLÁSSICA
A primeira descrição de estruturas parecidas com núcleo foi feita sobre células vegetais
em 1840 pelo botânico Nageli, recebendo o nome de “citoblastos transitórios”, posteriormente
sendo compreendidas como cromossomos (Hare e Singh, 1979). Porém, as primeiras imagens
de cromossomos humanos foram publicadas em 1882 pelo citologista Flemming, que também
denominou a porção corável do núcleo como cromatina e foi o primeiro a utilizar o termo
mitose para o processo de divisão celular (Maluf e Riegel, 2011).
Em 1888, uma técnica de coloração foi desenvolvida por Waldeyer, permitindo que
estruturas fossem melhor caracterizadas, sendo denominadas como cromossomos, além disso,
foi nessa época que muitos cientistas começaram a cogitar a possibilidade de que os
cromossomos transportam os determinantes da hereditariedade. Por volta do ano de 1900,
Sutton (e Boveri de forma independente) desenvolveram a teoria cromossômica da herança e
denominou o estudo dos cromossomos como citogenética. Depois disso, vários estudos foram
feitos em relação aos cromossomos e a quantidade que a espécie humana possui. Alguns
desses estudos tiveram resultados não condizentes com a realidade, como os que apresentaram
que os humanos, caracterizados como normais, possuem 48 cromossomos. Porém, esses
resultados puderam ser corrigidos, por volta de 1952, depois que foi percebido por Hsu que as
metáfases ficam mais espalhadas quando são lavadas com uma solução hipotônica antes do
processo de fixação, e não com uma solução isotônica como era feito até então. Isso se dá,
pois, devido ao processo de osmose que faz com que as membranas celulares aumentem e os
cromossomos sejam separados, facilitando sua visualização. Em 1955, Ford e Hamerton
modificam a parte do pré-tratamento celular desta técnica, tratando-as com colchicina para
que ocorresse o bloqueio do fuso mitótico, fazendo com que as células permanecessem na
metáfase mitótica. Em janeiro de 1956, Tijo, que havia feito estágio no laboratório de Ford e
Hamerton, juntamente com Levan otimizaram o método colchicina/hipotônica e expuseram
que a espécie humana possui 23 pares de cromossomos, o que foi confirmado por Ford e
Hamerton posteriormente (Maluf e Riegel, 2011).
Devido tais descobertas, um protocolo de cultura celular foi estabelecido, utilizando
leucócitos em mitose, obtidos a partir do sangue periférico, apresentando cromossomos
metafásicos ou prometafásicos (Moorhead et al, 1960 e Sharkey et al, 2005). O material passa
por tratamentos, cultura celular, até que as células cheguem à fase de divisão celular desejada,
13
para que seja empregada a técnica de bandeamento que cora os cromossomos (Figura 1)
(Borges-Osório e Robinson, 2013)
Algumas técnicas de bandeamento para identificação de cromossomos podem ser
empregadas, como: Bandeamento QFQ, que utiliza a quinacrina mostarda ou compostos
relacionados, padrão de bandas R, em que os cromossomos recebem um tratamento especial
antes do processo de coloração e apresentam um padrão de banda contrário ao de bandas Q,
padrão de bandas C, que cora a região do centrômero de cada cromossomo e de outras regiões
que possuem a heterocromatina constitutiva (Nussbaum, et al, 2009), padrão de banda NOR,
em que as regiões organizadoras de nucléolos são coradas e a padrão de bandas G ou
bandeamento GTG (Bandeamento G combinado com Tripsina e Giemsa), que utiliza a
tripsina, para que ocorra da desnaturação das proteínas do cromossomo e Giemsa, que fará
com que os cromossomos apresentem bandas claras, que possuem as bases nitrogenadas
guanina e citosina e são pouco condensadas, e escuras, que possuem timina e adenina e são
mais condensadas. A técnica de bandeamento GTG é considerada padrão ouro para a análise
citogenética clássica de rotina, pois faz com que as bandas do cromossomo fiquem mais
visíveis, para que seja feita a identificação do cromossomo e as possíveis alterações que
podem ocorrer (Regateiro, 2007 apud. Rossetto, 2015), sendo utilizada na maioria dos
laboratórios do mundo. Posteriormente o material é analisado ao microscópio e algumas
metáfases são selecionadas para a montagem do cariograma (cariótipo) (Figura 1) (Borges-
Osório e Robinson, 2013). Esta técnica avaliativa possui a resolução em torno de 3-5 Mb de
DNA dependendo do método utilizado (Sharkey et al, 2005).
14
Figura 1 – Esquema das técnicas de obtenção de cromossomos e coloração. (a) cultura celular; (b)
separação; (c) preparação da lâmina; (d) coloração; (e) bandeamento e análise. Fonte: Adaptado de
Genética Humana 3ª edição
15
1.2 CITOGENÉTICA MOLECULAR
O desenvolvimento das técnicas de bandeamento cromossômico (citogenética clássica)
possibilitou a identificação de anomalias cromossômicas estruturais como deleções,
duplicações, inversões e translocações, entretanto, para alterações menores que 5Mb (Liehr,
2008 e Smith & Hung, 2017) é necessário que técnicas mais sensíveis sejam empregadas,
como a técnica de Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH) (Liehr, 2008).
