Post on 01-Nov-2021
BIOLOGISCHE FUNKTIONSANALYSE UND IDENTIFIZIERUNG NEUER SUBSTRATE
DER METHYLTRANSFERASE DNMT2
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
im Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften
der Universität Kassel
Vorgelegt von
Sara Müller
Kassel, Oktober 2011
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Nellen 2. Gutachter: Prof. Dr. Albert Jeltsch
Datum der Disputation: 23.12.2011
Beim Erforschen und Versuchen hört man auch die Frömmsten fluchen.
(Prof. Dr. Hans-Jürgen Quadbeck-Seeger, Chemiker Quelle : »Der Wechsel allein ist das Beständige«, 2002)
1. Zusammenfassung
3
1. Zusammenfassung
Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten
verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor
unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte,
wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der
“Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et
al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später
robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde
zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum
5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse
Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2
(Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011).
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-
Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung
durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC)
MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-
Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem
Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-
Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen.
Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-
Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten
interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und
tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese
Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen,
ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-
Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu
den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC)
vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und
intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro
Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat
der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden.
Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein
System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-
Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt
als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem
1. Zusammenfassung
4
Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung
dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und
(GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in
beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht
erhöhte Translationseffizienz der Reportergene.
Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte
Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer
dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich
reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war.
Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben
keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription
des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche
sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des
Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden.
In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus
E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben
vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des
Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise
fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen
vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind.
Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als
konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-
Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA
Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige
zelluläre Dnmt2-Funktionen.
2. Summary
5
2. Summary
The highly conserved DNA methyltransferase 2 (Dnmt2) is the most widely distributed
eukaryotic DNA methyltransferase; however, its biological function is still enigmatic. Although
weak m5C-DNA methylation on retroelements has been reported for “Dnmt2-only” organisms
like D. discoideum, D. melanogaster and E. histolytica, its role is still controversially discussed
(Kunert et al. 2003; Banerjee et al. 2005; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009; Schaefer et
al.). Recent data have shown methyltransferase activity on tRNAAsp for different Dnmt2
homologues and, thus, suggested a dual activity (Goll et al. 2006; Jeltsch et al. 2006).
My work focused on identification of new RNA substrates and the biological function of tRNA
methylation by Dnmt2. Methylation analysis of the Dictyostelium Dnmt2-homologue, DnmA, has
also revealed a tRNA methylation activity for tRNAAsp in vitro and in vivo. Additionally,
tRNAGlu(UUC) was identified as substrate in vitro. For the Dnmt2-Homologue of S. pombe (Pmt1)
tRNAAsp methylation activity was also experimentally verified.
To identify further RNA substrates, a crosslink-RNA-immunoprecipitation (RNA-CLIP) of GFP-
tagged DnmA was combined with Next-Generation-Sequencing of associated RNAs. This
approach revealed interaction of DnmA with tRNA fragments covering the part from the
anticodon loop to the T-loop of a tRNA. In addition to fragments of tRNAAsp(GUC) and
tRNAGlu(UUC/CUC) enrichment of tRNAGly(GCC) was observed. However, the origin of these fragments
as well as the biological function are still unknown. Interestingly, for some tRNA we detected
antisense fragments with a low number of reads. These fragments show complementarities to
the sense fragments but are a few nucleotides smaller. Moreover, a separate RNA-CLIP
experiment reveals several additional RNA candidate substrates. In further validation
experiments rnu2 (U2 snRNA) but not sno7 (snoRNA 7) and two previously not annotated
intergenic transcripts could be methylated to a low extend in vitro by DnmA and Dnmt2.
In D. discoideum the aspartate codon GAC is used at least ten times less in comparison to GAU.
But only tRNAAsp complementary to the rare GAC codon is annotated in Dictybase. The question
arises if a putative tRNAAsp methylation caused by DnmA has an influence on codon recognition
and “wobbling”. A GFP-reporter system with either a (GAU)5- or a (GAC)5-leader has been
established to approach differences in translation efficiency between wildtype cells and dnmAKO
mutants. Contradicting the hypothesis the (GAC)5-GFP construct was translated slightly more
efficiently than the (GAU)5-leader. Overall, the translation efficiency was elevated in dnmAKO
mutants.
Approaching the uptake of external DNA by dnmAKO mutants and wildtype cells I observed
significantly reduced transformation efficiency with an integrating plasmid for one but not a
2. Summary
6
second dnmAKO strain. However, the uptake of an extrachromsomal plasmid was impaired in this
second strain in comparison to wildtype.
Investigating the role of DnmA in regulation of the skipper retrotransposon no realationship
between the generation of small skipper RNA and enhanced transcription in dnmAKO cells was
detected. Furthermore, experiments with a second mutant as well as rescue experiments failed
to link the skipper mobilisation to DnmA function.
In a further project the binding of the m5C-binding protein of E. histolytica (EhMLBP) to LINE
DNA (long interspersed nuclear element) was imaged using atomic force microscopy. Despite
many end binding events a preferential binding site could be defined. Possibly this site
correspond to one out of two A/T-rich sequences which are anticipated to be involved in
EhMLBP target recognition.
In summary, my results confirm tRNAAsp methylation as conserved Dnmt2 function. Moreover,
they indicate that DnmA has additional tRNA substrates and for the first time a putative non-
tRNA substrate is presented. In addition, several new phenotypes hint at extended roles of
Dnmt2 in cellular function.
3. Danksagung
7
3. Danksagung
Ich möchte mich bedanken…
…bei Wolfgang Nellen für ein Stück Laborbank, drei Pipetten, Enzyme, Nukleotide uvm.
Kurzum: für die Möglichkeit in seiner Abteilung eine Doktorarbeit anzufertigen und die
hervorragende Betreuung.
…bei Albert Jeltsch (Jacobs University Bremen), der sich als Zweitkorrektor für diese Arbeit zur
Verfügung gestellt hat.
…bei Tomasz Jurkowski (Abt. Jeltsch, Jacobs University Bremen) für die Vermittlung von
technischem Know-how und die Bereitstellung des hDnmt2-Plasmids.
…bei Cynthia Sharma und Jörg Vogel (Julius-Maximilians-Universität Würzburg), deren
Abteilung die RNA-Sequenzierungen durchgeführt hat. Außerdem danke ich Carsten Seehafer
(Abt. Hammann, TU Darmstadt) für die Hilfestellung bei der Datenauswertung.
…bei Oliver Bertinetti (Abt. Herberg, Universität Kassel) für die Massenspektrometrie.
…bei Markus Maniak (Universität Kassel) für die Bereitstellung des Fluoreszenzspektrometers.
…bei den gesamten Arbeitsgruppen Genetik und Zellbiologie für die angenehme und
kooperative Arbeitsatmosphäre. Insbesondere danke ich Indra Windhof für produktive Dnmt2-
Diskussionen und Sonja Fuhrmann für die Unterstützung bei der Klonierung der U2-snRNA
Vektoren. Ebenfalls soll an dieser Stelle die enge Zusammenarbeit mit den ehemaligen
Mitarbeitern Susanne Junk und Vladimir Maximov nicht unerwähnt bleiben.
…bei meinen Großpraktikanten Robin Lorenz, Katrin Thüne, Sebastian Regett und Nadja
Arens, die das Dnmt2-Projekt während ihrer Praktika tatkräftig unterstützt haben. Zusätzlicher
Dank geht an Robin für die Bereitstellung der Daten zur RNA Bisulfitsequenzierung, die er im
Rahmen einer Kooperation mit Matthias Schäfer (Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg) erhoben hat.
…bei allen Mitgliedern der der DFG FOR1082 für hilfreiche Diskussionen auf den Forscher-
gruppentreffen und darüber hinaus bei Malte Bussiek (Abt. Nellen, Universität Kassel), Serge
Ankri (Technion, Haifa, Israel), Maria Becker (Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-
Essen) und Olaf Nickel (Abt. Reuter, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg) für
Kooperationen bei Teilprojekten...
…bei der Studienstiftung des deutschen Volkes für knapp drei Jahre Promotionsförderung.
…und zu guter Letzt bei Kim Tobias und meinen Eltern, die auch das Fluchen geduldig
ertragen haben.
4. Inhaltsverzeichnis
8
4. Inhaltsverzeichnis
1. ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................................................................3
2. SUMMARY.....................................................................................................................................................5
3. DANKSAGUNG ..............................................................................................................................................7
4. INHALTSVERZEICHNIS ...............................................................................................................................8
5. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS....................................................................................................................11
6. EINLEITUNG ...............................................................................................................................................14
6.1. KATALYTISCHE BASENMODIFIKATIONEN IN NUKLEINSÄUREN.................................................................14 6.1.1. DNA Modifikationen in Eukaryoten..........................................................................................14 6.1.2. Modifizierte Nukleotide in eukaryotischer RNA .....................................................................16 6.1.3. DNA versus RNA 5mC-Methyltransferasen ..............................................................................20
6.2. DIE EUKARYOTISCHEN DNA 5MC-METHYLTRANSFERASEN.....................................................................22 6.2.1. Dnmt1-RID-CMT Methyltransferasen ......................................................................................23 6.2.2. Die Dnmt3 Familie ......................................................................................................................24 6.2.3. Dnmt2 – eine bifunktionelle DNA/RNA Methyltransferase?.................................................27
6.3. EPIGENETISCHE GENREGULATION..........................................................................................................31 6.3.1. Dynamik zwischen DNA Methylierung und Histoncode ........................................................31 6.3.2. Methyl-CpG-bindende Proteine .................................................................................................33 6.3.3. Erkrankungen durch aberrante DNA und RNA Modifikationen ..........................................34
6.4. DICTYOSTELIUM ALS MODELLORGANISMUS IN DER EPIGENETISCHEN FORSCHUNG....................................35
7. ZIELSETZUNG ............................................................................................................................................37
8. MATERIALIEN............................................................................................................................................38
8.1. GERÄTE................................................................................................................................................38 8.2. VERBRAUCHSMATERIALIEN...................................................................................................................39 8.3. CHEMIKALIEN .......................................................................................................................................40 8.4. AFFINITÄTSMATRICES FÜR CHROMATOGRAPHIE UND IMMUNPRÄZIPITATIONEN .....................................42 8.5. PUFFER UND LÖSUNGEN........................................................................................................................42 8.6. KITS.....................................................................................................................................................48 8.7. ENZYME UND ENZYMPUFFER .................................................................................................................48 8.8. GRÖßENSTANDARDS .............................................................................................................................49 8.9. NUKLEOTIDE ........................................................................................................................................49 8.10. ANTIKÖRPER ........................................................................................................................................50 8.11. NÄHRMEDIEN .......................................................................................................................................50 8.12. ANTIBIOTIKA........................................................................................................................................51 8.13. BAKTERIENSTÄMME .............................................................................................................................51 8.14. STÄMME DICTYOSTELIUM DISCOIDEUM...................................................................................................51 8.15. STAMM DROSOPHILA MELANOGASTER ....................................................................................................52 8.16. OLIGONUKLEOTIDE/PRIMER.................................................................................................................52 8.17. PLASMIDE ............................................................................................................................................56 8.18. KLONIERUNGSSTRATEGIEN ...................................................................................................................58 8.19. SEQUENZEN/GENE................................................................................................................................61
9. METHODEN ................................................................................................................................................62
9.1. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN ..............................................................................................................62 9.1.1. Anzucht von Escherichia coli .....................................................................................................62 9.1.2. Herstellung kompetenter Escherichia coli Zellen ..................................................................62 9.1.3. Transformation von Escherichia coli .......................................................................................62 9.1.4. Anzucht von Dictyostelium discoideum ...................................................................................62 9.1.5. Transformation von Dictyostelium discoideum .....................................................................63 9.1.6. Subklonierung von Dictyostelium discoideum .......................................................................63 9.1.7. Ernten von Sporen.......................................................................................................................64 9.1.8. Hitzeschock-Behandlung von Dictyostelium Zellen ...............................................................64 9.1.9. Hungerexperimente mit Dictyostelium Zellen in Schüttelkultur.........................................64 9.1.10. Fluoreszenzmikroskopie .......................................................................................................64 9.1.11. Fluoreszenzspektrometrie ....................................................................................................65
4. Inhaltsverzeichnis
9
9.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ..................................................................................................66 9.2.1. Präparation genomischer DNA aus Dictyostelium discoideum ...........................................66 9.2.2. Präparation von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum .............................................66 9.2.3. Anreicherung kleiner RNA aus Gesamt-RNA...........................................................................67 9.2.4. Trennung von Kern und cytoplasmatischer RNA ...................................................................67 9.2.5. Phenol/Chloroform Extraktion .................................................................................................67 9.2.6. Fällung von Nukleinsäuren .......................................................................................................68 9.2.7. Plasmidpräparationen aus E. coli ............................................................................................68 9.2.8. Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen ........................................................................68 9.2.9. Dephosphorylierung von Nukleinsäuren ................................................................................69 9.2.10. Phosphorylieren von Oligonukleotiden ..............................................................................69 9.2.11. Ligation von DNA Fragmenten .............................................................................................69 9.2.12. Hybridisieren komplentärer Oligonukleotide ...................................................................70 9.2.13. Polymerasekettenreaktion (PCR) ........................................................................................70 9.2.14. Rekursive PCR .........................................................................................................................71 9.2.15. Quantitative Real time-PCR ..................................................................................................71 9.2.16. PCR zur Herstellung methylierter PCR-Fragmente...........................................................72 9.2.17. Elektrophoretische Trennverfahren ...................................................................................73 9.2.18. Gelelution ................................................................................................................................74 9.2.19. Elektroelution .........................................................................................................................75 9.2.20. RNA Bisulfitsequenzierung ...................................................................................................75 9.2.21. Northern-Blot (Kapillarblot) ................................................................................................75 9.2.22. Northern-Blot für kleine RNAs (Semidry-Blot) ..................................................................76 9.2.23. Stripping von Northern Blots ...............................................................................................76 9.2.24. In vitro Transkription............................................................................................................76 9.2.25. Gelfiltration.............................................................................................................................78 9.2.26. Radioaktive Endmarkierung von Nukleinsäuren..............................................................78 9.2.27. Random primed oligo-labeling ............................................................................................78 9.2.28. Primer extension ....................................................................................................................79
9.3. BIOCHEMISCHE METHODEN ..................................................................................................................79 9.3.1. Überexpression rekombinanter Proteine in Escherichia coli ..............................................79 9.3.2. Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine aus E. coli.......................................................80 9.3.3. Affinitätsreinigung getaggter Proteine aus Dictyostelium ..................................................82 9.3.4. Co-Immunopräzipitationen von RNA .......................................................................................83 9.3.5. RNA Sequenzierung (Next-Generation-Sequenzierung) .......................................................85 9.3.6. Präparation von Gesamtprotein aus Dictyostelium discoideum.........................................85 9.3.7. Fällung von Proteinen ................................................................................................................85 9.3.8. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................................85 9.3.9. Coomassie Färbung ....................................................................................................................86 9.3.10. Coomassie Schnelltest............................................................................................................86 9.3.11. Massenspektrometrie (nanoLC-ESI-MS/MS Analyse) .......................................................86 9.3.12. Western Blot............................................................................................................................86 9.3.13. Proteinmengenbestimmung nach Bradford ......................................................................87 9.3.14. 3H-in vitro Methylierungsassay ...........................................................................................87 9.3.15. 3H-in vitro Shift-Assay............................................................................................................88 9.3.16. 3H-in vitro Blockierungs-Assay ............................................................................................88
9.4. BIOPHYSIKALISCHE METHODEN ............................................................................................................89 9.4.1. Probenvorbereitung für Atomic Force Microscopy................................................................89 9.4.2. AFM Imaging................................................................................................................................89
10. ERGEBNISSE ..........................................................................................................................................90
10.1. IN VITRO METHYLIERUNG VON NUKLEINSÄUREN AUS DICTYOSTELIUM DURCH DNMT2- HOMOLOGE ........90 10.1.1. Heterologe Expression und Reinigung von Dnmt2-Homologen aus E. coli ..................90 10.1.2. Das Dictyostelium Dnmt2-Homolog DnmA methyliert tRNA in vitro .............................91 10.1.3. Identifizierung von potentiellen tRNA-Substraten aus Dictyostelium ...........................96 10.1.4. tRNAAsp und tRNAGlu sind in vitro Substrate von Dnmt2-Homologen ..............................97 10.1.5. RNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen ............................101 10.1.6. Der in vivo Methylierungsstatus ausgewählter tRNAs in Dictyostelium .....................103 10.1.7. Das Dnmt2-Homolog Pmt1 aus S. pombe ist eine aktive tRNA Methyltransferase ....105
4. Inhaltsverzeichnis
10
10.2. IDENTIFIZIERUNG NEUER DNMA SUBSTRATE .......................................................................................106 10.2.1. Etablierung eines RNA-CLIP Systems zur Analyse von DnmA-RNA Interaktionen .....106 10.2.2. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit FA-crosslinking und
454-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten RNAs..................................................107 10.2.3. Dictyostelium U2-snRNA kann in vitro von Dnmt2-Homologen methyliert werden .110 10.2.4. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit UV- crosslinking und
Illumina®-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten RNAs .......................................112 10.3. EINFLUSS DER TRNAASP-METHYLIERUNG DURCH DNMA AUF DIE TRANSLATIONSEFFIZIENZ..................118
10.3.1. Aspartat-Codon usage in verschiedenen Organismen ...................................................118 10.3.2. Das „Asp-leader“-Reportersystem .....................................................................................119 10.3.3. DnmAKO-Mutanten zeigen leicht erhöhte Translationseffizienz ...................................120 10.3.4. DnmA ist nicht an der Transkriptionskontrolle des GFP-Reportergens beteiligt .....121
10.4. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON DNMA AUF DIE AUFNAHME UND INTEGRATION VON ........................... FREMD-DNA .....................................................................................................................................122 10.5. VERTIEFENDE ANALYSE ZUR FUNKTION VON DNMA BEI DER REGULATION DES RETROTRANSPOSONS ......... SKIPPER..............................................................................................................................................124
10.5.1. Untersuchung kleiner RNAs des Retrotransposons skipper ..........................................124 10.5.2. Analyse der skipper Transkription in DnmA-Mutanten .................................................125 10.5.3. Relative Bestimmung der skipper Kopienzahl in DnmA-Mutanten..............................127 10.5.4. In vitro Methylierung von DIRS-1 LTR und skipper RT Fragmenten ............................127
10.6. UNTERSUCHUNG VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN..................................................................128 10.7. ANALYSE SPEZIESÜBERGREIFENDER DNMT2 FUNKTIONEN ...................................................................132
10.7.1. Heterologe Expression humaner Dnmt2 in Dictyostelium.............................................132 10.7.2. Klonierung von DnmA in einen Drosophila Expressionsvector.....................................132
10.8. EINZELMOLEKÜLUNTERSUCHUNGEN DES 5MC-BINDENDEN PROTEINS EHMLBP AUS E. HISTOLYTICA .....133
11. DISKUSSION ........................................................................................................................................136
11.1. TRNA METHYLIERUNG ALS KONSERVIERTE DNMT2 FUNKTION............................................................136 11.1.1. DnmA und Pmt1 sind aktive tRNA Methyltransferasen .................................................136 11.1.2. tRNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen ...........................138 11.1.3. Endogene Dnmt2-Aktivität unterliegt vermutlich Umwelteinflüssen..........................138
11.2. DNMT2 ALS MULTISUBSTRAT-(T)RNA-METHYLTRANSFERASE ...........................................................139 11.2.1. Ist die RNA Methylierung durch Dnmt2 sequenzspezifisch?..........................................139 11.2.2. Methylierung vs. Bindung - dynamische Substraterkennung durch Dnmt2 ...............142
11.3. IDENTIFIZIERUNG VON NEUEN PUTATIVEN RNA-SUBSTRATEN MITTELS RNA-CLIP .............................144 11.3.1. U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA Substrat der Dnmt2 ..........................................146 11.3.2. DnmA ist mit tRNA-Fragmenten assoziiert ......................................................................147
11.4. BIOLOGISCHE FUNKTIONSANALYSE VON DNMT2..................................................................................150 11.4.1. Einfluss der tRNAAsp Methylierung auf die Translationseffizienz .................................150 11.4.2. Protein-Protein-Interaktionen ...........................................................................................152 11.4.3. Beeinflusst DnmA die Aufnahme von Fremd-DNA? .........................................................153 11.4.4. DnmA - ein Regulator des Retrotransposons skipper? ...................................................154
11.5. DAS BINDEVERHALTEN DES METHYLATED-LINE-BINDING-PROTEINS AUS E. HISTOLYTICA ....................155
12. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................................156
13. ERKLÄRUNG ........................................................................................................................................167
5. Abkürzungsverzeichnis
11
5. Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
Amp Ampicillin
AP Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminosäure
asRNA antisense RNA
ATP Adenosintriphosphat
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat
bp Basenpaare
BS Blasticidin
C Cytosin
CAM Chloramphenicol
cDNA copy/complemtary DNA
ChIP Chromatin-Immunopräzipitation
CTP Cytidintriphosphat
DAPI 4’,6-Diamidin-2’-phenylindol
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)
DnmA DNA Methyltransferase A (Dnmt2-Homolog)
Dnmt DNA-Methyltransferase
DTBP Dimethyl-3,3´-dithiobispropionimidate
dNTP Desoxyribonukleotide
DMF Dimethylformamid
dsRNA doppelsträngige RNA
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EhMLBP E. histolytica methylated LINE binding protein
EMSA electrophoretic mobility shift assay
ESC embryonale Stammzelle (embryonic stem cell)
EtOH Ethanol
F Farad
FA Formamid
G Guanin
G418 Geniticin
gDNA genomische DNA
5. Abkürzungsverzeichnis
12
GFP grün fluoreszierendes Protein
GSH Glutathion (γ-L-Glutamyl-L-Cysteinglycin)
GST Glutathion-S-Transferase
GTC Guanidiniumthiocyanat
GTP Guanosintriphosphat
gus β-Glucuronidase
h Stunde
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
5hmC 5-Hydroxymethylcytosin
IMAC immobilized metal chelat affinity chromatography
IPTG Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
KA Klebsiella aerogenes (Klebsiella mobilis)
KAN Kanamycin
kb Kilobasenpaare
kD Kilodalton
L Liter
LINE Long Interspersed Nuclear Element
LTR Long terminal repeat
M Molar (mol/L)
mA Milliampere
MBD methyl-CpG-binding domain protein
5mC 5-Methylcytosin
MeOH Methanol
min Minuten
miRNA micro RNA
MOPS 3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure
MTase Methyltransferase
MW molecular weight (Molekulargewicht)
ncRNA nicht-kodierende RNA
nt Nukleotide
NiNTA Nickel-Nitrilotriessigsäure
OD optische Dichte
Pi ortho-Phosphat
PAA Polyacrylamid
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
piRNA piwi-interacting RNA
5. Abkürzungsverzeichnis
13
PNK Polynukleotid Kinase
Pmt1 Pombe Methyltransferase 1 (Dnmt2-Homolog)
PSTVd potato spindle tuber viroid
qPCR quantitative PCR
rcf relative centrifuge force
RNA Ribonukleinsäure (ribonuecleic acid)
RNA-CLIP Crosslink-RNA-Immunopräzipitation
RNAi RNA Interferenz
RKM Rasterkraftmikroskopie
rNTP Ribonukleotide
rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
RT Reverse Transkriptase
s Sekunde
SAH (AdoHcy) S-Adenosylhomocystein
SAM (Adomet) S-Adenosylmethionin
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulphate)
siRNA small interfering RNA
snRNA small nuclear RNA
snoRNA small nucleolar RNA
SSC Standard saline citrate
SSPE Standard saline phosphate with EDTA
ssDNA singlestranded DNA
Su(var) Suppressor of variegation
T Thymin
TAP Tandem affinity purification
TBE Tris-Borat-EDTA
TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
TRD Target recognition domain
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
tRNA transfer RNA
TTP Thymidintriphosphat
U Uracil
u unit (Enzymeinheit)
üN über Nacht (~ ca. 16h)
UTP Uridintriphosphat
UV Ultraviolett
V Volt
6. Einleitung
14
6. Einleitung
Der Großteil des genetischen Materials einer eukaryotischen Zelle ist als Chromatin, einem
Komplex aus DNA und Proteinen (überwiegend Histonen), organisiert. Dabei wird die
Erbinformation nicht wie lange Zeit angenommen statisch allein durch die Abfolge der vier
Desoxyribonukleotide definiert, sondern das Genom unterliegt einer dynamischen Regulation.
Diese prägt sich beispielsweise in entwicklungs- oder gewebespezifischen Transkriptomen
sowie Veränderungen in der Genexpression als Reaktion auf Umweltbedingungen aus.
Varianzen im Genexpressionsmuster einer Zelle gehen dabei auf Änderungen in der
Chromatinstruktur zurück, an der neben post-translationaler Modifikationen der Histone vor
allem auch chemische Modifikationen der DNA beteiligt sind. Auch die Funktion vieler nicht
kodierender RNAs (ncRNAs) hängt oft von kovalenten Nukleotidmodifikationen ab.
6.1. Katalytische Basenmodifikationen in Nukleinsäuren
Katalytische Basenmodifikationen von Nukleinsäuren kommen in allen drei Reichen des Lebens
und zusätzlich in einigen Viren vor. Modifizierte DNA-Nukleotide sind dabei im Vergleich zu RNA
Modifikationen deutlich weniger divergent, da modifizierte Basen anfälliger für Mutationen sind
und die Erhaltung des Doppelstranges für das Überleben vermutlich essentiell ist
(zusammengefasst in Iyer et al. 2011). 1948 wurde erstmalig über das Auftreten nicht-
kanonischer Nukleotide in DNA berichtet (Hotchkiss 1948). Zwei Jahre später wurde 5-
Methylcytosin als fünfte Base der DNA (Wyatt 1950) und Mitte der fünfziger Jahre Pseudouridin
in RNA identifiziert (Davis et al. 1957; Cohn 1960). Seitdem sind mehr als 100 RNA
Modifikationen sowie einige weitere DNA Modifikationen entdeckt worden. Funktionell wurden
DNA Modifikationen als erstes in Bakterien als Bestandteil der Restriktions-Modifikations-
Systeme beschrieben. Dazu gehören die Methylierung des C5 von Cytosinen sowie die
Modifikationen N4-Methylcytosin und N6-Methyladenin (Ehrlich et al. 1987).
6.1.1. DNA Modifikationen in Eukaryoten
Mit Ausnahme der exozyklisch modifizierten Base N6-Methyladenin in niederen Eukaryoten wie
z. B. Tetrahymena (Hattman 2005) galt in höheren Eukaryoten 5-Methylcytosin (5mC) lange als
einzige Basenmodifikation. Mittlerweile ist mit 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) eine sechste
Base bekannt (Kriaucionis et al. 2009; Tahiliani et al. 2009), der ebenfalls eine Bedeutung
hinsichtlich epigenetischer Genregulation zugeschrieben wird (Abbildung 1). Neueste Studien
mittels single molecule real time-Sequenzierung deuten daraufhin, dass in eukaryotischer DNA
möglicherweise noch weitere Nukleotidmodifikationen vorhanden sind (Flusberg et al. 2010).
6. Einleitung
15
Desoxyribose
5-Methylcytosin
Desoxyribose
Cytosin
Desoxyribose
5-Hydroxymethylcytosin
MethylierungDnmt1, Dnmt3a/b, (Dnmt2)
(?) HydroxylierungTet 1-3
Demethylierung
N
NO H
NH2
N
NO H
CH3
NH2
N
NO H
NH2
OH
5-Methylcytosin
In Vertebraten, einigen Insekten (z. B. A. mellifera) und Deuterostomia (z. B. E. esculentus)
kommt 5mC überwiegend in symmetrischen CpG-Dinukleotiden vor (zusammengefasst in Suzuki
et al. 2008). In Säugetieren sind 60-90% aller Cytosine in CpG-Dinukleotiden methyliert (globale
Methylierung), das einem Anteil von 3-8% aller Cytosine entspricht (zusammengefasst in Jeltsch
2002). Ausnahmen bilden CpG-reiche Regionen (CpG islands), die nahe transkriptioneller
Startstellen (TSS) euchromatischer Gene vorkommen und weitestgehend unmethyliert bleiben.
In Pflanzen, Pilzen und vielen Invertebraten kommt DNA Methylierung meist in mosaikartigen
Strukturen vor. Neben CpG-Methylierung besitzen Pflanzen zusätzlich Methylierung von
Cytosinen in symmetrischen CpNpG (N = C, A, G, T) Kontexten und wie Pilze und viele
Invertebraten asymmetrische DNA Methylierung in CpNpN Abfolgen (Suzuki et al. 2008). Auch
in humanen embryonalen Stammzellen (ESC) wurde mittlerweile Nicht-CpG-Methylierung
beobachtet. Die Methylierung tritt hier überwiegend im gene body von Genen auf, die in RNA
Prozessierung, RNA Spleißen und RNA Stoffwechsel involviert sind, und ist mit aktiven Genen
assoziiert (Lister et al. 2009). Diese asymmetrische Methylierung verliert sich während der
Differenzierung und ihre biologische Funktion ist bisher unklar.
1975 wurde DNA Methylierung erstmals mit transkriptioneller Aktivität in Verbindung gebracht
und als „zelluläres Gedächtnis“ vorgeschlagen (Holliday et al. 1975; Riggs 1975). Heute ist
bekannt, dass in Eukaryoten vor allem heterochromatische Regionen wie perizentrische und
subtelomerische Bereiche durch DNA Methylierung transkriptionell inaktiviert werden.
Außerdem ist 5-Methylcytosin an der Stilllegung von Retroelementen (Walsh et al. 1998) sowie
einigen single copy Genen (z. B. X-linked Rhox cluster in Mäusen) beteiligt (Oda et al. 2006) und
für die Erhaltung der X-Chromosom-Inaktivierung sowie der Differenzierung embryonaler
Abbildung 1: Die Base Cytosin kann endozyklisch an der Position C5 des Pyrimidinrings durch DNA Methyl-transferasen (Dnmts) zu 5-Methylcytosin methyliert werden (Kapitel 6.2). Ein Mechanismus zur Demethylierung verläuft möglicherweise über die Hydroxylierung von m5C zu 5-Hydroxy-methylcytosin durch Tet-Proteine.
6. Einleitung
16
Stammzellen (ESCs) essentiell (Li et al. 1993a; Panning et al. 1996). Im Gegensatz zu ESCs büßen
adulte hämatopoetische Stammzellen bei Verlust der DNA Methylierung sogar schon die
Fähigkeit zur Selbsterneuerung ein (Trowbridge et al. 2009). DNA Methylierung ist ebenfalls ein
wesentlicher Bestandteil gesunder Embryonalentwicklung. Genomweite De- und
Remethylierung finden sowohl in der Zygote als auch in Primordialen Keimzellen statt, bei
denen auch neue Imprints gesetzt werden (zusammengefasst in Reik et al. 2001).
Base J und 5-Hydroxymethylcytosin
In Euglenoozoa wie Trypanosoma und Leishmania wird Base J (β-D-glucosyl-hydroxy-
methyluracil) mit der Assemblierung von Heterochromatin assoziiert und entsteht durch
Hydroxylierung und nachfolgende Glykosylierung der Base Thymin (zusammengefasst in Borst
et al. 2008). An diesem Prozess sind JBP-Hydroxylasen beteiligt, die zur Familie der 2-
Oxoglutarat- und Fe2+-abhängigen Dioxygenasen gehören. Derselben Familie werden die Tet
(Ten eleven Translocation)-Onkogene in Metazoen (Tet1-3) zugeordnet, deren Produkte
strukturelle Ähnlichkeiten zur DNA Methyltransferase Dnmt1 aufweisen und die Umwandlung
von 5-Methylcytosin zu 5-Hydroxymethylcytosin katalysieren. Mit Überexpression von murinem
Tet1 und Tet2, aber nicht Tet3, in U2OS and HEK293T Zellen korreliert das Auftreten von 5-
Hydroymethylcytosin mit der Abnahme von 5-Methylcytosin (Ito et al.). Außerdem spielt 5hmC
für die Selbsterhaltung von ESC durch Einfluss auf das Markergen Nanog sowie die Erhaltung
der inneren Zellmasse (ICM) eine essentielle Rolle (Ito et al.). Da bei hohem pH-Wert unter
Abspaltung von Formaldehyd eine spontane Umwandlung von 5-Hydroxylmethylcytosin zu
Cytosin stattfinden kann, besteht die Möglichkeit, dass 5hmC als Intermediat eines direkten
Demethylierungsprozesses dient (Privat et al. 1996) (Abbildung 1). Allerdings gibt es mehrere
Hinweise, dass 5hmC eine eher indirekte Funktion hat. Dazu gehört beispielsweise, dass eine
spezifische 5hmC Glykosylaseaktivität in Extrakten aus Kalbsthymus entdeckt worden ist
(Cannon et al. 1988).
6.1.2. Modifizierte Nukleotide in eukaryotischer RNA
Mehr als zwei Drittel der ca. 100 beschriebenen RNA Modifikationen beinhalten das Übertragen
einer Methylgruppe und finden mit wenigen Ausnahmen posttranskriptionell statt
(zusammengefasst in Motorin et al. 2011). RNA Methylierung kommt an allen vier
Hauptnukleotiden sowie Inosin und Pseudouridin vor (Abbildung 2) und hat oft mehrere
Funktionen. Aufgrund milder Phänotypen der zugehörigen Knockout-Mutanten sind RNA
Methylierungen häufig schwer zu untersuchen.
6. Einleitung
17
Guanosin Adenosin
UridinCytidin
Inosin
Pseudouridin
N N
NNH
O
NH2
O
OH
O
PO
OO
5´
3´
2´
1
23
7
Gm, m1G, m2G, m7G, m22G, imG,
m2,7G, m2,2,7G, yW, o2yW, OHyW,
OHyW*
Am, m1A, m6A, ms2m6A, m62A,
m62Am, m1Am, m6Am, i6A, io6A
m1I, Im
Cm, m3C, m5C, m5Cm, hm5C, m4C, f5Cm, m4C, ac4C
Um, m5U, m5Um, m3U, m3Um,m5D, mcm5U, s2U, ho5U, tm5U
mY,m1Y,m1acp3Y
5´
3´
2´
NHNH
O
O
OH
O
PO
OO
O
1
3´
N N
N
C
N
NH2
O
OH
O
PO
OO
5´
2´
12
6
5´
3´
2´
N
N
O
C
NH2
O
OH
O
PO
OO
3
4
5
5´
3´
2´
N
NH
O
C
O
O
OH
O
PO
OO
3
5
2
5´
3´
2´
N N
NNH
O
O
OH
O
PO
OO
1
Abbildung 2: Beispiele methylierter Nukleotide in eukaryotischer RNA. Methylierungen treten an den meisten Stickstoffatomen auf. Ausnahmen sind Stickstoffatome der glykosidischen Bindung sowie N3 und N7 von Adenosin. Zusätzlich treten RNA Methylierungen als 2´-O-Methylierung, 5-Methylpyrimidin sowie des Kohlenstoffatoms C2 und C8 am Adenosin auf. Ebenfalls sind Derivate von Wybutosin (yW) dargestellt. m: methyl, imG: Wyosine, o2: peroxy, OH: hydroxy, i: isopentyl, io: hydroxyisopentenyl, hm: hydroxy-methyl, f: formyl, ac: acetyl, D: Dihydrouridin, mcm: methoxycarbonylmethyl, s: thio, ho: hydroxy, t: taurin, Y = Ψ: Pseudouridine, acp: 3-amino-3-carboxylpropyl. (RNA Modifikationen entnommen aus http://rna-mdb.cas.albany.edu/RNAmods)
tRNA
tRNAs gehören zu den am besten untersuchten und am stärksten modifizierten RNAs
(Abbildung 3), wobei ihre Modifikationen zwischen einzelnen Spezies variieren können. tRNA
Modifikationen lassen sich nach ihrer Funktion in zwei große Gruppen einteilen: strukturelle
und metabolische Stabilität sowie Dekodierung von mRNA (zusammengefasst in Motorin et al.
