Post on 20-Feb-2018
7/24/2019 Cap 23 Final
1/15
CAPITOLUL 23DETECIA I BIOMARKERII APOPTOZEI
23.1. Introducere
n cele dou capitole anterioare am analizat apoptoza, ca mediator al aciunii
substanelor toxice. n plus, am prezentat n detaliu att la nivel celular ct i la nivel
molecular cile care regleaz moartea celular prin apoptoz. Totui, o nelegere
complet a rolului apoptozei n medierea oricror procese biologice depinde de o
cuantificare precis. Acest capitol va descrie morfologia i biomarerii apoptozei i
va avea n vedere aplicarea acestor informaii n cuantificarea morii celulare in vivo
iin vitro.
!rima descriere a morfologiei apoptozei s"a bazat pe stimularea timocitelor cu
glucocorticoizi
#Arends i $%llie, &''&(. )lterior, a devenit evident c trsturile
morfologice descrise erau comune la multe alte esuturi cum ar fi rinic*iul i ficatul.
n esutul sntos sau pentru celulele aderente n cultur, celulele capt un aspect
rotun+it i apare un *alou clar care ncepe s le separe de celulele nvecinate #figura
-.&A(. !rin folosirea coloraiilor *istologice clasice s"a observat c nucleul intens
colorat cu *ematoxilin apare condensat i delimitat de cromatin, iar citoplasma
devine intens eozinofil. Aceast serie de modificri morfologice este reprezentat
sc*ematic n figura -.&.
23.2 Paraetr!! care !nter"!n #n detec$!a a%o%to&e!
Aa cum s"a discutat n capitolul & stadiile bioc*imice ale apoptozei pot fi
descrise ca o suprapunere de leziune, analiz, cuplare i execuie. /a+oritatea
te*nicilor disponibile identific modificrile celulare asociate n final cu faza de
execuie a apoptozei mai degrab dect cu oricare alt faz latent de semnalizare i
transmitere.Astfel, toate metodele subestimeaz numrul celulelor apoptotice prezente.
7/24/2019 Cap 23 Final
2/15
'!(ura 23.1#A( M!cro)oto(ra)!e e*ectron!c+ a unu! ,e%atoc!t a%o%tot!c. 0elula s"a rotun+ti a pierdut contactul cu celulele nvecinate. !rezint citoplasm #0( i nucleu #1( condensate nsorganitele precum mitocondriile nc se pot recunoate. /rire 2.3456. #( -ec"en$+ ae"en!ente*or or)o*o(!ce care au *oc atunc! cnd o ce*u*+ de"!ne a%o%tot!c+. 7tadiul final alnecrozei secundare are loc n mod normal dup ce fragmentele celulare au fost fagocitate de ctrealte celule.
Ali factori care afecteaz rezultatul care cuantific apoptoza includ esutul
studiat i marerii alei #vezi tabelul -.&(. n plus, unele etape ale 8execuiei9
apoptozei sunt mult mai uor detectate dect altele: de exemplu, aspectul marginii de
cromatin este mult mai uor de recunoscut dect n stadiile urmtoare cnd apare
dezintegrarea nuclear. ;iferitele esuturi din organismele vertebratelor prezint rate
diferite ale apoptozei dependente de funciile lor. Aceste esuturi care prezint o rat
nalt de replicare celular cum ar fi esutul *ematopoetic i tractul gastrointestinal
prezint n general o rat mai ridicat a apoptozei dect celelalte esuturi, cum ar fi
ficatul, unde rata replicrii celulare tinde s fie sczut.
7/24/2019 Cap 23 Final
3/15
proporie de celule apoptotice pun cercettorului probleme suplimentare fa de cele
cu o rat nalt a apoptozei. Te*nicile care implic omogenizarea ntregului esut,
cum ar fi testul =>?7A, pot dilua micile proporii ale celulelor apoptotice att de mult
nct scad sub limitele de detecie #@aaradai colab., &''B(.