1.2.1 Hibridização In Situ por Fluorescência – FISH
Muitas técnicas de histoquímica foram desenvolvidas ao longo do tempo, contudo eram
utilizados vários tipos de corantes naturais que possuíam afinidade para diversas moléculas,
dificultando assim a diferenciação das estruturas. Contudo, no início da década de 1940, os
anticorpos foram combinados com fluorocromos permanecendo com a especificidade de
ligação ao epítopo, sendo possível detectar moléculas específicas durante a interação de
antígeno e anticorpo (Levsky e Singer, 2003).
Por volta de 1960, ocorreram as primeiras hibridações in situ, porém não eram
fluorescentes, e utilizavam sondas marcadas com radioisótopos (Levsky e Singer, 2003). No
final da década de sessenta, Joe Gall e Mary-Lou Pardue publicaram o primeiro trabalho
relacionado à hibridização in situ, descrevendo a hibridização de sondas de RNA no DNA de
células (Joe Gall e Mary-Lou Pardue, 1969 apud. Beesley, 2001). Aproximadamente sete anos
mais tarde, foi feita a primeira detecção relacionada à fluorescência dependente de anticorpos
de híbridos de ácido nucleico, sendo substituída logo depois por sondas de ácido nucleico
fluorescente (Levsky e Singer, 2003).
Em 1980, foi demonstrado que sequência de cópia única de genes individuais podem ser
detectados por hibridização in situ. Além disso, técnicas de sondas de DNA não radioativas
ganharam destaque. Mesmo assim, métodos que utilizavam químicos como
acetilaminofluorescência ou mercúrio, independentemente de não serem radioativos, eram
considerados perigosos. Já em 1986 um estudo demonstrou uma sinalização não isotópica
com biotina (uma substância mais segura) hibridizando a sonda no cromossomo humano e
detectada por marcação fluorescente. Tal técnica recebeu o nome de Hibridização In Situ por
Fluorescência (FISH – Fluorescent in situ hibridization) (Beesley, 2001).
A técnica FISH pode ser considerada como o avanço mais significativo da citogenética
clínica. Utilizando fragmentos de DNA incorporados a nucleotídeos acoplados a corantes
16
fluorescentes como sonda e expondo-os à luz ultravioleta para a visualização do material
presente na lâmina, o FISH tem como objetivo identificar alguma alteração envolvendo
determinada região de um cromossomo específico (Gersen e Keagle, 2008). Com isso, esta
técnica tem sido cada vez mais aplicada na rotina laboratorial, uma vez que pode ser utilizada
a diversas situações, desde aberrações complexas a estudos de células interfásicas. (Smeets,
2004).
1.3 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS
Para um desenvolvimento correto, é necessário que o número e estrutura dos
cromossomos estejam normais, uma vez que qualquer alteração nestes dois fatores pode
alterar a expressão gênica, já que os genes estão contidos nos cromossomos, dando origem a
um indivíduo anormal ou fenotipicamente inviável (Maluf e Riegel, 2011).
1.3.1 Alterações numéricas
Cariótipos que possuem a quantidade de cromossomos tanto maiores quanto menores
que 46 cromossomos recebem o nome de heteroplóide. Caso essa alteração seja um múltiplo
exato do número haploide de cromossomos, pode implicar em efeitos graves no indivíduo,
pois cada cromossomo possui vários genes. Seguindo este raciocínio, é possível compreender
que poucas alterações numéricas são compatíveis com a vida, se ocorrerem em todas as
células (Maluf e Riegel, 2011).
1.3.2 Alterações estruturais
As alterações que envolvem a estrutura do cromossomo podem ser divididas em
balanceadas e não balanceadas. As alterações balanceadas são as que não interferem na
quantidade de material genético, ou seja, não ocorrem perda nem ganho, havendo somente
uma redistribuição do material por quebra ou rearranjo (Maluf e Riegel, 2011).
Dentro do grupo de alterações balanceadas é possível encontrar a inserção (segmento
cromossômico encontrado em outro cromossomo), translocação recíproca (segmento
cromossômico substituído por um segmento de outro cromossomo), translocação
robertsoniana (dois cromossomos acrocêntricos perdem o braço curto e seus centrômeros se
unem ligando os braços longos), translocação de braço inteiro (as quebras ocorrem no
17
centrômero, assim tornando possível a ligação do braço curto de um cromossomo com o braço
longo de outro ou a ligação entre dois braços curtos ou dois braços longos), translocação
complexa (similar a translocação recíproca, entretanto envolvendo três cromossomos ou
mais), inversão paracêntrica (duas quebras no mesmo braço do cromossomo e a parte inicial
do segmento troca de lugar com a final, fazendo com que haja uma rotação de 180º), inversão
pericêntrica (duas quebras e uma rotação de 180º do segmento cromossômico, porém as
quebras estão em braços diferentes, fazendo com que a posição do centrômero seja alterada,
entre outras alterações) entre outras alterações (Maluf e Riegel, 2011).
Quanto às alterações não balanceadas, o indivíduo apresenta maior ou menor quantidade
de material genético. Entre as causas podemos encontrar duplicação (um segmento
cromossômico é visto duas vezes no mesmo cromossomo), isocromossomo (um dos braços do
cromossomo não está presente e existe a duplicação do outro), anel cromossômico (ocorre
uma quebra no braço curto e outra no braço longo do cromossomo, passando a não existir as
porções terminais, assim as extremidades se ligam fazendo com que o cromossomo passe a
ter uma forma circular) e deleção (o cromossomo perde um segmento de material genético)
(Maluf, Riegel, 2011), e é a causa da síndrome estudada neste trabalho.