2011).
6. Einleitung
18
Abbildung 3: Übersicht über tRNA Methylierungen in höheren Eukaryoten (modifiziert nach Motorin et al. 2011). Identische Modifikationen sind gleichfarbig gekennzeichnet. Positionen, die verschiedene Modifikationen tragen können, sind braun. Abkürzungen sind in der Legende von Abbildung 2 erklärt.
Beispielsweise begünstigen 2´-O-
Methylierungen an Pyrimidinen die C3´-endo-
Konformation des Zuckers und erhöhen so
die Schmelztemperatur der tRNA (Kawai et
al. 1992). In S. cerevisia gibt es mindestens
zwei Wege zum Abbau hypomodifizierter
und damit vermutlich fehl gefalteter tRNA.
Der TRAMP pathway (Cid14/Trf4-Air1-Mtr4
polyadenylation complex) wurde in
Trm6/Trm61 Mutanten entdeckt, denen
m1A58 in der tRNAiMet fehlt. Die tRNA wird
zunächst polyadenyliert und anschließend
durch das Exosom abgebaut (Kadaba et al.
2004). Rapid tRNA decay (RTD) ist erstmals
in TRM8 und TRM4 Doppelmutanten
beschrieben worden, in denen tRNAVal(AAC)
aufgrund fehlender im m7G und m5C
variablen Loop verstärkt durch die 5´-3´-
Exonukleasen Rat1 und Xrn1 degradiert wird (Alexandrov et al. 2006; Chernyakov et al. 2008).
Beschleunigter Abbau hypomodifizierter tRNA erfolgt in der Hefe auch als Antwort auf
oxidativen Stress (Chan et al. 2010). Auch das Fehlen von m5C38 in Drosophila Dnmt2-Knockout-
Mutanten vermindert die Stabilität verschiedener tRNAs nach Hitze- und oxidativem Stress
(Schaefer et al. 2010b). Neueste Erkenntnisse zeigen, dass Abbauprodukte von tRNAs häufig
definierte Fragmentlängen besitzen, z. B. 19mere des 5´-Endes oder „half-tRNAs“ (Schopman et
al.; Cole et al. 2009; Hsieh et al.). Inwiefern diese Produkte biologische Funktionen ausüben,
bleibt momentan Spekulation: Möglicherweise spielen Abbauprodukte von tRNAs eine Rolle bei
der Translationsinhibition oder können miRNA/siRNA ähnliche Funtionen ausüben
(zusammengefasst in Thompson et al. 2009).
Modifizierte Nukleotide des Anticodonloops einer tRNA spielen eine wesentliche Rolle bei der
Erhaltung des Leserasters während der Translation, wobei die bisher gewonnen Erkenntnisse
überwiegend auf prokaryotischen Translationssystemen beruhen. An Frameshifting Ereignissen
in Richtung +1 und -1 sind beispielsweise modifizierte Nukleotide an den Positionen 34 (u. a.
mnm5s2U34, Q34) und 37 (u. a. ms2io6A37, m1G37) beteiligt. An den genannten Positionen
mutierte tRNAs erhöhen das Auftreten eines Frameshifting Ereignisses um den Faktor 1,5 – 9,0
(Urbonavicius et al. 2001). Modifikationen an der Position 37 können beispielsweise eine vierte
Basenpaarung zwischen tRNA und mRNA verhindern. Durch Inkorporation von s2U34 in
6. Einleitung
19
unmodifizierte Transkripte der tRNALys(UUU) konnte gezeigt werden, dass diese Modifikation für
das „Wobbling“ dieser tRNA auf den Codons AAA und AAG verantworlich ist, aber gleichzeitig
falsches „Wobbling“ auf den Asparagin-Codons AAU und AAC verhindert (Ashraf et al. 1999).
Die Methylierung des G37 zu m1G37 in tRNAAsp aus Hefe schützt vor aberranter Aminoacylierung
der tRNA durch Argininyl-tRNA-Synthetase (Putz et al. 1994). Für tRNA Modifikationen im
Anticodonloop ist zusätzlich eine Bedeutung beim tRNA Priming der reversen Transkription von
Retroviren (HIV-1) vorgeschlagen worden, wobei die ursprünglichen Ergebnisse später nicht
reproduziert werden konnten (Barat et al. 1989; Thrall et al. 1996).
TRM9 aus S. cerevisiae ist neben ca. 25 weiteren Proteinen an der Modifikation von U34 beteiligt
(zusammengefasst in Motorin et al.) und bringt tRNA Modifikationen mit einer Reihe weiterer
zellulärer Prozesse in Verbindung: So ist TRM9 Teil des Elongator-Komplexes (Huang et al.
2005) und koppelt tRNA Modifikationen mit Histonacetylierung (Wittschieben et al. 1999) und
Exozytose (Rahl et al. 2005). Weiterhin verbinden TRM9 Modifikationen die Translation mit
DNA damage respsonse (Begley et al. 2007) und erzeugen Erkennungsmuster für Ribotoxine wie
Zymocin (Jablonowski et al. 2006). Zusätzlich wurde eine Auswirkung von TRM9 und Dnmt2
katalysierten tRNA Modifikationen auf die Regulation der Lebensspanne vorgeschlagen
(Fabrizio et al. 2010; Schaefer et al. 2010b).
rRNA
rRNA aller lebender Organismen enthalten sowohl Methylierungen von Basen als auch 2´-O-
Methylierungen der Ribosen. Funktionell ist Basenmethylierung von rRNA wichtig für den Erhalt
der Sekundärstruktur. In Hefe ist das Ausschalten von Dim1, einer konservierten m62A m62A
Dimethylase der 18S rRNA, sogar letal (Lafontaine et al. 1994). Generell führen hypomodifizierte
rRNAs zu geringerer Translationseffizienz (zusammengefasst in Motorin et al. 2011).
mRNA
Soweit bisher bekannt, beschränken sich Modifikationen in eukaryotischer mRNA im
Wesentlichen auf das kotranskriptionelle Capping (m7G) sowie die Editierung von C zu U und A
zu I. Fehler bei der A zu I Editierung werden mit amyotropher Lateralsklerose, Epilepsie,
Schizophrenie und Krebs in Verbindung gebracht (Dominissini et al.; Maas et al. 2006).
Abgesehen von wenigen m5C ist über m6A (1-3 pro RNA) in Exons und Introns berichtet worden
(zusammengefasst in Motorin et al. 2011).
6. Einleitung
20
snRNA und snoRNA
Während des Reifungsvorgangs erhalten eukaryotische U-snRNAs/snoRNAs im Kern ein m3G-
Cap, das als Signal für den Export aus dem Kern dient (Mouaikel et al. 2002). Zusätzlich ist über
Pseudouridine, 2´-O-Methylierungen der Ribosen und Basenmethylierung (z.B. m6A, m6Am und
m2G) in snRNA/snoRNAs berichtet worden (zusammengefasst in Massenet et al. 1998).
Kleine regulatorische RNAs
2´-O-Methylierung durch die MTase Hen1 ist ebenfalls von siRNA und miRNAs in Pflanzen
bekannt und schützt das 3´-Ende der Nukleinsäuren vor Uridylierung (Li et al. 2005; Yu et al.
2005; Yang et al. 2006). In Drosophila bilden keimbahnspezifische piRNAs sowie einzelsträngige
siRNAs Substrate für Hen1 (Horwich et al. 2007).
6.1.3. DNA versus RNA 5mC-Methyltransferasen
Bis auf sehr wenige Ausnahmen einiger folatabhängiger Methyltransferasen in Bakterien (Delk
et al. 1975; Urbonavicius et al. 2005) nutzen alle MTasen (S,S)-S-Adenosylmethionin (SAM oder
AdoMet) als Methylgruppendonor. Der Großteil der RNA MTasen sowie fast alle DNA MTasen
gehören zur Rossmannfold-MTase Familie, die sich durch ihr ubiquitär vorkommendes
Strukturmotiv zur Bindung Adenosin beinhaltender Kofaktoren auszeichnet (zusammengefasst
in Motorin et al. 2011). Obwohl SAM einen starken Methylgruppendonor darstellt und in vitro
schwache spontane Alkylierungen von Nukleinsäuren nachgewiesen werden konnten (Barrows
et al. 1982; Rydberg et al. 1982), läuft die Methylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin unter
physiologischen Bedingungen spontan nicht ab. In vivo werden Methylierungsreaktionen durch
5mC-Methyltransferasen, nach dem Reaktionsprinzip der Michael-Addition, katalytisch
begünstigt.
Kennzeichnend für DNA MTasen sind zehn Motive, die an der Methylierungsreaktion beteiligt
sind. Die Motive I – VI, VIII und X bilden die große, Motiv IX und die Target recognition domain
(TRD), zwischen Motiv VIII und IX, die kleine Domäne (Abbildung 5 und Abbildung 8). Dabei
sind die Motive I – III und X an der Bindung des Kofaktors beteiligt (zusammengefasst in Jeltsch
2002). RNA MTasen beinhalten generell die gleichen zehn Motive, jedoch meist weniger
konserviert und in anderer Reihenfolge.
Sowohl bei RNA als auch DNA Methyltransferasen ist die Reaktion durch das Auftreten eines
kovalenten Intermediats zwischen Enzym und Nukleinsäure gekennzeichnet, das zwischen einer
cysteinischen Thiolgruppe des Enzyms und dem Pyrimidinring des Cytosins ausgebildet wird
(Wu et al. 1987; Chen et al. 1991). RNA und DNA 5mC-Methyltransferasen beinhalten beide ein
6. Einleitung
21
konserviertes PC Motiv im Motiv IV (Abbildung 4). In den DNA MTasen erfolgt die Methylierung
durch einen nukleophilen Angriff dieses Cysteins auf das C6 der Base. Daraus resultiert ein
kovalentes Intermediat mit Carbanioncharakter an Position C5 des Cystosins, das ausreichend
nukleophil ist um die Methylgruppe des SAM zu akzeptieren (Wu et al. 1987). Ein konservierter
Glutamatrest im Motiv VI stabilisiert das Enamin-Intermediat (O'Gara et al. 1996). Nach
Auflösen des Enzym-Nukleinsäure-Komplex wird das freigesetzte S-Adenosylhomocystein (SAH)
enzymatisch zu Adenosin und Homocystein hydrolysiert (Chiang et al. 1996).
Interessanterweise unterstützt das genannte Cytosin die Methylierungsreaktion in RNA
Methyltransferasen ebenfalls, spielt jedoch keine katalytische Rolle. Der nukleophile Angriff der
Thiolgruppe erfolgt hier durch das Cystein eines TC Motivs im Motiv VI, das ausschließlich in
RNA Methyltransferasen konserviert ist (Liu et al. 2000). Für die Methylierung von tRNA durch
die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) konnte durch Mutagenesestudien gezeigt werden, dass
Dnmt2 den DNA Katalysemechanismus nutzt (Jurkowski et al. 2008).
Abbildung 4: Unterschiede im Reaktionsmechanismus von 5mC-DNA und 5mC-RNA Methyltransferasen (entnommen aus Schaefer et al. 2009b).
Die Kristallstruktur der bakteriellen DNA Metyltransferase M.HhaI (Abbildung 8 in Kapitel 6.2.3)
zeigte mit dem base flipping eine weitere mechanistische Gemeinsamkeit der 5mC-
Methyltransferasen (Cheng et al. 2001). Das Zielnukleotid wird durch eine Rotation um die
flankierenden Zucker-Phosphatreste um 180° aus der Doppelhelix herausgeklappt und so für
das katalytische Zentrum der MTase zugänglich gemacht.
6. Einleitung
22
6.2. Die eukaryotischen DNA 5mC-Methyltransferasen
Nach ihrer Abstammung lassen sich die eukaryotischen 5mC-Methyltransferasen in drei große
Gruppen einteilen: Dnmt1-CMT-RID-Methyltransferasen, die Dnmt3- und die Dnmt2-Familie
(Abbildung 5). Davon sind Dnmts der Säugetiere am besten untersucht.
Abbildung 5: Schematische Übersicht über die Struktur eukaryotischer DNA Methyltransferasen. NLS: Kernlokalisationssignal, BAH: bromo-adjacent homology, UBA: Ubiquitin assoziierte Domäne. (Modifiziert nach Goll et al. 2005).
6. Einleitung
23
6.2.1. Dnmt1-RID-CMT Methyltransferasen
Dnmt1 war die erste intensiv erforschte eukaryotische Methyltransferase (Bestor et al. 1988)
und kommt in fast allen Organismen vor, in denen m5C-DNA Methylierung gefunden wurde. Da
murine Dnmt1 in ersten Experimenten Präferenz für hemimethylierte CpG-Substrate zeigte
(Stein et al. 1982; Pradhan et al. 1999) und verstärkt während der S-Phase des Zellzyklus
exprimiert wird (Szyf et al. 1991; Robertson et al. 2000), wird nach wie vor ihre Hauptfunktion
in der Erhaltung von Methylierung nach der Replikation gesehen (maintenance Methylierung).
Bis heute ist jedoch unklar, inwiefern diese MTase in vivo als maintenance und/oder de novo-
Methyltransferase aktiv ist, da die Präferenz für hemimethylierte DNA durch Anwesenheit
methylierter Oligonukleotide als allosterische Regulatoren fast vollständig aufgehoben werden
kann (Goyal et al. 2006). Die resultierende de novo Methyltransferaseaktivität kann bis zu
zehnmal stärker als die von Dnmt3-MTasen sein (zusammengefasst in Svedruzic 2011).
Deletionen des dnmt1-Gens reduzieren DNA Methylierung in ESCs um ca. zwei Drittel.
Undifferenzierte ESCs ohne Dnmt1 zeigen normales Wachstum, aber induzierte Differenzierung
führt zu Apoptose in vitro und zu embryonaler Letalität in vivo (Li et al. 1992). Dnmt1 wird mit
der Stilllegung von Retrotransposons z. B. intracisternal A particle class LTR-retrotransposons in
Mäusen (Gaudet et al. 2004) sowie X-Chromosom-Inaktivierung, durch Methylierung und
Repression von Xist des aktiven X-Chromosoms, in Verbindung gebracht (Panning et al. 1996).
Homozygote loss-of-fuction-Mutationen von dnmt1 in Embryonen resultieren außerdem in
biallelischer Expression oder Repression geprägter Gene (z. B. H19 und Igf2) (Li et al. 1993b).
Bei der Reprogrammierung in frühen Embryonen erfolgt passive Demethylierung durch
Replikation unter Ausschluss von Dnmt1 aus dem Kern (Mertineit et al. 1998; Howell et al.
2001). Die Erhaltung der Methylierung in geprägten Genen wurde zunächst ausschließlich der
spezifisch in Oozyten und präimplantierten Embryonen exprimierten Isoform Dnmt1o
zugesprochen, die zwischen dem 8-16 Zellstadium kurzfristig kernlokalisiert ist (Ratnam et al.
2002). Mittlerweile ist jedoch gezeigt, dass das Dnmt1 Volllängeprotein sowohl als maternales
Restprotein als auch als neu synthetisiertes Protein ebenfalls im frühen Embryo nachzuweisen
ist (Cirio et al. 2008; Hirasawa et al. 2008).
In Pflanzen führt der Verlust des Dnmt1-Orthologs Met1 zu partieller Sterilität und
homöotischen Transformationen während der Blütenentwicklung (Finnegan et al. 1996).
Pflanzen besitzen mit der Gruppe der Chromomethylasen (CMTs) eine weitere Gruppe Dnmt1
verwandter Proteine. CMTs methylieren Cytosine im CpNpG und CpNpN Kontext und spielen
eine essentielle Rolle bei RNA vermittelter DNA Methylierung (Bartee et al. 2001; Lindroth et al.
2001). In Pilzen bildet DIM-2 aus N. crassa den Prototypen Dnmt1-ähnlicher Proteine. Sowohl
maintenance als auch de novo Methylierungsprozesse lassen sich in diesem Organismus auf
DIM-2 (defective in methylation) zurückführen (Kouzminova et al. 2001). Ascomyzeten
6. Einleitung
24
beinhalten mit RID (repeat induced point mutation defective) noch eine weitere
Methyltransferase, die Ähnlichkeiten zu Dnmt1 zeigt. RID methyliert repetitive DNA Sequenzen
und führt zu einer Punktmutation durch Deaminierung des methylierten Cytosins.
Strukturell ähnelt die MTase-Domäne der Dnmt1 eher den bakteriellen MTasen der
Restriktions-Modifikationssysteme als den C-terminalen Domänen von Dnmt2 und Dnmt3.
Dabei ist der „katalytische“ C-Terminus (nach GK-Wiederholungen) allein nicht aktiv, sondern
zur Methylierung wird ein großer Teil des N-Terminus benötigt. Das Fehlen der ersten 672 AS
führt zum Aktivitätsverlust (Pradhan et al. 2008). Der N-Terminus erfüllt im Wesentlichen drei
Funktionen:
a) Allosterische Regulation der katalytischen Aktivität. Dabei erfolgt Aktivierung durch
vollständig methylierte DNA und Inhibierung durch unmethylierte DNA sowie Poly(ADP)ribose.
RNA vermittelte DNA Methylierung wird durch methylierte und unmethylierte ncRNAs
beeinflusst (zusammengefasst in Svedruzic 2008).
b) Der N-Terminus beinhaltet Phosphorylierungs- und Methylierungsstellen, die die Aktivität
von Dnmt1 regulieren.
c) Interaktionen zwischen Dnmt1 und anderen Molekülen, die die DNA Methylierung
beeinflussen, erfolgen mit der Ausnahme des Kochaperons p23 durch den N-Terminus.
Mittlerweile sind über dreißig physikalische und funktionelle Interaktionspartner aus drei
Bereichen bekannt, die die vielfältigen Funktionen von Dnmt1 widerspiegeln. Beispielsweise
interagieren mit Dnmt1 Komponenten des Core chromatin remodeling complex wie Dnmt3a/B,
PCNA, Uhrf1, HP1β, HDAC1/2, MBD2/MBD3, LSH, NoRC (Kapitel 6.3.1). Nachgewiesene
Interaktionen mit PARP-1, p53 und Rb/E2F1 unterstützen die Annahme, dass Dnmt1 in
Prozesse wie DNA Reparatur, der Zellzyklusregulation und Apoptose involviert ist. Außerdem
beeinflussen RNA-Pol II und das m5C-bindende Protein MeCP2 Dnmt1 im Rahmen der RNA
vermittelte DNA Methylierung (zusammengefasst in Svedruzic 2011).
6.2.2. Die Dnmt3 Familie
Die Beobachtung, dass murine ESC ohne Dnmt1 weiterhin detektierbare Methylierung zeigen
und retrovirale Konstrukte de novo methylieren können (Lei et al. 1996), führte zur Entdeckung
der de novo Methyltransferasen Dnmt3a und Dnmt3b (Okano et al. 1998). Dnmt3 Homologe
kommen in Vertebraten, einigen Insekten, Knidarien und Tunikaten vor. In Pflanzen wird de
novo Methylierung überwiegend von DRM Methyltransferasen ausgeführt (Cao et al. 2002).
In vitro methylieren rekombinant exprimierte Dnmt3a und Dnmt3b unmethylierte und
hemimethylierte DNA gleichermaßen (Okano et al. 1998). Dabei ist im Gegensatz zu Dnmt1 der
6. Einleitung
25
C-Terminus allein katalytisch aktiv (Gowher et al. 2002). Die N-Termini von Dnmt3a und
Dnmt3b aus Säugetieren beinhalten eine PWWP-Damäne (Pro-Trp-Trp-Pro), die ein putatives
Histonbindemodul darstellt sowie eine zwischen Dnmt3a und Dnmt3b hochkonservierte ADD-
Domäne (AtrX-Dnmt3-Dnmt3L), die eine cysteinreiche Zinkfingerdomäne darstellt und ebenfalls
in Histonbindung involviert ist (zusammengefasst in Chedin 2011) (Abbildung 5). Im Gegensatz
zu Dnmt1 zeigen die Dnmt3 Homologe keine so stark ausgeprägte CpG Spezifität. Dnmt3a
methyliert in vitro auch CpA, aber nicht CpC und CpT, Dnmt3b hingegen CpA und CpT (Suetake
et al. 2003). Dnmt3-Homologe spielen wahrscheinlich jedoch ebenfalls eine Rolle bei
maintenance Methylierung, da Dnmt3a über den ganzen Zellzyklus hinweg gleichmäßig und
Dnmt3b verstärkt während der S-Phase exprimiert wird (Robertson et al. 2000).
In der Zelle führt Dnmt3a/b Methylierungsaktivität vermutlich zu hemimethylierter DNA (Lin et
al. 2002), so dass vollständige Methylierung symmetrischer CpG Stellen durch maintenance
Methylierung etabliert werden muss. Ist maintenance Methylierung ausschließlich an die
Replikation gekoppelt, tragen die Nachkommen variable Methylierungsmuster (RAMM -
replication associated maintenance methylation, Abbildung 6) (Chedin 2011).
Abbildung 6: Modell zur replikationsassoziierten maintenance Methylierung und replikationsunabhängigen maintenance Methylierung (übersetzt und modifiziert nach Chedin 2011). Weiße Kreise repräsentieren unmethylierte Nukleotide. Graufärbung symbolisiert de novo und schwarz maintenance Methylierung.
6. Einleitung
26
Neuere Erkenntnisse zeigen jedoch, dass Dnmt1 vermutlich auch unabhängig von der S-Phase an
das Chromatin assoziieren kann (Easwaran et al. 2004), um uniforme Methylierungsmuster zu
etablieren (RIMM – replication independent maintenance methylation; Abbildung 6). Das
Bindeglied zur Rekrutierung von Dnmt1 außerhalb der Replikation könnte Uhrf1 (ubiquitin-like,
containing PHD and RING finger domains 1) sein, das hemimethylierte DNA erkennt und dessen
Verlust in Säugetierzellen zu großräumiger Reduktion von DNA Methylierung führt (Bostick et
al. 2007; Sharif et al. 2007). Außerdem kann Uhrf1 auch mit Dnmt3a/b interagieren (Meilinger
et al. 2009).
Funktionell sind Dnmt3 Homologe in vivo in die Reproduktion und Entwicklung sowie Erhaltung
mentaler Gesundheit involviert. Knockout-Mutanten von Dnmt3a und Dnmt3b in Mäusen führen
zum Verlust von de novo Methylierung in präimplantierten Embryonen, wohingegen die
Methylierung geprägter Gene jedoch erhalten bleibt (Okano et al. 1999). Spätere Experimente
mit konditionalen Deletionen von Dnmt3a und Dnmt3b in der Keimbahn zeigten einen Einfluss
von Dnmt3a bei maternalem und paternalem Imprinting (Kaneda et al. 2004). Verlust von
Dnmt3b ist embryonal letal in Mäusen, Dnmt3a-Knockout-Mutanten leben bis zu vier Wochen
(Okano et al. 1999). Dnmt3a/b werden in der Blastocyste und während der Keimzellentwicklung
stark, nach Tag E10,5 nur noch in der Milz, Thymus und Gehirn exprimiert, wobei abhängig von
der Entwicklungsstufe von beiden Dnmt3 Homologen verschiedene Isoformen exprimiert
werden. Insgesamt zeigen differenzierte Zellen nur sehr wenig de novo Methylierung. Dnmt3a/b
sind außerdem verantwortlich für die Langzeiterhaltung der DNA Methylierung in ESCs, da
langzeitkultivierte Doppelmutanten fortschreitenden und globalen Verlust an DNA Methylierung
zeigen (Chen et al. 2003).
Neben den überlappenden Funktionen haben Dnmt3a und Dnmt3b unterschiedliche
Präferenzen hinsichtlich der Substrate. Beispielsweise ist die globale Methylierung sowie die
Methylierung geprägter Regionen überwiegend von Dnmt3a abhängig, Dnmt3b methyliert
dagegen bevorzugt minor satellite repeats (Okano et al. 1999). Gegenüber nackter DNA zeigt
Dnmt3a eine höhere Methylierungsaktivität in vivo, Dnmt3b modifiziert auch nucleosomale
DNA, wenn auch mit schwacher Aktivität. Eine dem rDNA Promotor komplementäre DNA (pRNA
– promotor associated RNA) kann im Rahmen RNA vermittelter Genregulation mit der
Erkennungsstelle des Transkriptionsfaktors TTF-I eine DNA:RNA Triple-Helix ausbilden, die
spezifisch von Dnmt3b erkannt wird (Schmitz et al.).
Dem Regulatorprotein Dnmt3L fehlt aufgrund der unvollständigen katalytischen Domäne die
Fähigkeit den Kofaktor SAM zu binden. Es hat außerdem nur geringe Affinität zu DNA und zeigt
folglich keine Methyltransferaseaktivität. Dnmt3L wird in ESCs sowie den Phasen der
Keimzellentwicklung exprimert, die mit de novo Methylierung einhergehen (Bourc'his et al.
2001; Huntriss et al. 2004). Somatische Zellen exprimieren hingegen kaum Dnmt3L. Knockout
6. Einleitung
27
Mutanten in Mäusen sind lebensfähig und asymptomatisch. Knockout Männchen sind jedoch
steril (Bourc'his et al. 2004) und den Eizellen von Knockout Weibchen fehlt DNA Methylierung
an geprägten Genen, was biallelische oder keine Expression zur Folge hat (Bourc'his et al. 2001).
Nachkommen aus einer Kreuzung von diesen Weibchen mit Wildtyp-Männchen sterben
während der Entwicklung.
Immunopräzipitationen zeigten physikalische Interaktion der pseudokatalytischen Domäne von
Dnmt3L mit den katalytischen Domänen von Dnmt3a und Dnmt3b (Hata et al. 2002). In
weiteren Experimenten kristallisierte sich eine regulatorische Funktion für Dnmt3L heraus, bei
denen Dnmt3L die Aktivität der Isoform Dnmt3A2 bis zu Faktor 20 stimuliert (Kareta et al.
2006). In Lösung können Dnmt3a und Dnmt3b unabhängig von Dnmt3L heterogene Komplexe
bilden, in vivo liegen Dnmt3a/b vermutlich als Homooligomere oder gemischte Heterooligomere
vor (zusammengefasst in Chedin 2011). Inwiefern diese Oligomerisierung eine spezielle
Funktion hat, ist nach wie vor unklar. Dnmt3a Oligomere scheinen aber eine reduzierte Aktivität
zu haben (Purdy et al. 2010). Dnmt3L hingegen liegt überwiegend als Homodimer vor und hat
die Fähigkeit heterogene Dnmt3a Komplexe zu heterotrameren Dnmt3a:Dnmt3L (2:2)
Komplexen zu reorganisieren (Abbildung 7) und so regulatorischen Einfluss auszuüben (Jia et al.
2007; Jurkowska et al. 2008).
Abbildung 7: Modell zur regulatorischen Funktion von Dnmt3L. SAM: S-Adenosylmethionin. (übersetzt und modifiziert nach Chedin 2011).
6.2.3. Dnmt2 – eine bifunktionelle DNA/RNA Methyltransferase?
Die Dnmt2 Familie nimmt unter den eukaryotischen DNA Methyltransferasen eine Sonderrolle
ein. Obwohl Dnmt2-Homologe alle zehn charakteristischen MTase Motive in typischer
Reihenfolge enthalten (Abbildung 5, Kapitel 6.2), konnte lange Zeit keine DNA
Methylierungsaktivität nachgewiesen werden. Dabei ist Dnmt2 die am weitesten verbreitete
DNA MTAse und ihre Homologe in verschiedenen Organismen weisen hohe Konservierung (30 –
50% Identität) auf (Goll et al. 2005). Abgesehen von C. elegans und S. cerevisiae existiert Dnmt2
auch in niederen eukaryotischen Modellorganismen wie D. discoideum, D. melanogaster, S.
6. Einleitung
28
pombe und E. histolytica, deren Genom für keine weiteren DNA MTAsen kodiert („Dnmt2-only“-
Organismen). In Säugetieren und Drosophila werden verschiedene Isoformen in allen Geweben
exprimiert, wobei die höchste Expression in Ovarien und Hoden nachgewiesen werden konnte
(Yoder et al. 1998; Schaefer et al.).
Die zunächst nicht nachzuweisende DNA Methylierungsaktivität von Dnmt2 wurde zum einen
auf den fehlenden N-Terminus zurückgeführt, der anderen MTasen zur Rekrutierung an die Ziel-
DNA dient (Abbildung 5, Kapitel 6.2). Zum anderen gibt die Kristallstruktur humaner Dnmt2
einen weiteren Anhaltspunkt zur Erklärung reduzierter DNA Methylierungsaktivität: Die TRD
von Dnmt2-Homologen enthält ein einzigartiges CFT-Motiv (CFTXXYXXY), bei dem das zweite
Tyrosin möglicherweise zu einer sterischen Hinderung bei der Bindung doppelsträngiger DNA
führt (Abbildung 8). Die Struktur der bakteriellen MTase M.HhaI besitzt an der genannten Stelle
ein für die Funktion essentielles Glycin (Dong et al. 2001). Allerdings konnten mit Dnmt2 und
dsDNA SDS-stabile kovalente Komplexbildung nachgewiesen werden (Dong et al. 2001).
Im Jahr 2003 wurde erstmals schwache DNA Methylierungsaktivität der humanen Dnmt2 in
vitro detektiert (Hermann et al. 2003). In den folgenden Jahren konnte in den „Dnmt2-only“-
Organismen E. histolytica, D. discoideum und D. melanogaster eine schwache Dnmt2-abhängige
5mC-DNA Methylierung in vivo nachgewiesen werden (Lyko et al. 2000; Kunert et al. 2003;
Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005), die überwiegend asymmetrisch und mit
Retroelementen assoziiert ist (Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Dem „Dnmt2-only“
Organismus S. pombe scheint DNA Methylierung zu fehlen, was ursprünglich auf eine Mutation
Abbildung 8: Überlagerung der Kristallstrukturen von M.HhaI (hellblau, PDB: 10MH) und hDnmt2 (dunkelblau, PDB: 1G55). Rot: Mit M.HhaI kokristallisierte DNA, magenta: Targetnukleotid, welches während des Methylierungsprozesses aus der DNA heraugeklappt wird, grün: Methylgruppendonor SAM (der M.HhaI), das mit hdnmt2 kokristallisierte SAM ist nicht dargestellt. türkis: zweites Tyrosin des CFT-Motivs der hDnmt2, beige: äquivalente Position (Glycin) zum zweiten Tyrosin des CFT-Motivs der hDnmt2. (DeLano 2002)
180°C
6. Einleitung
29
im katalytischen PCG Motiv des Dnmt2-Homologs Pmt1 zurückgeführt wurde (Wilkinson et al.
1995). Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Reproduzierbarkeit der Daten zur DNA
Methylierung durch Dnmt2 bleibt das Ausmaß der DNA Methylierungsaktivität von Dnmt2 nach
wie vor unklar (Schaefer et al.; Krauss et al. 2011).
In vitro Experimente der Arbeitsgruppe Bestor resultierten in der Entdeckung der RNA
Methylierungsaktivität von Dnmt2. Die MTase methyliert tRNAAsp an der Postion C38 mit
deutlich stärkerer Effizienz (Goll et al. 2005). Hochkonservierte Nukleotide der tRNAAsp
verschiedener Organismen mit Dnmt2 lassen eine Koevolution zwischen dem Anticodonloop
dieser tRNA und Dnmt2 vermuten (Goll et al. 2006). Organismen ohne Dnmt2 zeigen im
Anticoconloop der tRNAAsp Sequenz eine größere Variabilität. Grundsätzlich besteht die
Vermutung, dass es sich bei Dnmt2 um eine Ableitung bakterieller DNA-MTasen handelt, die ihr
Hauptsubstrat von DNA zu RNA verändert hat (Jeltsch et al. 2006). Mittlerweile konnte in
D. melanogaster neben der tRNAAsp(GUC) auch Dnmt2 abhängige Methylierung tRNAGly(GCC) und
tRNAVal(AAC) nachgewiesen werden (Schaefer et al.). Die Behandlung von humanen Krebszellen
mit dem DNA MTase Inhibitor 5-Azacytidin resultierte in einer Reduktion der Dnmt2-
abhängigen tRNA Methylierung (Schaefer et al. 2009a). Die tRNA Methylierungsaktivität von
Ehmeth, dem Dnmt2-Homolog aus E. histolytica, scheint durch Interaktion mit dem
glykolytischen Enzym Enolase inhibiert zu werden (Tovy et al.).
Funktionell geben Experimente mit Dnmt2-Knockout-Mutanten weitere Hinweise auf die
biologische Bedeutung der Methyltransferase (Abbildung 9). Nachdem zunächst keine
offensichtlichen Phänotypen in verschiedenen Organismen detektiert wurden (Wilkinson et al.
1995; Kunert et al. 2003; Goll et al. 2005), zeigten Dnmt2 Knockout Mutanten in Drosophila und
Dictyostelium Auswirkungen auf die Genomstabilität. In Dictyostelium führt eine Deletion des
dnmA-Gens zur Mobilisierung des Retroelements skipper (Kuhlmann et al. 2005), in Drosophila
geht das Ausschalten des dnmt2-Gens mit Verlust von H4K20me3 Methylierung sowie Verlust
subtelomerischer Invader-Cluster einher (Phalke et al. 2009). In Entamoeba ist das Dnmt2-
Homolog Ehmeth vermutlich essentiell (Fisher et al. 2006). Interessanterweise können virulente
Entamoeba durch die Gabe von 5-Azacytidin in eine nicht-virulente Form überführt werden
(Fisher et al. 2004). Zusätzlich konnte in Dictyostelium AX4 Stämmen das Ausschalten des dnmt2
Gens mit morphologischen Defekten in der späten Entwicklung in Verbindung gebracht werden
(Katoh et al. 2006). Über Dnmt2 Knockout Mutanten des Zebrafisches wurden Defizite in der
Organentwicklung berichtet (Rai et al. 2007).
6. Einleitung
30
Abbildung 9: Morphologische und molekulare Phänotypen durch Deletion oder Überexpression (OE) von Dnmt2 in verschiedenen Organismen.
Neuere Ergebnisse deuten daraufhin, dass Dnmt2 in die zelluläre Stressantwort sowie den RNA
Stoffwechsel involviert ist. Schäfer et al. zeigten eine Reduktion der Lebensspanne von
Drosophila Dnmt2-Knockout-Mutanten unter oxidativem Stress wie Paraquat oder Wasserstoff-
peroxid. Gleichzeitig wird bei oxidativem oder Hitzestress die tRNA Stabilität beeinflusst. In
Drosophila dnmt2-/- steigt die Anzahl an tRNA Fragmenten der tRNAs, die im Wildtyp von Dnmt2
methyliert werden (Schaefer et al.). In Drosophila sowie Entamoeba wurde über einen
Zusammenhang von Überexpression der Dnmt2-Homologe und Hochregulation von Hitze-
schockproteinen berichtet (Lin et al. 2005; Fisher et al. 2006).