7imilar, te*nicile *istologice care folosesc coloraia *ematoxilin C eozin pe
seciuni tisulare pot descoperi o singur celul apoptotic prezent n interiorul
seciunii tisulare dar cuantificarea poate necesita un efort considerabil i experien
din partea operatorului.
Ta/e*u* 23.1. Mo*ecu*e ar0er %oten$!a*e %entru tud!! de a%o%to&+
Mar0er -%ec!)!c!tate%entru a%o%to&+
-c,!/
c"m%cDfos 1especific Ecl"Dfamilie ax un FDE0aG 1especific EHragmentare A;1 un E
p4- >imitat E/orfologie Hoarte bun 0ondensareD
fragmentareIoec*st ---2 unJ 0ondensare a A;1
Transglutaminaza un E0aspaze un E #activitate
enzimatic(
/etoda =>?7A furnizeaz date cantitative ca urmare a omogenizrii tisulare i
a centrifugrii difereniale a componentelor celulare. ;eoarece este necesar o
cunoatere a distribuiei marerului la nivel celular este dificil s raportm rezultatele
obinute prin metoda =>?7A la modificrile din populaia celular. Asemntor,
gradul de desfurare a A;1 a fost considerat ca un marer definitiv al apoptozei, dar
aceasta este o situaie care se refer la fenomenele aprute n toate fazele apoptozei,
iar n situaii n care numai o mic proporie din celule sunt supuse apoptozei nivelul
sczut al sensibilitii exclude detecia lor ridicat datorit unui factor de diluie cu
valoare nelimitat a A;1"ului de la celulele non"apoptotice.
n funcie de marerul folosit, metodele *istologice pot fi sensibile #vezitabelul -.&(, i sunt aplicabile la aproape toate esuturile ce necesit studiul. Totui
-
7/24/2019 Cap 23 Final
4/15
aprecierea cantitativ a prepartelor *istologice tisulare va presupune ntotdeauna un
efort considerabil, c*iar dec acurateea acestor metode este ridicat.
Adeseori, poate exista un compromis ntre specificitate i uurina deteciei. )n
marer care nu este exprimat specific de celulele apoptotice poate fi totui util dac
permite unui cercettor s disting celulele apoptotice de celulele vecine #/c0art*%,
=van, &''B(. )n exemplu de astfel de marer este *ematoxilina i eozina n te*nicile
*istologice clasice, i Ioec*st ---2 n culturile celulare. 1ici una din metode nu
localizeaz specific celulele apoptotice, dar ele sunt folosite n mod real, datorit
faptului c marc*eaz diferenial celulele apoptotice.
23.3. Metode %entru detectarea ce*u*e*or a%o%tot!ce
/etodele pentru detectarea celulelor apoptotice pot fi mprite n trei categorii
generale n funcie de te*nica de preparare tisular. !rima presupune procesri ale
esutului intact pentru *istologie i utilizeaz mareri specifici i nespecifici ai
celulelor apoptotice. 0ea de"a doua presupune obinerea celulelor separate din esutul
intact, iar cea de"a treia metod presupune dezagregarea esutului i a celulelor i
analiza proteinelor celulare rezultate i sau a A;1"ului.
23.3.1. Metode care )o*oec $eut !ntact
7/24/2019 Cap 23 Final
5/15
cercettorului, celulele pot fi corect recunoscute i pot fi cuantificate folosind te*nici
morfometrice pe un numr de seciuni tisulare suficient pentru a susine un eantion
reprezentativ. !rintre avanta+e aminitim uurina n utilizare datorat compatibilitii
acestor te*nicii morfologice cu mi+loacele de examinare *istologice i ultrastructurale
folosite curent. !rincipalul dezavanta+ deriv din subiectivitatea n recunoaterea
celulelor apoptotice care poate depinde de experiena examinatorului. 7tudiile lui
ursc*i colab.#&'BL( au combinat cuantificri de celule apoptotice att cu, ct i
fr fragmente nucleare, cu identificarea celor din urm doar pe baza corpilor
eozinofilici rotunzi, cel mai adesea prezeni n alte celule neafectate. Astfel,
variabilitatea de la examinator la examinator i de la laborator la laborator trebuie s
fie evitat. n plus stabilirea mrimii eantionului att din interiorul seciunii ct i
dintre seciunile aceleiai probe trebuie determinat statistic pentru a limita
variabilitatea.