1.5 SÍDROME DE PRADER-WILLI
A Síndrome de Prader-Willi (SPW), que possui a incidência de 1:15.000 e prevalência
de 60:1.000.000 (Damiani, 2008) é uma doença genética que se apresenta de forma
multissistêmica (Cassidy et al, 1997) descrita pela primeira vez em 1956 pelos cientistas
suíços Prader, Labhart e Willi (Prader et al, 1956). Esta síndrome foi a primeira a ser
relacionada ao imprinting genômico e causada por uma falha em determinada região do
cromossomo 15 de origem paterna (Donaldson et al, 1994) ou dissomia uniparental materna
(Kim et al, 2016). É possível identificar o cromossomo e a região em que ocorre a mutação
devido ao padrão de bandas que o cromossomo em questão possui (Alberts, 2010), neste
trabalho foi utilizada a técnica de bandeamento GTG. No caso da SPW, a alteração ocorre na
sub-banda 13, da banda 1, da região 1, do braço longo (q) do cromossomo 15 (15q11-13)
(Angulo et al, 2016).
Em torno de 70% de pessoas com Síndrome de Prader-Willi possuem deleção na
região 15q11. 2-13 no cromossomo paterno, 25% apresentam dissomia uniparental materna,
menos de 5% tem uma alteração na sequência do centro de imprinting, e menos de 1% possui
um rearranjo estrutural cromossômico envolvendo a região 15q11.2-13 (Cassidy et al, 1997).
18
Este rearranjo estrutural relaciona-se também a uma outra síndrome, conhecida por Síndrome
de Angelman (SA), condição esta que é clinicamente distinta da SPW mas que, juntamente
com esta, foi essencial para os primeiros estudos relacionados ao mecanismo genético de
impressão (imprinting) genômica, a partir da descrição de genes (locados em 15q11.2-13) que
possuem expressão monoalélica e cujas ausências determinam o fenótipo clínico dependendo
da origem parental (Pina-Neto et al, 1997).
O imprinting genômico está relacionado à origem parental dos cromossomos e os
padrões de expressão diferencial, não ocorrendo alteração nas sequências de base do DNA. Os
genes que sofrem o imprinting possuem o alelo silenciado, ou seja, somente um alelo passa a
ser expresso. As síndromes de Prader-Willi e Angelman estão relacionadas ao imprinting
genômico, uma vez que estudos feitos em pacientes que apresentam estas síndromes tendo
como causa dissomia uniparental apresentam o gene silenciado pelo imprinting, não
ocorrendo a expressão gênica, levando a crer que a expressão estaria relacionada ao gene
ausente (Fridman et al, 1997, Maris & Trott, 2011).
O diagnóstico desta síndrome baseia-se em aspectos clínicos que mudam de acordo com
a idade do indivíduo, como hipotonia que costuma ocorrer durante a infância e deficiência no
desenvolvimento na adolescência e fase adulta (Holm, et al, 1993). Os principais sintomas da
Síndrome de Prader-Willi são letargia infantil, deficiência no crescimento, hipogonadismo,
aparência facial característica, hiperfagia podendo causar obesidade mórbida, se não
controlada, baixa estatura, fenótipo comportamental típico (Cassidy, et al, 2008), saliva
espessa, aumento da razão circunferência cabeça / tórax, genitália pouco desenvolvida tanto
em homens quanto em mulheres, criptorquidia frequente no caso masculino, mãos e pés
pequenos, lábio superior fino, boca voltada para baixo (Butler, et al, 2006). Quanto às
características endócrinas, os indivíduos apresentam baixa resposta do hormônio de
crescimento (hr GH) em testes de estimulação (Cassidy et al, 1997, Partsch, et al, 2000),
deficiência na secreção das gonadotrofinas LH e FSH e esteroides sexuais gonadais (Cassidy
et al, 2012), proteína-3 de ligação ao fator de crescimento IGF baixo (Talebizadeh & Butler,
2005.) e fator de crescimento insulina-like (IGF)-I baixo (Cassidy et al, 1997, Partsch et al,
2000).
A utilização do hormônio de crescimento (hr GH) nas crianças com SPW faz com que
ocorra a mudança da composição corpórea, a melhora da atividade física e da qualidade de
homocisteina. Porém é necessária uma avaliação da apneia do sono e permeabilidade das vias
aéreas, uma vez que o tratamento com hr GH pode fazer com que o padrão respiratório piore.
(Damiani, 2008). Para que o tratamento seja feito corretamente, o diagnóstico deve ser
19
complementado através do estudo dos cromossomos dos indivíduos (Damiani, 2008),
utilizando técnicas de citogenética como bandeamento GTG (Seabright, 1971) e técnica de
Hibridização In Situ por Fluorescência (FISH) (Bauman, et al, 1980), além de técnicas
moleculares baseadas em reação em cadeia da polimerase (PCR) como: hibridização
genômica comparativa (CGH), análise de microarranjos (microarray) e Amplificação
Multiplex de Sondas Dependente de Ligação (MLPA) sensível a metilação (MS-MLPA)
(Smith e Hung, 2017).