Mittels Immunopräzipitationen aus HeLa-Zellen wurden Proteine, die in den RNA
Prozessierungsmechanismus involviert sind, als Interaktionspartner von Dnmt2 identifiziert
(Thiagarajan et al.). Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass auch in humanen Zellen endogene
Dnmt2 kernlokalisiert ist und unter Stress in P-bodies (processing bodies) und Stressgranula
relokalisiert. In Dictyostelium lokalisiert auch überexprimierte DnmA überwiegend nukleär
(Kuhlmann et al. 2006), in Drosophila ist eine Assoziation mit der Kernmatrix (Schaefer et al.
2008) und für Ehmeth, das Dnmt2-Homolog aus Entamoeba, mit scaffold/matrix attachment
region vorgeschlagen worden (Banerjee et al. 2005).
6. Einleitung
31
6.3. Epigenetische Genregulation
Der Begriff Epigenetik (griech. epi - „über“) wurde erstmals durch Conrad Waddington in den
1940er Jahren geprägt, um zu erklären, inwiefern es Wechselwirkungen zwischen Umwelt und
Genen geben kann, die sich phänotypisch niederschlagen (Waddington 1942). Heute wird
Epigenetik allgemein als vererbbare Änderung in der Genexpression definiert, die nicht auf
Änderungen in der DNA Sequenz zurückgehen. Dabei spielen strukturelle Änderungen des
Chromatins die Hauptrolle, die auf Interaktionen zwischen fünf Phänomenen beruhen: kovalente
Modifikationen der DNA sowie der Histone, chromatin remodeling complexes, Einbau von
Histonvarianten sowie der Einfluss nicht-kodierender RNAs (Abbildung 10).
Abbildung 10: Übersicht über die verschiedenen Mechanismen epigenetischer Genregulation. Ac: Histonacetylierung, Me: Histonmethylierung, P: Phosphorylierung (modifiziert nach Cheng et al. 2011).
6.3.1. Dynamik zwischen DNA Methylierung und Histoncode
Da Dnmt1 und Dnmt3a/b abgesehen von der CpG Spezifität keine Sequenzspezifität aufweisen
(Yoder et al. 1997), spielt die Struktur des Chromatins eine entscheidende Rolle bei der
Regulation von DNA Methylierung. Ein erster Hinweis, dass Histonmethylierung DNA
Methylierung beeinflussen kann, kam von Experimenten mit N. crassa, in denen gezeigt werden
konnte, dass globale DNA Methylierung von H3K9 Trimethylierung durch DIM-5 abhängt
(Tamaru et al. 2001). H3K9me3 wird durch die Chromodomäne von HP1 (Heterochromatin
Protein 1) erkannt und rekrutiert die DNA MTase DIM-2 (Honda et al. 2008). Mittlerweile wird
die Kontrolle von DNA Methylierung durch H3K9 Methylierung als konservierte Funktion
angesehen: In A. thaliana führen Mutationen des KYP-Gens (KRYPTONITE), das eine H3K9
Methyltransferase kodiert, zum Verlust CMT3 vermittelter DNA Methylierung an CpNpG-
Nukleotidabfolgen und zur Aktivierung endogener Retroelemente (Jackson et al. 2002). Das
HP1-Ortholog LHP1 aus Arabidopsis scheint für DNA Methylierung jedoch nicht benötigt zu
werden (Malagnac et al. 2002). Dafür kann die Chromodomäne von CMT3 (Abbildung 5) direkt
6. Einleitung
32
mit Histon H3 interagieren, wenn K9 und K27 gleichzeitig methyliert sind (Lindroth et al. 2004).
Doppelmutanten der mit Heterochromatin assoziierten H3K9 Methyltransferasen Suv39h1 und
Suv39h2 in murinen ESCs ziehen den spezifischen Verlust von DNA Methylierung an den
perizentrischen major satellite repeats, aber nicht an anderen zentromerischen Sequenzen, nach
sich (Lehnertz et al. 2003).
Demethylierung von H3K4 spielt bei der Etablierung maternaler Imprints eine entscheidende
Rolle. Deletion der murinen H3K4 Demethylase KDM1B/LSD2 führt zu erhöhter H3K4
Methylierung und verhindert die Etablierung von DNA Methylierung an vier von sieben
untersuchten geprägten Genen in Oozyten. Embryonen aus diesen Eizellen zeigen bialleische
Expression oder Inaktivierung dieser Gene und sterben im Embryonalstadium (Ciccone et al.
2009). Mittels Immunopräzipitationen und Bindungsstudien konnte eine direkte Interaktion der
ADD Domäne von Dnmt3L mit dem N-Terminus des Histon H3 nachgewiesen werden. Der
Lysinrest K4 wird durch zwei Aspartatreste von Dnmt3L erkannt, die aufgrund sterischer
Hinderungen nur Bindung an unmethylierte Lysine erlauben (Ooi et al. 2007). Vermutlich bindet
Dnmt3L unmodifiziertes H3K4 und rekrutiert die keimbahnspezifische Isoform der de novo
Methyltransferase Dnmt3A2 zu unmethylierten H3K4 (Ooi et al. 2007). Aufgrund der hohen
Konservierung der ADD Dömanen zwischen Dnmt3L und Dnmt3a/b ist eine direkte Interaktion
von Dnmt3a/B mit unmethyliertem H3K4 wahrscheinlich und konnte für Dnmt3a in vitro auch
bestätigt werden (Otani et al. 2009). Erst kürzlich wurde außerdem entdeckt, dass die PWWP
Domäne von Dnmt3a, aber nicht von Dnmt3b, in vitro mit H3K36me3 interagiert (Dhayalan et
al.). Beide Interaktionen erhöhten die Aktivität von Dnmt3a auf nukleosomaler DNA. H3K36me3
ist häufig an gene bodies aktiver Gene zu finden und korreliert mit dem Auftreten von DNA
Methylierung an diesen Stellen (Hodges et al. 2009).
In neueren Experimenten wurde gezeigt, dass die Histondemethylase LSD1 auch weitere
Proteine demethylieren kann und Dnmt1 wurde als neues Substrat für LSD1 identifiziert.
Deletion von LSD1 in murinen ESCs resultierte in einem fortschreitenden Verlust von DNA
Methylierung (Wang et al. 2009). In weiteren Experimenten wurde verminderte Stabilität des
Dnmt1 Proteins durch Methylierung des Lys-142 durch die Protein Methyltransferase Set7/9
nachgewiesen (Esteve et al. 2009).
Die Arbeitsgruppe von G. Reuter schlug erstmals eine Verbindung zwischen Dnmt2 und
Histonmodifikationen vor. Deletion von Dnmt2 in Drosophila ist mit einem Verlust von
H4K20me3 Methylierung sowie Aktivierung von Retrotransposons assoziiert (Phalke et al.
2009). Inwiefern die Beobachtungen ein direkter Effekt von DNA Methylierung durch Dnmt2
sind, steht im Focus der aktuellen Forschung.
6. Einleitung
33
6.3.2. Methyl-CpG-bindende Proteine
Biologische Effekte von DNA Methylierung werden u. a. von Methyl-CpG-bindenden Proteinen
vermittelt, die - soweit bis heute bekannt – alle in die Etablierung und Erhaltung von
Heterochromatin involviert sind. Die bisher identifizierten Methyl-CpG-bindenden Proteine
lassen sich in drei große Familien gliedern: die MBD Familie, die Kaiso und Kaiso-like Familie
sowie die SRA Domänen Proteine. Ein Beispiel für die letztgenannte Familie ist Uhrf1, dessen
Verlust in Säugetierzellen zu großräumiger Reduktion von DNA Methylierung führt (Bostick et
al. 2007; Sharif et al. 2007). Da Uhrf1 hemimethylierte DNA mit hoher Affinität bindet und eine
physikalische Interaktion mit Dnmt1 nachgewiesen wurde, ist wahrscheinlich, dass Uhrf1
Dnmt1 an hemimethylierte DNA Regionen rekrutiert. Uhrf1 ist außerdem in die Etablierung von
Heterochromatin involviert, da ESCs ohne Uhrf1 keine exogenen Reportergene stilllegen können
(Meilinger et al. 2009). Methyl-CpG-bindende Proteine spielen auch eine Rolle bei der X-
Chromosom-Inaktivierung, da beispielsweise MBD2 an der Repression des Xist-Gens des aktiven
X-Chromosoms beteiligt ist (Barr et al. 2007). MeCP2 der MBD Familie spielt eine wichtige Rolle
bei der Stilllegung des L1 Retrotransposons in Säugetieren (Yu et al. 2001).
Interessanterweise binden einige MBDs (u. a. MBD2) auch verschiedene Arten an RNA
Molekülen (mRNA und siRNA). Wenn MDBs jedoch eine RNA gebunden haben, können sie nicht
mehr mit methylierter DNA interagieren (Jeffery et al. 2004). Vermutlich koordinieren RNA
Moleküle so den Zugang zu methylierter DNA zwischen Dnmts und MBDs, da die
Bindungsstellen jeweils nur von einem der großen Proteine gebunden werden können.
In „Dnmt2 only“-Organismen sind Moleküle, die 5-Methylcytosin „lesen“ können, kaum vertreten.
Das Genom von Drosophila kodiert für ein Ortholog der MBD2 aus Säugetieren (MBD2/3), wobei
Daten zur selektiven Bindung von methyliertem CpA/T (Marhold et al. 2004) oder CpG (Roder et
al. 2000) nicht reproduziert werden konnten. Vermutlich kann dieses Protein aufgrund von
Mutationen kein 5mC detektieren (Krauss et al. 2011). Die H3K9 Methyltransferase SETDB1 aus
Drosophila erkennt 5mC in einem CpA Kontext in vitro, wobei noch nicht nachgewiesen wurde,
dass dSETDB1 in vivo als MBD fungiert. Durch ChIP-Experimente wurde bisher gezeigt, dass
H3K9me3 durch dSETDB1 vermutlich dDnmt2 und das HP1-Ortholog Su(var)205 an Zielgene
von dSETDB1 rekrutiert (Gou et al. 2005). In E. histolytica wurde vor einigen Jahren das Protein
EhMLBP entdeckt, welches bevorzugt methylierte DNA in interspersed nuclear elements und
rDNA bindet, aber keine Homologien zu den „klassischen“ MBDs aus Säugetieren aufweist (Lavi
et al. 2006; Lavi et al. 2008; Lavi et al. 2009).
6. Einleitung
34
6.3.3. Erkrankungen durch aberrante DNA und RNA Modifikationen
Aberrante DNA Methylierung ist mit vielen Krebsarten, Imprintingerkrankungen, verschiedenen
Autoimmunerkrankungen sowie neuronalen Defekten assoziiert. Tumore sind häufig durch
Hypomethylierung von Onkogenen und repetitiven Elementen wie SINEs und LINEs (short and
long interspered repeat elements) sowie spezifischer Hypermethylierung der Promotoren von
Tumorsuppressorgenen gekennzeichnet (Feinberg et al. 2004). Die abweichenden
Methylierungsmuster werden oft mit erhöhter Expression der Dnmts in Verbindung gebracht,
wobei die Fehlregulation der MTasen auf verschiedenen Ebenen stattfinden kann.
Beispielsweise können Mutationen in Tumorsuppressorgenen wie z. B. p53 oder Rb, die an der
transkriptionellen Regulation von Dnmt1 beteiligt sind, die Expressionsrate der MTase
verändern (zusammengefasst in Kinney et al. 2011). In der Brustkrebszelllinie MCF-7 wurde bei
gleich bleibender mRNA Menge eine erhöhte Stabilität des Dnmt1 Proteins nachgewiesen. Auch
wenn der genaue Mechanismus noch ungeklärt ist, wurde gezeigt, dass die ersten 118 AS das
Dnmt1 Protein stabilisieren (Agoston et al. 2005). Die Expression der Dnmts wird außerdem
durch miRNAs reguliert. In Lungenkrebzellen konnte die Menge an Dnmt3a und Dnmt3b durch
verstärkte Expression der miR29s reduziert werden (Fabbri et al. 2007). Ein weiteres Beispiel
bildet die Regulation der dnmt1 mRNA durch Interleukin 6 regulierte miRNAs (Braconi et al.).
Deren Expression ist in Cholangiokarzinomen reduziert, was die Repression von
methylierungssensitiven Turmorsuppressorgenen nach sich zieht. Es konnte gezeigt werden,
dass mir148a und mir152 direkt mit dem 3´UTR der dnmt1 mRNA interagieren und das Dnmt1
Level reduzieren können. Folglich erhöhte sich die Expression der Tumorsuppressorgene.
Auch die „sechste“ Base 5-Hydroxymethlycytosin (Kapitel 6.1.1) scheint in Krankheitsprozesse
involviert zu sein. Erst kürzlich ist über eine Verbindung zwischen geringem 5hmC-Level und
Mutationen des Tet2-Proteins in Patienten mit myeloiden Erkrankungen berichtet worden
(Ko et al.).
Neben Defekten in der DNA Methylierung sind tRNA Modifikationen in die Entstehung von
Krebserkrankungen involviert. tRNAs aus Morrin-Hepatomzellen wiesen einen deutlichen
Rückgang an m5U, m3C und m5C im Vergleich zu tRNAs aus Hepatozyten auf (Randerath et al.
1974). In einigen humanen Lymphomen und Leukämiezellen ist die Base Queosin in tRNAs
unterrepräsentiert (Emmerich et al. 1985).
Mutationen der katalytischen Domäne von Dnmt3b werden in Verbindung mit dem autosomal
rezessiven ICF-Syndrom (Immundefefekt, Zentromerinstabilität und faciale Anomalien)
gebracht (Xu et al. 1999). ICF-Patienten leiden unter schwerwiegende DNA Hypomethylierung in
satellite tandem repeats der Chromosomen 1, 9 und 16 (Jeanpierre et al. 1993).
Autoimmunerkrankungen wie z.B. Atopische Dermatitis (Neurodermitis) oder Systemischer
6. Einleitung
35
Lupus erythematodes (SLE), einer chronischen Bindegewebserkrankung, sind ebenfalls durch
weitreichende DNA Hypomethylierung gekennzeichnet, zeigen dabei aber keine locus-
spezifische Hypermethylierung wie sie bei Krebserkrankungen beschrieben wird. Schizophrenie
ist hingegen mit genspezifischer Hypermethylierung assoziiert, die die Expression neuronaler
Proteine reprimiert (zusammengefasst in Kinney et al. 2011).
Das Auftreten uniparentaler Disomien (Engel et al. 1991) oder Fehler beim Imprinting führen zu
bialleischer Expression oder Stilllegung geprägter Gene. Imprintingfehler liegen beispielsweise
bei ca. 4% der Patienten mit Angelman-Syndrom sowie ca. 1% der Patienten mit Prader–Willi-
Syndrom (PWS) vor. Bei 25-30% der PWS-Erkrankten fehlt die väterliche Genexpression
aufgrund einer maternalen uniparentalen Disomie 15 (zusammengefasst in Horsthemke 2008).
Beim Silver-Russel- und Beckwith–Wiedemann-Syndrom spielt reziproke Hypo- und
Hypermethylierung des maternalen und paternalen Allels von imprinting control regions (ICR) -
insbesondere ICR1 auf Chromosom 11 - eine entscheidende Rolle (Eggermann et al. 2008).
6.4. Dictyostelium als Modellorganismus in der epigenetischen Forschung
Dictyostelium discoideum bietet aufgrund mehrerer Eigenschaften ein gutes Modell zur
Untersuchung epigenetischer Genregulation. Die soziale Amöbe wird phylogenetisch den
Amoebozoa zugeordnet, die sich nach der Verzweigung von Pflanzen und Tieren, aber vor der
Divergenz von Pflanzen und Pilzen abgeteilt haben (Eichinger et al. 2005). Außerdem wachsen
Dictyostelium Zellen einerseits einzellig, andererseits entwickeln sie sich bei Hungerphasen zu
einem differenzierten Fruchtkörper (zusammengefasst in Kessin 2001). Dictyostelium bildet
damit ein Bindeglied zwischen der Komplexität höheren Eukaryoten und der Einfachheit von
beispielsweise Hefen.
Das haploide Genom (34 Mbp) ist sehr A/T reich (78%) und in sechs Chromosomen,
mitochondrialer DNA sowie einem extrachromosomalen rDNA Palindrom mit ca. 100 Kopien
pro Zelle organisiert (Eichinger et al. 2005). Die ca. 12 500 Gene kodieren u. a. für RNAi
Komponenten wie Dicer, RdRPs und Argonauten (Martens et al. 2002; Kuhlmann et al. 2005),
Histonvarianten (z.B. CenH3) (Dubin et al. 2010a) und Histon modifizierende Enzyme wie HMTs
(z. B. Set1 (H3K4 MTase)) (Chubb et al. 2006) und SuvA (H3K9 MTase) (Kaller et al. 2006b)
sowie HP1-Homologe (HcpA, HcpB, HcpC) (Kaller et al. 2006a). Wie in Kapitel 6.2.3 beschrieben
konnte schwache DNA Methylierung durch das Dnmt2-Homolog DnmA im LTR des
Retrotransposon DIRS-1 sowie im RT des Retrotransposons skipper nachgewiesen werden
(Kuhlmann et al. 2005). Insgesamt 10 % des Dictyostelium entfallen auf Retroelemente, davon ist
6. Einleitung
36
das LTR Retrotransposon DIRS-1 mit 240 kompletten und inkompletten Kopien, das am
häufigsten vorkommende Retrotransposon in der Amöbe (ca. 3% des Genoms) (Glockner et al.
2001). Interessanterweise kodiert der ORF3 von DIRS-1 für eine N6A-Methyltransferase, die
jedoch aufgrund einer unvollständigen SAM-Bindestelle inaktiv ist (Goodwin et al. 2004). In
einigen Grünalgen wie Volvox ist jedoch mindestens ein DIRS-1-Elemente mit aktiver N6A-MTase
bekannt (zusammengefasst in Iyer et al. 2011).
Der Großteil aller bekannten kleinen regulatorischen RNAs aus Dictyostelium sind zu DIRS-1
komplementär (Kuhlmann et al. 2005; Hinas et al. 2007). Für das zweithäufigste im Genom
vorkommende Retrotransposon skipper (~1 % des Genoms) wurden mittlerweile acht miRNA
ähnliche ncRNAs nachgewiesen (Hinas et al. 2007). Zusätzlich sind zwei miRNA Kandidaten in
Dictyostelium beschrieben (Hinas et al. 2007). Neben den klassischen ncRNAs wie tRNAs, snRNA
und snoRNAs, kommen im Dictyosteliumgenom zwei weitere Klassen kleiner RNAs vor, class I
und class II RNAs, die vermutlich Dictyostelium spezifisch sind (Hinas et al. 2007).
7. Zielsetzung
37
7. Zielsetzung
Im Gegensatz zu den DNA Methyltransferasen Dnmt1 und Dnmt3a/b ist über die am weitesten
verbreitete Methyltransferase Dnmt2 relativ wenig bekannt. Die in einigen „Dnmt2 only“-
Organismen veröffentlichte schwache DNA Methyltransferaseaktivität wird kontrovers
diskutiert (Schaefer et al.; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009).
Zusätzlich wurde vor einigen Jahren entdeckt, dass Dnmt2 nach dem Mechanismus einer DNA-
MTase auch die tRNAAsp an der Position C38 methylieren kann (Goll et al. 2006; Jurkowski et al.
2008). Zu Beginn dieser Arbeit war tRNAAsp-Methylierungsaktivität der Dnmt2-Homologe aus D.
melanogaster und H. sapiens nachgewiesen. Weiterhin zeigen trotz hoher evolutionärer
Konservierung der Dnmt2 Proteine Knockout-Mutanten verschiedener Organismen nur milde
Phänotypen. Um Antworten auf die Frage zu finden, welche biologische – möglicherweise
bifunktionelle - Aktivität die evolutionäre Erhaltung des Proteins bewirkt hat, sind die
Identifikation des Substratspektrums sowie die Analyse von Dnmt2-Funktionen in vivo von
besonderem wissenschaftlichem Interesse.
Das Hauptziel dieser Dissertation bildete die biologische und biochemische Charakterisierung
der RNA Methyltransferaseaktivität des Dnmt2-Homolgs DnmA aus Dictyostelium. Dazu
gehörten der Nachweis der tRNA Methylierung in vitro und in vivo. Im Vordergrund standen die
Identifizierung neuer RNA-Substrate sowie die Untersuchung eines eventuellen Einflusses der
tRNA-Methylierung auf die Translation.
Basierend auf den Daten zur Mobilisierung des Retrotransposons skipper (Kuhlmann et al. 2005)
wurde zusätzlich der regulatorische Einfluss von DnmA auf das Retrotransposon unter dem
Aspekt RNA vermittelter Genregulation vertiefend charakterisiert.
Im Rahmen der Dnmt2-Forschergruppe FOR1082 war außerdem eine Beteiligung an der
Analyse speziesübergreifender Dnmt2-Funktionen sowie der Abbildung der Bindeeigenschaften
des Methylcytosin bindenden Proteins EhMLBP aus Entamoeba histolytica mittels AFM
vorgesehen.
8 Materialien
38
8. Materialien
8.1. Geräte
Binokular Zeiss, Jena
Blottingapparatur Biometra, Göttingen
Brutschrank Adolf Kühner, Birsfelden, Schweiz
Cantilever Tap 300AL-G Nano and more, Wetzlar
Elektrophorese-Kammern Agarosegele, V-Kammer Metallwerkstatt, Universität Kassel PAA-Gele (groß) Metallwerkstatt, Universität Kassel Mini-PROTEAN® Tetra Cell Biorad, München
Elektroporator (Gene PulserII®) Biorad, München
Feinwaage (BP 210 S) Sartorius, Göttingen
Fluoreszenzmikroskop Leica DM IRB Leica, Wetzlar
Fluoreszenzspektrometer Hitachi, VWR-Vertriebszentrum Hannover (Hitachi F2700)
Fotometer Novaspec™ III Visible Spectro- photometer GE Healthcare, München Pharmacia Gene quant RNA/DNA calc. Pharmacia, Stockholm, Schweden
Geldokumentation Intas, Göttingen
Geltrockner Drystar Bachofer, Reutlingen
Glimmer Plano, Wetzlar
Kulturschüttler Schütt, Göttingen
Mikroliter-Pipetten (20 μl, 200 μl, 1000 μl) Gilson, Langenfeld
Mikroliter-Pipette (10 μl) Eppendorf, Hamburg
Multimode AFM mit Nanoscope 3a Controller Bruker (Digital Instruments), Karlsruhe
PCR-Thermocycler Mastercycler personal Eppendorf, Hamburg Mastercycler ep gradient S Eppendorf, Hamburg
Realplex2 Mastercycler ep gradient S Eppendorf, Hamburg
Phosphoimager (Fujifilm FLA-7000) Fujifilm, Düsseldorf
Sterilbänke Galaire, Italien; Nunc, Wiesbaden
Ultraschallprozessor (UP 200S) Dr. Hielscher, Hamburg
UV-Stratalinker 2400 Stratagene, Amsterdam, Niederlande
UV-Tisch Bachofer, Reutlingen
Vakuum-Zentrifuge Bachofer, Reutlingen
8 Materialien
39
Zellzähler (Z2 Coulter® Particle Count & Beckman Coulter®, Hialeah, Florida Size Analyzer) Zentrifugen
Avanti®30 Beckmann, München Centrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5804R Eppendorf, Hamburg Rotina 48R Hettich, Tuttlingen
8.2. Verbrauchsmaterialien
Chromatographiesäulen (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) Biorad, München
Cryoröhrchen Nunc, Wiesbaden
Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig
Einmalskalpell Bayha, Tuttlingen
Einmalküvetten Sarstedt, Nümbrecht
Einwegspritzen (Ominfix-F 1 mL) B. Braun, Melsungen
EP-Küvetten (Gene Pulser® 0,4 cm) Biorad, München
Falconröhrchen (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Nürnbrecht
Filterpapiere (3mm Chr) Whatman, Dassel
Glasflaschen, Bechergläser Schott, Mainz
Glaspipetten Hirschmann, Eberstadt
Klebefolie (95.1994) Sarstedt, Nürnbrecht
Nitrozellulosemembran Macherey-Nagel, Düren (porablot™ NCP)
Nylonmembran Amersham, GE, München (Hybond-NX)
Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig
PCR-Reaktionsgefäße Sarstedt, Nürnbrecht
Petrischalen Sarstedt, Nürnbrecht
Pipettenspitzen Sarstedt, Nürnbrecht
Real time PCR Platten (Twin.tec 96) Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (1,5 mL; 2 mL) Sarstedt, Nürnbrecht
Röntgenfilme Raymed Imaging AG, Krauchthal (Contatyp CX-BL+ Medical X-ray film)
Sterilfilter Sarstedt, Nürnbrecht
Zentrifugalfilter (Amicon® Ultra-4, 4mL) Millipore, Schwalbach
8 Materialien
40
8.3. Chemikalien
Acrylamid/Bisacrylamid (30%, 40%) Roth, Karlsruhe
Agarose Sigma, Taufkirchen
Agar-Agar Euler, Frankfurt am Main
Aluminiumsulfat Roth, Karlsruhe
Ammoniumacetat Merck, Darmstadt
Ammoniumthiocyanat Roth, Karlsruhe
Amplify-Solution Amersham, GE, München
APS Merck, Darmstadt
BCIP-T Fermentas, St. Leon-Rot
Borsäure Roth, Karlsruhe
Bromphenolblau Fluka, Deisenhofen
BugBuster® Protein Extraction Reagent Merck, Darmstadt
Calciumchlorid Roth, Karlsruhe
Complete-mini (Protease Inhibitor Tabletten) Roche, Mannheim
Coomassie Brillant Blue G-250 Serva, Heidelberg
DABCO Roth, Karslruhe
DEPC Roth, Karslruhe
Dinatriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
DMF Merck, Darmstadt
DMSO Sigma, Taufkirchen
DTT Roth, Karlsruhe
DTBP Sigma, Taufkirchen
EDC Sigma, Taufkirchen
EDTA Roth, Karlsruhe
Essigsäure 100 % Roth, Karlsruhe
Ethanol >99.8% Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid Fluka, Deisenhofen
Galactose Roth, Karlsruhe
Glucose Roth, Karlsruhe
Glycerin 86 %, >99% Roth, Karlsruhe
GTC Roth, Karlsruhe
Harnstoff Roth, Karlsruhe
HEPES Roth, Karlsruhe
Hexanukleotid Random-Primer-Mix Roth, Karlsruhe
8 Materialien
41
Imidazol Roth, Karlsruhe
IPTG Roth, Karlsruhe
Isopropanol Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid Roth, Karlsruhe
Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe
Magermilchpulver Rossmann, Kassel
Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe
Magnesiumsulfat Roth, Karlsruhe
Mercaptoethanol (-β) Fluka, Deisenhofen
MOPS Roth, Karlsruhe
Natriumacetat Merck, Darmstadt
Natriumchlorid Roth, Karlsruhe
Natriumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe
Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid Roth, Karlsruhe
NP40 Fluka, Deisenhofen
Paraformaldehyd Roth, Karlsruhe
PEG8000 Promega, Mannheim
Phenol Roth, Karlsruhe
Phenol/Chloroform Roth, Karlsruhe
Phosphorsäure Fluka, Deisenhofen
Saccharose Roth, Karlsruhe
S-Adenosyl-L-methioninchlorid Sigma, Taufkirchen
Salzsäure 37% Merck, Darmstadt
SDS Roth, Karlsruhe
Sepharose (Sephadex® G-50-150) Fluka, Deisenhofen
SYBR-Green Jena Bioscience, Jena (EvaGreen® Fluorescent DNA stain)
TEMED Roth, Karlsruhe
Tris Roth, Karlsruhe
TritonX-100 Roth, Karlsruhe
Xylencyanol Fluka, Deisenhofen
8 Materialien
42
8.4. Affinitätsmatrices für Chromatographie und Immunpräzipitationen
IgG-Agarose rabbit Sigma, Taufkirchen
GSH-Agarose Sigma, Taufkirchen
GFP-trapA (Nanotrap, GBP) Chromotek, Planegg-Martiensried
NiNTA-Sepharose™ Qiagen, Hilden
Strep-Tactin® Superflow® IBA, Göttingen
8.5. Puffer und Lösungen
AP-Puffer 100 mM Tris/HCl pH 9,5 (Western-Blot) 100 mM NaCl
20 mM MgCl2 BCIP-Lösung 50 mg/ml BCIP-T in DMF Bindepuffer (1x) 10mM Tris–HCl, pH 7,5 (für SFM) 50mM NaCl 6mM EDTA
4% (v/v) Glycerin Blockierlösung 2% Magermilchpulver in 1x NCP Church-Puffer 0,25 M NaPi, pH 7,0 (Northern-Blot) 1 mM EDTA (0,5 M) 1% BSA 7% SDS Coomassie-Färbelösung, kollodial 0,1% Coomassie Brilliant Blue G250
(SDS-PAGE) 2% (w/v) Phosphorsäure 5% (w/v) Aluminumsulfat
Coomasie-Färbelösung 0,1% Coomassie Brilliant Blue G250 (Schnelltest) 10% Essigsäure Crosslinking solution 127 mM Methylimidazol
(Northern-Blot) 0,16 M EDC in DEPC-H2O pH 8,0 einstellen (HCl)
Crosslink-Reversal-Buffer 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 300 mM NaCl 0,5% NP40 0,5% Natriumdeoxycholat 5 mM EDTA 0,5 % SDS Denhardt Lösung (100x) 2% Ficoll 400 (Northern-, Southern-Blot) 2% Polyvinylpyrrolidone
2% BSA
8 Materialien
43
DEPC-Wasser 0,1% DEPC in dest. Wasser (üN stehen lassen, dann 2x
autoklavieren) Dialysepuffer I 30 mM KPi, pH 7,0 (IMAC) 200 mM KCl
20% (v/v) Glycerin 0,1 mM EDTA 1 mM DTT
Dialysepuffer II 30 mM KPi, pH 7,0 (IMAC) 100 mM KCl
50% (v/v) Glycerin 0,1 mM EDTA
1 mM DTT Dialysepuffer I 30 mM KPi, pH 7,5 (GST-Affinitätschromatographie) 150 mM NaCl 20% (v/v) Glycerin
0,5 mM EDTA 0,1 mM DTT Dialysepuffer II 30 mM KPi, pH 7,5 (GST-Affinitätschromatographie) 150 mM NaCl 50% (v/v) Glycerin
0,5 mM EDTA 0,1 mM DTT
Dilution Buffer 20 mM Tris/HCl, pH 7,0 (modifiziert im Original ohne Mg2+) 150 mM NaCl (GFP-Nanotrap) 3 mM MgCl2
DNA-Auftragspuffer (6x) 10 mM Tri/HCl, pH7,6 60% (v/v) Glycerin 60 mM EDTA 0,03% Xylencyanol und/oder 0,03% Bromphenolblau
Elutionspuffer 30 mM KPi, pH 7,0 (IMAC) 300 mM KCl
10% (v/v) Glycerin 200 mM Imidazol
0,1 mM DTT Elutionspuffer 50 mM Tris/HCl, pH 9,6 (GST-Affinitätschromatographie) 150 mM NaCl 20 mM GSH EP-Puffer (für Elektroporation) 10 mM Na2HPO4
50 mM Saccharose, sterilfiltrieren
8 Materialien
44
Ethidiumbromid-Lösung 1 mg/mL Ethidiumbromid in dest. H2O Fixierlösung (für denat. PAA-Gele) 10% MeOH
10% HAc Formamid-RNA-Ladepuffer (2x) 95% Formamid (FA-Puffer) 5 mM ETDA, pH 7,4
0,03% Xylencyanol und/oder 0,03% Bromphenolblau
Hybridisierungslösung nach Denhardt 5x Denhardt Lösung (Northern-, Southern-Blot) 5x SSC
50% Formamid 1% SDS 120 mM Phosphatpuffer, pH 6,7
Inactivation Buffer 100 mM Tris/HCl, pH 8,0 (nach DTBP crosslinking für Affinitätschr.) 150 mM NaCl IPP 150 (mit 0,1% NP40) 300 mM Galaktose
(TAP) 10 mM Tri/HCl, pH 8,0 150 mM NaCl
0,1% NP40 Lämmli-Puffer (Probenpuffer 5 x) 31 mL 1M Tris, pH 6,8 (SDS-PAGE) 10 g SDS 50 mL Glycerin (zum Lösen etwas erwärmen) 1,8 mg Bromphenolblau Ad 100 mL H2O
10% (v/v) β-Mercaptoethanol Lösung I 25 mM Tris/HCl, pH 7,4 (Plasmidpräp.) 10 mM EDTA
15% Saccharose Lösung II 200 mM NaOH (Plasmidpräp.) 1% SDS Lösung III 3 M Natriumacetat pH 4,7 (Plasmidpräp.)