=xaminarea celulelor apoptotice n microcopia optic #figura -.( are ca
avanta+e pregtirea rapid i necostisitoare i investiiile te*nice minime. n plus,
numrul de celule apoptotice pe fiecare seciune este suficient pentru cuantificare:
acest proces poate fi automatizat prin utilizarea te*nicii similare celei descrise
anterior pentru evaluarea de rutin a indicilor celulari de proliferare.
n plus fa de microscopia optic, pentru identificarea celulelor apoptotice
prin morfologia acestora se poate aplica microscopia electronic. Aceast
metodologie reprezint probabil 8standardul de aur9 n ceea ce privete apoptoza n
esutul intact deoarece corpii apoptotici pot fi identificai n toate stadiile lor de
progresie, cu sau fr fragmente nucleare #figura -.(.!entru detectarea apoptozei se poate folosi imuno*istoc*imia datorit faptului
c multe proteine sunt exprimate specific sau preferenial de ctre celule intrate n
apoptoz. =xist cteva proteine propuse n acest scop, care sunt prezentate n tabelul
-.&. Transglutaminaza este o enzim implicat n reacia din care rezult
condensarea proteinelor tubulare ce permit recunoaterea celulelor apoptotice n
seciuni tisulare cu coloraii *istologice de rutin. Keacia de legare ncruciatcatalizat de glutaminaz conduce la polimerizarea proteic, care este extrem de
4
7/24/2019 Cap 23 Final
6/15
puternic. 7upraexpresia transglutaminazei tisulare sau de tipul ?? se crede a fi
specific pentru apoptoz dei au fost remarcate niveluri sczute ale acesteia n celule
endoteliale, celule musculare netede i celule mezangiale viabile.
'!(ura
23.2 #A( A%ectu*,!to*o(!c a* une!ce*u*e a%o%tot!ce
#n )!catu* deo/o*an. 0oloraie *ematoxilin"eozin, mrire -B56. #( M!cro)oto(ra)!e e*ectron!c+ a a!u*tor cor%! a%o%tot!c! AB45 un!! cu nuc*eu ! a*$!! )+r+ nuc*eu. Acetia sunt prezeni att n*epatocite ct i n celulele @upffer, n ficatul unui oarece cruia i s"a administrat un solventclorinat. n toate cazurile sunt prezente organite citoplasmatice ce pot fi recunoscute, cu omorfologie similar celor prezente n *epatocitele care au fagocitat celulele. /rire .-346.
;ei n identificarea celulelor apoptotice s"au adus argumente n favoarea
proteinelor marer precum c"m%c, p-2, 7!M" i vitronectin, acestea sunt n modcert nespecifice procesului i utilizarea lor trebuie combinat cu morfologia pentru
L
7/24/2019 Cap 23 Final
7/15
identificarea sigur a celulelor apoptotice. /ai nou se folosesc caspazele ca
biomarei ai apoptozei. 0aspazele constituie o familie de proteaze care sunt activate
n stadiul final, de execuie al apoptozei prin clivarea dintr"o pro"caspaz. Activarea
cascadei proteolitice a caspazei determin moartea celular apoptotic. ;ei
anticorpii pentru caspaz sunt disponibili i pot fi utilizai pentru imuno*istoc*imie,
nivelurile proteinei caspaza pot s par nesc*imbate, activarea rezultnd din cliva+ul
enzimatic. Astfel, experimentele bazate pe caspaz sunt foarte utile ca i biomareri
ai apoptozei i vor fi discutate n subcapitolul -.2.-.