20
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Identificar o impacto da análise citogenética no diagnóstico dos pacientes
encaminhados por suspeita clínica da síndrome de Prader Willi no âmbito do SUS.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Caracterizar através da citogenética clássica todos os casos encaminhados por suspeita
clínica de SPW;
Aplicar a técnica FISH para caracterização de possíveis micro deleções e/ou outras
eventuais alterações crípticas envolvendo a região 15q11-13;
Traçar um perfil citogenético dos pacientes encaminhados por suspeita clínica das
síndromes de Prader-Willi.
21
3 METODOLOGIA
Todos os 30 casos investigados estão cadastrados e acompanhados pela equipe médica
coordenada pelo Dr. Juan Clinton Lleren Jr. no Ambulatório de Genética Médica do Instituto
Fernandes Figueira (IFF) –Fiocruz.
Este trabalho faz parte de um projeto intitulado “O PAPEL DO HORMÔNIO DO
CRESCIMENTO NA SÍNDROME DE PRADER-WILLI: ESTUDO DA REGULAÇÃO DA
EXPRESSÃO DE GH ATRAVÉS DA ESTRATÉGIA CRISPR/CAS9, RASTREAMENTO
NEONATAL E DIAGNÓSTICO MOLECULAR”, coordenado pela Dra. Letícia da Cunha
Guida e Dr. Juan Clinton Llerena Junior e registrado no Comitê de Ética do IFF/FIOCRUZ
sob o número 45767015.0.0000.5269.
3.1 TÉCNICA DE OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS METAFÁSICOS
O implante da amostra sanguínea foi feito em fluxo laminar, utilizando um tubo
cônico de 15 mL onde foram adicionados 6,0 mL de meio de cultura RPMI – 1640, 1,5 mL de
soro fetal bovino (cultilab), 0,2 mL de fitohemaglutinina (cultilab) e aproximadamente 1mL
de sangue total. Depois este tubo foi incubado na estufa a 37ºC por 72 horas, sendo que ao
completar 71 horas na estufa, em fluxo laminar, foram adicionados 45µl de colchicina
(Colcemid – Cultilab) em uma concentração de 10mg/mL e o material tornou a ser colocado
na estufa, a 37ºC, para completar o tempo, ou seja, permaneceu por mais 60 minutos. Quando
completaram 72 horas, o material foi centrifugado a 579g por 10 minutos (Centrífuga
FANEM – modelo 206 – Excelsa baby I), em temperatura ambiente. Quando a centrifugação
terminou, desprezou-se o sobrenadante, fazendo com que somente o pellet permanecesse no
tubo. Posteriormente adicionou-se 7,0 mL de solução de KCL hipotônica (0,075M) e então o
tubo voltou para estufa, onde permanecendo por 30 minutos a 37ºC.
Ao completar 30 minutos, a cultura foi retirada da estufa para ser feito o processo pré-
fixação. Adicionou-se 0,5 mL de fixador (metanol – ácido acético 3:1) ao tubo, e o material
foi centrifugado por 10 minutos a 579g. O sobrenadante foi desprezado após a centrifugação e
as células ressuspensas em 10 mL de fixador e depois o tubo tornou a voltar para a centrífuga,
10 minutos a 579g, este procedimento ocorreu mais duas vezes ou mais, em alguns casos, até
que o material se apresentasse límpido. As células foram ressuspensas em volumes menores
22
de fixador, cerca de 2 a 3 vezes o volume do pellet, para então serem feitas as lâminas
(Moorhead et al, 1960 modificada por Bender, 1965).
3.2 OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS PROMETAFÁSICOS A PARTIR DE SANGUE
PERIFÉRICO
3.2.1 Implante das culturas
Foi feita uma cultura de linfócitos de sangue periférico, da mesma forma que a
descrita anteriormente. Todavia, 02 horas antes do término da cultura foram adicionados
0,3mL de brometo de etídio (16mg/100 mL) e 15 minutos antes do término da cultura,
adicionou-se 0,05mL de colchicina (0,8µg/mL), levando a cultura para a estufa a 37ºC até
terminar o horário (Moorhead et al, 1960 modificada por Bender, 1965).
3.2.2 Término das culturas
O término das culturas seguirá o protocolo padrão de obtenção de cromossomos
metafásicos, como citado no subitem 3.1.
3.3 PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS
Depois do término da cultura as lâminas foram feitas utilizando uma pipeta Pasteur.
Com a suspenção do material (pellet celular mais aproximadamente três vezes o seu volume
de fixador metanol-ácido acético 3:1) foram pingadas duas gotas em lâminas de vidro
contendo lençol d’água, com o auxílio de uma pinça para segurar a lâmina. As lâminas foram
devidamente identificadas, secas em placa aquecida a 50°C, e observadas em microscópio
invertido para análise do índice mitótico e qualidade das metáfases, e depois foi feito o
bandeamento (Moorhead et al, 1960 modificada por Bender, 1965).
23
3.4 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO E BANDEAMENTO
3.4.1 Técnica de bandeamento GTG
As lâminas contendo o material permaneceram em temperatura ambiente para que
envelhecessem, sem definição de tempo, contudo a maioria esperou cerca de cinco dias para
serem bandeadas. Foi feita uma solução de tripsina (100mg de tripsina em 100 mL de tampão
Dulbeco – 0,8g de Nacl; 0,2g de Kcl; 0,2g de KH2PO4; 1,44g de Na2HPO4-2H2O em
1000mL de água destilada) na qual as lâminas permaneceram durante 10 a 14 segundos à
temperatura ambiente, porém esse tempo pode variar dependendo do número de dias que a
lâmina foi feita. Ao retirar as lâminas da solução de tripsina, foram lavadas em tampão fosfato
(6,808 g de KH2PO4; 0,882g de NaOH em 1000 mL de água destilada, pH 6,8), para que a
ação da tripsina fosse interrompida, depois participaram da etapa de coloração,
permanecendo, durante 4 minutos e 20 segundos em solução de Giemsa a 3% ou 4% em
solução de tampão fosfato citado anteriormente, e por fim lavadas em água destilada, secas ao
ar e observadas sob microscópio óptico (Seabright, 1971).