Lysepuffer 1x PBS (GST-Affinitätschromatographie) 100 mM KCl 1% Triton-X 100
1 mM DTT Lysis Buffer 20 mM Tris/HCl, pH 7,0
(modifiziert im Original ohne Mg2+) 150 mM NaCl (GFP-Nanotrap) 3 mM MgCl2
0,5% NP40
8 Materialien
45
Methylierungspuffer (10x) 500 mM Tris, pH 7,0 50 mM MgCl2 10 mM DTT 500 mM NaCl MOPS-Laufpuffer für PAA-Gele 20 mM MOPS, pH 7,0 NCP-Puffer (10 x) 12,1 g Tris/HCl, pH 8,0
87 g NaCl 5 g Tween®20 ad 1 L ddH2O
OLB-Mix (5x) 100 µL 1M Tris/HCl, pH 7,5
12,5 µL 1M MgCl2 1,7 µL β-Mercaptoethanol 2,5 µL 50mM dCTP 2,5 µL 50mM dGTP 2,5 µL 50mM dTTP 250 µL 2M Hepes, pH 6,6 150 µL 90 A260 Units/mL Oligonukleotide (PL) pd(N)6
Paraformaldehydlösung 4% Paraformaldehyd (Fixierung von Zellen) 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,7 PBS (10 x) 80,6 g NaCl/HCl pH 7,3
7,65 g Na2HPO4 x 2 H2O 2,01 g KCl 1,91 g KH2PO4 ad 1 L H2O
Proteinase K storage buffer 20 mM Tri/HCl, pH 7,4
1 mM CaCl2 50% Glycerol
Proteingel-Laufpuffer (5 x) 15,1 g Tris 72 g Glycin 5 g SDS ad 1 L H2O
Protein-Sammelgelpuffer 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8
14 mM SDS Protein-Trenngelpuffer 1,5 M Tris/HCl, pH 8,8
14 mM SDS RIPA-Buffer (modifiziert) 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 150 mM NaCl 0,5% NP40 0,5% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA
8 Materialien
46
RIPA-Equilibration-Buffer 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 300 mM NaCl 0,5% NP40 0,5% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA 0,1 % SDS Rivetti-Puffer 10 mM Hepes, pH 9,0 (AFM) 10 mM NaCl
2 mM MgCl2 RNA-Auftragspuffer (nativ) 0,1x TBE 70% (v/v) Glycerin SDS/TE 0,3% SDS in 1 x TE-Puffer, pH 7,5 Semidry Blotpuffer 5,8 g Tris
2,92 g Glycin 0,38 g SDS 200 mL Ethanol ad 1 L H2O
Soerensen-Phosphatpuffer 2 mM Na2HPO4
(Malchow et al. 1972) 15 mM KH2PO4 auf pH 6,0 mit H3PO4 einstellen
Sonifizierungspuffer/Waschpuffer 30 mM KPi (pH 7,0)
(IMAC) 300 mM KCl 10% (v/v) Glycerin 10 mM Imidazol
0,1 mM DTT
SSC (20x) 3 M NaCl 0,3 M Natriumzitrat, pH 7,0
SSPE (20x) 3,6 M NaCl 200 mM NaH2PO4 20 mM EDTA, pH 7,4 mit NaOH STE-Puffer 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 (Hybridisieren von Oligonukleotiden) 50 mM NaCl 1 mM EDTA StrepII-Lysepuffer 30 mM KPi, pH 7,5 150 mM KCl 1 mM EDTA 1% Triton-X100 1 mM DTT 5% (v/v) Glycerin StrepII-Waschpuffer 30 mM KPi, pH 7,5 150 mM KCl 1 mM EDTA 0,1% Triton-X100 1 mM DTT 5% (v/v) Glycerin
8 Materialien
47
StrepII-Elutionspuffer 30 mM KPi, pH 7,5 150 mM KCl 1 mM EDTA 0,1% Triton-X100 1 mM DTT 5% (v/v) Glycerin 2,5 mM Desthiobiotin StrepII-Dialysepuffer 30 mM KPi, pH 7,5 100 mM KCl 1 mM EDTA 1 mM DTT 50% (v/v) Glycerin
Stringency RIPA-Buffer A 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 1 M NaCl 1% NP40 1% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA 0,1% SDS 1 M Urea
Stringency RIPA-Buffer A 50 mM Tris/HCl, pH 7,5 (RNA-CLIP) 1 M NaCl 1% NP40 1% Natriumdeoxycholat 1 mM EDTA 0,1% SDS 2 M Urea
Stripping Buffer 0,1x SSC (Northern-Blot) 1% SDS TBE-Puffer (5x) 445 mM Tris
445 mM Borsäure 10 mM EDTA pH 8,0
TE-Puffer (1x) 10 mM Tris (pH 7,5 oder pH 8,0) 1 mM EDTA TEV cleavage buffer 10 mM Tri/HCl, pH 7,0
(TAP) 150 mM NaCl 0,1% NP40 0,5 mM EDTA 1 mM DTT
Transkriptionspuffer (10x) 400 mM Tris/HCl, pH 8,0 (nach Doudna) 200 mM MgCl2 20 mM Spermidin 0,1% Triton X-100 Waschlösung I oder A 2 x SSC (Northern- und Southern-Blot) 0,1% SDS
8 Materialien
48
Waschlösung B 1x SSC (Northern-Blot) 0,1% SDS Waschlösung C 0,5x SSC (Northern-Blot) 0,1%SDS Waschlösung II 0,2 x SSC (Northern- und Southern-Blot) 0,1% SDS
Waschpuffer A 1xPBS (GST-Affinitätschromatographie) 100 mM KCl
1% Triton X-100 Waschpuffer B 1xPBS (GST-Affinitätschromatographie) 100 mM KCl Zelllysepuffer 50 mM HEPES pH 7,5 (Dictyostelium für gDNA) 40 mM MgCl2 20 mM KCl 5% (w/v) Saccharose
8.6. Kits
NucleoSpin® ExtractII Macherey-Nagel, Düren
NucleoBond® PC 100 Macherey-Nagel, Düren
CloneJETTM PCR-Cloning Kit Fermentas, St. Leon-Rot
Gene JetTM PCR-Cloning Kit Fermentas, St. Leon-Rot
SensiFAST SYBR No-ROX One-Step Kit Bioline, Luckenwalde
8.7. Enzyme und Enzympuffer
AcTEVTM Protease Invitrogen, Karlsruhe
Apa I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
BamH I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
BSA (10mg/mL) New England Biolabs, Frankfurt am Main
CIAP 1 u/μL (+ 10x CIAP-Puffer) Fermentas, St. Leon-Rot
DNase I (1 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
McRBC (10.000 U/mL) New England Biolabs, Frankfurt am Main
M-MuLV Reverse Transcriptase (20 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
Nco I (10 u/µL)
Pfu Polymerase Universität Kassel
Proteinase K Roth, Karlsruhe
Pst I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
8 Materialien
49
Pvu II (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
RNase A (1 mg/mL) Merck Biosciences, Bad Soden
T4 DNA Ligase (1 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
T4 Polynukleotid-Kinase (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
T7 RNA Polymerase Universität Kassel
Taq DNA Polymerase Universität Kassel
Xba I (10 u/μL) Fermentas, St. Leon-Rot
Xho I (10u/µL) Fermentas, St. Leon-Rot
10 x B+, O+, R+, Y+/Tango Puffer Fermentas, St. Leon-Rot
10 x Pfu Puffer (+MgSO4) Fermentas, St. Leon-Rot
10 x T4 Ligase-Puffer (+DTT) Fermentas, St. Leon-Rot
10 x T4 PNK Buffer A Fermentas, St. Leon-Rot
10 x Taq-Puffer (+ KCl, +MgCl2) Fermentas, St. Leon-Rot
DMSO (100%) Fermentas, St. Leon-Rot
Glycogen (RNA grade, 20 mg/mL) Fermentas, St. Leon-Rot
8.8. Größenstandards
GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot
GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder Plus Fermentas, St. Leon-Rot
GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus Fermentas, St. Leon-Rot
RiboRuler™ Low Range RNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot
Low Range ssRNA Ladder New England Biolabs, Frankfurt am Main
PageRulerTM Plus Prest. Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot
PageRulerTM Unstained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot
microRNA Marker New England Biolabs, Frankfurt am Main
DecadeTM marker Ambion, Austin, Texas
8.9. Nukleotide
[γ-32P] ATP (110 TBq/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig
[α-32P] UTP (110 TBq/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig
[3H]-SAM (2,22 TBq/mmol) Hartmann Analytic, Braunschweig
Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Fermentas, St. Leon-Rot
Ribonukleotide (ATP, CTP, GTP, UTP) Dianova, Hamburg
8 Materialien
50
dm5CTP New England Biolabs, Frankfurt am Main
8.10. Antikörper
Kaninchen-anti-TAP OPEN Biosystem, Huntsville
Maus-anti-His (MRGSHHHH) Universität Kassel, Kassel
AP-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen Dianova, Hamburg
AP-gekoppelter Ziege-anti-Maus Dianova, Hamburg
Maus-anti-GFP Universität Kassel, Kassel
GST (Z-5):sc-459 Santa Cruz Biotech, Heidelberg
8.11. Nährmedien
Medien für Dictyostelium discoideum
HL5-Medium FormediumTM, Norfolk HL5+-Medium HL5-Medium + 50 μg/mL Ampicillin + 0,25 μg/mL Amphotericin + 10 μg/mL Penicillin + 10 μg/mL Streptomycin
BS10-Medium HL5+-Medium + 10 μg/mL Blasticidin G10-Medium HL5+-Medium + 10 μg/mL Geniticin (G418) G10/BS10-Medium HL5+-Medium + 10 μg/mL Geniticin (G418) + 10 μg/mL Blasticidin Phosphatagar Soerensen-Phosphatpuffer + 13 g/L Agar-Agar
Medien für Escherichia coli
LB-Medium, pH 7,0 10 g Bacto-Trypton 5 g Hefeextract 5 g NaCl ad 1 L H2O LB-Amp-Medium LB-Medium + 50 μg/mL Ampicillin
8 Materialien
51
LB-Amp-CAM-Medium LB-Amp-Medium + 34 µg/µL Chloramphenicol LB-KAN-CAM-Medium LB-Medium + 10 µg/µL Kanamycin + 34 µg/µL Chloramphenicol LB-Agar LB-Medium + 13 g/L Agar-Agar
Medium für Klebsiella aerogenes (Enterobacter mobilis)
SM-Agar 15 g Bacto-Agar 10 g Pepton 10 g Glucose 1 g Hefeextrakt 1 g MgSO4
2,2 g KH2PO4
8.12. Antibiotika
Amphotericin (0,25 mg/mL) PAA, Cölbe
Ampicillin (50 mg/mL) Roth, Karlsruhe
Blasticidin (5 mg/mL) MP Biomedicals, Eschwege
Chloramphenicol (34 mg/mL) Merck, Darmstadt
Geniticin G418 (100 mg/mL) PAA, Cölbe
Kanamycin solution (10mg/mL) Sigma, Taufkirchen
Penicillin/Streptomycin (100x) PAA, Cölbe
8.13. Bakterienstämme
Escherichia coli-DH5αTM Invitrogen, Karlsruhe
Escherichia coli One Shot® TOP10 Invitrogen, Karlsruhe
Escherichia coli-(DE3) Rosetta2 pLysS Invitrogen, Karlsruhe
Klebsiella aerogenes Universität Kassel
8.14. Stämme Dictyostelium discoideum
AX2 (wt) (Watts et al. 1970b)
AX2 DnmAKO (Kuhlmann et al. 2005)
8 Materialien
52
AX2 DnmAKO “rox” (C. Joppich, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_DnmA-CTAP/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_DnmA-NTAP/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_ DnmA-StrepII/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_DnmA-GFP/DnmAKO (V. Maximov, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_DnmA-GFP/wt
AX2 pDneo2a_GFP (Dubin et al. 2010b)
AX2 pDbsrXP gfp (I. Windhof, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_hDnmt2-GFP/wt
AX2 pDneo2a_hDnmt2-GFP/dnmAKO (H. Ziegler, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_hDnmt2-NLS-GFP/wt (H. Ziegler, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_hDnmt2-NLS-GFP/dnmAKO (H. Ziegler, unveröffentlicht)
AX2 pDneo2a_GFP(GAC)5/wt
AX2 pDneo2a_GFP(GAC)5/DnmAKO
AX2 pDneo2a_GFP(GAU)5/wt
AX2 pDneo2a_GFP(GAU)5/DnmAKO
8.15. Stamm Drosophila melanogaster
Vermillion-Rosy v1/Y; +/+; ry506/ry506
8.16. Oligonukleotide/Primer
tRNA Oligonukleotide
SM3_tRNAAsp_5A (tRNAAsp Oligo 1) TTGTAATACGACTCACTATAGCGTCCTTGTTGGTCTAGTGGTGAGG
SM4_tRNAAsp_3´+BamHI (tRNAAsp Oligo 3) CGCGAAAGGCCCGGGTTCAATTCCCGGACAGGGAG GATCC
SM5_tRNAAsp_mid (tRNAAsp Oligo 2) CCCGGGCCTTTCGCGTGACAGGCGAAAATCCTCACCACTAGACCAACAAG
SM6_tRNAAsp_3´_rev (tRNAAsp Oligo 4) GGATCCTCCCTGTCCGG
SM7_tRNAGlu_C38A_5´ (tRNAGlu C38A Oligo 1) TTGTAATACGACTCACTATAGGGTCCTCATTGGTGTAGTCGGTAAC
SM8_tRNAGlu_C38A_3´ (tRNAGlu C38A Oligo 3) TTTCAAACTGGTACCTCGGGTTCGATTCCCGAATGGGGAGGATCC
SM9_tRNAGlu_C38A_mid (tRNAGlu C38A Oligo 2) CCCGAGGTACCAGTTTGAAAGACTAGAGTGTTACCGACTACACCAATGAG
8 Materialien
53
SM10_tRNAGlu_C38A_3´_rev (tRNAGlu C38A Oligo 4) GGATCCTCCCCATTCGG
SM11_tRNALeu-AAG8_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGCGTAAGCTTGCCCGAGCTGGTTTAAGGG
SM12_tRNALeu-AAG8_Oligo2 AACCCTTGTATCAATGATATTGCAGCCTTAATGCAACCCCTTAAACCAGCTCGG
SM13_tRNALeu-AAG8_Oligo3 GCAATATCATTGATACAAGGGTTCGAATCCCTTAGCTTACAGCTG
SM14_tRNALeu-AAG8_Oligo4 CAGCTGTAAGCTAAGGGAT
SM15_tRNALeu-UAG1_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCGAGTGGTTAAGACAATAG
SM16_tRNALeu-UAG1_Oligo2 CGCGACCCCGGAGGATAGAGCCTAAATCTATTGTCTTAACCACTCGACCAA
SM17_tRNALeu-UAG1_Oligo3 CCTCCGGGGTCGCGGGTTCGAACCCCGCATCTCTCAGCTG
SM18_tRNALeu-UAG1_Oligo4 CAGCTGAGAGATGCGGG
SM19_tRNAVal-CAC1_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGGGAAAGTAGTGTAGTGGTTATCAC
SM20_tRNAVal-CAC1_Oligo2 CCACGACCTAACCCGTGTGAAGGGCTCGTGATAACCACTACACTACTTTC
SM21_tRNAVal-CAC1_Oligo3 CACGGGTTAGGTCGTGGGTTCGATCCCCATCTATCTCAGCTG
SM22_tRNAVal-CAC1_Oligo4
CAGCTGAGATAGATGGGG
SM24_tRNAAsp_mid_C38A (tRNAAsp C38A Oligo2) AGCGAAAGGCCCGGGTTCAATTCCCGGACAGGGAGGATCC
SM25_tRNAAsp_3´_C38A (tRNAAsp C38A Oligo3) CCCGGGCCTTTCGCTTGACAGGCGAAAATCCTCACCACTAGACCAACAAG
SM 38_Asp_primer-ext CTGTCCGGGAATTGAAC
SM 78_anti-as-Glu(UUC)-Fragment CACACTGGTACCTCGGG
Oligonukleotide für U-snRNA, snoRNA und intergenische Sequenzen
SM39_sno7_primer-ext TCAGATTTGTGCGAACAC
SM40_intergenicR69_primer-ext TCAGGAAAGAATAATGCATAG
SM41_Sno14as_primer-ext TCAGACGTCTTCTAAAGAAG
SM45_sno7_5-end TTGTAATACGACTCACTATAGCGTTGAATGATGATTGGTTGCAC
8 Materialien
54
SM46_sno7_3-End+BamHI GGATCCTGGTCAGATTTGTGC
SM47_intR24_sno14as_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGCG TAGATGATGAACCAAAATAC
SM48_intR24_sno14as_Oligo2 CACTATGGGTTCTAAAGTATAGGATAATACGTATTTTGGTTCATCATCTAC
SM49_intR24_sno14as_Oligo3 CTTTAGAACCCATAGTGAAATGATTTTACAACCTTCTTTAG
SM50_intR24_sno14as_Oligo4 GGATCCTCAGACGTCTTCTAAAGAAGGTTGTAAAATC
SM51_intR69_Oligo1 TTGTAATACGACTCACTATAGCGCTTGGTGATGATTAACAGCTAAAG
SM52_intR69_Oligo2 GTCTCAGCAATAGTTTTTACAGAAACTCTAGTCTTTAGCTGTTAATCATCACC
SM53_intR69_Oligo3 GTAAAAACTATTGCTGAGACTATGCATTATTCTTTCCTGA GGATCC
SM54_intR69_Oligo4 GGATCCTCAGGAAAGAATAATG
SM55_rnu2ab-5-End TTGTAATACGACTCACTATAGCGACCTTCTTGAAGCGTCTC
SM56_rnu2ab-3-End+BamHI GGATCCGTGAGGCGCAC
SM60_DDU2 (Hinas) GCACATCAACGTGTGATGGC
SM61_T7_PROMOTOR+GCG TTGTAATACGACTCACTATAGCG
SM62_Rnu2a/b_C73A_fw CTGCCATCAAACGTTGATGTG
SM63_Rnu2a/b_C73A_rev CACATCAACGTTTGATGGCAG
SM64_Rnu2a/b_C155A_fw CGACCTCTAAGCATTCGCTC
SM65_Rnu2a/b_C155A_rev GAGCGAATGCTTAGAGGTCG
SM66_rnu4a_5-end TTGTAATACGACTCACTATAGCGATCTTTACGCTGGGAC
SM67_rnu4a_3-end + NcoI CCATGGATAGTGACAAAAATTGC
SM72_hU2-fw+T7 TTGTAATACGACTCACTATAGCGATCGCTTCTCGGCCTTTTG
SM73_hU2-rev+BamHI GGATCCGGGTGCACCGTTCCTG
8 Materialien
55
DnmA und hDnmt2 Oligonukleotide (inkl. NLS-Oligonukleotide)
SM1_DnmA_Dm_forw GGGCCCATGGAACAATTGCGCGTGCTGGAATTTTATAG
SM2_DnmA_Dm_rev GGCTTTGTTAGCAGCGGGCCCCGTATTTTTTTCCTTC
SM30_DnmA-Nterm-NdeI CAGCCATATGGAACAATTGAGAGTATTAG
SM31_DnmA-Cterm-XhoI CTCGAGTTATTTTTTTCCTTCTTTTTCCTTTTG
SM34_hDnmt2_for_pDneo2a_fw CTGCAGAAATGGAACCACTTCGTGTTCTTGAACTATACAGC
SM35_hDnmt2_for_pDneo2a_rev GGATCCTTCATATAAGATTTTGATTAGTTTAGCTACTAC
SM43_NLS_BamHI_fw GATCCCCAAAAAAGAAA CGTAAAGTTG
SM44_NLS_BamHI_rev GATCCAACTTTACGTTTCTTTTTTGGG
Translationssystem
SM26_Asp(GAC)-Oligo I P-GAAATGGCTAAAACTGACGACGACGACGACG
SM27_Asp(GAC)-Oligo II P-GATCCGTCGTCGTCGTCGTCAGTTTTAGCCATTTCTGCA
SM28_Asp(GAU)-Oligo I P-GAAATGGCTAAAACTGATGATGATGATGATG
SM29_Asp(GAU)-Oligo II P-GATCCATCATCATCATCATCAGTTTTAGCCATTTCTGCA
qPCR Oligonukleotide
SM57_ GFP-qPCR-fw GAAAACTACCTGTTCCATGGC
SM58_ GFP-qPCR-rev GGCATGGCACTCTTGAAAAAG
SM70_skipper_RT_fw_qPCR GTAGGTTATCCAAAGAAACACAATG
SM71_skipper_RT_rev_qPCR ACTTCTCTGATCCATTCAGGTTC
SM74_skipper-gag-fw-qPCR CTACTCCTTCAAAGAAAGCCATC
SM75_skipper-gag-rev-qPCR TTCGACGTCGGATACATCAG
Coronin_qPCR_fw AAATATCGTCATGTTTTTGCAGCACAAC
8 Materialien
56
Coronin_qPCR_rev AATAATGGAACTGATGTGGTTTTACCTGAA
cinD_Forw GCCAGAAATGCTTTGAAAATGACAC
CinD_Rev GAGTGGTTTGCCAATTTCTTTTCCT
Weitere Oligonukleotide
SP6-GEM-PCR ATTTAGGTGACACTATAGAATAC
T7-GEM-PCR TGTAATACGACTCACTATAGGG
28nt T-Oligo TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
BB007_5.8S_consensus_N CATAAACGGTGAATACCTCGACTCC
BB008_5.8S_consensus_C AAAGGACCGATGTCATCATGTGCGT
8.17. Plasmide
Klonierungsstrategien der in dieser Arbeit entstandenen Plasmide sind im folgenden Kapitel
separat aufgeführt.
Plasmide für heterologe Proteinexpression in E. coli
pET 15b-DnmA rc rescue (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)
pET28a(+) hDnmt2 (Jurkowski et al. 2008)
pET15b pmt1 (M. Becker, Essen, unveröffentlicht)
pGEX-4T-1 EhMLBP full length (Lavi et al. 2006)
pGEX-4T-1 EhMLBP-ter (Lavi et al. 2006)
pET 28a(+) DnmA (N-term) (Klon 2)
über pJET1.2 DnmA NdeI/XhoI (N-term)
Plasmide für in vitro Transkription
pGEM T-Easy Glu5 (T. Winckler, Jena)
pGEM T-Easy suppresssor Glu (T. Winckler, Jena)
pJET1Glu5 (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)
pJET1Glu5rev (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)
pJET1Glusup (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)
8 Materialien
57
pJET1Glu5suprev (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)
pJET1 tRNA Phe (V. Maximov, Kassel, unveröffentlicht)
pJET1 tRNA Asp (T7, BamHI)
pJET1 tRNA Glu C38A (T7, BamHI)
pJET1 tRNA LeuAAG (in Kooperation mit S. Junk)
pJET1 tRNA Leu UAG (in Kooperation mit S. Junk)
pJET1 tRNA Val CAC (2nd) (in Kooperation mit S. Junk)
pJET1 tRNA Asp C38A (in Kooperation mit S. Junk)
pJET1 rnu2a/b
pJET1 sno7
pJET intergenic R24 (sno14as)
pJET intergenic R69
pJET1 rnu2a/b C73A (in Kooperation mit S. Fuhrmann)
pJET1 rnu2a/b C155A (in Kooperation mit S. Fuhrmann)
pJET1 rnu4a (in Kooperation mit S. Fuhrmann)
pJET1 rnu2-1 (human)
Plasmide für Proteinexpression in Dictyostelium
pDneo2a_GFP (Dubin et al. 2010b)
pDneo2a_Asp(GAC)5_GFP
pDneo2a_Asp(GAU)5_GFP
pDneo2a_hDnmt2-GFP
pDneo2a_NLS-hDnmt2-GFP (in Kooperation mit H. Ziegler)
Plasmide für Proteinexpression in Drosophila
pGS UAS V5 (Schotta et al. 2000)
pJET DnmA f. D.m. (Klon 3)
pGS UAS DnmA V5 (Klon 3/8)
Sonstige Plasmide
pJET1.2 5.8s consensus (K13) (B. Boesler, Kassel, unveröffentlicht)
pGEM T-Easy RT LINE (Lavi et al. 2006)
Dnmt2 KO vector (ohne loxP sites) (Kuhlmann et al. 2005)
pGEM T-Easy Skipper RT (Kuhlmann et al. 2005)
pGEM T-Easy DIRS rLTR (Kuhlmann et al. 2005)
8 Materialien
58
8.18. Klonierungsstrategien
Plasmid für heterologe Proteinexpression in E. coli
pET 28a(+) DnmA (N-term): Das dnmA-Gen
wurde aus dem Plasmid pET 15b DnmA
amplifiziert, dabei unter Verwendung der Primer
SM30 und SM31 mit einer NdeI sowie einer XhoI
Schnittstelle versehen und in den pJet 1.2 Vektor
zwischenkloniert (pJET1.2 DnmA NdeI/XhoI (N-
term)). Der Zwischenvektor wurde mit den
genannten Restriktionsenzymen verdaut und das
Fragment gerichtet in den durch NdeI und XhoI
linearisierten Zielvektor ligiert.
Plasmide für in vitro Transkription
pJET1 tRNA-Plasmide, pJET1 int. R24 und R69 und pJET1 sno7: Die Gene der tRNAs (Kapitel
8.19), sno7 sowie die intergenischen Sequenzen (R24 und R69) wurden mittels rekursiver PCR
hergestellt (Kapitel 9.2.14) und ungerichtet in den Vektor pJET1 ligiert. Klone mit dem Gen in
der gewünschten Orientierung wurden mittels analytischer PCR identifiziert. Die vewendeten
Oligonukleotide für die Klonierung sind in Kapitel 8.16 unter Oligonukleotide für tRNA-Plasmide
und Oligonukleotide für U-snRNA, snoRNA und intergenische Sequenzen aufgeführt.
Oligonukleotide wurden so generiert, dass sich direkt vor jedem Gen ein T7-Promotor befindet
und das Transkript mit einem GCG oder GGG beginnt. Direkt an das 3´-Ende des Gens wurde eine
Restriktionsschnittstelle (5´-Überhang oder Blunt) kloniert: Plasmide der tRNAAsp(GUC),
tRNAAsp(GUC) C38A, tRNAGlu(UUC) C38A, der intergenischen Sequenzen und sno7 wurden mit einer
BamHI Schnittstelle versehen. Die tRNA-Plasmide von Leucin und Valin lassen sich mittels PvuII
linearisieren (Junk 2010). Die Punkmutationen C38A in die tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC) wurden
unter Verwendung der entsprechend mutagenisierten Oligonukleotide eingefügt.
Transkriptionsstart GCG/GGG und Restriktionsschnittstelle wurden so gewählt, dass die Faltung
möglichst wenig beeinflusst wird (Mfold, Zuker 2003). Beispiele der Vektorkarten:
pJET1 tRNA Asp (T7)
3228 bp
tRNA Asp
GCG
T7 promotor
BamHI (593)
BamHI (1124)
pJET1 tRNA Val-CAC (T7)
3225 bp
tRNA Val
GGG
T7 Promotor
PvuII (591)
PvuII (628)
PvuII (1170)
pET28a(+)DnmA N-term
6433 bp
DnmA cDNA
His-tag
KanR
Start ATG
T7-Promotor
NdeI (5130)
XhoI (6272)
8 Materialien
59
pJET1 rnu2a/b, pJET2 rnu2-1 und pJET rnu4: Die Gene der U2-snRNA rnu2a/b sowie der
rnu4a wurden von genomischer DNA aus Dictyostelium und das Gen rnu2-1 von humaner gDNA
mittels PCR amplifiziert. Analog zur Konstruktion der tRNA Plasmide wurde ein T7-Promotor
und GCG als Transkriptionsstart sowie BamHI bzw. NcoI als Schnittstelle zur Linearisierung des
Plasmids hinzugefügt.
pJET1 rnu4a
3279 bp
rnu4a
GCG
T7 Promotor
NcoI (644)
NcoI (686)
pJET1 rnu2-1 (human)
3345 bp
rnu2-1
GCG
T7 Promotor
BamHI (710)
BamHI (1241)
pJET1 rnu2a/b C73A, pJET rnu2a/b C155A: Die Herstellung der mutierten rnu2a/b Vektoren
erfolgte mittels ortsspezifischer Mutagenese. Die U2-snRNA wurde jeweils in zwei Teilen aus
gDNA amplifiziert, wobei jeweils die internen Primer, die die Mutationsstelle überdeckten,
entsprechend punktmutiert waren. Für die C73A Mutation wurden die Primerpaare SM56/SM63
und SM62/SM56 und für die Mutation C155A die Primerpaare SM55/SM65 und SM64/SM56
vewendet. Die beiden Einzelfragmente wurden zusammen in einer weiteren PCR unter
ausschließlicher Verwendung der randständigen Primer SM61/SM56 amplifiziert und in den
pJET1 Vektor kloniert.
Plasmide für Proteinexpression in Dictyostelium
pDneo2a_Asp(GAC)5_GFP, pDneo2a_Asp(GAU)5_GFP:
Das Plasmid pDneo2a_GFP wurde mittels PstI und
BamHI verdaut und CIAP behandelt. Die Oligo-
nukleotide SM26/SM27 und SM28/SM29 wurden
hybridisert und jeweils gerichtet in das vorbereitete
pDneo2a_GFP-Plasmid ligiert.
pDneo2a Asp-leader-GFP
6844 bp
Amp(r)
T 4903 res 1029-2254
Asp-lead er
GFP
Act6pro
Act15-P
Act8-T
Act 15-T
BamHI (37)
Pst I (6)
8 Materialien
60
pDneo2a_hDnmt2-GFP: Die Amplifikation von
humaner dnmt2 erfolgte aus dem Vektor pET28a(+)
hDnmt2 mit Hilfe der Primer SM34 und SM35. Die
Primer wurden so designt, dass am 5´-Ende eine PstI
und am 3´-Ende eine BamHI Schnittstelle angefügt
wurde. Zudem erfolgte eine zielgerichtete
Mutagenese der ersten Codons am 5´-Ende der
kodierenden Sequenz um diese hinsichtlich der
Codon usage in Dictyostelium zu optimieren. Das Amplicon wurde in den pJET1.2 Vektor
zwischenkloniert. Aufgrund mehrerer endogener PstI Schnittstellen in dem dnmt2 Gen wurde
der Zwischenvektor zunächst mittels BamHI geschnitten und im Anchluss 15 min mit PstI
teilverdaut. Die Bande gewünschter Größe wurde geleluiert und in den BamHI und PstI
verdauten und dephosphorylierten Vektor pDneo2a_GFP ligiert.
pDneo2a_hDnmt2-NLS-GFP: Die Oligonukleotide
SM43/SM44 wurden hybridisiert, phosphoryliert
und ungerichtet in das durch BamHI linearisierte
und CIAP dephosphorylierte Plasmid
pDneo2a_hDnmt2-GFP ligiert. Inserts in
gewünschter Orientierung wurden mittels
analytischer PCR identifiziert.
Plasmid für Proteinexpression in Drosophila
pP{GS[v+,UASDnmAV5]} (Klon 3/8): Das dnmA
Gen wurde aus dem Vektor pET15b dnmA mit Hilfe
der Primer SM1 und SM2 amplifiziert und an das
Ende des Gens jeweils eine ApaI Schnittstelle
angefügt. Dabei wurden ebenfalls die ersten
Codons des dnmA Gens zielgerichtet mutiert um
diese hinsichtlich der Codon usage in Drosophila zu
optimieren. Das Gen wurde in den Zwischenvektor
pJET1.2 kloniert, dieser mittels ApaI verdaut und das dnmA Fragment ungerichtet in den
linearisierten Zielvektor pP{GS[vermillion+,UASV5]} ligiert.
pGS v+UAS+DnmA+V5
7458 bp
DnmA
V5-Tag
Vermillion
pBluescript II KS+
UAS
ApaI (924)
ApaI (2071)
pDneo2a hDnmt2-GFP
7990 bp
hDn mt2
Amp(r)
T 4903 res 1029-2254
Act6pro
Act15-P
Act8-T
Act 15-T
G FP
BamHI (1178)
Pst I (1)
Pst I (709)
Pst I (937)
pDneo2a hDnmt2-NLS-GFP
8017 bp
hDnmt2
NLS
Amp(r)
T 4903 res 1029-2254
Act6p ro
Act15-P
Act8-T
Act 15-T
GF P
BamHI (1178)
BamHI (1205)
Pst I (1)
Pst I (709)
Pst I (937)
8 Materialien
61
8.19. Sequenzen/Gene
Dictyostelium discoideum (Dictybase)
dnmA DDB_G0288047
tRNAAsp(GUC-1) DDB_G0294707
tRNAGlu(UUC-2) DDB_G0294709
tRNAVal(AAC-1) DDB_0234789
tRNALeu(UAG-1) DDB_0234827
tRNALeu(AAG-8) DDB_0235066
sno7 (DdR7, r7) DDB_G0295615
rnu2a/b (U2A, DdR19A) DDB_G0295491
rnu4a (U4A, DdR38A) DDB_G0295559
intergenische Sequenz R24 Chromosom 3, 385-469 von DB_G0280923 klonierte Sequenz: tagatgatgaaccaaaatacgtattatcctatactttagaacccatagtgaaatgattttacaaccttctttagaagacgtctga
intergenische Sequenz R69 Chromosom 5, 5394-5469 von gefQ
(DDB0191356|DDB_G0289665) klonierte Sequenz: cttggtgatgattaacagctaaagactagagtttctgtaaaaactattgctgagactatgcattattctttcctga
Homo sapiens (NCBI)
dnmt2 NM_004412.5, GI:297591820
rnu2-1 NR_002716.3, GI:225735587
9. Methoden
62
9. Methoden
9.1. Zellbiologische Methoden
9.1.1. Anzucht von Escherichia coli
E. coli wurde entweder als Schüttelkultur (240 rpm) in LB-Medium (ggf. mit entsprechendem
Antibiotikum) im Brutschrank (37°C) angezogen oder zur Selektion nach Transformationen auf
LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikum kultiviert.
9.1.2. Herstellung kompetenter Escherichia coli Zellen
Eine 5 mL-Vorkultur wurde bei 37°C auf dem Schüttler über Nacht inkubiert. Am Folgetag
wurden 2 mL der Vorkultur in 100 mL Schüttelkultur mit LB-Medium überimpft. Bei einer
Zelldichte von OD550 = 0,4-0,5 wurde die Kultur in zwei sterilen 50 mL-Reaktionsgefäßen für
5 min bei 1700 rcf abzentrifugiert und in 50 mL 50 mM CaCl2-Lösung resuspendiert. Die
Zellsuspension wurde für 30 min auf Eis gestellt und im Anschluss erneut zentrifugiert. Der
Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet in 15% Glycerinlösung (1,5 mL Glycerin 60%,
2,5 mL 100 mM CaCl2, 2 mL Millipore-H20) resuspendiert und in 100 µL Aliquots bei -80°C
eingefroren.
9.1.3. Transformation von Escherichia coli
Transformationen von Plasmiden in E. coli erfolgten mit der Hitzeschock-Methode. Dazu wurde
Plasmid-DNA (0,1 µg für Trafos in DH5α oder 1 µg für BL21/Rosetta2) oder ein kompletter
Ligationsansatzes mit 100 – 400 µL kompetenter Zellen gemischt. Nach einer 20 minütigen
Inkubation auf Eis wurden die Zellen für 90 s im Heizblock auf 42 °C erhitzt und danach sofort
wieder auf Eis gebracht. Der Ansatz wurde mit 1 mL LB-Medium versetzt, für 30 min bei 37 °C
im Brutschrank inkubiert und anschließend 3 min bei 1700 rcf zentrifugiert. Nach Dekantieren
des Überstandes wurden die Zellen im verbliebenen Restmedium resuspendiert, auf LB-Agar mit
dem entsprechenden Antibiotikum (Amp, Kan, Cam) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C
inkubiert.
9.1.4. Anzucht von Dictyostelium discoideum
D. discoideum wurde unter Dauerlicht entweder in Flüssigkultur (Sussman et al. 1967; Watts et
al. 1970a) oder auf einem Bakterienrasen (Klebsiella aerogenes) angezogen. Bei der Kultivierung
in Schüttelkultur (150 rpm), in Petrischalen oder Multiwell-Platten wurde axenisches HL5+-
Medium (ggf. mit entsprechendem Antibiotikum zur Selektion) verwendet. Schüttelkulturen
wurden bei entsprechender Zelldichte (höchstens 2 – 3 x 106 Zellen/mL) durch frisches Medium
9. Methoden
63
auf minimal 5 x 104 Zellen/mL verdünnt, bei Kulturen in Petrischalen und Multiwellplatten
wurde das Medium alle 2 – 3 Tage komplett gewechselt.
KA-Platten zur Kultivierung auf Bakterienrasen wurden durch Plattieren von ca. 500 µL
Bakteriensuspension auf eine SM-Agarplatte und einer Inkubation über Nacht bei 22 °C oder
30 °C hergestellt. Alternativ konnten vorhandene KA-Platten mit 2 mL Soerensen-
Phosphatpuffer abgewaschen und die Suspension auf mehrere SM-Agarplatten plattiert werden.
Die Dictyostelium Zellen wurden entweder mit einem Zahnstocher auf die mit Klebsiella
bewachsenen Platten angeimpft bzw. direkt zusammen mit den Bakterien ausplattiert.
9.1.5. Transformation von Dictyostelium discoideum
Für die Elektroporation von D. discoideum (Howard et al. 1988; Gaudet et al. 2007) wurden
2 x 107 Zellen im Medium für 10 min auf Eis inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 5 min bei
390 rcf wurden die Zellen einmal mit Soerensen-Phosphatpuffer und zweimal mit jeweils 5 mL
EP-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden in 600 μL EP-Puffer aufgenommen, mit 10 μg Plasmid-
DNA gemischt und auf 800 μL mit EP-Puffer aufgefüllt. Die Suspension wurde in eine
vorgekühlte EP-Küvette überführt und 10 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgte bei
1 kV und 25 μF. Nach erneuter 10 minütiger Ruhepause auf Eis wurden die Zellen zu 8 μL
100 mM MgCl2 sowie 8 μL 100 mM CaCl2-Lösung in eine Petrischale gegeben 15 min dort
belassen. Anschließend wurde mit 10 mL HL5+-Medium aufgefüllt. Am nächsten Tag erfolgte der
Wechsel gegen das Selektionsmedium mit den entsprechenden Antibiotika. Hierbei wurden die
Zellen möglichst gleichmäßig auf der Petrischale verteilt. Nach erfolgreicher Transformation
wurden nach etwa einer Woche einzelne Kolonien sichtbar.