0u toate metodele imuno*istoc*imice, metodologia de fixare trebuie adaptat
pentru a se potrivi esutului i epitopilor. Hixatorii bazai pe alde*ide precum
paraformalde*ida i formalde*ida, sau fixatori alcoolici precum met*acarn i sunt toi
utilizai n imuno*istoc*imie. n general, fixativii alcoolici sunt mai puin distructivi
pentru deteminanii antigenici, fixativii alde*idicii inducnd legturi ncruciate
extinse ce pot face de nerecunoscut epitopul pentru un anticorp ndreptat mpotriva
proteinei native. n unele cazuri fixatorii pot fi contraindicai iar esuturile vor trebui
s fie ng*eate rapid naintea secionrii. n cazul esuturilor de+a fixate, trebuie
efectuat recuperarea antigenic. n general trebuie meninut un ec*ilibru delicat ntre
fixarea care pstreaz morfologia i pierderea antigenicitii: aceti factori trebuie
ec*ilibrai pentru identificarea reuit a celulelor apoptotice prin te*nici
imuno*istoc*imice #Koberts, 555(.
n cursul apoptozei, fragmentarea A;1 are loc simultan cu modificrile
morfologice ale condensrii cromatiniene. 7"au elaborat cteva sisteme care permit
localizarea acestor rupturi A;1 n seciuni tisulare i n celule izolate n cultur. !eransamblu, metodele se mpart n trei categorii funcionale n funcie de enzima
folosit n procesul de legare. /arcarea procesului final in situ #?7=>( utilizeaz
A;1"polimeraza ? #polimeraza @ornberg( care are funcie dubl: poate aduga baze
marcate cu digoxigenin la grupurile libere niate -N*idroxil dar de asemenea poate
marca i ntrerupe translaia din monocatenele rupte, de unde acronimul ?71T # in situ
nic translation(. Alternativ, fragmentul @leno al A;1"polimerazei ? #lipsit deactivitate de ntrerupere a translaiei a polimerazei @ornberg( poate fi folosit pentru
3
7/24/2019 Cap 23 Final
8/15
efectuarea marcrii finale a A;1 pe seciuni tisulare. Alternativ, enzima terminal
deoxinuclotidil"transferaza #Tdt( a fost utilizat pentru marcarea captului ntrerupt
d)T! Tdt metilat C T)1=> #Tdt"mediated d)T! nic end labelling( sau codare.
Acest enzim poate aduga baze marcate ;?M att grupurilor -N*idroxil
monocatenare ct i celor bicatenare. /arerii legai pe A;1"ul nou sintetizat poate
fi ulterior detectat cu a+utorul peroxidazei con+ugate cu avidin sau alt marer
enzimatic adecvat #Hoster, 555(.
Te*nica a fost criticat ca fiind nespecific deoarece marc*eaz i celulele
necrotice i d rezultate fals pozitive. Totui, acest lucru era de anticipat din moment
ce catenele rupte de A;1 nu sunt specifice apoptozei: ca i n cazul tuturor te*nicilor
imunocitoc*imice, trebuie acordat atenie interpretrii, iar ca i criteriu suplimentar
ar trebui folosit cel morfologic al apoptozei simultan cu marca+ul.
23.3.2. Metode ce )o*oec ce*u*e !&o*ate
n multe aplicaii necesitatea meninerii organizrii tisulare este secundar
multiplelor avanta+e oferite de celulele izolate. ;e exemplu, celulele obinute pot fi
relativ omogene i n numr mare. n unele cazuri celulele pot fi sicronizate pentru a
intra n apoptoz n numr mare iar aspectele dependente de timp ale apoptozei pot fi
studiate n aceiai celul n timpul progresiei de la stadiul normal la necroza
secundar. )n aspect important este faptul c efectele factorilor exogeni, cum ar fi
calciul, xenobioticele i factori de cretere cum ar fi factorul de transformare a
creterii O, pot fi studiate n condiii prestabilite.