3.5 ANÁLISE CROMOSSÔMICA CLÁSSICA
Os cromossomos que passaram pela técnica de bandeamento GTG foram analisados
sob objetiva de imersão em microscópio óptico, e classificados de acordo com o Sistema
Internacional de Nomenclatura para a Citogenética Humana (ISCN – 2016) e o cariótipo
montado com a utilização do programa de cariotipagem LUCIA Cytogenetics - Karyo™
(Laboratory Imaging).
3.6 TÉCNICA DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU POR FLUORESCÊNCIA (FISH)
A técnica de hibridização in situ por fluorescência foi realizada utilizando as sondas
comerciais descritas abaixo (Figuras 2 e 3).
24
Figura 2: Esquema da sonda utilizada para FISH. Sinal vermelho corresponde à região 15q11. 2 e o sinal verde,
corresponde ao cromossomo 15 (utilizada como controle interno). Fonte: Adaptado de Cytocell, Prader-
Willi/Angelman (SNRPN) Region Probe.
Figura 3: Esquema da sonda utilizada para FISH. Sinal vermelho corresponde à região 1511.2-112 e o sinal
verde, corresponde ao cromossomo 15 (utilizada como controle interno). Fonte: Adaptado de Cytocell,
Angelman (UBE3A/D15S10).
Destaca-se que as deleções maiores que 3-4Mb da região 15q11-13 devem envolver os
genes relacionados as sondas SNRPN/IC e UBE3A/D15S10. Deleções menores que
incorporam o centro de imprinting e SNRPN, podem não provocar a deleção do gene
relacionado à sonda UBE3A/D15S10. Assim, um resultado tido como normal utilizando a
sonda UBE3A/D15S10 deve ser investigada, pois não exclui a possibilidade da Síndrome de
Prader-Willi, já que a marcação é para um gene diferente do envolvido com a SPW (Ming e
Cols, 2000)
Somente uma gota do material foi colocada na região central da lâmina de vidro com
pipeta Pasteur. A lâmina foi observada em microscópio invertido para ver se as condições do
material permitiam a técnica FISH, e então, depois de uma noite deixada em temperatura
ambiente para envelhecer, foi colocada em uma solução de 2x SSC (pH 7,0) a temperatura
25
ambiente por 30 minutos. Após isso a lâmina foi desidratada em etanol a 70%, 85% e 100%
respectivamente, por 2 minutos cada, e postas para secar naturalmente.
Depois do pré-tratamento foi realizada a codesnaturação, em que, depois da
homogeneização da sonda (SNRPN ou UBE3A), 8µl desta foram aplicadas sobre uma
lamínula e posta no centro da lâmina, sobre o material que ali havia. Sua borda foi selada com
cola especial (rubber cement), e esta lâmina colocada sobre uma placa aquecida a 72°C, por
10 minutos. Posteriormente ocorreu a fase de hibridação, em que a lâmina foi guardada em
uma câmara úmida e escura na estufa a 37°C durante uma noite (de 12 a 16 horas).
No dia seguinte, retirou-se a câmara úmida e escura da estufa, a cola especial posta ao
redor da lamínula e a própria lamínula foram removidas cuidadosamente. A lâmina foi lavada
em duas soluções: solução I (SSC 0,4x + tween 0,3% com pH 7,0) a 72°C por um minuto e
solução II (SSC 2x + tween 0,1% com pH7,0) a temperatura ambiente por 2 minutos. Após a
lavagem, a lâmina secou naturalmente. Então 10 µl de DAPI do mesmo kit da sonda foi
aplicado e a lâmina e coberta com outra lamínula, selada com esmalte e levada para geladeira
em uma caixa escura, por no mínimo 10 minutos. Por fim, o material presente na lâmina foi
analisado em microscópio de fluorescência (Olympus BX50) (Pinkel et al 1986).
26
4 RESULTADOS
No presente estudo foi realizada a análise citogenética clássica (bandeamento GTG) e
molecular (técnica FISH) em um total de 30 casos encaminhados para avaliação. Os
resultados da análise por bandeamento GTG e FISH estão dispostos na tabela 1. Em quatro
destes casos foi possível a identificação de uma possível deleção da região 15q11. 2 através
do padrão de alongamento em torno de 500 bandas por ser haploide.
Paciente GTG FISH
285/13 - Normal
430/13 46, XY Normal
559/13 46, XX Deletado
111/14 46, XX Normal
160/14 46, XY Normal
339/14 46, XY Normal
490/14 46, XY Normal
87/15 - Normal
323/15 46, XX Normal
332/15 46, XX Normal
333/15 46, XX Normal
331/15 46, XY, del 15q11.2 Deletado
334/15 46, XX Normal
339/15 46, XY, del 15q11.2 Deletado
173/16 46, XX Normal
229/16 46, XX Normal
306/16 46, XX Normal
311/16 46, XY Normal
351/16 46,XX, del 15q11. 2 Deletado
387/16 46, XY Normal
410/16 46, XX Normal
468/16 46, XY Normal
501/16 46, XY Normal
511/16 46, XX Normal
27
26/17 46, XX, del 15q11.2 Deletado
81/17 46, XX Normal
86/17 46, XY Normal
137/17 46, XY Normal
174/17 46, XX Normal
383/17 - Normal
Tabela 1: Casos investigados pelas técnicas de bandeamento GTG e Hibridização in situ por fluorescência-
FISH.