9.1.6. Subklonierung von Dictyostelium discoideum
Die Subklonierung (Vereinzelung) von Transformanten kann nach zwei verschiedenen
Methoden erfolgen. Sind eine Woche nach der Transformation nur wenige voneinander
abgegrenzte Kolonien sichtbar, können diese mit Hilfe einer Pipette direkt von der Petrischale
auf eine Multiwell-Platte übertragen werden. Dazu wurde 1 mL des jeweiligen Mediums in je ein
Loch der Multiwell-Platte gegeben und die Zellen darin angeimpft.
Waren nach der Transformation viele Kolonien vorhanden, wurde das Medium von der
Petrischale entfernt und die Zellen in einem geringeren Volumen (ca. 3 mL) des Mediums
resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und seriell in Phosphatpuffer verdünnt, so dass in 100
– 200 µL Suspension ca. 100 Zellen auf eine KA-Platte ausplattiert werden konnten. Nach drei bis
9. Methoden
64
fünf Tagen waren Einzelklone erkennbar. Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wurden vom
Fressrand der Einzelklone Zellen entnommen und in Multiwell-Platten herangezogen.
9.1.7. Ernten von Sporen
Um transformierte D. discoideum Zellen dauerhaft lagern zu können, werden deren Sporen in
flüssigem Stickstoff eingefroren. Dazu wurden ca. 2 x 108 Zellen aus dicht gewachsenen
Schüttelkulturen 5 min bei 390 rcf abzentrifugiert und mit Soerensen-Phosphatpuffer
gewaschen. Das Pellet wurde in 1 mL Soerensen-Phosphatpuffer resuspendiert und auf einer
Phosphatagar-Platte ausplattiert. Aufgrund des Nahrungsmangels treten dabei die Zellen in die
Entwicklung ein, an deren Ende sich einige Zellen zu Sporen ausdifferenzieren. Nach 3 Tagen
konnten die reifen Sporenköpfe durch Abspülen mit 1 mL Soerensen-Phosphatpuffer geerntet
und in 1,5 mL Cryoröhrchen eingefroren werden. Sporen wurden alternativ auch von
bewachsenen KA-Platten durch Abschlagen der Sporen in den Plattendeckel geerntet.
9.1.8. Hitzeschock-Behandlung von Dictyostelium Zellen
1,5 – 2x108 Dictyostelium Zellen wurden abzentrifugiert (390 rcf, 3 min) und in 100 mL bei 30°C
vorgewärmten Medium resuspendiert. Es folgte eine zweistündige Inkubation bei 30°C auf dem
Schüttler.
9.1.9. Hungerexperimente mit Dictyostelium Zellen in Schüttelkultur
1x108 Dictyostelium Zellen wurden abzentrifugiert (390 rcf, 3 min), mit Phosphatpuffer
gewaschen und in 10 mL Phosphatpuffer resuspendiert. Es folgte eine vierstündige Inkubation
auf dem Schüttler.
9.1.10. Fluoreszenzmikroskopie
Für Fluoreszenzmikroskopie wurde ein Leica DM IRB Fluoreszenzmikroskop verwendet (Filter
GFP und DAPI). Bilder wurden bei einer 1000fachen Vergrößerung über die eingebaute
Digitalkamera aufgenommen und als Graustufenbilder exportiert. Die Bildbearbeitung erfolgte
mit CorelDrawX3 durch Verteilen der Graustufenbilder auf die entsprechenden Kanäle eines
RGB Bildes.
9. Methoden
65
Vorbereitung lebender Zellen
100 μL in Medium suspendierte Zellen einer mittelmäßig bewachsenen Kultur wurden auf ein
quadratisches Deckglas (5 cm2) pipettiert und für 15 min in einer feuchten Kammer absitzen
gelassen. Danach wurde das Medium abgezogen und durch 100 μL Phosphatpuffer ersetzt. Die
Zellen wurden für 45 min in der feuchten Kammer inkubiert, bevor der Phosphatpuffer erneut
gewechselt wurde.
Fixierung und DAPI-Färbung (modifiziert nach Dubin 2010)
100 μL in Medium suspendierte Zellen einer mittelmäßig bewachsenen Kultur wurden auf ein
Deckglas (2 cm2) pipettiert, absitzen gelassen und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Der
Puffer wurde gegen eine 4%ige Paraformaldehydlösung (PFA in 20 mM Phosphatpuffer pH 6,7)
gewechselt und zehn Minuten bei 22°C inkubiert. Im Anschluss wurde die PFA-Lösung
abgenommen, der Objektträger für 10 min in MeOH getaucht und danach 20-60 min bei -20°C
inkubiert. Es folgten zwei Waschschritte mit 1xPBS und eine 15 minütige Inkubation mit 10 –
20 µL DAPI-Lösung (1:15000 in H2O). Zum Abschluss wurde das Deckglas mit Hilfe eines
Tropfens DABCO (Gelvatol) auf einem Objektträger fixiert.
9.1.11. Fluoreszenzspektrometrie
Zur Quantifizierung des Gehalts fluoreszierender Proteine (S65T-GFP, (Heim et al. 1996) Ex:
489nm, Em: 511 nm) in Dictyostelium wurde Fluoreszenzspektrometrie genutzt. Alle Messungen
wurden als Doppelbestimmung durchgeführt. Für eine fluoreszenzspektrometrische Messung
wurden 5x107 Zellen aus einer ca. 2x106 Zellen/mL entnommen, bei 390 rcf für 5 min
abzentrifugiert und einmal mit 10mL Soerensen-Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellen wurden
dabei in ein 15mL-Gefäß überführt. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 10 mL
Phosphatpuffer resuspendiert und für 1,5 - 2 Stunden auf einem Schüttler (150rpm) bei 22°C
inkubiert. Im Anschluss erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt, von dem der Überstand
verworfen wurde. Die Zellen wurden in 2 mL Soerensen-Phosphatpuffer resuspendiert und
direkt hintereinander je 1 mL im Fluoreszenzspektrometer (Hitachi F2700) vermessen.
Proben für die erforderliche Proteinmengenbestimmung (dreimal 2x106 Zellen) wurden aus der
verbleibenden Kultur entnommen, 5 min bei 10.000 rcf abzentrifugiert, das Medium verworfen
und einmal mit 1 mL Soerensen-Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellpellets konnten bis zur
Proteinmengenbestimmung (Kapitel 9.3.13) bei -20°C eingefroren werden.
9. Methoden
66
9.2. Molekularbiologische Methoden
9.2.1. Präparation genomischer DNA aus Dictyostelium discoideum
In kleinem Maßstab
Für Präparationen von genomischer DNA in kleinem Maßstab aus D. discoideum wurden jeweils
1 mL Kultur einer dicht bewachsenen Multiwell-Platte verwendet. Die Zellen wurden im Medium
resuspendiert und in ein 1,5 mL-Reaktionsgefäß überführt. Nach einer Zentrifugation bei 390 rcf
für 5 min wurde das Medium sorgfältig abgenommen. Die Zellen wurden in 200 µL 0,3% SDS/TE
lysiert. Das Lysat wurde mit 2 µL RNAse A (2mg/mL Stocklösung) versetzt und 15 min bei 37°C
inkubiert. Darauf folgte die Zugabe von 20 µL Proteinase K (2 mg/mL Stocklösung) und eine
weitere Inkubation für 1 h bei 45 °C. Anschließend wurde eine Phenol/Chloroform Extraktion
(Kapitel 9.2.5) durchgeführt, die DNA aus der wässrigen Phase gefällt (Kapitel 9.2.6) und das
getrocknete DNA Pellet in 50 µL UV-Wasser aufgenommen.
In großem Maßstab
2x108 Dictyostelium Zellen wurden durch eine dreimiütige Zentrifugation bei 390 rcf pelletiert
und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Das Zellpellet wurde anschließend in 45 mL
Zelllysepuffer resuspendiert und tropfenweise (bis max. 1%) mit 10% NP40 versetzt, so dass die
Zell- aber nicht die Kernmembran lysiert wurde. Danach folgte eine Zentrifigation bei 3220 rcf
für 15 min (Ausschwingrotor) und die pelletierten Zellkerne wurden in 5 mL SDS/TE-Puffer
resuspendiert. Nach Zugabe von 125 µL Proteinase K (20 mg/mL Stocklösung) folgte eine
einstündige Inkubation bei 60°C im Hybridisierungsofen. Abschließend wurde das Kernlysat
Phenol/Chloroform extrahiert (Kapitel 9.2.5), die DNA aus der wässrigen Phase gefällt (Kapitel
9.2.6) und das getrocknete DNA Pellet in 100 µL UV-Wasser aufgenommen.
9.2.2. Präparation von Gesamt-RNA aus Dictyostelium discoideum
Die Präparation von RNA aus D. discoideum erfolgt aus 2x107 bis 1x108 Zellen mit der Trizol-
Methode (Chomczynski 1993). Dazu wurden die Zellen bei 390 rcf für 5 min abzentrifugiert und
der Überstand verworfen. Die Zellen wurden in 1 mL Trizol pro 2x 107 Zellen resuspendiert und
5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zehnminütiger Zentrifugation (10.000 rcf) wurde
der Überstand in ein neues Rekationsgefäß überführt. Es folgte eine Chloroform-Extraktion mit
fünfminütiger Inkubation auf einem Rollinkubator bei Raumtemperatur (200 µL Chloroform pro
mL Trizol). Die Phasentrennung erfolgte durch 10 min Zentrifugation (10.000 rcf). Der wässrige
Überstand wurde abgenommen und mit 0,8 Volumen Isopropanol bei -20 °C gefällt (2 h bis üN).
Im Anschluss erfolgte erneutes Zentrifugieren bei 10.000 rcf für 30 min bei 4°C. Der Überstand
9. Methoden
67
wurde dekantiert und das Pellet mit 1 mL 70% Ethanol gewaschen. Nach erneutem
Zentrifugieren und Trocknen wurde die RNA in 50-100 µL DEPC- oder UV-Wasser
aufgenommen.
9.2.3. Anreicherung kleiner RNA aus Gesamt-RNA
Der Anreicherung kleiner RNAs ging eine Präparation von Gesamt-RNA aus 1-5x108 Zellen
voraus (Kapitel 9.2.2). Wurde die Gesamt-RNA in verschiedenen Ansätzen präpariert, wurden
die einzelnen Fraktionen vereint und auf 2-3 mL Volumen aufgefüllt. Das Reaktionsgefäß wurde
auf Eis gebracht und mit dem gleichen Volumen eines Gemisches aus 1 M NaCl/10% PEG 8000
versetzt und vorsichtig gemischt. Es folgte eine Inkubation bei -20°C für genau 30 min. Nach
einer dreißigminütigen Zentrifugation (10.000 rcf, 4°C) wurde der Überstand in ein neues Gefäß
überführt und die RNA mit dem dreifachen Volumen 100%igem Ethanol über Nacht bei -20°C
gefällt. Im Anschluss wurde 30 min (10.000 rcf, 4°C) zentrifugiert und das RNA Pellet in der
Vakuumzentrifuge getrocknet. Die RNA wird in 50-100 µL DEPC- oder frischem UV-Wasser
aufgenommen.
9.2.4. Trennung von Kern und cytoplasmatischer RNA
5-6x108 Dictyostelium-Zellen wurden in drei 50 mL-Reaktionsgefäßen geerntet und zweimal mit
eiskaltem H2O (bidest) gewaschen. Das Zellpellet wurde in 45 mL eiskaltem Zelllysepuffer
resuspendiert und tropfenweise 10%ige NP40-Lösung bis zu einer max. Endkonzentration von
1% hinzugegeben. Die Zellkerne wurden bei 3220 rcf (Ausschwingrotor) für 15 min
abzentrifugiert.
RNA aus Cytoplasma: Der Überstand eines 50mL-Reaktionsgefäß würde in zwei neue Gefäße
überführt, von den anderen beiden der Überstand verworfen. Es erfolgte eine
Phenol/Chloroform Extraktion mit anschließender Fällung der RNA bei -20°C über Nacht. Die
getrocknete RNA wurde in 100 µL DEPC-Wasser aufgenommen.
RNA aus Zellkernen: Je ein Kernpellet wurde in 1 mL Trizol lysiert und alle drei Kernpellets in
ein Reaktionsgefäß überführt. Weiteres Vorgehen erfolgte wie in Kapitel 9.2.2 beschrieben mit
auf die 3 mL-Trizol angepassten Volumina.
9.2.5. Phenol/Chloroform Extraktion
Die Entfernung von Proteinen aus Nukleinsäurelösungen erfolgte durch Phenol/Chloroform-
Extraktion. Dabei wurde die Lösung mit einem Volumen Phenol/Chloroform versetzt, gut
invertiert und für 15 min bei 20000 rcf zentrifugiert. Anschließend konnte die wässrige,
9. Methoden
68
nukleinsäurehaltige Phase vorsichtig abgenommen werden. Um Reste der organischen
Lösungsmittel zu entfernen, wurde die Nukleinsäure anschließend einer Fällung unterzogen.
9.2.6. Fällung von Nukleinsäuren
Zur Fällung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen, werden diese mit 1/10 Volumen 3 M
NaAc pH 4,7 und 0,8 Volumen Isopropanol oder 2,5 Volumen Ethanol versetzt und i. d. Regel
20 min bis über Nacht bei -20 °C inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 30 min bei 20000 rcf
wurde der Überstand dekantiert und das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Es folgte eine
weitere Zentrifugation für 15 min. Anschließend wurde der Überstand verworfen, das Pellet in
der Vakuumzentrifuge getrocknet und die Nukleinsäure in der gewünschten Menge UV-Wasser
aufgenommen.
9.2.7. Plasmidpräparationen aus E. coli
Für Plasmidminipräparationen aus E. coli (Birnboim 1983) wurden über Nacht angewachsene
1 mL-Schüttelkulturen für 5 min bei 1700 rcf abzentrifugiert und das Pellet in 100 μL Lösung I
resuspendiert. Nach Zugabe von 200 μL Lösung II und einer fünfminütigen Inkubation bei RT
wurde der Ansatz mit 150 μL vorgekühlter Lösung III versetzt. Es folgte ein weiterer
Inkubationsschritt von 10 min auf Eis sowie das Pelletieren der gefällten Proteine und
genomischer DNA durch Zentrifugieren für 15 min bei 20000 rcf. Der Überstand wurde
vorsichtig abgenommen, gefällt und die Plasmid-DNA in 25 μL UV-Wasser aufgenommen.
Midipräparationen von Plasmiden erfolgten aus über Nacht angewachsenen 100mL-
Schüttelkulturen. Dazu wurde das NucleoBond® PC 100 Kit nach Anleitung des Herstellers
verwendet.
9.2.8. Schneiden von DNA mit Restriktionsenzymen
Restriktionsverdaue wurden entweder analytisch (1 µg Plasmid-DNA in einem 20 µL Ansatz, 1h,
37°C) oder präparativ (15 – 20 µg in einem 75 µL Ansatz, 3h, 37°C) durchgeführt. Die Auswahl
des Enzympuffers erfolgte nach Vergleich der Aktivitäten der verwendeten Enzyme, wobei diese
mindestens 50% betragen sollte. Das Volumen der verwendeten Enzyme richtete sich nach der
Aktivität des Enzyms in u/µL. Die geschnittene DNA wurde danach entweder direkt
elektrophoretisch analysiert oder durch Phenol/Chloroform Extraktion weiter gereinigt.
9. Methoden
69
9.2.9. Dephosphorylierung von Nukleinsäuren
Dephosphorylierung von Plasmid-DNA
Dephosphorylierung von Plasmid-DNA erfolgte entweder durch Zugabe von 1 µL CIAP zum
Restriktionsverdau (Kapitel 9.2.8) oder erfolgte separat in einem 20 µL-Ansatz mit
entsprechendem CIAP-Puffer. Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Phenol/Chloroform-
Extraktion oder Hitzedenaturierung.
Dephosphorylierung von RNA
Zu dephosphorylierende RNA wurde in 44 µL DEPC-H2O aufgenommen, mit 5 µL CIAP-Puffer
und 1 µL CIAP versetzt und für 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Reaktionsansatz
mit DEPC-H2O auf 150 µL aufgefüllt um in Folge eine Phenol/chloroform-Extraktion mit
anschließender Fällung vornehmen zu können.
9.2.10. Phosphorylieren von Oligonukleotiden
Das Phosphorylieren von Oligonukleotiden erfolgte für 20 min bei 37°C nach dem
Reaktionsansatz aus Tabelle 1. Im Anschluss wurde das Enzym für 10 min bei 75°C inaktiviert.
Tabelle 1: Reaktionsansatz einer Phosphorylierungsreaktion.
Reaktionsansatz
50 pmol Oligo
2 µL 10x PNK Puffer A
2 µL dATP (10mM)
1 µL T4-PNK
ad 20 µL UV-H2O
9.2.11. Ligation von DNA Fragmenten
Bei Verwendung des CloneJETTM oder GeneJetTM PCR-Cloning Kit erfolgten die Liagtionen nach
Anleitung des Herstellers. Ligationen ohne Kit wurden nach dem Reaktionsansatz in Tabelle 2
angesetzt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der gesamte Ansatz
für eine Transformation eingesetzt.
9. Methoden
70
Tabelle 2: Reaktionsansatz einer Ligation.
Reaktionsansatz
Ca. 50 ng Plasmid
Ca. 150 ng Insert
2 µL T4 DNA Ligase Puffer
1 µL T4 Ligase
ad 20 µL UV-H2O
9.2.12. Hybridisieren komplentärer Oligonukleotide
Die Hybridierung komplentärer Oligonukleotide wurde für Klonierungen verwendet, wenn
kurze Inserts (bis ca. 40 bp) in Plasmide inseriert werden sollen. Dazu wurden je 1 µL
Oligonukleotid (10 µM Stock) mit 8 µL STE-Puffer in einem PCR-Reaktionsgefäß gemischt. Die
Hybrisierungsreaktion erfolgte in einem Thermocycler, der zunächst für 5 min auf 95°C
hochheizte, und dann in Minutenabständen die Temperatur jeweils um 5°C reduzierte bis
Raumtemperatur erreicht war.
Für eine nachfolgende Ligation wurden 0,4 µL hybridierte Oligonukleotide pro 50 ng Plasmid in
einem 20 µL Ligationsansatz verwendet. Da linearisierte Plasmide meist dephosphoryliert
wurden, wurden phosphorylierte Oligonukleotide verwendet oder die hybridisierten
Oligonukleotide wurden nachfolgend phosphoryliert (Kapitel 9.2.10).
9.2.13. Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (Mullis et al. 1986) wurde analytisch, präparativ oder als Colony-
PCR durchgeführt (Tabelle 3 und Tabelle 4). PCR-Fragmente für Klonierungen wurden mit
einem Taq/Pfu-Polymerase-Mix (2 µL/1µL) in präparativen Ansätzen hergestellt.
Tabelle 3: Reaktionsansatz verschiedener PCR-Reaktionen.
Reaktionsansatz
Präp. PCR Analyt. PCR/Colony-PCR
1 µL 1 µL/einige Bakterienzellen DNA-Probe/ Plasmid (10 ng/µL)
5 µL 2 µL 10 x PCR-Puffer (+MgCl2, + KCl)
5 μL 2 μL dNTPs (2,5 mM jedes dNTPs)
2 μL 1 μL 5’ Primer (5 mM, 5 pmol/µL)
2 μL 1 μL 3’ Primer (5 mM, 5 pmol/µL)
2 μL 1 μL Taq-Polymerase
ad 50 μL ad 20 μL UV-H2O
9. Methoden
71
Tabelle 4: Programmbeispiel einer Standard-PCR.
Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen
Erste Denaturierung 95 °C 3 – 5 min 1
Denaturierung 95 °C 30 s
Annealing 45 – 60 °C 30 s
Elongation 68 – 72 °C 1 kb/min bei 72°C
25 – 30
Finale Elongation 68 – 72 °C 3 – 5 min 1
9.2.14. Rekursive PCR
Kleinere Gene (< 150 bp) von tRNAs und snoRNAs wurden mittels rekursiver PCR amplifiziert.
Dazu wurden vier überlappende Oligonukleotide, die das gesamte Gen abdeckten, verwendet
(Abbildung 11). Die beiden inneren Oligonukleotide dienen als Template, die beiden äußeren als
Primer. Der PCR Ansatz erfolgte wie in Tabelle 3 beschrieben, mit den Ausnahmen, dass anstelle
des DNA-Templates die entsprechenden Oligonukleotide eingesetzt wurden und die Primer-
konzentration auf 20 pmol/Reaktion verdoppelt wurde.
Abbildung 11: Prinzip der rekursiven PCR (schematisch).
9.2.15. Quantitative Real time-PCR
Die Analyse von mRNA erfolgte mit Hilfe des One-Step-Kit (Bioline) nach Angaben des
Herstellers. Gesamt-RNA wurde mit Trizol (Kapitel 9.2.2) isoliert und 400 ng pro Reaktion
eingesetzt. Auf ein DNAseI Verdau wurde in der Regel verzichtet, da Kontroll-PCR-Reaktionen
DNA freie RNA bestätigten. Das relative Expressionslevel R wurde mit der ΔΔCt Methode
berechnet (Livak et al. 2001): R = 2 – [(CT target – CT housekeeping gene) – (CT calibrator – CT housekeeping gene)]
9. Methoden
72
Real time PCR auf genomische DNA wurde mit dem Ansatz aus Tabelle 5 durchgeführt.
Tabelle 5: Reaktionsansatz einer Real time-PCR auf gDNA.
Reaktionsansatz
4 µL DNA-Probe
2 µL 10 x PCR-Puffer (+MgCl2, + KCl)
2 μL dNTPs (2,5 mM jedes dNTP)
1,6 μL Primer-Mix (5 µM)
0,4 μL SYBR-Green
0,4 μL Taq-Polymerase
ad 20 μL UV-H2O
Alle Ansätze wurden als Triplikate in Twin.tec-96-well-Platten (Eppendorf) durchgeführt
(Tabelle 6). Als Housekeeping-Gene wurden cinD (bei RNA) und Coronin A (bei gDNA)
verwendet. In die Datenauswertung wurden ausschließlich Reaktionen einbezogen, deren Ct-
Werte der Triplikate weniger als 0,5 Einheiten voneinander abwichen.
Tabelle 6: Programm für Real-time PCR mit RNA oder DNA Template.
Schritt Temperatur Zeit (RNA) Zeit (DNA) Anzahl der Zyklen
cDNA- Synthese 45°C 10 min -- 1
Erste Denaturierung 95 °C 1,5 min 2 min 1
Denaturierung 95 °C 30 s 5 s
Annealing/Elongation 60 °C 1 min 20 s
35 – 40
9.2.16. PCR zur Herstellung methylierter PCR-Fragmente
Für rasterkraftmikroskopische Untersuchungen wurden methylierte Amplicons eines DNA-
Fragments des Reversen Transkriptase-Gens eines LINES aus E. histolytica hergestellt (Tabelle 7
und Tabelle 8). Die PCR Produkte wurden im Anschluss gelelektrophoretisch aufgterennt und
elektroeluiert (Kapitel 9.2.19). Zur Kontrolle des Einbaus von d5mCTPs wurde die PCR Produkte
mit dem Enzym McrBC (5´…PumC(N40-3000)PumC…3´) verdaut.
9. Methoden
73
Tabelle 7: Reaktionsansatz für die Herstellung eines methylierten PCR-Produktes.
Reaktionsansatz
1 µL DNA-Probe (10 ng/µL)
5 µL 10 x PCR-Puffer (+MgCl2, + KCl)
5 μL dNTPs (2,5 mM je dATP, dTTP, dGTP)
5 μL d5mCTP (2,5 mM)
2 μL Primer-Mix (SP6, T7), (5 µM)
1,6 µL 100% DMSO
2 μL Taq-Polymerase
ad 50 μL UV-H2O
Tabelle 8: PCR-Programm zur Herstellung eines methylierten DNA-Fragments.
Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen
Erste Denaturierung 95 °C 3 min 1
Denaturierung 95 °C 30 s
Annealing 50 °C 15 s
Elongation 72 °C 40 s
30
Finale Elongation 72 °C 2 min 1
9.2.17. Elektrophoretische Trennverfahren
Agarosegelelektrophorese von DNA
Die Auftrennung von dsDNA erfolgte mit Hilfe nichtdenaturierender Agarosegele (0,8 bis 2,5 %
Agaroseanteil). Nukleinsäuren wurden mit Ethidiumbromid (0,01 %) gefärbt, welches dem Gel
nach Auflösen hinzugegeben wurde. Als Laufpuffer wurde 1xTBE verwendet und die Proben mit
mindestens 1/6 Volumen DNA-Auftragspuffer versetzt. Die Elektrophorese wurde im Anschluss
bei 6 - 10 V/cm durchgeführt.
GTC-Gelelektrophorese von RNA
Die Auftrennung von RNA erfolgte prinzipiell analog zur DNA Agarosegelelektrophorese.
Zusätzlich wurden die 1,8%igen Agarosegele nach dem Aufkochen auf 60 °C heruntergekühlt
und GTC (0,24 g/100 mL) hinzugegeben. Als Auftragspuffer für die Proben wurde FA-Puffer (2x)
verwendet, welcher zur Färbung der RNA zuvor mit entsprechender Menge
9. Methoden
74
Ethidiumbromidlösung versetzt wurde. Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Gel für
5 min auf 80 °C erhitzt und dann auf Eis gebracht.
Polyacrylamidgelelektrophorese
PAA-Gele wurden in den Größen 18x24 cm und 18x14 cm mit 1mm Tiefe verwendet. Die
Komponenten und Laufbedinungen für die verwendeten nativen und denaturierenden PAA-Gele
sind in Tabelle 9 aufgeführt. Zur Vorbereitung der Gele wurden die Komponenten gemischt,
TEMED und APS werden als letztes zugegeben, da APS als Radikalstarter für die
Polymerisationsreaktion dient. Die Proben wurden je nach Bedarf mit gleichen Volumen
nativem RNA-Auftragspuffer oder denaturierendem FA-Puffer versetzt. Letztere wurden
zusätzlich 5 min bei 80 °C erhitzt und sofort auf Eis gestellt um eine Renaturierung der RNA zu
vermeiden.
Tabelle 9: Zusammensetzung von Polyacrylamidgelen.
Komponente Denaturierend (TBE) Nativ (TBE) Denaturierend
(MOPS)
8% 10% 12% 6% 11 %
40% Acrylamid (29:1) 10 mL 12,5 mL 15 mL 4,5 mL 14 mL
Urea (7M) 21 g 21 g 21 g -- 21 g
5x TBE 10 mL 10 mL 10 mL 6 mL --
1 M MOPS pH7 -- -- -- -- 1 mL
Dest. H2O 15 mL 12,5 mL 10 mL 19,5 mL 21 mL
TEMED 100 µL 100 µL 100 µL 80 µL 100 µL
APS (20%) 100 µL 100 µL 100 µL 80 µL 100 µL
Σ 50 mL 50 mL 50 mL 30 mL 50 mL
Laufbedingungen 400 mM, 25 mA (30 min Vorlauf) 100 – 200V, 15 mA 150 V, 10 mA
9.2.18. Gelelution
Für die Gelelutionen aus Agarosegelen wurden die gewünschten DNA-Banden auf einem UV-
Tisch mittels Skalpell ausgeschnitten und in 1,5 mL Reaktionsgefäße überführt. Die
anschließende Elution erfolgt mit dem NucleoSpin® Extract II Kit nach Anleitung des Herstellers.
9. Methoden
75
9.2.19. Elektroelution
Die Elektroelutionskammer (V-Kammer) wurde mit 0,25x TBE-Puffer gleichmäßig befüllt. Zu
eluierende DNA Banden wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und so in die dafür
vorgesehene Vertiefung der V-Kammer gelegt, dass die Lauffront parallel zu den Elektroden
ausgerichtet ist (Abbildung 12). Nachdem jedes „V“ wird durch die vertikale Öffnung mit 140 µL
8M Ammoniumacetat befüllt wurde, erfolgte die Elektroelution für 45 min bei 180 V. Nach der
Elektroelution wurden die schräg horizontalen Öffnungen mit abgeschnittenen gelben Spitzen
verschlossen, der Pufferstand unter die obere Kante des „V“-Blocks abgesenkt. Durch die
vertikale Öffnung wurden ca. 200 µL Ammoniumacetat entnommen und die DNA mit 2,5x
Volumen 100% EtOH bei -20°C gefällt. Nach Waschen und Trocknen wurde die DNA in 40 µL
sterilfiltriertem Wasser (Sterilfilter 0,2 µm) aufgenommen.
Abbildung 12: Schematische Darstellung der Elektro-elutionskammer (Seitenansicht). Die Abbildung wurde freundlicherweise von N. Arens zur Verfügung gestellt.
9.2.20. RNA Bisulfitsequenzierung
Die RNA Bisulfitsequenzierung wurde von Robin Lorenz in Kooperation mit M. Schäfer (Abt.
Lyko, DKFZ, Heidelberg) nach einem etablierten Protokoll der Arbeitsgruppe durchgeführt
(Schaefer et al. 2009c).
9.2.21. Northern-Blot (Kapillarblot)
Für den Kapillarblot wurde die RNA zunächst mittels Agarosegelelektrophorese in einem GTC-
Gel aufgetrennt (Kapitel 9.2.17). Für den Blotaufbau wurde eine Glasplatte über eine Schüssel
mit 10 x SSPE Puffer gelegt. Auf die Glasplatte wurde ein Whatmanpapier in Größe des Gels
gelegt, welches jedoch rechts und links so lang war, dass es in das Pufferbad eintauchte. Auf
dieses Whatmanpapier folgte eine weitere Schicht Whatmanpapier in exakter Größe des Gels.
Nun folgten das Gel, die Nylonmembran und wieder zwei Schichten Whatmanpapier.
Whatmanpapier und Membran wurden zuvor in 1x SSPE getränkt. Auf die letzte Schicht
Whatmanpapier wurde ein Stapel Papiertücher gelegt und dieser mit Hilfe einer Glasplatte und
9. Methoden
76
eines Gewichtes (ca. 300 g) beschwert. Der Kapillarblot wurde über Nacht durchgeführt. Im
Anschluss wurde die Membran an der Luft getrocknet und durch UV-crosslinking bei 0,56 J/cm2
die RNA auf der Membran fixiert. Prähybridisierung mit Denhardt-Hybridisierungslösung
(Denhardt 1966) erfolgte für 60 min bei 42°C, Hybridisierung der radioaktiv markierten OLB-
Sonden erfolgte über Nacht. Nach der Hybridisierung wurde die Membran für 30 min mit der
Waschlösung I und im Anschluss mindestens 30 min mit der Waschlösung II gewaschen.
9.2.22. Northern-Blot für kleine RNAs (Semidry-Blot)
Northern Blot Analysen kleiner RNAs erfolgten in Anlehnung an das Protokoll von G. Pall (Pall et
al., 2007). 25 - 40 μg Gesamt-RNA wurden gelelektrophoretisch (denat. 11% PAA, 20 mM MOPS)
aufgetrennt (Kapitel 9.2.17) und anschließend mittels Elektroblot auf eine HybondTM-NX-
Membran (Amersham) übertragen. Diese wurde auf drei mit DEPC-H2O getränkte Whatman-
Papiere gelegt. Darauf folgten das PAA-Gel und drei weitere Lagen Whatman-Papier. Der
Elektroblot erfolgt bei 4 °C mit 20 V für 10-15 min.
Die Quervernetzung der RNA an die Membran erfolgte durch eine Carbodiimid-vermittelte
Methode. Dazu wird das Gel auf ein mit der Crosslinking-solution getränktes Whatmanpapier
platziert, eingeschweißt und zwei Stunden bei 55 °C im Hybridisierungsofen inkubiert. Bei
Bedarf wurde zusätzlich zuvor ein UV-crosslinking durchgeführt (Kapitel 0). Nach Abspülen der
Membran mit DEPC-H2O erfolgte die Prähybridisierung mit Church-Puffer für 30 min bei 42 °C.
Danach wurde die Membran über Nacht mit einem radioaktiv endmarkierten Oligonukleotid
hybridisiert (42 °C). Die Membran wurde zweimal 15 min mit Waschlösung A, zweimal 10 min
mit Waschlösung B und zweimal 5 min mit Waschlösung C bei 42 °C gewaschen. Die Exposition
zur Detektion kleiner RNAs erfolgte für 16 bis 72 Stunden.
9.2.23. Stripping von Northern Blots
Um Northern-Blots erneut mit einer Sonde hybridisieren zu können, wurden alte Sonden ggf.
durch dreimaliges Waschen mit Stripping-Buffer für 20 min bei 80 – 95°C im Hybridisierungs-
ofen entfernt.
9.2.24. In vitro Transkription
In vitro Transkription von tRNAs
Für die Herstellung von Transkripten für den Methylierungsassay, wurden alle Komponeneten
zusammengegeben (Tabelle 10). Die Vektoren, von denen transkribiert wurde, mussten im
Vorfeld durch einen präparativen Restriktionsverdau linearisiert, Phenol/Chloroform extrahiert
9. Methoden
77
und gefällt werden. Die Transkription fand während einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C
im Heizblock statt. Im Anschluss erfolgt ein fünfzehnminütiger DNAse I (RNAse frei) Verdau.
Wurden große Mengen benötigt, wurden zwei bis drei parallele Ansätze gemacht, anschließend
vereint und auf 150 µL mit DEPC-Wasser aufgefüllt. Der Ansatz wurde einer Phenol-Extraktion
unterzogen. Die wässrige Phase wurde zur Entfernung nicht eingebauter Nukleotide gelfiltriert
(Kapitel 9.2.25).
Tabelle 10: Reaktionsansatz einer in vitro-Transkription für tRNAs.
Reaktionsansatz
0,5 µg DNA template (linearisiertes Plasmid)
10 µL 5x Transkriptionspuffer (Fermentas)
10 µL NTP-Mix (5mM each)
2 µL T7 RNA-Polymerase (homemade)
1 µL RNAse Inhibitor (40u/µL)
ad 50 µL (DEPC- oder UV-H2O)
In vitro Transkription von snoRNAs und U-snRNAs
In vitro Transkriptionen von snoRNAs und U-snRNAs erfolgten prinzipiell analog zur in vitro
Transkription von tRNA. Abweichend wurde hier der Transkriptionspuffer nach Doudna (Ferre-
D'Amare et al. 1996) verwendet (Tabelle 11). Nach Phenol/Chloroform Extraktion der
Transkripte wurden diese einer Ethanolfällung unterzogen.
Tabelle 11: Reaktionsansatz einer in vitro Transkription für snoRNA und U-snRNAs.
Reaktionsansatz
0,5 µg DNA Template (linearisiertes Plasmid)
5 µL 10x Transkriptionspuffer (Doudna)
25 µL NTP-Mix (5mM each)
2 µL T7 RNA-Polymerase (homemade)
1 µL RNAse Inhibitor (40u/µL)
ad 50 µL (DEPC- oder UV-H2O)
9. Methoden
78
9.2.25. Gelfiltration
Für die Gelfiltrationschromatographie wurde der Boden einer 1 mL-Einmalspritze mit Glaswolle
ausgekleidet und die Spritze anschließend durch Zentrifugation mit 1 mL Sephadex®G50 befüllt.