/c0art*% i =van #&''B( au utilizat video"microscopia ultra"rapid pentru astudia efectele densitii celulare i contactului celular asupra frecvenei apoptozei i
fagocitoza consecutiv a fragmentelor celulare apoptotice. Holosind acest sistem ei au
demonstrat c factorii de supravieuire precum cl" i factorul de cretere insulin"
lie ? au supresat instalarea apoptozei n celule ns nu au afectat dinamica
evenimentelor la nivel individual. n contrast, in*ibitorii caspazelor nu au avut efect
asupra instalrii apoptozei dar au prevenit fiecare moarte celular prin apoptoz.Astfel, video"microscopia ultra"rapid poate oferii informaii unice asupra evoluiei i
B
7/24/2019 Cap 23 Final
9/15
ratei apoptozei la celule izolate. Totui, necesitatea ec*ipamentelor de specialitate
poate fi pro*ibitiv.
!rocesul apoptozei poate fi studiat prin imuno*istoc*imie n celule izolate
folosind anticorpi mpotriva unei categorii de antigene asociate apoptozei #tabelul
-.&(, aa cum s"a precizat anterior n cazul seciunilor tisulare #subcapitolul -.-.&(.
;in nou, experiena operatorului este esenial pentru identificarea precis a celulelor
apoptotice iar pentru un imunomarca+ optim este necesar o metod de fixare
adecvat. n plus, celulele n cultur au o membran celular intact care trebuie s
fie permeabilizat pentru a permite ptrunderea moleculelor relativ mari de anticorpi.
Acest lucru este de obicei realizat prin fixarea cu alcool sau printr"o combinaie de
expunere la soluii saline *ipotone i ng*eare parial. Alegerea produsului final de
reacie pentru vizualizarea celulelor apoptotice poate fi reprezentat de un cromogen
sau un fluorocrom.
0a o alternativ la imuno*istoc*imie poate fi folosit marca+ul intercalrii A;1
pentru detecia apoptozei n celule izolate primare sau n linii celulare in vitro. =xist
cteva substane de marca+ disponibile precum iodura de propidium, acridine orange
sau Ioesc*t --4B. Aceti colorani permit detecia A;1"ului condensat n interiorul
nucleilor celulelor apoptotice i reprezint un instrument important n studiul
apoptozei in vitro. n condiii bune se pot face estimri foarte precise ale numrului
de celule apoptotice n urma tratamentului culturii cu factori de cretere sau
medicamente citotoxice #Hoster, 555(. Te*nica T)1=>, descris pentru esuturi n
subcapitolul -.-.&, este aplicabil i culturilor celulare.
Hlo"citometria este probabil una din cele mai eficiente metode pentru studiuli cuantificarea apoptozei #van =ngelandi colab.,&''B(. >a trecerea celulelor printr"
un fascicul laser, acestea pot fi difereniate pe baza dimensiunii i densitii lor.
0oninutul A;1 pentru fiecare celul poate fi determinat cu a+utorul iodurii de
propidium pentru a permite analiza proporiei de celule ce vor intra n apoptoz.
Tabelul -. prezint o list de colorani A;1 folosii n flo"citometrie
#Hraeri colab., &''4(. Hlo"citometria poate fi util n special atunci cnd trebuiescanalizate populaii de celule amestecate, te*nica putnd diferenia mai mult de un
'
7/24/2019 Cap 23 Final
10/15
parametru simultan. ;e exemplu, timocitele pot fi analizate simultan pentru
coninutul n A;1 cu a+utorul iodurii de propidium i tipizate celular prin expresia
0;2D0;B folosind anticorpi #/c0art*% i =van, &''B(. Alternativ, iodura de
propidium poate fi folosit alturi de ali mareri asociai cu apoptoza precum
transglutaminaza, anexina P #vezi -.-.-(, T)1=> #vezi -.-.-( sau cl".