Na mesma tabela 1, podemos notar que aproximadamente 13,33% dos casos mostraram
deleção da região 15q11. 2 por GTG e 16,66% por FISH. Nas figuras 4 e 5 é possível
observar o cariograma de uma representação dos grupos normal e alterado respectivamente.
Note que na figura 5, a seta indica a ausência da região 15q11. 2-13, fazendo com que o
cromossomo 15 da direita se apresente um pouco mais curto que o da esquerda, confirmando
o diagnóstico de tal aberração cromossômica.
Figura 4: Análise de bandeamento GTG apresentando região 15q11. 2 normal – Cariótipo: 46,XX (ISCN,2016).
28
Figura 5: Análise em alta definição sugerindo deleção da região 15q11. 2 l – Cariótipo: 46,XX del(15)(q11.2 -
q11.3) (ISCN,2016)
A figura 6 mostra o resultado da análise num caso normal no qual podemos perceber a
presença de ambos os sinais verdes (controle interno da sonda) e ambos os sinais vermelhos
(região 11.2) caracterizando integridade da região investigada. Na figura 7 nota-se a ausência
de um dos sinais vermelhos, tanto no núcleo interfásico quanto na metáfase, caracterizando
deleção da região q11. 2 de um dos cromossomos 15.
Figura 6: Análise FISH detectou dois sinais (vermelho e verde) em ambos os cromossomos 15, caracterizando
integridade da região avaliada (setas). 46, XY. ish 15q11.2 (SNRPN x2) (ISCN,2016).
29
Figura 7: Análise FISH detectou ausência do sinal vermelho em um dos cromossomos 15, caracterizando
deleção da região 15q11. 2 (setas). 46, XX, del(15)(q11.2-q11.3).ish 15q11.2 (SNRPN x2) (ISCN, 2016).
30
5 DISCUSSÃO
O Departamento de Genética do Instituo Fernandes Figueira (FIOCRUZ) realiza o
atendimento (diagnóstico e acompanhamento) multidisciplinar dos pacientes encaminhados
por diferentes condições genéticas incluindo pacientes com suspeita clínica de Síndrome de
Prader-Willi, estes indicados principalmente por obesidade e atraso no desenvolvimento. No
início do ano de 2015, tivemos aprovado um projeto de doenças raras que inclui dentre os
objetivos a avaliação diagnóstica destes pacientes.
Considerando a complexidade no diagnóstico e diversos trabalhos sugerindo a
utilização de métodos de biologia molecular (especialmente as análises de padrão de
metilação da região 15q11. 2), ficamos responsáveis por realizar o estudo de caracterização
citogenética clássica e molecular, através da técnica FISH, dos pacientes incluídos no projeto.
Foram analisados então 30 casos pelas técnicas de citogenética bandeamento GTG e
FISH. Estes casos também foram avaliados através das técnicas de biologia molecular, que
incluem entre outras, as análises do padrão de metilação por PCR e por análise da curva de
dissociação em alta resolução (HRM do inglês High Resolution Melting). Como estes últimos
métodos não foram realizados pela autora deste trabalho, os mesmos foram considerados
apenas para comparação e não serão abordados e/ou discutidos no momento.
De todos os casos analisados através da citogenética clássica, em 90% foi possível a
realização do cariótipo. Em 10% tivemos problemas para obtenção de cromossomos
metafásicos. A falha na obtenção de cromossomos metafásicos pode se dar em decorrência de
diversas causas como: coleta inapropriada (utilização de anticoagulante não adequado),
quantidade insuficiente de amostra, manutenção da amostra sob condição de temperatura
inadequada, validade e/ou qualidade alterada de reagentes, manuseio inadequado, condições
de assepsia, entre outros. Para estes casos sem crescimento foi realizada a técnica FISH em
núcleos interfásico, assim, todos os casos foram analisados ou por bandeamento e/ou por
FISH.
Sempre que possível, a análise foi realizada em um padrão de resolução entre 500 e
850 bandas por conjunto haploide, que nos daria uma segurança em termos da detecção de
pequenas deleções citogenéticas. Em 13,33% casos, foi possível a identificação da deleção
em nível de 500 bandas.
A técnica de FISH confirmou a deleção (figura 7) de 100% dos casos cuja deleção
citogenética foi sugerida (figura 5) e caracterizou a deleção em 3,7% dos casos cuja análise
por banda G foi considerada normal (Figura 4).