Die Spritze wurde dann in ein 15 mL-Falconröhrchen gegeben, in dessen Spitze ein 1,5 mL
Reaktionsgefäß zum Sammeln des Durchflusses dient. In die so präparierte Spritze konnte nun
die zu gelfiltrierende Probe (Mindestvolumen 100 µL) gegeben werden. Nach einer fünf
minütigen Zentrifugation bei 200 rcf wurde das Reaktionsgefäß mit der darin befindlichen,
gereinigten Nukleinsäure wieder entfernt.
9.2.26. Radioaktive Endmarkierung von Nukleinsäuren
Die Herstellung radioaktiv endmarkierter Nukleinsäuren erfolgte durch Übertragung eines
radioaktiven Phosphats von [γ-32P]-ATP an das 5’-OH Ende der Nukleinsäure durch die
T4-Polynukleotid-Kinase. Nach Zugabe aller Komponenten (Tabelle 12) wurde das
Reaktionsgefäß für 30 min bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Überschüssige Nukleotide wurden
anschließend durch Gelfiltration (Kapitel 9.2.25) entfernt. In dieser Arbeit wurden radioaktiv
markierte Oligonukleotide als Sonden für Northern-Blot Analysen oder für Primerextension-
Assays genutzt. In Co-Immunopräzipitationen angereicherte RNA wurden ebenfalls für erste
Analyse endgelabelt.
Tabelle 12: Ansatz einer Endmarkierungsreaktion.
Reaktionsansatz
8 µL
X µL*
Oligonukleotid (1 pmol/µL)
oder
RNA
5 μL 10x T4 PNK Puffer A (for)
1 μL T4 Polynukleotid Kinase (10 µg/µL)
1 μL [γ-32P] ATP (110 TBq/mmol)
ad 50 μL DEPC-H2O
* Werte wurde den Bedürfnissen entsprechend angepasst.
9.2.27. Random primed oligo-labeling
Die Herstellung radioaktiv markierter DNA Sonden erfolgt ausgehend von einem geluierten PCR
Produkt oder eines Restriktionsfragments. Nach der Zugabe aller Komponenten (Tabelle 13)
9. Methoden
79
wurde für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte zum Abtrennen überschüssiger
Nukleotide eine Gelfiltration (Kapitel 9.2.25).
Tabelle 13: Reaktionsansatz einer Random priming-Reaktion.
Reaktionsansatz
500 ng DNA-Fragment
10 µL 5 x OLB-Mix
ad 41 µL H2O
3 min, 95°C
Danach ergänzen:
2 µL BSA (10 mg/mL)
5 µL (1,8 MBq) [α-32P] ATP (110 TBq/mmol)
2 µL Klenow-Fragment (2u/µL)
UV-H2O ad 50 μL
9.2.28. Primer extension
Für Primer extension wurden 0,1 µg in vitro Transkript oder 2 µg Gesamt-RNA mit 3 µL eines
radioaktiv endmarkierten Oligonukleotide (Konzentration nach Endmarkierung ~ 0,08
pmol/µL) (Kapitel 9.2.26) gemischt und auf 11,5 µL mit DEPC-H2O aufgefüllt. Nach fünf
minütiger Inkubation bei 80°C wurde der Ansatz auf Eis gebracht. Nach Zugabe von 4 µL 5x RT-
Reaktionspuffer, 2 µL 10 mM dNTPs und 0,5 µL Ribolock (x u/µL) folgte eine weitere Inkubation
bei 37°C für 5 min. Die reverse Transkription erfolgte durch Zugabe von 1 µL RT für 1 Stunde bei
37°C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von denaturierndem Auftragspuffer gestoppt und die
Probe auf einem denaturierenden 12%igem PAA-Gel aufgetrennt.
9.3. Biochemische Methoden
9.3.1. Überexpression rekombinanter Proteine in Escherichia coli
Um rekombinante Proteine für nachfolgende Experimente zu gewinnen, wurde eine Vorkultur
(LB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Antibiotika) mit den gewünschten E. coli Klonen
inokuliert und über Nacht bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert. Bei den in dieser Arbeit
verwendeten E. coli Expressionsstämmen handelt es sich um BL21 pLysS (DE3) oder Rosetta2
pLysS. Durch das Lysozym kodierende zusätzliche Plasmid musste bei der Selektion dem
9. Methoden
80
Medium auch Chloramphenicol zugesetzt werden. Am nächsten Tag wurde eine Hauptkultur
(20 mL für Expressionschecks, 500 mL für präparative Zwecke) angesetzt, in die die
Starterkultur 1:50 verdünnt wurde. Die Zellen wurden bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert bis
ein OD600-Wert von ca. 0,6 erreicht ist. Nach Abnahme der Nullproben, konnte die Expression
der Proteine durch Zugabe von IPTG, wobei die Endkonzentration dem jeweilig zu
exprimierenden Enzym angepasst wurde (Tabelle 14), induziert werden. Die Kulturen wurden
weiterhin bei gewünschter Temperatur inkubiert (Tabelle 14). Nach einigen Stunden (Tabelle
14) wurden die Kulturen schließlich in Falconröhrchen für 10 min bei 1700 rcf gesammelt
(100mL Kultur pro Falcon). Die Zellpellets zur Lagerung bei -20°C oder -80 °C eingefroren
werden.
Tabelle 14: Übersicht der Expressionsbedingungen verwendeter rekombinanter Proteine in E. coli.
Protein Vektor Selektionsmedium C(IPTG) Temp. Dauer
His6-DnmA pET15b LBAmp+CAM 0,5 mM 22°C 3 h
pET28a(+) LBKAN+CAM 1 mM 22°C 3 h
His6-hDnmt2 pET28a(+) LBKAN+CAM 1 mM 37°C 3 h
His6-Pmt1 pET15b LBAmp+CAM 1 mM 37°C 2 h
GST-EhMLBP pGEX-4T-1 LBAmp+CAM 0,5 mM 30°C 4 h
GST-EhMLBP (C-ter) pGEX-4T-1 LBAmp+CAM 0,5 mM 30°C 4 h
9.3.2. Affinitätsreinigung rekombinanter Proteine aus E. coli
Allen Zellaufschlusspuffern wurde je 10 mL Volumen eine Proteinaseinhibitortablette (complete
mini, Roche) zugesetzt.
9.3.2.1. Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC)
Die Reinigung rekombinanter His6-markierter Proteine erfolgt über immobilisierte Metallchelat-
Affinitätschromatographie (IMAC) mittels NiNTA-Sepharose™. Der Zellaufschluss erfolgte durch
Auftauen der Zellpellets und erneutem Einfrieren bei -20°C für ca. eine Stunde. Danach wurden
die Pellets (aus je 100 mL Kultur) erneut aufgetaut und in je 5 mL Sonifizierungspuffer mit
1mg/mL Lysozym resuspendiert. Es folgte eine ca. zwanzigminütige Inkubation auf Eis.
Nach Vortexen wurden alle Fraktionen vereint und ca. zehn Mal für 10 sec sonifiziert (Amplitude
50%, Zyklus 0,5). Zwischen jeder Ultraschallbehandlung wurde 30 sec Pause eingelegt. Es
folgten zwei Zentrifugationsschritte (10.000 rcf, 4°C, 10 min) um das unlösliche Zellmaterial zu
9. Methoden
81
pelletieren. Nach dem ersten Zentrifugationsschritt wurde der Überstand in ein neues
Reaktionsgefäß überführt. Vom Lysat sowie nach jedem weiteren Schritt wurde eine Probe zur
Analyse auf einem SDS-Gel entnommen. Alle weiteren Schritte fanden bei 4°C statt. Zwei
10mL-Chromatographiesäulen (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) wurden hierzu mit je 500 μL NiNTA-
Sepharose™-Suspension befüllt und mit 5 mL Sonifizierungs-/Waschpuffer äquilibriert. Das
Zelllysat wurde auf die erste Chromatographiesäule gegeben und der Durchfluss direkt auf eine
zweite Säule geleitet. Nach dem Binden der His-getaggten Proteine an die NiNTA-Matrix wurden
beide Säulen separat weiterbearbeitet. Jede Säule wurde einmal mit 10 mL und im Anschluss
noch einmal mit 5mL Sonifizierungs-/Waschpuffer gewaschen. Die Elution erfolgte durch
Zugabe von je 500 µL Elutionspuffer pro Säule, gefolgt von einer zehnminütigen Inkubation. Im
Anschluss wurde die Elutionsfraktion aus der Säule entlassen und zwei weitere Elutionsschritte
ohne weitere Inkubation wiederholt. Die einzelnen Fraktionen wurden separat gesammelt.
Mittels Coomassie-Schnelltest wurde der Proteingehalt der einzelnen Elutionen semiquantitativ
bestimmt und die entsprechenden Fraktionen vereint. Die Dialyse erfolgte für zwei Stunden in
Dialysepuffer I gefolgt von einer Inkubation über Nacht in Dialysepuffer II.
9.3.2.2. GST-Affinitätschromatographie
Induzierte und eingefrorene Bakterienpellets wurden aufgetaut und ein weiteres Mal für ca. 30-
60 min eingefroren. Nach erneutem Auftauen wurden die Zellen in 15 ml Lysepuffer + 5 ml
Bugbuster resupsendiert und für 20 min auf Eis inkubiert. Der Zellaufschluss wurde durch ca.
zehnmaliges Sonifizieren (Amplitude 80 %, Cycle 0,8; 10 s, 20 s Pause) komplettiert. Die
Zellreste wurden durch Zentrifugieren für 15 min bei 10.000 rcf und 4°C entfernt. Vom
Überstand des Lysats sowie jedem weiteren Schritt wurden Proben zur Analyse auf einem SDS-
Gel entnommen.
Der Überstand wurde mit 500 μL äquilibrierter (10 mL 1xPBS) Gluthation-Sepharose versetzt
und für 2 h bei 4 °C auf dem Drehrad inkubiert. Im Anschluss wurde der Ansatz auf eine
Chromatographiesäule (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) gegeben, der Durchfluss verworfen und
jeweils dreimal mit 10 mL Waschpuffer A und Waschpuffer B gewaschen. Die GSH-Sepharose
wurde in 500 μL Elutionspuffer aufgenommen und in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß für 1 h bei
4 °C auf dem Drehrad inkubiert. Der Ansatz wurde erneut auf die Säule gegeben und die Elution
aufgefangen. Es folgte eine Nachelution ohne Inkubation mit 300-500 μL Elutionspuffer. Die
Eluate wurden mit Hilfe des Coomassie-Schnelltests überprüft, positive Eluate vereint und 3 h in
Dialysepuffer I und danach über Nacht in Dialysepuffer II dialysiert.
9. Methoden
82
9.3.3. Affinitätsreinigung getaggter Proteine aus Dictyostelium
Allen Zellaufschlusspuffern wurde je 10 mL Volumen eine Proteinaseinhibitortablette (complete
mini, Roche) zugesetzt.
9.3.3.1. Tandem-Affinitätsreinigung (TAP)
Tandem Affinitätsreinigung (TAP, tandem affinity purification) wurde ähnlich wie in Puig et al.
beschrieben durchgeführt (Puig et al. 2001). 4-5 x 108 Dictyostelium Zellen (mit pDneo2a_N-TAP,
pDneo2a_N-TAP-DnmA oder pDneo2a_DnmA-C-TAP) wurden durch Zentrifugieren bei 390 rcf
für 5 min geerntet und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Die Zellen wurden in 15 mL
IPP 150 resuspendiert und fünf- bis zehnmal für 10 s sonifiziert (Amplitude 25, Cycle 0,25). Es
folgte eine Zentrifugation für 20 min bei 4°C mit 10.000 rcf. Vom Überstand wurden zur Analyse
auf dem SDS-Gel 30 µL Probe entnommen und mit dem gleichen Volumen Lämmli-Puffer
versetzt. Von jedem weiteren Schritt wurden ebenfalls 30 µL Probe zur Analyse auf dem SDS-Gel
entnommen.
300 µL IgG-Agarose wurden mit 5 mL IPP150 äquilibriert und anschließend der Überstand für
zwei Stunden mit den Beads inkubiert. Die IgG-Agarose wurde mit Hilfe einer
Chromatographiesäule (Polyprep 0,8x4cm, 10 mL) herausfiltriert und dreimal mit 10 mL
IPP 150 gewaschen. Nachdem die IgG-Agarose beads mit 5 mL TEV cleavage buffer äquilibriert
wurden, erfolgte die Elution für 2 h bei 16°C in 1mL TEV cleavage buffer, der mit 100 u der
AcTEVTM Protease versetzt wurde. Nach der TEV Proteolyse wurden die IgG-Sepharose beads
erneut mit Hilfe der Chromatographiesäule vom Eluat getrennt und mit 200 µL des TEV cleavage
buffers nacheluiert. Der zweite Reinigungsschritt der Tandem Affinitätsreinigung wurde in
dieser Arbeit nicht verwendet. Für Aktivitätstests wurde das Eluat mit Hilfe eines
Zentrifugalfilters (Amicon® Ultra-4) durch Zentrifugieren auf ca. 100-200 µL ankonzentriert
und der Puffer mit 50% Glycerin angereichert.
9.3.3.2. StrepII-Affinitätsreinigung
Für die StrepII-Affinitätsreinigung wurden 5x108 DnmA-StrepII überexprimierende
Dictyostelium Zellen geerntet, mit Phosphatpuffer gewaschen und in 10 mL StrepII-Lysepuffer
resupsendiert. Nach fünfzehnminütiger Inkubation auf Eis wurden unlösliche Zellreste
abzentrifugiert (10.000 rcf, 30 min, 4°C). 200 µL Strep Tactin® SuperflowTM Agarose beads
wurden mit 5 mL StrepII-Lysepuffer äquilibriert und anschließend für 30 min bei 4°C mit dem
Überstand des Lysates auf einem Drehrad inkubiert. Im Anschluss wurde der Überstand
verworfen und die Beads je einmal mit 10 mL und 5 mL StrepII-Waschpuffer gewaschen. Die
9. Methoden
83
Elution erfolgte in fünf Schritten mit je 250 µL StrepII-Elutionspuffer. Die einzelnen Fraktionen
wurden im Coomassie-Schnelltest oder SDS-PAGE überprüft, positive Fraktionen vereint und
über Nacht gegen StrepII-Dialyspuffer dialysiert.
9.3.3.3. Affinitätsreinigung mit der GFP-Nanotrap
Die Reinigung von DnmA-GFP und GFP für den Aktivitätstest im Methylierungsassay erfolgte
prinzipiell analog zu der unter Kapitel 9.3.4.2 (mit Formaldehyd-crosslinking) beschriebenen
Methode. Es wurden 2x108 Zellen eingesetzt, kein Crosslinking durchgeführt und die mit dem
Protein beladenen beads wurden direkt im Methylierungsassay eingesetzt.
Zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen (1,5x109 Zellen) wurde das Formaldehyd-
crosslinking durch Crosslinking mit DTBP ersetzt. Dazu wurden die Zellen in 1xPBS mit 5 mM
DTBP resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend folgte ein Waschschritt mit
20 mL Inactivation Buffer sowie ein weiterer Waschschritt mit 1xPBS. Alle weiteren Schritte
erfolgten analog zu Kapitel 2.3.4.2. Von jedem Schritt wurden je 30 µL Probe zur Analyse auf
einem SDS-Gel abgenommen.
9.3.4. Co-Immunopräzipitationen von RNA
9.3.4.1. RNA-IP mit Tandem-Affinitätschromatographie
RNA-Co-Immunopräzipitationen mit TAP-DnmA wurden analog zur Tandem-Affinitätsreinigung
überexprimierter DnmA aus Dictyostelium durchgeführt (Kapitel 9.3.3.1). Für die RNA Analysen
wurden vom Überstand und Durchfluss zusätzlich jeweils 100 µL Probe entnommen, von allen
weiteren Proben 1 mL bzw. der Elution 1,2 mL. Zur Gewinnung der RNA wurden diese Proben
mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt, radioaktiv endmarkiert und
auf einem denaturierenden PAA-Gel analysiert.
9.3.4.2. RNA-CLIP mit der GFP Nanotrap
Mit Formaldehyd-crosslinking
Für Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen wurden DnmA-GFP und GFP exprimierende
Dictyostelium-Zellen (5x107 - 2x109) (Kuhlmann et al. 2005) bei 390 rcf für 5 min abzentrifugiert,
mit Phosphatpuffer gewaschen und in 1-40 mL Phosphatpuffer (1 mL/5x107 Zellen) mit
1% Formaldehyd resuspendiert. Nach 15 min bei 22°C wurde die Crosslinking Reaktion durch
Zugabe von Glycin (125 mM Endkonz.) gestoppt. Nach einem Zentrifugationsschritt bei 4°C
(10.000 rcf) wurden die Zellen in 1 - 40mL Lysis Buffer resuspendiert und dreimal sonifiziert
9. Methoden
84
(Amplitude 50, Cycle 0,5). Es folgten drei Zentrifugationsschritte bei 10.000 rcf, 15 min, 4°C. Der
Überstand wurde zwischen den Zentrifugationen jeweils in ein neues Gefäß überführt. 250-
300 µL SephadexTM G-50 Medium in 1x TE-Puffer wurden dreimal mit 1 mL Dilution Buffer
äquilibriert (Abzentrifugieren bei 510 rcf) und das Lysat für 15 min bei 4°C auf dem Drehrad mit
den Beads inkubiert. 20-100 µL GBP-NHS-Sepharose (Rothbauer et al. 2008) wurden ebenfalls
mit 1 – 1,5 mL Dilution Buffer äquilibriert (Abzentrifugieren bei 1000 rcf) und der Überstand für
30 min bei 4°C auf dem Drehrad inkubiert. Es folgten vier Waschschritte mit 0,5 – 2,5 mL
Dilution buffer.
Zur Gewinnung der RNA wurden die Beads in 300 µL Dilution buffer resuspendiert, mit 1 mg/mL
Proteinase K versetzt und für 30 min bei 56°C inkubiert. Je 30 µL Probe des Inputs wurden mit
70 µL Dilution buffer vesetzt und ebenfalls mit Proteinase K und 56°C behandelt. Von den
Waschschritten wurde jeweils 1 mL analysiert. Im Anschluss erfolgte eine Phenol/Chloroform-
Extraktion, die RNA wurde mit Isopropanol gefällt (-20°C üN), mit 70% EtOH gewaschen und in
DEPC-H2O aufgenommen.
Mit UV-crosslinking
Für das RNA-CLIP-Experiment mit UV-crosslinking wurden je 2-4x108 Dictyostelium Zellen
verwendet. Die Zellen wurden geerntet, einmal mit Phosphatpuffer gewaschen und in 20-40 mL
1xPBS resuspendiert. Je 10 mL der Suspension wurden auf eine Petrischale (10 cm
Durchmesser) gegeben. Nach 15 minütiger Ruhe erfolgte das UV-crosslinking bei 250 mJ/cm2 bei
254 nm. Jede Petrischale wurde mit 4 mL RIPA-Puffer (modifiziert) abgewaschen und die Zellen
in ein 15 mL-Reaktionsgefäß überführt. Die Lyse wurde durch drei- bis fünfmaliges Sonifizieren
für je 10s (Amplitude 50, Cycle 0,5) unterstützt. Zentrifugation, Präinkubation mit Sephadex und
Inkubation mit der Nanotrap (60 µL) erfolgte wie oben beschrieben. Das Waschen erfolgte
zweimal mit 1,5 mL stringency RIPA Buffer A und dreimal mit 1,5 mL stringency RIPA Buffer B.
Die GBP-Sepharose wurde mit 1 mL RIPA Equilibration Buffer äqulibriert und die beads in 500-
800 µL Crosslink Reversal Buffer resuspendiert.
Für die Extraktion der RNA wurden vom Input je 30 µL Probe entnommen mit 70 µL Crosslink
Reversal Buffer versetzt und 4,8 µL EDTA (25 mM stock, pH 7,4) hinzugefügt. Die Waschschritte
wurden jeweils mit 4 mM EDTA versetzt und ebenso wie die in Crosslink Reversal Buffer
resuspendierten Beads vollständig weiterverarbeitet. Alle Proben wurden mit 1 mg/mL
Proteinase K versetzt und für 1 h bei 42°C und dann 5 h bei 65°C inkubiert. Phenol/Chloroform
Extraktion und Fällung der RNA erfolgte wie oben beschrieben. Allerdings wurde die Fällung
durch Zugabe von 20 µg Glykogen unterstützt.
9. Methoden
85
9.3.5. RNA Sequenzierung (Next-Generation-Sequenzierung)
Die Next-Generation-Sequenzierung der co-immunopräzipitierten RNA wurde von J. Vogel und
C. Sharma (Zentrum für Infektionsforschung, Universität Würzburg) nach einem etablierten
Protokoll der Abteilung durchgeführt (Sittka et al. 2008).
9.3.6. Präparation von Gesamtprotein aus Dictyostelium discoideum
Für Western-Blot Analysen zur Überprüfung der Expression von Proteinen wurde 1 mL einer
dicht gewachsenen Dictyostelium-Schüttelkultur für 3 min bei 390 rcf abzentrifugiert. Das
Zellpellet wurde in 50-100 μL 5 x Probenpuffer aufgenommen und durch zehnminütiges
Erhitzen auf 95 °C im Heizblock denaturiert.
9.3.7. Fällung von Proteinen
Um Proteine für eine Gelelektrophorese zu konzentrieren, kann eine Fällung mit
Trichloressigsäure erfolgen. Die proteinhaltigen Lösungen wurden je mit dem gleichen Volumen
20%iger TCA-Lösung versetzt und mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurde der
Ansatz mit 20.000 rcf für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
Pellet mit Aceton gewaschen, getrocknet und in 5 x Probenpuffer aufgenommen (ggf. wurde der
pH-Wert durch Tris-Feststoff wieder eingestellt).
9.3.8. SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Für die SDS-PAGE (Laemmli 1970) wurden die Proteinproben mit 1/5 Volumen
5 x Propenpuffer versetzt, für zehn Minuten bei 95 °C denaturiert und im Anschluss sofort auf
Eis gestellt. Die Auftrennung der dentaurierten Proteine erfolgte in 12%igen PAA-Gelen (Tabelle
15) mit 1x Proteingel-Laufpuffer (25 mA/Gel).
Tabelle 15: Komponenten für die SDS-PAGE (ausreichend für 2 Gele).
Komponente 12 % Trenngel Sammelgel
Acrylamid/Bisacrylamid (30 %) 4,4 mL 450 μL
Protein-Trenngelpuffer 2,64 mL -
Protein-Sammelgelpuffer - 1 mL
H2O 3,4 mL 2,5 mL
250 mM EDTA 43,2 μL 16 μL
TEMED 5 μL 4 μL
APS (20 %) 120 µL 60 µL
9. Methoden
86
9.3.9. Coomassie Färbung
Um die aufgetrennten Proteine nach einer SDS-PAGE sichtbar zu machen, wurden die Gele
zunächst für 10 min mit kochendem destilliertem Wasser überschichtet um SDS aus dem Gel zu
entfernen. Die Inkubation in kollodialer Coomassie-Lösung erfolgte schwenkend über Nacht. Am
nächsten Tag konnte die Färbelösung gegen Wasser gewechselt werden.
9.3.10. Coomassie Schnelltest
Um Proteingehalt von Lösungen semiquantitativ zu bestimmen, wurden 5 µL Proteinhaltige
Lösung auf Whatmann-Papier getropft, 30 s in der Mikrowelle getrocknet und in Coomassie-
Lösung (0,1% CBB G250; 10% HAc) getaucht. Überschüssiges Coomassie wurde mit Wasser
abgespült.
9.3.11. Massenspektrometrie (nanoLC-ESI-MS/MS Analyse)
Die Probenvorbereitung und massenspektrometrische Analyse wurden von O. Bertinetti (Abt.
Herberg, Universität Kassel) durchgeführt. Der In-Gel-Verdau erfolgte nach einem etablierten
Protokoll der Abteilung (Bertinetti et al. 2009). Für die nanoLC-ESI-MS/MS Analyse wurde ein
nanoLC System (NANOLC 1D™ PLUS, eksigent) mit einem QTRAP Massenspektrometer (4000
QTRAP® LC/MS/MS System, AB Sciex) verwendet.
9.3.12. Western Blot
Für Western Blot-Analysen (Renart et al. 1979) wurde das zu blottende Gel auf eine
Nitrozellulosemembran (Towbin et al. 1979) gelegt und zwischen je zwei Lagen mit Semidry-
Blotting Buffer getränkte Filterpapiere eingebettet. Der Transfer wurde für 50 min bei 200 mA
durchgeführt. Im Anschluss wurde die Membran mind. 30 min mit Blockierlösung präinkubiert.
Nach Zugabe des 1. Antikörper (Verdünnung 1:3 bzw. 1:1000 bei kommerziellen AK) folgte eine
weitere Inkubation bei 4°C über Nacht. Anschließend wurde die Membran fünfmal 5 min mit
1 x NCP-Puffer gewaschen und 3h erneut mit dem 2. Antikörper (AP-gekoppelter Ziege-anti-
Maus oder AP-gekoppelter Ziege-anti-Kaninchen, je 1:5000) inkubiert. Nach erneutem Waschen
und Umpuffern in AP-Puffer folgte die Farbreaktion durch Inkubation der Membran in 35 μL
BCIP-Lösung/10 mL AP-Puffer im Dunkeln.
9. Methoden
87
9.3.13. Proteinmengenbestimmung nach Bradford
Die Proteinmengenbestimmung nach
Bradford basiert auf einer Anlagerung eines
Coomassiefarbstoffs an basische
Aminosäuren (Bradford 1976). Für den Test
wurde die Roti-Quant Lösung (Roth) sowie
das Fotometer (Novaspec III, Amersham)
verwendet. Die Eichgerade wurde von
Stephan Wiegand erstellt und diente zur
Quantifizierung der Proteinmenge
(Abbildung 13).
a) Die Bestimmung der Proteinkonzentration zur Referenzierung der fluoreszenz-
spektrometrischen Messungen (in Anlehnung an ein Protokoll der Abt. Zellbiologie,
Universität Kassel): Die Zellpellets aus je 2x106 Zellen wurden in je 300µL
Phosphatpuffer resuspendiert und dreimal in flüsssigem Stickstoff eingefroren und bei
37°C wieder aufgetaut. Die Zelllyse wurde durch mehrmaliges Vortexen unterstützt. Es
folgte eine einstündige Zentrifugation bei 10.000 rcf bei 4°C. Vom Überstand wurden
40 µL in eine 1 mL-Einwegküvette mit 760 µL dest. Wasser überführt und mit 200 µL
Roti-Quant Lösung gemischt. Nach 10 min Inkubation erfolgte die photometrische
Bestimmung bei OD595.
b) Für die Bestimmung der Proteinkonzentration isolierter rekombinanter Proteine
wurden je nach Bedarf zwischen 2-10 µL eingesetzt (790-798 mL dest. Wasser).
9.3.14. 3H-in vitro Methylierungsassay
Die Methylierung von RNA Substraten wurde mit wenigen Änderungen wie in Jurkowski et al.
beschrieben durchgeführt (Jurkowski et al. 2008). Der Reaktionsansatz (Tabelle 16) wurde bei
22°C von 1 min bis zu 3 h inkubiert. Bevor die RNA zum Reaktionsansatz hinzugefügt wurde,
erfolgte eine Präinkubation für 5 min, die der Beladung der MTasen mit radioaktiv markierten
Kofaktor diente. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 mM nicht-radioaktivem SAM (2 µL,
Stock: 10mM) und 1 mg/mL Proteinase K (2 µL, Stock: 20 mg/mL) für 30 min gestoppt. Im
Anschluss wurden die Proben mit dem gleichen Volumen FA-Puffer versetzt und auf 8-12%
denaturiereden PAA-Gelen aufgetrennt. Das Gel wurde mit EtBr gefärbt, zweimal 10-15 min
fixiert (10% MeOH, 10% HAc) und für 1h in Amplify-Solution inkubiert. Nach Trocknen des Gels
bei 60-70°C für 1-3 h erfolgte eine Exposition auf einen für 16h bis zu 4 Wochen.
Eichgerade für Bradford-Assay
0 5 10 15 200.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
y = 0,04611x
R2 = 0,989
BSA [µg]
OD
59
5
Abbildung 13: Eichgerade (mit BSA) zur Bestimmung der Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.
9. Methoden
88
Tabelle 16: Reaktionsansatz eines Methylierungsassays.
9.3.15. 3H-in vitro Shift-Assay
Der 3H-in vitro Shift-Assay macht sich die unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten von
einzelsträngigen und doppelstängigen Nukleinsäuren (in diesem Fall RNA/DNA Hybriden)
zunutze. Zunächst erfolgte ein Methylierungsassay wie in Kapitel 9.3.14 beschrieben. Nach
Stoppen der Reaktion wurde das gewünschte Oligonukleotid zum Reaktionsansatz pipettiert
(5 µL Oligonukleotid; Stock: 10 µM je Oligonukleotid in STE-Puffer). Der Reaktionsansatz wurde
in einem Thermocycler für 5´ bei 80°C erhitzt, dann für 3´ bei 78°C inkubiert. Darauf folgte eine
Temperaturabsenkung auf 75°C und je eine weitere Absenkung um 5°C nach jeder weiteren
Minute bis eine Temperatur von 20°C erreicht war. Die Proben wurden daraufhin mit nativem
RNA-Auftragspuffer versetzt und auf einem nativen PAA-Gel (6%) aufgetrennt.
9.3.16. 3H-in vitro Blockierungs-Assay
Der 3H-in vitro Blockierungs-Assay basiert auf der Annahme, dass Methylierung am
Zielnukleotid einer RNA nicht mehr erfolgen kann, wenn diese Stelle durch Hybridisierung mit
einem DNA Oligonukleotid „blockiert“ ist. Dazu wurde die gewünschte Menge RNA (500 ng
Transkript oder 10 µg kleine angereichte RNA) mit 5 µL Oligonukleotid (Stock: 10 µM je
Oligonukleotid in STE-Puffer) versetzt und wie in Kapitel 9.3.15 beschrieben hybridisiert. Dieser
Ansatz wird danach für einen Methylierungsassay (Kapitel 9.3.14) eingesetzt.
Reaktionsansatz
3 -6 µM
3 -12 µM
His6-hDnmt2 oder
His6-DnmA
2 µL 10x Methylierungspuffer
2µL [3H]-SAM (Endkonz.: 1,7 µM)
1 u/µL RiboLock™ RNase Inhibitor
5 min Präinkubation
500 ng
20 µg
10 µg
(t)RNA-Transkript oder
Gesamt-RNA oder
angereicherte kleine RNA aus Dictyostelium
ad 20 µL UV-H2O
9. Methoden
89
9.4. Biophysikalische Methoden
9.4.1. Probenvorbereitung für Atomic Force Microscopy
Für die Abbildung des Bindeverhaltens des EhMLBP-Proteins an methylierte DNA mittels Atomic
force microscopy (AFM) wurde affinitätsgereinigtes GST-EhMLBP C-ter verwendet. RT-LINE DNA
wurde unter Verwendung von dm5CTP amplifiziert (Kapitel 9.2.16) und anschließend
elektroeluiert (Kapitel 9.2.19). Der folgende Reaktionsansatz wurde in angebender Reihenfolge
pipettiert und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Tabelle 17: Reaktionsansatz für AFM Messungen.
Reaktionsansatz
1,8 µL 5x Bindepuffer
1 µL DTT (5mM)
15 pmol RT-LINE DNA
1,5 µL GST-EhMLBP C-ter (2,7 µM)
ad 10 µL ddH2O (filtriert 0,1 µm)
In der Zwischenzeit wurde die Glimmeroberfläche vorbereitet, indem mit einem Stück
Klebestreifen die oberste Glimmerschicht abgezogen wurde. Im Anschluss wurden 1 μL des
Ansatzes mit 30 μL Rivetti-Puffer verdünnt für 1 min auf dem Glimmer inkubiert. Nach
dreimaligem Waschen mit 1 mL sterilfiltriertem Wasser wurde die Oberfläche mit Stickstoff
getrocknet.
9.4.2. AFM Imaging
Die nach Kapitel 9.4.1 vorbereiteten Proben wurden mit einem AFM Multimode mit Nanoscope
3A Controller (Bruker) im Tapping mode (in Luft) analysiert. Dazu wurden Tap 300AL-G
Cantilever (Nanoandmore) verwendet. Die Messungen erfolgten mit einer Auflösung von
512x512 Pixel, einer Scanrate von 1,5 Hz sowie einer Scangröße von 3 µm. Die Auswertung der
Daten erfolgte mit Image J.
10. Ergebnisse
90
10. Ergebnisse
Alle Bilder der Methylierungsassays sind mit Corel Draw Graphics Suite X3 in das Bitmap-Format
(Graustufen, 8bit, 300 dpi) konvertiert. Um den dabei entstehenden Kontrastverlust auszugleichen sind
die Bilder zusätzlich mit der Funktion „automatische Kontrastanpassung“ bearbeitet.
10.1. In vitro Methylierung von Nukleinsäuren aus Dictyostelium durch Dnmt2-
Homologe
In vitro-Methylierungsstudien mit humaner Dnmt2 (hDnmt2) zeigten, dass Gesamt-RNA aus
Dictyostelium discoideum im Bereich der tRNA-Fraktion methyliert werden kann (Jurkowski et
al. 2008). Dieses Kapitel der vorliegenden Arbeit adressiert die Frage, inwiefern das Dnmt2-
Homolog aus Dictyostelium (DnmA) ebenfalls als tRNA Methyltransferase aktiv ist und welche
(t)RNAs aus Dictyostelium als Substrate dienen können. Dabei wurden die in vitro
Methylierungsstudien mit DnmA überwiegend vergleichend zur hDnmt2 durchgeführt.
10.1.1. Heterologe Expression und Reinigung von Dnmt2-Homologen aus E. coli
Für die Methylierungs- und Bindungsstudien in vitro wurden die Dnmt2-Homologe hDnmt2
(H. sapiens), DnmA (D. discoideum) und Pmt1 (S. pombe) rekombinant in E. coli exprimiert und
mittels immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt (Kapitel
9.3.2.1). Im Verlauf der Arbeit stellte sich heraus, dass rekombinante His6-DnmA deutlich
schwächere Methylierungsaktivitäten zeigte als das humane Homolog. Eine Umklonierung von
DnmA aus dem Vektor pET15b in den Vektor pET28a(+) konnte die Aktivität des rekombinanten
Enzyms erhöhen (Abbildung 14 und Daten nicht gezeigt).
Abbildung 14 zeigt SDS-PAGEs mittels IMAC gereinigter und anschließend durch Dialyse
konzentrierter Dnmt2-Homologe (mit His6-tag). hDnmt2 (berechnetes MW: 46,7 kD) und Pmt1
(berechnetes MW: 40,5 kD) entsprechen in ihrem Laufverhalten dem kalkulierten
Molekulargewicht. DnmA zeigt mit einer Bande bei ca. 50 kD eine Abweichung, da die
berechneten Molekulargewichte 46,2 kD (im pET15b Vektor) und 44,1 kD (im pET28a(+)
Vektor) betragen.