Ta/e*u* 23.2. Co*ora$!! AD6 )o*o!te #n od o/!nu!t #n or)o*o(!e ! )*o78c!toetr!e
Co*orant ce e *ea(+ *a AD6L!n!e de e9c!ta$!e*aer n4
Inter"a* de e!!en4
?odura de propidium ?ntercalar 2BB 445"L25romura de et*idium ?ntercalar 2BB 445"L25Acridin orange ?ntercalar 2BB, 42& 4&5"4-53"amino"actinomicina ; ?ntercalar 2BB L25"LB5
;aunomicina ?ntercalar 2BB 4L5"L55/itramicina A =xtern 243 4&5"4-50romomicina A =xtern 243 445"4B5Qlivomicina =xtern 243, 2B5"455 4-5"4L5Ioec*st --4B =xtern -4&"-L2 -B5"25Ioec*st ---2 =xtern -4&"-L2 -B5"25;A!? =xtern -4&"-L2 -B5"25
23.3.3. Metode ce )o*oec )rac$!un! u/ce*u*are
/ulte teste folosesc alte proprieti ale celulelor apoptotice precum modificri
proteice, membranare sau ale A;1"ului. =xist multe ituri disponibile comercial ce
folosesc aceste modificri n scopul de a oferi msurtori rapide i un cost mai mic
pentru celulele moarte. )nele experimente utilizeaz =>?7A pentru a detecta proteine
specifice sau a cerceta prezena A;1 n fraciuni celulare neadecvate #@aaradai
colab., &''B,(. Q metod folosit n studiul apoptozei utilizeaz anticorpi primari
ndreptai fie mpotriva A;1"ului monocatenar nsui, fie mpotriva proteinei
*istonice.
>a baza te*nicii comerciale denumit 8=>?7A moarte celular9 a stat
combinaia de utilizare a anticorpilor ndreptai att mpotriva A;1 ct i a *istonelor
#figura -.-(. n cursul etapelor incipiente ale apoptozei, membrana plasmatic
devine relativ impermeabil, dar membrana nuclear rmne nesc*imbat: pe msur
ce A;1"ul nuclear se dezintegreaz, aceste fragmente pot fi detectate n citoplasm.A%ala i colab. #&''B( au folosit te*nica pentru a studia instalarea leziunilor
&5
7/24/2019 Cap 23 Final
11/15
*epatocelulare induse prin sepsis la oareci, evideniind dezavanta+ele acesteia i a
oricrei alte te*nici bazate pe =>?7A. !rincipalul inconvenient este imposibilitatea de
a raporta datele la numrul real de celule i, consecutiv, imposibilitatea de a compara
aceste date cu altele precedente complementare.
'!(ura 23.3 #A( Re%re&entare (ra)!c+ a te,n!c!! ELI-A :oarte ce*u*ar+;. Anticorpiianti"*istone sunt adsorbii pe peretele plcuei, apoi nucleozomii coninui n prob se leag prinintermediul *istonelor la anticorpii anti"*istone imobilizai. )n anticorp anti"A;1 con+ugat cu
peroxidaza reacioneaz cu A;1 imobilizat din prob, cantitatea de anticorp imobilizat fiind directproporional cu cantitatea de mono" i oligonucleozomi din citoplasma prezent n esutul original.#( D!a(ra+ de #%r+t!ere a !nd!ce*u! a%o%tot!c der!"at d!n ec$!un!*e ,!to*o(!ce a*eec$!un!*or ,e%at!ce arcate %r!n etoda TU6EL AB< contro*4.
Q alt te*nic utilizat n evaluarea apoptozei care a ctigat popularitate este
detecia fosfatidil serinei #!7(, un fosfolipid ncrcat negativ, reinut n mod normal
la nivelul suprafeei interne a bistratului membranar plasmatic. n cursul apoptozei,
&&
7/24/2019 Cap 23 Final
12/15
!7 este externalizat, acionnd n sensul declanrii fagocitozei. Acest proces poate fi
urmrit folosind proteina de legare a fosfolipidului, ce ataaz anexina P sau
anticorpi anti"!7. Anexina P poate fi utilizat n celule vii i este folosit n studierea
dinamicii i ratei apoptozei n culturiile celulare.