31
Paciente Parentesco Padrão de Metilação
GTG FISH Sonda PCR HRM
285/13
------- ------ Sem metáfases Normal SNRPN
430/13
PWS PWS 46, XY Normal SNRPN
559/13
------ ------ 46, XX Deletado SNRPN
111/14
------ ------ 46, XX Normal UBE3A
160/14
PWS PWS 46, XY Normal SNRPN
339/14
------ ------ 46, XY Normal UBE3A
490/14
------ ------ 46, XY Normal SNRPN
87/15
------ ------ Sem metáfases Normal SNRPN
323/15
Normal Normal 46, XX Normal SNRPN
332/15 Irmãs
Normal Normal 46, XX Normal SNRPN
333/15 PWS PWS 46, XX Normal UBE3A
331/15
PWS PWS 46, XY, del 15q11.2 Deletado SNRPN
334/15
------ ------ 46, XX Normal SNRPN
339/15
PWS PWS 46, XY, del 15q11.2 Deletado SNRPN
173/16
------ ------ 46, XX Normal SNRPN
229/16
Normal Normal 46, XX Normal SNRPN
306/16
Normal Normal 46, XX Normal SNRPN
311/16
------ ------ 46, XY Normal SNRPN
351/16
------ ------ 46, XX, del 15q11.2 Deletado SNRPN
387/16
Normal Normal 46, XY Normal SNRPN
410/16
Normal Normal 46, XX Normal SNRPN
468/16
Normal Normal 46, XY Normal SNRPN
501/16
Normal Normal 46, XY Normal SNRPN
511/16
------ Normal 46, XX Normal UBE3A
26/17
PWS PWS 46, XX, del 15q11.2 Deletado UBE3A
81/17
------ ------ 46, XX Normal UBE3A
86/17
------ ------ 46, XY Normal UBE3A
137/17
------ ------ 46, XY Normal UBE3A
174/17
PWS PWS 46, XX Normal SNRPN
383/17
------ ------ Sem metáfases Normal UBE3A
Tabela 2: Casos investigados pelas técnicas de citogenética bandeamento GTG e Hibri FISH, e pelas técnicas de
metilação PCR e HRM.
32
Comparando nossos achados com os métodos de biologia molecular realizado no
projeto maior (tabela 2), podemos considerar que o método de metilação nos parece mais
adequado para auxílio diagnóstico também em nossa casuística, mesmo não indicando a causa
da anomalia cromossômica.
33
6 CONCLUSÕES
A caracterização através da citogenética clássica (bandeamento GTG) foi realizada em
90 % dos casos propostos;
A técnica FISH foi eficiente na caracterização dos casos portadores de deleção na
região 15q11. 2-q13;
A análise citogenética obteve um pequeno impacto na identificação da etiologia da
Síndrome de Prader-Willi em nossos pacientes, mostrando um perfil cuja maioria dos
casos é normal em nível de resolução citogenética, corroborando para a existência de
evento epigenético como a causa etiológica mais provável;
A análise citogenética continua tendo importância significativa, uma vez que outros
tipos de alteração cariotípica podem ser excluídos/identificados, além de ser o mais
acessível atualmente, considerando nosso sistema único de saúde (SUS). Entretanto, a
utilização de métodos avaliando o padrão de metilação poderia selecionar melhor os
casos, auxiliando no diagnóstico clínico/molecular principalmente em condições cujas
características clínicas se sobrepõem.
34
REFERÊNCIAS
ALBERTS, B. - Biologia Molecular da Célula- 5ª Edição, Artmed, 203 pág., 2010.
ANGULO, M. A.; BUTLER, M. G.; CATALETTO, M. E. - Prader-Willi Syndrome: A
Review of Clinical, Genetic, and Endocrine Findings. - Journal of Endocrinological
Investigation 38 (2015): 1249–1263, 2016.
BAUMAN, J.G.J., WIEGANT, J., BORST, P. & DUIJN, P. VAN - A new method for
fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ
hybridization of fluorochrome-labelled RNA. Experimental Cell Research 138, 485-490,
1980.
BEESLEY, J. E. - Immunocytochemistry and In Situ Hybridization in the Biomedical
Sciences - 1ª Edição, Birkhäuser Basel, 138 - 139 pág., 2001.
BENDER, M.A. – Methods in human cytogenetics - 1965
BORGES-OSÓRIO, M. R.; ROBINSON, W. M., - Genética Humana – 3ª Edição, Porto
Alegre, Artmed, 98-99 pág., 2013.
BUTLER, M.G.; LEE, P.D.K.; WHITMAN, B.Y. - Management of Prader-Willi Syndrom
- Springer, New York, 2006.
CASSIDY, S.B.; DRISCOLL, D.J. - Prader-Willi syndrome.- Eur J Hum Genet, 2008.
CASSIDY, S.B.; SCHWARTZ, S.; MILLER, J. L.; DRISCOLL, D. J. - Prader-Willi
syndrome. -Genet Med 14(1):10–26, 2012.
CASSIDY, S.B.- Prader-Willi syndrome - Journal of Medical Genetics, 34(11):917-923
pág., 1997.
DAMIANI, D. - Uso de hormônio de crescimento na síndrome de Prader-Willi. -Arq Bras
Endocrinol Metab, São Paulo, v. 52, n. 5, 833-838 pág., 2008.
35
DONALDSON, M. D. C.; CHU, C.E.; COOKE, A.; WILSON, A.; GREENE, S.A.;
STEPHENSON, J.B.P. - The Prader-Willi syndrome Archives of Disease in Childhood-
58-63 pág. 1994.
FRIDMAN, C.; KOK, F.; DIAMENT, A.; KOIFFMANN, C. P. – Síndrome de Angelman
– Causa frequentemente não reconhecida de deficiência mental e epilepsia -1997.
HARE, W.C.D.; SINGH, E.L. - Cytogenetics in Animal Reproduction. Slough:
Commonwealth Agricultural Bureaux, UK, 1979.