10. Ergebnisse
91
Abbildung 14: SDS-PAGE (12%) der Dnmt2-Homologe mit His6-tag nach IMAC. Gezeigt sind mittels pET15b Vektor exprimierte His6-DnmA (240 pmol) im Vergleich zu His6-hDnmt2 (60 pmol) (A) und mittels pET28a(+) exprimierte His6-DnmA (60 pmol) im Vergleich zu His6-hDnmt2 und His6-Pmt1 (je 60 pmol) (B). Die eingesetzten Mengen entsprechen der Masse an Protein, die pro Methylierungsassay verwendet wurde. Marker: PageRuler™ Unstained Protein Ladder (Fermentas)
10.1.2. Das Dictyostelium Dnmt2-Homolog DnmA methyliert tRNA in vitro
Um rekombinant exprimierte His6-DnmA auf ihre RNA Methylierungsaktivität zu untersuchen,
wurden 3H-in vitro Methylierungsstudien (Kapitel 9.3.14) durchgeführt. Als Substrat wurde
Gesamt-RNA oder aus Gesamt-RNA angereicherte kleine RNA aus verschiedenen Dictyostelium
Stämmen verwendet.
DnmA ist eine aktive tRNA Methyltransferase
Erste Experimente zeigten, dass rekombinante DnmA in vitro als tRNA Methyltransferase aktiv
ist. Die Reaktionstemperatur musste jedoch im Vergleich zur hDnmt2 auf 22°C, der optimalen
Wachstumstemperatur für Dictyostelium-Zellen, gesenkt werden, da DnmA bei 37°C keine
Methylierungsaktivität zeigte (Abbildung 15A). Alle weiteren Experimente wurden bei 22°C
durchgeführt, da die hDnmt2 in einem Vergleichsexperiment keine verminderte Aktivität bei
dieser Temperatur zeigte (Daten nicht gezeigt).
Ein Timecourse mit rekombinanter DnmA über einen Zeitraum von 180 min ergab, dass nach ca.
80-100 min keine weitere Inkorporation von Radioaktivität in die RNA mehr stattfindet
(Abbildung 15B). Dies entspricht dem Reaktionsverlauf hDnmt2 (Jurkowski et al. 2008).
Allerdings trifft diese Beobachtung nur auf die obere Bande der im Methylierungsassay zu
sehenden Signale zu. Die untere Bande erscheint erst nach 40-60 min und erreicht zwischen
A B
10. Ergebnisse
92
100-120 min ihr Maximum. Dieses Ergebnis weist daraufhin, dass vermutlich mehr als eine
tRNA durch DnmA methyliert werden kann (siehe auch Kapitel 10.1.5). Allerdings kann ebenfalls
nicht ausgeschlossen werden, dass die untere Bande ein Degradationsprodukt darstellt.
Abbildung 15: Das Dnmt2-Homolog DnmA aus Dictyostelium ist eine aktive tRNA Methyltransferase in vitro. Gezeigt sind zwei 3H-Methylierungsassays mit rekombinanter His6-DnmA aus E. coli und angereicherten kleinen RNAs aus Dictyostelium. Im Gegensatz zur hDnmt2 (nicht gezeigt) ist DnmA temperatursensitiver und nur bei 22°C, der optimalen Wachstumstemperatur von Dictyostelium, methylierungsaktiv (A). Timecourse der Methylierung von angereicherter kleiner RNA durch His6-DnmA (B). Exposition: 16 h
Die Methylierbarkeit von tRNA aus Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO-Zellen
Durch vergleichende in vitro Methylierungsstudien von RNA aus Dictyostelium Wildtyp- und
dnmAKO-Zellen wurde indirekt der in vivo-Methylierungstatus der tRNAs untersucht: Eine aktive
DnmA in vivo führt zu einer verminderten Inkorporation von radioaktiven Methylgruppen in die
RNA in vitro. Dieses Experiment wurde vielfach wiederholt und führte zu verschiedenen
Ergebnissen. Abhängig von der RNA-Präparation traten starke bis keine Unterschiede in der in
vitro-Methylierbarkeit der RNA aus Wildtyp- und dnmAKO-Zellen auf (Abbildung 16). Die
wechselnde Methylierbarkeit der RNA aus Wildtyp- und dnmAKO-Zellen steht im Einklang mit
Ergebnissen einer Bestimmung des Methylierungsstatus der tRNAAsp aus Drosophila, die eine
Varianz der C38 Methylierung von 40-70% zeigen (pers. Mitteilung M. Schäfer, DKFZ Heidelberg,
siehe auch Kapitel 11.1.2 der Diskussion).
A B
10. Ergebnisse
93
Ein in vitro Methylierungsassay mit angereicherter kleiner RNA aus Cytoplasma im Vergleich zu
RNA aus angereicherten Zellkernen, gibt einen Hinweis auf eine verstärkte in vivo Methylierung
von tRNA im Zellkern (Abbildung 17). Dies würde eine nukleäre Funktion der überwiegend im
Zellkern lokalisierten DnmA stützen.
Da sich die Expression vieler Gene sowie die Aktivität einiger Proteine in Dictyostelium mit
Eintritt in die Entwicklung verändert, sollte dieser Einfluss auch bezüglich der Methylierbarkeit
der tRNA durch DnmA untersucht werden. Zusätzlich ist bezüglich der DnmA abhängigen
Regulation des Retrotransposons skipper ein Effekt bei der Langzeitkultivierung von Zellen
gezeigt worden (Kuhlmann et al. 2005), so dass ebenfalls ein Langzeiteffekt auf die tRNA
Methylierung überprüft werden sollte. In weiteren Experimenten wurde daher RNA aus
Wildtyp- und dnmAKO-Zellen, die vier Stunden in Phosphatpuffer kultiviert und damit die ersten
vier Stunden der Entwicklung durchlaufen haben, sowie über 28 Monate in Schüttelkultur
gewachsene Zellen getestet. Die zugehörigen in vitro Methylierungsassays gaben keinen
Abbildung 16: In vitro Methylierung angereicherter kleiner RNA aus Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO Stämmen mit His6-hDnmt2 und His6-DnmA aus E. coli. Je nach RNA Präparation wird die tRNA Fraktion aus Wildtyp- (1) und dnmAKO-Zellen (2) mit unterschiedlicher Effizienz methyliert.
Abbildung 17: In vitro Methylierungsassay mit His6-DnmA und kleiner angereicherter RNA aus Dictyostelium Wildtyp- (1) und dnmAKO–Zellen (2). Dem Experiment ging eine Zellfraktionierung in Kern und Cytoplasma voraus.
10. Ergebnisse
94
weiteren Hinweis darauf, dass einer dieser Einflüsse zu verstärkter tRNA Methylierung durch
DnmA in vivo führt (Daten nicht gezeigt).
In vitro Methylierungsanalysen mit Dictyostelium DnmA-Überexpressions-Stämmen
Aus Dictyostelium gereinigte TAP-getaggte DnmA ist ebenfalls methylierungsaktiv (Abbildung
16B), aber auch bei diesem Enzym variierten die Methylierungseffizienzen in Abhängigkeit von
der RNA Präparation (Abbildung 18A und vgl. Abbildung 16). Grundsätzlich ist anzumerken,
dass die Methylierungssignale der TAP-getaggten DnmA durch auf einem SDS-Gel fast nicht
sichtbare Menge an Protein generiert wurden (Abbildung 18B).
Abbildung 18: In vitro Methylierung mit TAP-getaggter DnmA aus Dictyostelium. Aus Dictyostelium isolierte TAP-getaggte DnmA ist unabhängig von der Position des Tags methylierungsaktiv. Zum Aktivitätsvergleich ist eine Methylierungsreaktion mit His6-DnmA aus E. coli dargestellt (A). Für den Assay aus (A) wurde angereicherte kleine RNA aus Wildtypzellen (1) und angereicherte kleine RNA aus dnmAKO-Zellen (2) verwendet. SDS-PAGE zum Vergleich der im Methylierungsassay eingesetzten Konzentrationen an DnmA-C-TAP und His6-getaggten Enzym (60 pmol) und Western-Blot zum Nachweis von DnmA-C-TAP (* Volllänge-Protein) (B). Gereinigte DnmA-C-TAP wurde freundlicherweise von V. Maximov zur Verfügung gestellt.
Für isolierte DnmA aus DnmA-GFP und DnmA-StrepII Überexpressionsstämmen (mit dnmAKO-
Hintergrund) konnte ebenfalls Methylierungsaktivität in vitro nachgewiesen werden (Abbildung
19). Massenspektrometrische Analysen von DnmA-StrepII ergaben zwei putative
posttranslationale Phophorylierungsstellen (Maximov 2010). Ein Einfluss auf die Aktivität durch
eine mögliche Phosphorylierung erscheint nach einem ersten Aktivitätstest mit CIAP
behandelter DnmA-StrepII als unwahrscheinlich (Abbildung 19B).
A B
10. Ergebnisse
95
In weiteren Experimenten wurde die Methylierbarkeit von tRNAs aus den genannten
Überexpressionsstämmen mit His6-DnmA und His6-hDnmt2 aus E. coli untersucht. Gesamt-RNA
aus DnmA-GFP überexprimierenden Zellen wurde reproduzierbar durch rekombinante His6-
DnmA kaum in vitro methyliert (Abbildung 20A). RNA aus dem DnmA-Überexprimierer mit
StrepII-tag wurde ebenfalls wie RNA aus Wildtyp Zellen manchmal stark und manchmal nur
sehr schwach methyliert. Eine Northern-Blot Analyse zur Bestimmung der dnmA mRNA-Menge
in den beiden Überexprimierern, um damit indirekt auf den Proteingehalt und die damit
verbundene Aktivität schließen zu können, zeigte keine gravierende Unterschiede der
Expression (Abbildung 20B).
Abbildung 20: In vitro Methylierung von RNA aus DnmA-GFP (2) und DnmA-StrepII (1) Überexpressionsstämmen (A). Northern-Blot zum Nachweis von DnmA in verschiedenen Dictyostelium Stämmen (B). Die Expression von DnmA im Wildtyp ist so gering, dass sie unter der Detektionsgrenze des Northern Blots liegt.
Abbildung 19: In vitro Methylierung mit isolierter DnmA-GFP und DnmA-StrepII aus Überexpressionsstämmen. DnmA-GFP wurde mit Hilfe der GFP-Nanotrap angereichert und an die Beads gekoppelt in den Methylierungs-assay eingesetzt. Trotz Immobilisierung ist das Enzym ebenfalls methylierungsaktiv (A). Methylierungsassay von DnmA-StrepII mit und ohne vorherige Behandlung des Proteins mit CIAP (B). Für die Assays wurde aus Gesamt RNA angereicherte kleine RNA aus dnmAKO-Zellen verwendet. .
A B
A B
10. Ergebnisse
96
Auffällig ist jedoch, dass His6-hDnmt2 die RNA aus beiden DnmA-Überexprimierern
reproduzierbar methyliert (Abbildung 20A). Wie später gezeigt werden konnte, ist die Präferenz
für in vitro Methylierung von tRNAAsp von DnmA stärker ausgeprägt als bei hDnmt2. Vermutlich
kommt bei hDnmt2 die grundsätzlich stärkere Methylierungsaktivität auf anderen Substraten
(wie z.B. tRNAGlu) bei der Methylierung der RNA aus DnmA-Überexprimieren zum Tragen.
Aus den erhobenen Daten lässt sich schlussfolgern, dass DnmA Aktivität in vivo von
möglicherweise schwer kontrollierbaren Umwelt- oder Wachstumsbedingungen, die bisher
nicht identifiziert werden konnten, abhängig ist (siehe auch Kapitel 11.1.3 der Diskussion).
10.1.3. Identifizierung von potentiellen tRNA-Substraten aus Dictyostelium
Aus den bisher vorgestellten Experimenten ergibt sich die Frage, welche tRNAs aus
Dictyostelium von Dnmt2-Homologen methyliert werden. Einer Hypothese zu Folge modifiziert
hDnmt2 die Position C38 einer tRNA, wenn an den Positionen 32, 37 und 40 die Nukleotide
Cytosin, Adenosin und wieder Cytosin zu finden sind (unveröffentlichte Daten, M. Helm,
Johannes-Gutenberg-Universität Mainz) (Abbildung 21).
Zur Identifizierung potentieller tRNA-Substrate aus Dictyostelium wurden die in der Dictybase
(http://dictybase.org/) annotierten tRNAs auf das vorgeschlagene Sequenzmuster untersucht
(Abbildung 22). Neben der tRNAAsp zeigt nur die tRNAGlu das vollständige Erkennungsmuster.
Auffällig hierbei ist das ausschließliche Vorkommen von 22 identischen tRNAAsp(GUC) Genen,
obwohl Aspartat auch durch die tRNAAsp(AUC) translatiert werden kann (Dieses Phänomen wird in
Kapitel 10.3.1 näher betrachtet). Bei der tRNAGlu zeigen alle 19 chromosomal kodierten
tRNAGlu(UUC) das Muster sowie eine der drei tRNAGlu(CUC).
Abbildung 21: Vorgeschlagenes Sequenz-muster zur Erkennung von Substrat-tRNA durch Dnmt2- Homologe. Die Methylierung findet an der Position C38 statt, wenn die tRNA die Nukleotide C32, A37 und C40 enthält.
10. Ergebnisse
97
Abbildung 22: Ausgewählte tRNAs aus Dictyostelium, die das vorgeschlagende Sequenzmuster zur Substraterkennung durch Dnmt2 vollständig oder teilweise enthalten. Dargestellt sind der Sequenzbereich des Anticodonloops sowie einige Nukleotide up- und downstream davon. Nukleotide des Sequenzmusters sind in Magenta, das Zielnukleotid C38 in Rot hervorgehoben. Das Anticodon ist durch Fettdruck markiert. Alle schwarz gedruckten tRNAs wurden in Methylierungsassays getestet.
10.1.4. tRNAAsp und tRNAGlu sind in vitro Substrate von Dnmt2-Homologen
Zur Überprüfung der Hypothese zur Substraterkennung aufgrund des postulierten
Sequenzmusters wurden die Gene der in Abbildung 22 aufgeführten tRNAs mittels rekursiver
PCR generiert, kloniert, in vitro transkribiert und auf eine Funktion als in vitro Substrat getestet.
Aufgrund identischer Sequenzen up- und downstream des Anticodons der beiden tRNAGlu wurde
ausschließlich die tRNAGlu(UUC) für Experimente verwendet.
tRNAAsp und tRNAGlu werden mit unterschiedlicher Effizienz methyliert
In vitro transkribierte tRNAAsp aus Dictyostelium dient ebenfalls als Substrat für DnmA und
hDnmt2 (Abbildung 23). Als optimale Magnesiumkonzentration für die Methylierung konnten
5 mM ermittelt werden. Eine Konzentration von 10 mM Mg2+-Ionen führen im Zeitraum von
60 min nahezu zu einem kompletten Verlust des radioaktiven Signals. Bei optimaler
Magnesiumkonzentration zeigen hDnmt2 und DnmA eine sehr ähnliche Kinetik hinsichtlich der
Methylierung der tRNAAsp. Die Umsetzung ist nach ca. 30 min abgeschlossen (Abbildung 23B und
Daten nicht gezeigt).
10. Ergebnisse
98
Abbildung 23: Timecourse der Methylierung von tRNAAsp. Die Methylierung ist sensitiv gegenüber der Magnesiumkonzentration (A). Methyliertes Produkt akkumuliert über einen Zeitraum von ca. 30 min, wobei DnmA und hDnmt2 ähnliche Kinetiken zeigen (A, B).
tRNAGlu(UUC) wird ebenfalls von beiden Dnmt2-Homologen modifiziert jedoch mit deutlich
geringerer Effizienz als tRNAAsp(GUC) (Abbildung 24A). Durch gerichtete Mutation des potentiellen
Zielnukleotids C38 zu A konnte dieses Cytosin als Target identifiziert werden. Ein antisense
Transkript der tRNAGlu(UUC) diente als zusätzliche Negativkontrolle (Abbildung 24B).
A B
Abbildung 24: In vitro Methylierung von Dictyostelium tRNAAsp(GUC), tRNAGlu(UUC) und suppressor tRNAGlu(CUA) durch DnmA und hDnmt2. Die Methylierungsreaktion wurde mit rekombinanten Dnmt2-Homologen sowie in vitro transkribierter tRNA durchgeführt. Das Zielnukleotid für die Methyltransferasen ist das C38 im Anticodonloop (A). Antisense (as) trans-kribierte tRNAGlu dient nicht als Substrat für DnmA und hDnmt2 (B).
A
B
10. Ergebnisse
99
Um den Einfluss des Anticodons auf die Substraterkennung durch Dnmt2 zu untersuchen, wurde
zusätzlich die synthetisch hergestellte suppressor tRNAGlu(CUA) verwendet (Dingermann et al.
1990). Abbildung 24A (links) lässt eine unterschiedliche Präferenz von hDnmt2 und DnmA
bezüglich der Methylierung von tRNAGlu und suppressor tRNAGlu vermuten, was in
Folgeexperimenten jedoch nicht bestätigt werden konnte (rechts). Möglicherweise spielt hierbei
jedoch auch die größere Instabilität der tRNAGlu(UUC)-Transkripte eine Rolle (siehe EtBr-Färbung
Abbildung 24 rechts).
Ein Timecourse mit der suppressor tRNAGlu(CUA) zeigt, dass das methylierte Produkt mindestens
über einen Zeitraum von zwei Stunden akkumuliert und damit deutlich langsamer abläuft als
mit der tRNAAsp (Abbildung 25A). Auch hier konnte die optimale Magnesiumkonzentration von
5mM bestätigt werden (Abbildung 25B).
Abbildung 25: In vitro Methylierung der suppressor tRNAGlu(CUA) mit DnmA und hDnmt2. Radioaktives Produkt akkumuliert über einen Zeitraum von mindestens zwei Stunden (A). Ebenso wie für die tRNAAsp liegt die optimale Mg2+-Konzentration bei 5 mM (90 min Inkubationszeit) (B).
Alle getesteten tRNAs ohne vollständiges Erkennungsmuster sind keine DnmA-Substrate
Alle getesteten tRNAs, die zwar ein C38, aber das vorgeschlagene Erkennungsmuster im
Gegensatz zur tRNAAsp und tRNAGlu nicht oder nur unvollständig enthalten, konnten weder durch
DnmA noch durch hDnmt2 effizient methyliert werden (Abbildung 26).
A B
10. Ergebnisse
100
Abbildung 26: In vitro Methylierungsassay mit Dictyostelium tRNAs, die C38, aber das vorgeschlagene Sequenzmuster für die Substraterkennung durch Dnmt2 nicht oder nur unvollständig zeigen. Bei keiner dieser tRNAs konnte - auch nach langer Expositionszeit (Daten nicht gezeigt) – Inkorporation von Radioaktivität nachgewiesen werden. Die Mehylierungsreaktion wurde mit rekombinanten Dnmt2-Homologen sowie in vitro transkribierter tRNA durchgeführt. Positivkontrolle: tRNAAsp(GUC), Negativkontrolle: tRNAPhe(GAA).
Dnmt2 vermittelte Methylierung benötigt keine prozessierten Enden der tRNAs
Alle in dieser Arbeit getesteten in vitro transkribierten tRNAs zeichnen sich durch ein GGG oder
GCG am 5´ Ende als Startpunkt für T7 Polymerase aus und sind am 3´ Ende aufgrund der
klonierten Restriktionsschnittstellen zur Linearisierung der Plasmide um zwei bis fünf
Nukleotide länger. Weder das Tragen einer Aminosäure noch das Vorhandensein des CCA-
Trinukleotids scheinen für die Substraterkennung durch DnmA essentiell. Wie aus vorherigen
Experimenten bekannt, sind ebenso andere Modifikationen keine Voraussetzung für C38
Methylierung (Jurkowski et al. 2008). Für rasterkraftmikroskopische Bindungsstudien wurden
die tRNA Substrate in ein gus-PSTVd Konstrukt kloniert, in dem die tRNA in ein langes, teilweise
doppelsträngiges Transkript eingebettet ist (Bonin et al. 2001; Schöne 2009) (Abbildung 27A).
Methylierungsstudien mit diesen Transkripten zeigten, dass die tRNAs auch in diesem Kontext
methyliert werden können. Eine Dnmt2 vermittelte Methylierung von tRNA Präkursoren wäre
damit vorstellbar.
A B
Abbildung 27: In vitro Methylierung der GUS-PSTVd tRNAGlu(CUA) mit His6-DnmA und His6-hDnmt2. Schematische Zeichnung der gefalteten gus-PSTVd RNA (gus (β-Glucuronidase) blau, PSTVd (potato spindle tuber
viroid), grün) mit integrierter tRNA (rot) (A) (Entnommen aus Anspach 2009). Nur gus-PSTVd mit in sense Orientierung integrierter tRNA dient als in vitro Substrat der Methyltransferasen (B). 1: gus-PSTVd RNA, 2: gus-PSTVd tRNAGlu(CUA) sense, 3: gus-PSTVd tRNAGlu(CUA) antisense. Die Transkripte wurden von A. Schöne zur Verfügung gestellt.
10. Ergebnisse
101
10.1.5. RNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen
Nachdem in vitro transkribierte tRNAAsp und tRNAGlu als Substrate für DnmA und hDnmt2
identifiziert wurden, stellt sich die Frage, ob auch beide tRNAs in Gesamt-RNA methyliert
werden.
Um dies zu untersuchen wurde ein Experiment entwickelt, bei dem die RNA nach der in vitro
Methylierungsreaktion mit einem anti-tRNAAsp-Oligonukleotid hybridisiert und in einem nativen
Polyacrylamidgel aufgetrennt wurde (Abbildung 28). Das Oligonukleotid wurde im Überschuss
eingesetzt, so dass alle tRNAAsp Moleküle als RNA-DNA-Hybrid vorliegen und im Gel verminderte
Mobilität zeigen sollten.
Abbildung 28: Prinzip des 3H-Shift-Assays. Blau und gün: verschiedene tRNAs, rot: anti-tRNA-Oligonukleotid, gelb: radioaktive CH3-Gruppe.
Dieses Gelretardierungsexperiment führte zum vollständigen Shift des radioaktiven Signals in
den Spuren, bei denen die RNA zuvor durch DnmA methyliert wurde (Abbildung 29). In der Spur
des Methylierungsassays mit hDnmt2 verblieb jedoch ein deutliches Signal mit höherer
Mobilität. Nach zweiwöchiger Expositionszeit konnte in den Spuren mit DnmA ebenfalls ein
verbleibendes Signal mit erhöhter Mobilität detektiert werden (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 29: Fluorogramm eines in vitro Shift-Assays mit angereicherter kleiner RNA aus dnmAKO-Zellen und rekombinanter DnmA und hDnmt2. Die RNA wurde nach der 3H-Methylierungsreaktion mit einem anti-tRNAAsp Oligonukleotid hybridisert. Exposition: 16h
10. Ergebnisse
102
Um herauszufinden, ob das verbleibende Signal von einer Methylierung der tRNAGlu verursacht
wurde, wurde ein weiteres Experiment entwickelt. Dazu wurde angereicherte kleine RNA
einmal zuerst mit einem anti-tRNAAsp-Oligonukleotid und ein zweites Mal zusätzlich mit einem
anti-tRNAGlu-Oligonukleotid hybridisiert. Die Oligonukleotide überdeckten den gesamten
Bereich des Anticodonstem- und loops und sollten damit die tRNA für Dnmt2 unzugänglich
machen (Abbildung 30). Ziel war es, auf diese Weise schwache Methylierung potentieller
weiterer Substrate sichtbar zu machen.
Abbildung 30: Prinzip des 3H-Blocking-Assays. Blau und grün: verschiedene tRNAs, rot: anti-tRNA-Oligo-ukleotid, gelb: radioaktive CH3-Gruppe.
Die Methylierung in vitro transkribierter tRNAAsp wurde durch vorherige Hybridisierung mit
einem anti-tRNAAsp-Oligonukleotid, welches das Zielnukleotid überdeckt, vollständig blockiert
(Abbildung 31A).
Abbildung 31: In vitro 3H-Blockierungsassay mit His6-DnmA und His6-hDnmt2. Durch vorherige Hybridisierung mit einem anti-tRNAAsp Oligonukleotid kann die 3H-Methylierung eines in vitro Transkriptes der tRNAAsp vollständig blockiert werden (A). Blockierung von angereicherter kleiner RNA mit einem anti-tRNAAsp oder einem anti-tRNAAsp und anti-RNAGlu Oligonukleotid führt nicht zum vollständigen Verlust der Methylierungssignals (B).
A B
10. Ergebnisse
103
Im Gegensatz dazu konnte die in vitro Methylierung der tRNA-Fraktion angereicherter kleiner
RNA aus Dictyostelium durch Zugabe des anti-tRNAAsp-Oligonukleotids nicht vollständig
blockiert werden. Von den verbleibenden zwei Banden konnte jedoch die untere durch
vorherige zusätzliche Hybridisierung mit einem anti-tRNAGlu-Oligonukleotid eliminiert werden
(Abbildung 31B). Interessanterweise verblieb eine weitere radioaktive Bande, welche einen
Hinweis darauf lieferte, dass Dnmt2 möglicherweise noch weitere Substrate methyliert. Bei der
verbleibenden Bande kann es sich nicht um die zweite tRNAGlu mit CUC-Anticodon handeln, da
sich die verschiedenen tRNAGlu kaum voneinander unterscheiden und die wenigen
Fehlpaarungen die Hybridisierung des Oligonukleotids nicht beeinträchtigen sollten (Abbildung
32).
Abbildung 32: Alignments der tRNAGlu(UUC) und tRNAGlu(CUC) aus Dictyostelium. Identische Nukleotide in allen drei tRNAs sind in Rot, identische Nukloetide in zwei tRNAs blau und abweichende Nukleotide in Grün dargestellt. Das Anticodon ist schwarz.
10.1.6. Der in vivo Methylierungsstatus ausgewählter tRNAs in Dictyostelium
Mittels RNA-Bisulfitsequenzierung (Schaefer et al. 2009c) wurde in Kooperation mit Robin
Lorenz und Matthias Schäfer (Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg) der in vivo Methylierungsstatus der
tRNAAsp(GUC), tRNAGlu(UUC/CUC) und tRNAVal(AAC) aus Dictyostelium Wildtyp-, verschiedenen dnmAKO-
und DnmA-Überexpressionsstämmen bestimmt. 30% der tRNAAsp Sequenzen aus Wildtypzellen
zeigten eine Methylierung der Position 38, die in den beiden analysierten dnmA-Knockout-
Mutanten nicht detektierbar war (Abbildung 33). Alle tRNAs waren unabhängig von DnmA an
der Position C48 methyliert. Aus S. cerevisae ist bekannt, dass diese Position von TRM4
methyliert wird (Motorin et al. 1999). Eine Hitzeschockbehandlung der Dictyostelium Zellen bei
30°C über einen Zeitraum von zwei Stunden scheint keinen Einfluss auf DnmA abhängige C38
Methylierung zu haben (Abbildung 33).
10. Ergebnisse
104
Abbildung 33: In vivo Methylierungsstatus der Cytosine in tRNAAsp(GUC) aus verschiedenen Dictyostelium Stämmen. Ergebnisse der RNA-Bisulfitsequenzierung (454-Seqeuencing) sind in Prozent für die einzelnen Cytosin-Positionen angegeben. Die Zahl der Sequenzierungen ist in Klammern in der jeweiligen Überschrift des Diagramms angegeben. Die Daten wurden freundlicherweise von Robin Lorenz zur Verfügung gestellt.
10. Ergebnisse
105
Überexpression von DnmA-GFP im dnmAKO-Hintergrund führt zu einer 100%igen Methylierung
des C38 in der tRNAAsp. Allerdings ist die Methylierung aller Cytosine in dieser tRNA erhöht.
Überexpression humaner Dnmt2 in Dictyostelium Wildtyp-Zellen führt einem Anstieg der C38
Methylierung auf ca. 50%. Möglicherweise liegt dies an der unterschiedlichen Lokalisation von
DnmA-GFP und hDnmt2-GFP begründet (siehe Kapitel 10.7.1). Eine unvollständige Konversion
der Cytidine zu Uridinen bei der Bisulfitbehandlung der RNA aus dem DnmA-
GFP/dnmAKO-Stamm kann jedoch ebenfalls nicht ausgeschlossen werden. Die Zunahme der
Methylierung in dem hDnmt2-Überexpressionsstamm gibt jedoch erstmals einen Hinweis auf
speziesübergreifende Dnmt2 Aktivität. In tRNAGlu und tRNAVal konnte keine DnmA abhängige
Cytosinmethylierung detektiert werden. tRNAGlu zeigte lediglich 100% Methylierung der Position
C49 und 10-50% Methylierung der Position 60 (Daten nicht gezeigt). Da die verwendete
Methode möglicherweise auf unmodifizierte tRNAs selektiert, kann dies nicht als eindeutiger
Hinweis für Nicht-Methylierung der tRNAGlu in vivo gedeutet werden.
10.1.7. Das Dnmt2-Homolog Pmt1 aus S. pombe ist eine aktive tRNA Methyltransferase
S. pombe gehört wie D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica zu den „Dnmt2-only“-
Organismen. Das Dnmt2-Homolog von S. pombe Pmt1 beinhaltet im Gegensatz zu anderen
Dnmt2-Homologen jedoch in dem konservierten katalytischen Motiv IV eine Mutation, bei der
ein Prolin gegen ein Serin ausgetauscht ist (PPCQ zu PSCQ). Bisher wurde davon ausgegangen,
dass Methyltransferasen durch diese Mutation inaktiviert werden. Diese Vermutung steht im
Einklang mit der fehlenden DNA Methylierung in S. pombe (Wilkinson et al. 1995) sowie der
Beobachtung, dass durch Deletion des Serincodons DNA Methylierungsaktivität in vitro (wieder)
hergestellt werden kann (Pinarbasi et al. 1996). In Zusammenarbeit mit M. Becker (Abt.
Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen) konnte erstmals gezeigt werden, dass Pmt1
trotz der Mutation im Motiv IV als tRNA Methyltransferase aktiv ist und die tRNAAsp aus
Dictyostelium an der Position C38 methylieren kann (Abbildung 34).
Abbildung 34: In vitro Methylierung von in vitro transkribierter tRNAAsp(GUC) aus Dictyostelium durch rekombinante Pmt1, DnmA und hDnmt2. Wie DnmA und hDnmt2 methyliert Pmt1 die tRNAAsp an der Position C38. Exposition: 16h
10. Ergebnisse
106
10.2. Identifizierung neuer DnmA Substrate
Bei den 3H-Blockierungsexperimenten konnten neben einer Bande in der Größe einer tRNA nach
langer Expositionszeit auch schwache Banden, die einem höheren Molekulargewicht
entsprachen, detektiert werden (Daten nicht gezeigt). Aufgrund dieser Ergebnisse sowie später
hinzugekommenen Hinweisen aus anderen Arbeitsgruppen (Schaefer et al. 2010b), dass DnmA
vermutlich eine multisubstrat RNA Methyltransferase ist, wurde ein RNA-CLIP (Crosslink-RNA-
Immunopräzipitation) System etabliert um DnmA-RNA Interaktionen in vivo zu untersuchen
und neue RNA Substrate zu identifizieren (Abbildung 35). Die mit DnmA co-
immunopräzipitierte RNA wurde einer RNA Sequenzierung unterzogen um so potentielle neue
RNA Substrate der DnmA zu identifizieren. Geeignete Kandidaten wurden im Anschluss durch in
vitro Methylierung validiert.
Abbildung 35: Schematische Darstellung der Arbeitsabläufe zur Identifizierung neuer Dnmt2-Substrate mittels RNA-CLIP auf Basis der GFP-Nanotrap® und nachfolgender Next-Generation-Sequenzierung. Aufgrund der kurzen Barcode Sequenzen können in der abschließenden Analyse die Sequenzen aus den Fraktionen mit DnmA-GFP und der GFP-Kontrolle voneinander getrennt werden. Dem Experiment geht ein in vivo crosslinking (mit Formaldehyd oder durch UV-Strahlung) voraus (nicht dargestellt).
10.2.1. Etablierung eines RNA-CLIP Systems zur Analyse von DnmA-RNA
Interaktionen
Eine Tandem-Affinitätschromatographie mit N-TAP-DnmA, anschließender 32P-Endmarkierung
und denaturierender PAA-Gelelektrophorese der assoziierten RNAs zeigte keine Unterschiede
im Vergleich zur Negativkontrolle (nur N-TAP) (Daten nicht gezeigt). Eine deutlich kürzere und
sehr effiziente Methode für Immunopräzipitationen ist die GFP-Nanotrap (Rothbauer et al.
2008), bei der in vivo Crosslinking sowie Reinigung unter denaturierenden Bedingungen genutzt
werden kann. Zusätzliche Optimierung der radioaktiven Endmarkierungsreaktion durch CIAP
Behandlung sowie Hitzedenaturierung der RNA Enden vor der PNK-Reaktion ermöglichte auch
das radioaktive Markieren von tRNA, die aufgrund ihres phospohrylierten rezessiven 5´-Endes
nur schwer zugänglich für die Kinase ist (Daten nicht gezeigt).
10. Ergebnisse
107
Ein RNA-CLIP-Experiment mit DnmA-GFP ergab eine Anreicherung von RNAs mit einer Größe
zwischen etwa 60 nt - 150 nt mit DnmA-GFP im Vergleich zur GFP-Kontrolle (Abbildung 36).
Verstärkt traten angereicherte RNAs mit einer Größe von ca. 75 – 85 nts auf und entsprechen
damit der Größe von tRNAs.
10.2.2. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit
FA-crosslinking und 454-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten RNAs Für die Identifikation neuer RNA-Substrate und RNA-Interaktionspartner wurde zunächst ein
RNA-CLIP Pilotexperiment mit Formaldehyd-crosslinking (Kapitel 9.3.4.2) durchgeführt und die
präzipitierte RNA mittels 454-Sequenzierung analysiert.
Das Experiment erfolgte mit DnmA-GFP/dnmAKO Zellen vergleichend zu nur GFP
exprimierenden Zellen im Widtyp-Hintergrund. Pro Probe wurden 20.000 Sequenzen analysiert.
Davon entsprachen jeweils ~ 19.000 Sequenzen denen von rRNAs (extrachromosomales rRNA
Palindrom) (Daten nicht gezeigt) und nur ~ 700 Sequenzen passten zu Sequenzen genomischer
DNA aus Dictyostelium. In die Auswertung wurden ausschließlich Sequenzen einbezogen, die
entweder mit ≥2:0 oder mindestens dreifach in der DnmA-GFP-Probe oder der GFP-Kontrolle
angereichert waren (Abbildung 37). Sequenzen mit gleicher Anzahl in beiden Proben wurden
nicht berücksichtigt. Überraschenderweise waren kaum tRNAs in den Sequenzen der 454-
Abbildung 36: Autoradiogramm von 32P-endmarkierter RNA verschiedener Fraktionen eines RNA-CLIP Experiment mit DnmA-GFP und GFP als Kontrolle. IN: Input, W: letzter Waschschritt, IP: immuno-präzipitierte RNA. In der IP mit DnmA-GFP sind angereicherte RNAs mit einem roten Pfeil markiert. Die radioaktiven Signale mit einer Größe von 10nt sind nicht mit RNAseA verdaubar, so dass es sich hierbei möglicherweise nicht um RNA handelt. Decade marker (Ambion), Größen in nt. Exposition: 16h
10. Ergebnisse
108
Sequenzierung zu finden. Troubleshooting Experimente deuteten daraufhin, dass bei der cDNA
Synthese die Reverse Transkriptase die tRNAs entweder aufgrund der starken Faltung und
Modifikationen oder aufgrund unzureichenden Crosslink Reversal schlecht transkribiert (Daten
nicht gezeigt). Bei dem Folgeexperiment mit UV-crosslinking trat dieses Problem jedoch nicht auf
(Kapitel 10.2.4). Für die Anreicherung der tRNAGly in der GFP-Kontrolle gibt es bisher keine
Erklärung.