0aspazele constituie o familie de proteaze care sunt activate n etapa de
execuie a apoptozei #vezi capitolul &( prin cliva+ul dintr"o form pro"activ.
Activarea cascadei proteolitice a caspazei determin moartea celular prin apoptoz.
Activarea caspazelor n cursul apoptozei mpreun cu descoperirea ctorva substraturi
pentru caspaze au dus la dezvoltarea testelor pentru caspaze ca biomareri pentru
apoptoz #/c0art*% i =van, &''B(.
Aceste teste se mpart n dou mari categorii, cele care monitorizeaz cliva+ul
caspazelor nsei prin estern blott i cele care msoar cliva+ul substratului fie prin
estern blott, fie prin metode colorimetriceDfluorometrice. Actual, anticorpii anti"
caspaze sunt disponibili comercial i pot fi folosii n urmrirea cliva+ului proteolitic
al membrilor cei mai importani ai familiei caspazelor, ca de exemplu caspazele -, B
i &5. Acest tip de studii asigur detalii importante asupra progresiei n timp a
cascadei caspazelor i au fost utilizate pentru determinarea rolurilor +ucate de diferii
membrii ai familiei n diferite esuturi. ;ezavanta+ele acestei abordri sunt
specificitatea anticorpilor i complexitatea. !entru cele mai multe aplicaii,
experimentele bazate pe cliva+ul substraturilor caspazelor sunt mai flexibile i
practice. @iturile ce testeaz cliva+ul substratului natural al caspazei"- prin estern
blot, poli #A;!"ribozei( polimerazei #!AK!(, nu sunt disponibile. n plus, exist o
varietate mare de substraturi peptidice artificiale, care se bazeaz pe situsurile declivare cunoscute, legate de un fluorofor sau de un cromogen. Anumite substraturi
peptidice au o specificitate mare, n timp ce altele sunt clivate de ctre civa membrii
ai familiei caspazelor. ;e asemenea, sunt disponibili i in*ibitorii, demonstrnd nc
o dat specificitatea metodei.
&
7/24/2019 Cap 23 Final
13/15
23.3.=. Cuant!)!care
Te*nicile reevaluate mai sus sunt diferite dar toate au ca obiectiv asigurarea
unei metode de cuantificare semnificativ a morii celulare n diferite condiii
experimentale. 0onversia numerelor brute obinute pe baza rezultatelor cu o
asemenea semnificaie determin numeroase provocri. !entru metode ce cuantific
proporia celulelor apoptotice i viabile fie n culturi celulare, fie in vivo, indicele
apoptotic poate fi calculat direct. !entru estimrile in vivo, aprecierea morfologic i
numrarea manual a seciunilor tisulare este cea mai comun prin analogie cu
metodologia indicelui de marca+ folosit pentru numrarea celulelor ce au iniiat
sinteza A;1 #Hoster, 555(.
/etodele tipice numr 555 de celule i evalueaz indicele apoptotic ca
raport al celulelor apoptotice fa de numrul total. Totui, acest lucru ar putea fi
insuficient datorit indicilor apoptotici bazali sczui #de ex. B"&4 celule apoptotice la
&5.555 de celule n ficatul de obolan(. Astfel, trebuie s existe un numr suficient de
celule pentru obinerea unor date semnificative.
n figura -.2A se prezint o te*nic T)1=> ce combin analiza imagistic
automatizat cu numrarea manual. 1umrul total de celule din fiecare lob *epatic
poate fi estimat prin analiza imagistic a numrului de nuclei din fiecare seciune
#dintr"o medie de 4 cmpuri luate la ntmplare( i o estimare a ariei seciunii.