HOLM, V.A.; CASSIDY, S.B.; BUTLER, M.G.; HANCHETT, J.M.; GREENSWAG,
L.R.; WHITMAN, B.Y.; GREENBERG, F.- Prader-Willi syndrome: Consensus
diagnostic criteria, Pediatrics 398-402 pág. 1993.
KIM, S.J.; MILLER, J.L.; KUIPERS, P.J.; GERMAN, J.R.; BEAUDET, A.L.; SAHOO,
T.; DRISCOLL, D.J. - Unique and Atypical Deletions in Prader–Willi Syndrome Reveal
Distinct Phenotypes. - European Journal of Human Genetics 20.3 (2012): 283–290 pág.
2016.
LEVSKY, J.M.; SINGER, R.H. - Fluorescence in situ hybridization: past, present and
future - J Cell Sci.116 (Pt 14):2833-8, 2003.
LIEHR, T. - Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) – Application Guide.1ª edição.
Alemanha, Springer Science & Business Media, 3 pág, 2008.
MALUF, S.W.; RIEGEL, M. - Citogenética Humana. - Artmed, 1ª. ed., 11 pág., 2011.
MARIS, A.F.; TROTT, A. – A patogênese genética e molecular da syndrome de
Angelman- J. Bras. Psiquiatr, vol.0, no4, Rio de Janeiro, 2011.
MING, J.E.; BLAGOWIDOW, N.; KNOLL, J.H.; ROLLINGS, L.; FORTINA, P.;
MCDONALD-MCGINN, D.M.; SPINNER, N.B.; ZACKAI, E.H. - Submicroscopic
36
deletion in cousins with Prader-Willi syndrome causes a grandmatrilineal inheritance
pattern: effects of imprinting. - Med. Genet. 92: 19-24, 2000.
MOORHEAD, P.S.; NOWELL, P.C.; MELLMAN, W.J.; BATTIPS, D.M.;
HUNGERFORD, D.A. - Chromosome preparations of leukocytes cultured form human
peripheral blood. Experimental Cell Research, v.20, 613-616 pág., 1960.
NEVES, S.M.N.; GUEDES, R.M.C. - Hibridização in situ fluorescente: princípios básicos
e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina veterinária. - Arq.
Inst. Biol., São Paulo, v. 79, n. 4, 627-632 pág., 2012.
NICHOLLS, R. D.; KNEPPER, J. L. - Genome Organization, Function, and Imprinting in
Prader-Willi and Angelman Syndromes. - Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:153–75,
2001.
NUSSBAUM, R.L.; MCINNES, R.R.; WILLARD, H.F. - Genética médica – Thompson
&Thompson. - 7ª edição. Rio de Janeiro: Ed. Guanabara Koogan, 63-64 pág., 2009.
PARTSCH, C.J.; LAMMER, C.; GILLESSEN-KAESBACH, G.; PANKAU, R.; - Adult
patients with Prader-Willi syndrome: clinical characteristics, life circumstances and
growth hormone secretion. - Growth Horm IGF Res 10, Suppl B: S81-S85, 2000.
PINA-NETO, J.M.; FERRAZ, V.E.F; MOLFETTA, G.A.; BUXTON, J; RICHARDS, S;
MALCOLM, S. - Clinical-neurologic, cytogenetic and molecular aspects of the Prader-
Willi and Angelman Syndromes. - Arq. Neuro-Psiquiatr., São Paulo, v. 55, n. 2, 199-208
pág, 1997.
PINKEL, D., STRAUME, T., GRAY, J.W. – Cytogenetic analysis using quantitative,
high sensitivity fluorescence hybridization - 1986
PRADER, A.; LABHART, A.; WILLI, A. - Ein syndrom von adipositas, kleinwuchs,
kryptorchismus und oligophrenie nach myotonie artigen zustand im neugeborenenalter. -
Schweiz Med Wochen.;86:1260–1260, 1956.
37
PROCTER, M.; CHOU, L.S.; TANG, W.; JAMA, M.; MAO, R. - Molecular Diagnosis of
Prader–Willi and Angelman Syndromes by Methylation-Specific Melting Analysis and
Methylation-Specific Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. – 2006.
ROSSETTO, A.F.R. - Avaliação do Bandeamento Cromossômico por Digestão
Enzimática e Tratamento com Solução Tampão Citratado – 2015
SEABRIGHT, M. - A Rapid Banding Techinique for Human Chromosomes. Lancet -1971
SHARKEY, F.H.; MATHER, E.; FITZPATRICK, D.R. - Chromosome analysis: what and
when to request Archives of Disease in Childhood - 90:1264-1269, 2005.
SMEETS, D.F. - Historical prospective of human cytogenetics: from microscope to
microarray. Clin Biochem, 37:439– 446, 2004.
SMITH, A.; HUNG, D. - The dilemma of diagnostic testing for Prader-Willi syndrome-
Transl Pediatric; 6(1): 46–56, 2017.
GERSEN, S.L.; KEAGLE, M.B. - The Principles of Clinical Cytogenetics. - 2ª edição.
Humana Press, Totowa, New Jersey. 455 pág, 2008.
TALEBIZADEH, Z.; BUTLER, M.G. - Insulin resistance and obesity-related factors in
Prader-Willi syndrome: comparison with obese subjects. - Clin Genet 67:230-23, 2005.