7electarea a 4 cmpuri se bazeaz pe numrul minim necesar pentru obinerea unor
deviaii standard acceptabile de pn la &5R din valoarea medie. ;up aceast
apreciere automat a numrului total de celule, numrul total de celule apoptotice este
numrat manual prin scanarea sistematic a seciunii.)n exemplu al efectului a patru substane c*imice ce determin creterea ratei
apoptozei n ficatul obolanului este redat n figura -.2. n ciuda unor niveluri
foarte sczute ale apoptozei n ficatul netratat, s"a putut detecta o in*ibiie
semnificativ statistic a indicelui apoptotic #Koberts, 555(.
&-
7/24/2019 Cap 23 Final
14/15
'!(ura 23.= #A( D!a(raa te,n!c!! )o*o!te %entru ca*cu*area !nd!ce*u! a%o%tot!c #nec$!un! de )!cat co*orate %r!n te,n!ca TU6EL. B4 E)ectu* na)eno%!n8u*u!5 )eno/ar/!ta*u*u!od!c PB4 ! a %re(ne*o*on car/on!tr!*u*u! PC64 au%ra !nd!ce*u! a%o%tot!c AB>1?.???ce*u*e4 ! !nd!ce*e de arcare -%,ae BrdU LI4 #n )!catu* de o/o*an! #n )unc$!e de u/tan$e*e
! do&e*e %re&entate %e %atru &!*e.7e poate remarca cum indicele de marcare crete cu tratamentul,indicele apoptotic scade iar ficatul obolanilor tratai crete n dimensiuni.
;atele obinute prin flo"citometrie permit ele nsele cuantificarea, din
moment ce indicele apoptotic este derivat direct din profilul fluxului. n cazul
suspensiilor celulare sau n cazul sistemelor ce utilizeaz limfocitele, de exemplu,
te*nica flo"citometriei este relativ simpl i interpretarea uor inteligibil #Hraericolab., &''4(. n ciuda acestor aspecte, exist lucrri unde s"au observat doar corelaii
&2
7/24/2019 Cap 23 Final
15/15
limitate ntre apoptoza estimat prin flo"citometrie i evaluarea morfologic
#Koberts, 555(.
!entru metodele =>?7A, se livreaz o scal de densitate optic, ceea ce
necesit interpretarea pe baza unui set de curbe standard. Aa cum este descris n
subcapitolul -.-.-, raportarea scalei densitii optice la numrul real de celule pare
destul de dificil. Higura -.-0 prezint o comparaie ntre indicele apoptotic derivat
din metoda =>?7A 8moarte celular9, descris n subcapitolul -.-.-, cu cea derivat
dintr"un procedeu T)1=>.
23.=. Conc*u&!!
=xist numeroase metode de evaluare a modificrilor indicelui apoptotic,
fiecare avnd meritul lor #tabelul -.-(. Acestea vor continua s se dezvolte pentru a
crete uurina i acurateea cu care evenientele relativ rare precum apoptoza pot fi
urmrite.
Ta/e*u* 23.3. Co%ara$!! #ntre te,n!c!*e d!%on!/!*e de et!are a !nd!ce*u! a%o%tot!c
Te,n!ca Re)er!n$eMor)o*o(!e
&. /icroscopie optic ursc*i colab., &'BL. /icroscopie electronic
'ra(entare AD6
&. /icroscopie optic Hraer i colab., &''4. Hlo"citometrie /c0ar*%,=van, &''B
Te,n!c! cu ant!cor%!
&. /icroscopie optic Koberts, 555. =>?7A 8moarte celular9 A%alai colab., &''B-. Hlo"citometrie Hoster, 5555
/odificri ale procedeelor de pregtire i creterea specificitii te*nicilor
aplicate, mpreun cu descoperirea unor mareri noi, mai specifici promit s fac
acest domeniu din ce n ce mai productiv pe viitor.
&4