Abbildung 37: Ergebnisse der 454 Sequenzierung von mit DnmA-GFP angreicherter RNA. Dargestellt ist die absolute Anzahl an Sequenzen, die Treffer auf genomische DNA (nach http://dictybase.org/) ergeben haben und die entweder mit ≥2:0 oder mindestens dreifach in der DnmA-GFP Probe oder der GFP-Kontrolle angereichert waren. Die ncRNAs, die für nachfolgende in vitro Methylierungsexperimente eingesetzt wurden, sind mit einem schwarzen Pfeil markiert.
10. Ergebnisse
109
Mittels Northern-Blot konnte die Existenz der tRNAAsp in der Elutionsfraktion jedoch
nachgewiesen werden (Abbildung 38).
Interessanterweise wurden viele snoRNAs und U-snRNAs sowie intergenische Sequenzen als
angereicherte RNA-Spezies in der DnmA-GFP Probe identifiziert. Erste Validierungsexperimente
bestätigten die Expression ausgewählter ncRNA-Transkripte der intergenischen Bereiche in
vegetativen Dictyostelium Zellen (Abbildung 39).
Weitergehende bioinformatische Analyse der intergenischen Sequenzen zeigte, dass einige von
diesen die für snoRNAs charakteristischen 5´-CUGA-3´ Motive beinhalten. Möglicherweise
handelt es sich bei diesen Sequenzen um nicht annotierte snoRNAs oder soRNA-ähnliche RNAs.
Es ist jedoch anzumerken, dass DnmA-GFP nukleär lokalisiert und die mit diesem Protein
angereicherten RNAs (U-snRNAs, snoRNAs) überwiegend kernlokalisiert sind. Im Gegensatz
Abbildung 39: Primer extension zur Überprüfung der Existenz ausgewählter intergenischer Transkripte aus Abbildung 37. Die snoRNA sno7 wurde als Positivkontrolle verwendet.
Abbildung 38: Northern-Blot mit anti-tRNAAsp Sonde verschiedener Fraktionen des RNA-CLIP Experiment mit FA-crosslinking. Die verwendeten Bait-Proteine in der Co-IP waren DnmA-GFP und GFP als Kontrolle. IN: Input (0,03%), W: letzter Waschschritt (83%), IP: immunopräzipitierte RNA (83%). Die Kontrollhybridisierung mit einer anti-5.8S rRNA-Sonde gibt einen Hinweis auf möglicherweise unspezifische Anreicherung von RNA mit DnmA-GFP bei der verwendeten Methode.
10. Ergebnisse
110
dazu sind die scRNAs (small cytoplasmic RNA) und SRP-RNAs (signal recognition particle RNA),
die vor allem mit dem ubiquitär vorkommenden GFP assoziiert sind, cytoplasmatisch lokalisiert,
so dass die Anreicherung möglicherweise auch aufgrund der Lokalisation des Bait-Proteins
beruht. Bei dem Folgeexperiment mit UV-crosslinking (Kapitel 10.2.4) wurde dieses Phänomen
jedoch nicht beobachtet. Beispielsweise wurden SRP-RNAs bei diesem Experiment
gleichermaßen in der DnmA-GFP und GFP Probe gefunden (Daten nicht gezeigt).
Für weitere Analysen wurden die in Abbildung 37 mit einem Pfeil markierten RNAs ausgewählt
(Kapitel 10.2.3).
10.2.3. Dictyostelium U2-snRNA kann in vitro von Dnmt2-Homologen methyliert
werden Die ausgewählten RNAs (Abbildung 37) wurden kloniert, in vitro transkribiert und im
Methylierungsassay mit rekombinant hergestellter His6-DnmA und His6-hDnmt2 getestet. Da die
Gene rnu2a und rnu2b identische Transkripte ergeben und im Rahmen dieser Studie nicht
unterschieden werden können, wird im Folgenden die Bezeichnung rnu2a/b verwendet. Im
Gegensatz zu snoRNA 7 (sno7) und den intergenischen ncRNAs R69 und R24 kann die U2-
snRNA (rnu2a/b) von His6-DnmA und His6-hDnmt2 sehr schwach methyliert werden (Abbildung
40A).
Abbildung 40: In vitro Methylierungsassay zur Validierung der mittels RNA-CLIP identifizierten potentiellen DnmA Substrate. U2-snRNA (rnu-2a/b) wird im Gegensatz zu snoRNA 7 (sno7) und den intergenischen ncRNAs R69 und R24 von His6-DnmA und His6-hDnmt2 schwach methyliert (A). Mutationen der Cytosine an den Positionen 73 und 155 führen nicht zum Verlust des Methylierungssignals. U4-snRNA dient ebenfalls nicht als Dnmt2-Substrat (B).
Im Vergleich zu den genannten RNAs zeigt die U2-snRNA das für die Substraterkennung durch
Dnmt2-Homologe vorgeschlagene Sequenzmuster zweimal (Abbildung 41). Einzelmutationen
der beiden potentiellen Zielcytosine führten in weiteren Experimenten nicht zum Verlust des
Methylierungssignals (Abbildung 40B). Möglicherweise werden beide Cytosine parallel
A B
10. Ergebnisse
111
methyliert oder ein anderes Cytosin dient als Targetnukleotid. Sollte es sich um eine
Methylierung aufgrund einer Kontamination in den Proteinpräparationen (aus E. coli) handeln,
wäre diese spezifisch für die U2-snRNA aus Dictyostelium.
Abbildung 41: Sequenz- und Strukturdarstellung der U2-snRNA (rnu2a) aus Dictyostelium. Die bei tRNAs identifizierte Erkennungssequenz für Dnmt2-Substrate ist rot gekennzeichnet. Potentielle Zielcytosine sind mit einem Pfeil markiert (modifiziert nach Hinas et al. 2006).
Die ebenfalls im RNA-CLIP Experiment angereicherte U4-snRNA (rnu4a) zeigt ebenfalls einmal
das Erkennungsmuster (Abbildung 42), dient in vitro jedoch nicht als Substrat (Abbildung 40B).
In einem ersten Versuch konnte die humane U2-snRNA (rnu2-1) ebenfalls nicht in vitro
methyliert werden (Abbildung 42 und Daten nicht gezeigt).
Abbildung 42: Sequenzen der U4- und U2-snRNA aus D. discoideum sowie der U2-snRNA aus H. sapiens. Das potentielle Erkennungsmuster für Dnmt2-Substrate ist in Grün, das jeweilige potentielle Zielcytosin in Rot dargestellt.
Die Bestimmung des in vivo Methylierungsstatus der jeweiligen Regionen um die potentiellen
Zielnukleotide (C73 und C155) der U2-snRNA aus Dictyostelium ergab keine Methylierung der
untersuchten Cytosine (in Zusammenarbeit mit R. Lorenz, Daten nicht gezeigt). Zusätzliche
10. Ergebnisse
112
Northern-Blot Analysen mit Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zeigten keinen Einfluss auf die
Expression oder Stabilität der U2-snRNA (rnu2a/b) durch DnmA (Daten nicht gezeigt).
10.2.4. Ermittlung von RNA-Substratkandidaten mittels RNA-CLIP mit UV-
crosslinking und Illumina®-RNA-Sequenzierung von DnmA assoziierten
RNAs
Für einen zweiten Deep Sequencing-Ansatz wurde die RNA-CLIP-Methode auf UV-crosslinking
umgestellt und die RNA Sequenzierung mittels der Illumina®-Technologie durchgeführt.
Insgesamt wurden pro Probe ca. 5,5 Mio. Sequenzen erhoben (DnmA-GFP: 5 674 433/GFP:
5 540 257), von denen bei der Probe DnmA-GFP 1 249 579 Sequenzen und bei der GFP-
Kontrolle 514 809 Sequenzen dem Dictyostelium-Genom zugeordnet werden konnten (Tabelle
18).
Tabelle 18: Verteilung der Sequenzen aus der Illumina®-RNA-Sequenzierung auf das Dictyostelium-Genom. Das Auftreten von Dezimalzahlen ergibt sich aus der Verteilung der Reads auf das Genom. Kommt eine Sequenz bspw. dreimal im Genom vor, wird diese bei der verwendeten Methode nur jeweils mit 1/3 berücksichtigt.
Genom DnmA-GFP GFP
Chromosom 1 234 812,528 188 940,19
Chromosom 2 335123,756 59532,592
Chromosom 3 1377559,425 73855,775
Chromosom 4 396655,465 126256,981
Chromosom 5 79813,519 371714,427
Chromosom 6 58719,625 23944,371
Mt-DNA 2,0 2,36
rDNA 6892,688 5093,298
∑Rohdaten 1 249 579 514 809
Für die Auswertung wurden die Rohdaten normalisiert (Kapitel 9.3.5 und Anhang) um die
Unterschiede in der Häufigkeit der Rohsequenzen zwischen DnmA-GFP und GFP auszugleichen
und jeweils die Sequenzen ausgewertet, die mit dem Bait-Protein DnmA-GFP angereichert
waren.
tRNA und tRNA-Fragmente
In den erhobenen Daten fallen tRNA-Fragmente mit einer Länge von ca. 20 – 24 nt auf, die im
Bereich des Anticoconloops beginnen und bis in den T-loop der tRNA hineinreichen („mid“-
Fragment) (Abbildung 43A-D). Besonders hebt sich hier die tRNAAsp(GUC) hervor. Ebenfalls stark
10. Ergebnisse
113
angereichert in der DnmA-GFP Probe sind „mid“-Fragmente der tRNAGlu(UUC), tRNAGlu(CUC) und
tRNAGly(GCC) (Abbildung 43A). Bei der tRNAPro(UGG), tRNALys(UUU-3) und tRNAGln(UUG-2) ist dieser Effekt
weit weniger ausgeprägt (Abbildung 43B/C links). Interessanterweise wurden in der
Sequenzierung bei den genannten tRNAs (außer der tRNALys(UUU-3)) und zusätzlich bei der
tRNAVal(UAC) antisense tRNA-Fragemente (as-Fragmente) detektiert, die meist nur mit einer
Häufigkeit von ca. 15-20 Sequenzen in der DnmA-GFP Fraktion, aber nie in der GFP-Kontrolle
auftraten (Abbildung 43A/B). Eine Ausnahme bilden die as-Fragmente der tRNAGlu(UUC), die mit
einer Häufigkeit von ca. 250 Sequenzen beobachtet wurden. Die as-Fragmente sind ca. 17 – 18nt
groß und meist zu den „mid“-Fragmenten komplementär, jedoch an jedem Ende jeweils um
einige Nukleotide kürzer (Abbildung 43E und Tabelle 19). Die einheitliche Länge und Position
dieser Transkripte schließen ein Zufallsartefakt weitgehend aus.
Tabelle 19: Übersicht über Länge und Position der sense und antisense tRNA-Fragmente.
* Reale Längen der Fragmente können um wenige Nukleotide von den angegebenen Längen abweichen.
Von den tRNAs Cystein und Threonin (tRNACys(GCA), tRNAThr(UGU)) wurde in der Sequenzierung
eine leichte Anreicherung eines 17nt langen Fragments des 5´-Endes festgestellt. Auffällig ist
zusätzlich noch die tRNAAla(AGC), von der ein Fragment des 3´-Endes (20nt) mit DnmA-GFP
Fragmente
Sense Antisense
„mid“ 5´- Ende 3´- Ende „mid“ tRNA
Länge [nt]*
Position Länge [nt]*
Position Länge [nt]*
Position Länge [nt]*
Position
Asp(GUC) 20 36 – 55 - - - - 18 53 - 36
Glu(UUC) 24 32 – 55 - - - - 18 53 - 36
Glu(CUC) 21 36 -55 - - - - 18 53 - 36
Gly(GCC) 23 33 – 55 - - - - 21 53 - 33
Gly(GCC) - - - - 42 30 - 71 21 53 - 33
Pro(UGG-4) 24 28 – 50 - - - - 19 51 - 33
Pro(UGG-2) - - - - 42 30 - 71 18 53 - 36
Gln(UUG-2) 24 33 – 56 - - - - 18 53 – 36
Gln(UUG-8) - - - - 43 32-72 19 53 - 35
Lys(UUU-3) 22 34 – 55 - - - - - -
Ala(AGC) - - - - 20 54 - 73 - -
Cys(GCA) - - 17 1-17 - - - -
Thr(UGU) - - 17 1- 17 - - - -
Phe(GAA) - - - - 20 54-74 - -
Lys(UUU-8) - - - - 43 31-73 - -
10. Ergebnisse
114
assoziiert (Abbildung 43C). Dass tRNAs oder tRNA-Fragmente nicht grundsätzlich höhere
Affinität zu DnmA-GFP haben, zeigt die exemplarische Auswertung des +-Stranges von
Chromsom 1 auf Sequenzen, die in beiden Proben gleichmäßig vorkommen oder in der GFP-
Kontrolle angereichert sind (Abbildung 43D).
10. Ergebnisse
115
Abbildung 43: Ergebnisse des RNA-CLIP Experiment mit UV-crosslinking und anschließender Illumina®-Sequenzierung der RNA. Dargestellt sind tRNAs sowie sense und anstisense tRNA Fragmente, die spezifisch mit DnmA-GFP angereichert wurden (A-C), V/P – Volllänge tRNA oder Präkursor. „Mid“-Fragmente sind grün, 3´-Fragmente blau, 5´-Fragmente gelb und antisense Fragmente rot markiert. Zum Vergleich sind tRNAs dargestellt, die in beiden Proben gleich oder in GFP leicht angereichert vorkommen (D). Schematische Darstellung der „mid“-sense und antisense tRNA Fragmente (E).
10. Ergebnisse
116
Northern-Blot Analysen konnten die Existenz von tRNAAsp-Fragmenten in den
immunopräzipitierten RNA-Fraktionen bestätigen (Abbildung 44A). Jedoch fällt hier auf, dass
die Volllänge-tRNA deutlich stärker als z. B. die 20 nt Fragmente vertreten sind. Der Unterschied
zwischen Northern-Blot und Sequenzierung kann auf einer effizienteren reversen Transkription
der Fragmente beruhen. In einem ersten Experiment konnten außerdem as-Fragmente der
tRNAGlu in der DnmA-GFP-Fraktion nachgewiesen werden (Abbildung 44B).
snoRNA, U-snRNA, intergenische Sequenzen
Weitere RNAs oder RNA Fragmente wurden als angereichert betrachtet, wenn sie in der
DnmA-GFP Probe mindestens dreimal so häufig vorkamen wie in der GFP Kontrolle. Gezielte
Analyse der kleinen Kern-RNAs ergab, dass keine snoRNA dieses Kriterium erfüllte. Die U2-
snRNA kam im Gegensatz zum ersten Deep Sequencing-Ansatz in unregelmäßigen Fragmenten
vor und war ebenfalls nicht verstärkt mit DnmA assoziiert. Die U1-snRNA (rnu1b) zeigte jedoch
eine deutliche Anreicherung in der DnmA-GFP Probe im Vergleich zur GFP-Kontrolle (Abbildung
45).
Abbildung 44: Northern-Blot der mit DnmA-GFP und GFP immunopräzipitierten RNA. Mit einer anti-tRNAAsp Sonde, die sich von Position 3 – 48 nt der tRNA erstreckt, können die Volllänge-tRNA (72 nt) sowie vier Fragmente detektiert werden (A). Das bei 20 nt angereicherte Fragment könnte dem „mid“-Fragment aus der Sequenzierung entsprechen. Mit einem DNA-Oligonukleotid, welches extakt komplementär zum as-Fragment der tRNAGlu
ist, kann eine ca. 16nt große Bande detektiert werden (B). Aufgrund der starken Sequenzähnlichkeit zwischen tRNAGlu(UUC) und tRNAGlu(CUC) können Fragmente dieser tRNAs nicht differenziert werden. Mit Hilfe des ssRNA low range Markers wurde eine Eichgerade (y = 403,51e-0,3754x) erstellt, die zur Berechnung der Fragmentlängen herangezogen wurde.
A B
10. Ergebnisse
117
Abbildung 45: Ergebnisse der Illumina®-Sequenzierung für snoRNA und U-snRNA. Sequenzen, die in der DnmA-GFP Probe mindestens dreimal häufiger als in der GFP Kontrolle vorkamen, sind mit einem violetten Kreuz gekennzeichnet.
Weiterhin wurden noch einige intergenische Sequenzen detektiert, die das oben genannte
Kriterium erfüllen (Abbildung 46).
Abbildung 46: Ergebnisse der Illumina®-Sequenzierung für intergenische Sequenzen. Sequenzen, die in der DnmA-GFP Probe mindestens dreimal häufiger als in der GFP Kontrolle vorkamen, sind mit einem violetten Kreuz gekennzeichnet.
10. Ergebnisse
118
10.3. Einfluss der tRNAAsp-Methylierung durch DnmA auf die
Translationseffizienz
Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Erkennung der Codons und damit den
Translationsprozess beeinflussen können (Kapitel 6.1.2), wurde in dieser Arbeit ein System zur
Analyse der Translationseffizienz in Abhängigkeit des Dnmt2-Homologs DnmA aus Dictyostelium
entwickelt. Zunächst wurde dafür die Aspartat-Codon usage analysiert und im Anschluss ein auf
einem „Asp-leader“-Reportergen basierendes Translationssystem etabliert.
10.3.1. Aspartat-Codon usage in verschiedenen Organismen
Die Aminosäure Aspartat wird durch die Codons GAC und GAU kodiert. In Dictyostelium wird das
Codon GAC jedoch deutlich seltener benutzt (ca. Faktor 10) als das Codon GAU (Tabelle 20).
Allerdings ist nur eine tRNAAsp mit dem GUC Anticodon (komplementär zum GAC Codon) in der
Dictybase annotiert. Insgesamt gibt es 22 tRNAAsp(GUC)-Gene, die zu identischen Transkripten
führen.
Tabelle 20: tRNAAsp Codon usage in ausgewählten Organismen. Das häufiger genutzte Codon ist jeweils rot hervorgehoben.
tRNAAsp
Organismus Codon usage [%] GAC GAU
Anzahl der tRNAAsp-Gene GUC AUC
D. discoideum* 0.43 4.7 22 0
S. pombe 1.55 3.79 8 0
D. melanogaster 2.46 2.76 14 0
H. sapiens 2.51 2.18 19 0
M. musculus 2.6 2.1 16 0
D. rerio 2.78 2.48 150 1
B. taurus 2.82 2.05 48 6
A. thaliana 1.72 3.66 26 0
S. cerevisiae 2.03 3.81 16 0
C. elegans 1.71 3.58 27 0
Quelle: Genomic tRNA database (http://gtrnadb.ucsc.edu/GtRNAdb), *Codon bias table from
Dictybase (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=44689)
10. Ergebnisse
119
Die Codon usage der beiden „Dnmt2 only“-Organismen S. pombe und D. melanogaster sowie C.
elegans und S. cerevisiae, deren Genom für keine Dnmt kodiert, zeigt einen ähnlichen Trend, der
jedoch deutlich schwächer ausgeprägt ist. Eine untersuchte Auswahl an Organismen, die alle
drei DNA-Methyltransferasen beinhalten zeigen – mit Ausnahme von A. thaliana - hingegen eine
leichte Präferenz für das Codon GAU (Tabelle 20).
Mit wenigen Ausnahmen kodieren die Genome der untersuchten Spezies alle nur tRNAAsp-Gene
mit dem GUC Anticodon. Auch der Mensch kodiert nur für tRNAAsp mit GUC Anticodon, allerdings
gibt es hier zwei tRNAAsp Spezies. Der Großteil der Transkripte ist nahezu identisch, einige
wenige haben Punktmutationen im Akzeptorstamm. Sie zeigen jedoch alle das Nukleotidmuster
für die Substraterkennung durch Dnmt2. Zwei Transkripte fallen aus der Reihe, sie sind bis auf
wenige Punktmutationen im Akzeptorstamm identisch, aber beide haben die Punktmutation
C38U (Genomic tRNA database: http://gtrnadb.ucsc.edu/GtRNAdb).
C. elegans, C. briggsae und C. remanei haben etliche tRNAAsp(AUC) Pseudogene, für Bos taurus sind
sechs tRNAAsp(AUC) Gene annotiert. Vereinzelt findet man in wenigen Eukaryoten wie z. B. Pferd,
Hund, Katze, Reis, Zebrafisch tRNAAsp(AUC)-Gene. Interessanterweise zeigt keins der untersuchten
tRNAAsp(AUC)-Gene das vorgeschlagene Sequenzmuster für Methylierung durch Dnmt2,
wohingegen die meisten der tRNAAsp(GUC)-Gene die Nukleotidabfolge beinhalten. Goll et al. (2006)
beschrieben, dass Organismen mit Dnmt2 einen hochkonservierten Anticodonstamm und -loop
der tRNAAsp(GUC) zeigen, dem möglicherweise eine Koevolution zwischen Dnmt2 und der tRNAAsp
zu Grunde liegt. Ausnahmen bildeten S. cerevisiae und C. elegans, die keine Dnmt2 Homologe
haben.
Die Analyse der tRNA-Gene sowie der Codon usage wirft die Frage auf, inwiefern eine
Methylierung durch Dnmt2 für das „Wobbling“ der tRNAAsp(GUC) verantwortlich ist.
10.3.2. Das „Asp-leader“-Reportersystem
Um den Einfluss DnmA vermittelter tRNAAsp(GUC) Methylierung auf die Codonerkennung bei der
Translation zu untersuchen, wurde auf der Grundlage des Translationssystems von Nakamura et
al. (2007) ein „Asp-leader“-Reportersystem entwickelt (Abbildung 47).
Abbildung 47: Schematische Dar-stellung der Vektoren des „Asp-leader“-GFP-Reporter-systems.
10. Ergebnisse
120
Dazu wurde in den pDneo2a_GFP Vektor N-terminal ein „Asp-leader“ kloniert, der für die
Aminosäuresequenz MAKTDDDDDGS kodiert. Die vor der Asp-Sequenz vorgeschalteten vier AS
werden durch häufig genutzte Codons kodiert und sind für einen effizienten Start der
Translation notwendig. In Dictyostelium ist beispielsweise bekannt, dass die
Translationseffizienz zurückgeht, wenn überwiegend seltene Codons innerhalb der ersten zehn
AS verwendet werden (Vervoort et al. 2000). Für das System wurden zwei verschiedene Asp-
Leader verwendet, einmal ausschließlich mit dem Asp-Codon GAC und einmal mit GAU
(Abbildung 47), die beide jeweils mehrfach in Dictyostelium Wildtyp-Zellen und dnmAKO-
Mutanten transformiert wurden. Die Transformanten wurden nicht subkloniert, sondern als
Population verwendet. Eine Population wurde in die Analyse miteinbezogen, wenn nach der
Transformation mindestens zehn klonal gewachsene Transformanten auf der Petrischale zu
finden waren. Die Translationseffizienz wurde insgesamt definiert als:
Die Fluoreszenz lebender Zellen wurde dabei fluoreszenzspektrometrisch als
Doppelbestimmung erhoben und im Verhältnis zur Masse an Gesamtprotein einer Zelle
angegeben. Das Experessionlevel der gfp mRNA wurde mittels Real time-PCR und der ΔΔCt-
Methode relativ quantifiziert. Als Housekeeping-Gen diente das Gen cinD. Die
Translationseffizienz wird als dimensionslose Zahl angegeben.
10.3.3. DnmAKO-Mutanten zeigen leicht erhöhte Translationseffizienz
In Abbildung 48 sind die Translationseffizienzen (normalisiert auf die Population GFP/wt 1 = 1)
des „Asp-leader“-GFP-Reportergens in Wildtyp und dnmAKO-Zellen dargestellt. Durchschnittlich
ist die Translation des Reportergens in dnmAKO Zellen doppelt so effizient wie in Wildtyp-Zellen
unabhängig vom Asp-leader. Diese Beobachtung widerspricht der Hypothese, dass DnmA
abhängige tRNA Methylierung für effizientes Wobbling verantwortlich ist Der Asp(GAC)-Leader
wird hingegen gegenüber dem Asp(GAU)-Leader doppelt so gut translatiert. Aufgrund der Codon
usage in Dictyostelium wurde jedoch eine effizientere Translation des Asp(GAU)-leaders
erwartet.
Statistische Analyse mittels ungepaartem t-Test ergaben keine signifikanten Unterschiede
zwischen Wildtyp- und dnmAKO-Zellen sowie zwischen den beiden Asp-Leadern. Vergleicht man
nur die Populationen miteinander, die am gleichen Tag entstanden sind, ergibt sich ein P-value
10. Ergebnisse
121
von p= 0.0072 (**) (gepaarter t-Test). Zur besseren Übersicht wurden die gepaarten Daten
jeweils aus wt = 1 normalisiert (Abbildung 48 rechts).
Abbildung 48: Translationseffizienzen der „Asp-leader“-GFP-Reportergene in Wildtyp und dnmAKO Stämmen. Fehlerbalken: mean with range. n: unabhängige Populationen, #Zwei unabhängige Populationen und ein biologisches Replikat, gepaarter t-Test: p = 0.0072 (**).
10.3.4. DnmA ist nicht an der Transkriptionskontrolle des GFP-Reportergens
beteiligt
Bei detaillierter Analyse der für das Translationssystem erhobenen Daten fällt auf, dass die
Unterschiede zwischen den Wildtyp- und dnmAKO-Zellen in der Translationseffizienz vor allem
auf signifikant reduzierter Expression in den dnmAKO-Populationen beruht (Abbildung 49A
und B), d.h. trotz geringerer mRNA Mengen (Abbildung 49B) findet man etwa gleiche
Fluoreszenzintensität (Abbildung 49A).
Dieser starke Unterschied im Expressionslevel warf die Frage auf, inwiefern die deutlich
reduzierte Expression des Reportergens in dnmAKO-Zellen transkriptionsreguliert ist oder durch
eine geringere Anzahl an Integrationen des Transgens verursacht wird. Von sechs
Populationspaaren wurde mit qPCR auf gDNA die relative Anzahl der Integrationen bestimmt.
Abgesehen von einem Populationspaar spiegelt sich der Trend der Expressionsunterschiede in
der Anzahl der Integrationen wieder (Abbildung 49C), so dass eine Rolle von DnmA bei der
Transkriptionskontrolle des Transgens ausgeschlossen ist.
10. Ergebnisse
122
Abbildung 49: Vergleichende Darstellung der Fluoreszenz/Protein [µg] (A), der relativen Expression (B) und der relativen Anzahl an Integrationen (C) des „Asp-leader“-GFP-Reportergens. as relative Expressionslevel und die relative Anzahl an Integrationen sind einmal mit und einmal ohne die Population 1 dargestellt. Fehlerbalken: mean with range, n: unabhängige Populationen, gepaarter t-Test: p = 0.0028 bei n = 8 (**) und p = 0,0004 bei n = 7 (***) (B), (C) p = 0,002 bei n = 5 (**).
10.4. Untersuchung des Einflusses von DnmA auf die Aufnahme und Integration
von Fremd-DNA
Aus den Daten aus Kapitel 10.3.4 und der Durchführung vieler Transformationen von Plasmiden
in Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO-Zellen ergab sich die Vermutung, dass die Mutanten
möglicherweise weniger effizient transformierbar sind. Transformationen schlugen häufiger fehl
und die Entwicklung von Zellkolonien nahm meist mehr Zeit in Anspruch als bei Zellen mit
Wildtyp-Hintergrund. (Die Zahlen der Populationen des Translationssystems spiegeln diese
Vermutung nicht wieder, da hier mehrere Transformationen in Knockout-Zellen durchgeführt
wurden um sicherzustellen eine ausreichende Anzahl an Populationen zu erhalten.) Zusammen
mit der Beobachtung, dass die relative Anzahl der Integrationen eines GFP-Reportergens
(Kapitel 10.3.4) in dnmA-Knockouts geringer ist, ergibt die Frage, ob generell die DNA Aufnahme
in die dnmAKO-Zellen weniger effektiv ist oder ob ausschließlich die DNA Integration des
Transgens in das Genom inhibiert ist. Um diese Fragestellung zu untersuchen, wurden ein
extrachromosomales (pDbsrXP_gfp) und ein integrierendes Plasmid (pDneo2a_gfp) mehrfach in
den Wildtyp, dnmAKO-Zellen und als Kontrolle in Knockout-Zellen des Argonaut-Proteins B
(AgnB) transformiert. Die Anzahl sich entwickelnder Kolonien wurde über einen Zeitraum von
einigen Tagen bis einigen Wochen verfolgt. Da Dictyostelium Knockout-Stämme eine Blasticidin-
A B C
10. Ergebnisse
123
Resistenz (BSR) tragen, können sie nicht mit dem extrachromosomalen Plasmid transformiert
werden, da hier ebenfalls eine BS-Selektion notwenig wäre. Daher wurden zusätzlich dnmAKO-
und agnBKO-Zellen verwendet, denen die BSR-Kassette entfernt wurde (KO „rox“). Ein Stopcodon
in der kodierenden Sequenz erhält den Knockout-Status.
Entsprechend den vorherigen Beobachtungen ließ sich der dnmAKO-Stamm schlechter mit dem
integrierenden Plasmid transformieren als die AgnB Mutanten und der Wildtyp. Der dnmAKO-
„rox“-Stamm hingegen zeigte eine dem Wildtyp vergleichbare Transformationseffizienz
(Abbildung 50A). Bei Transformationen mit dem extrachromosomalen Plasmid blieb die Anzahl
resistenter Klone des dnmAKO „rox“-Stammes signifikant hinter dem AngBKO „rox“- und dem
Wildtyp-Stamm zurück (Abbildung 50B).
Abbildung 50: Transformationseffizienz verschiedener Dictyostelium Stämme mit dem integrierenden Plasmid pDneo2a_gfp (A) und dem extrachromosomalen Plasmid pDbsrXP_gfp (B). Fehlerbalken: Mean with
SEM; ungepaarter t-Test: p = 0,0448 (*) (A), p = 0,0072 (**) (wt/DnmAKO “rox”) und p = 0,0002 (***) (AgnBKO „rox“/ DnmAKO “rox”). Die AgnBKO-Zellen wurden freundlicherweise von B. Boesler zur Verfügung gestellt.
Die Daten geben einen Hinweis darauf, dass DnmA die Aufnahme eines extrachromosomalen
Plasmids inhibiert. Das unterschiedliche Verhalten der beiden untersuchten dnmAKO–Stämme
bezüglich der Aufnahme eines integrierenden Plasmids kann momentan nicht erklärt werden
(siehe auch Kapitel 11.4.3 der Diskussion).
A B
10. Ergebnisse
124
Abbildung 51: miRNA ähnlicher Präkursor der kleinen skipper RNAs. Für die Northern-Analysen wurde eine dem rotem Bereich komplementäre Sonde verwendet (entnommen aus Hinas et al. 2007).
10.5. Vertiefende Analyse zur Funktion von DnmA bei der Regulation des
Retrotransposons skipper
Dictyostelium galt lange Zeit als Organismus ohne DNA-Methylierung (Smith et al. 1991).
Unabhängig voneinander wiesen vor wenigen Jahren zwei Arbeitsgruppen schwache
asymmetrische m5C-Methylierung in Dictyostelium durch DnmA nach (Kuhlmann et al. 2005;
Katoh et al. 2006). Die Methylcytosine wurden im LTR des Retrotransposons DIRS-1 und im RT
Bereich des Retrotransposons skipper (Abbildung 53) lokalisiert. Northern-Blot Analysen
ergaben eine verstärkte Expression des Retrotransposons skipper (Volllänge-Transkript) in
dnmAKO– und langzeitkultvierten Wildtyp- und dnmAKO –Zellen, wobei der Effekt in letzteren am
stärksten ausgeprägt war (Kuhlmann et al. 2005). Das Retrotransposon DIRS-1 wird in den
genannten Zellen nicht erhöht exprimiert. Mittels quantitativer Southern-Blots (mit skipper RT
Sonde) konnte in dnmAKO-Zellen eine leichte Zunahme an skipper Integrationen (ca. 1,5)
detektiert werden, die in den langzeitkulitivierten dnmAKO-Zellen auf das ca. 1,7fache Anstieg
(Kuhlmann et al. 2005). Allerdings konnten die skipper Integrationen nicht im Genom lokalisiert
werden (Kuhlmann et al. 2005). Im Gegensatz zu skipper wurden für das Retrotransposon DIRS-
1 siRNAs nachgewiesen, die nahezu die gesamte Sequenz des Retrotransposons abdeckten.
Mittlerweile wurden auch für skipper acht miRNA
ähnliche kleine RNAs publiziert, die einer partiellen
skipper Kopie auf dem Chromosom 2 zuzuordnen
sind. Einige von ihnen könnten aber auch von
vollständigen skipper Kopien an anderen Stellen
des Genoms stammen (Hinas et al. 2007). Sechs der
acht kleinen RNAs entstehen aus einer Hairpin
ähnlichen Struktur, die einem miRNA Präkursor
ähnelt (Abbildung 51).
dnmAKO-Mutanten sowie langzeitkultivierte Zellen sollten auf das Vorkommen der kleinen RNAs
untersucht werden. Zusätzlich wurde überprüft, ob Überexpression von DnmA im Knockout-
Hintergrund die erhöhte Expression von skipper kompensieren kann.
10.5.1. Untersuchung kleiner RNAs des Retrotransposons skipper
Als Sonde für Northern-Blot Analysen auf kleine skipper RNA in verschiedenen dnmA-Mutanten
wurde ein Oligonukleotid verwendet, dass dem Loop des putativen miRNA Präkursors
komplementär ist (Abbildung 51).
Überraschenderweise konnte in allen untersuchten dnmA-Mutanten (Knockout- und
Überexpressionsstämmen) eine moderate Erhöhung der kleinen skipper RNAs festgestellt
10. Ergebnisse
125
werden (Abbildung 52). Eine erste Vermutung, dass sowohl Überschreiten als auch
Unterschreiten des endogenen DnmA Levels zur Hochregulation kleiner skipper RNAs führt,
konnte in Folgeexperimenten nicht belegt werden. Überexpression von ausschließlich GFP von
einem integrierenden high copy Plasmid verursachte ebenfalls diesen Effekt. GFP Expression von
einem extrachromosomalen Plasmid zeigte dagegen Wildtyplevel an kleinen skipper RNAs
(Abbildung 52A). Moderate Hochregulation der kleinen skipper RNA ist demnach kein DnmA
spezifischer Effekt. Dass jedoch nicht jede genetische Manipulation einer Zelle in Dictyostelium
den beschriebenen Effekt zeigt, bestätigen die Knockout-Mutanten von Argonaut A und B. Im
AgnBKO sind die kleinen RNAs ebenso wie im Wildtyp kaum zu detektieren, wohingegen der
AgnAKO eine starke Anreicherung kleiner RNAs zeigt
Argonaut A abhängige siRNAs des Retrotransposon DIRS-1 entsprachen in allen untersuchten
DnmA-Mutanten dem Wildtyp Niveau (Abbildung 52).
Abbildung 52: Northern-Blots zur Detektion kleiner RNAs der Retrotransposons DIRS-1 und skipper. Alle untersuchten DnmA Mutanten (Knockout und Überexpressionsstämme) sowie ein GFP-Überexpressionsstamm zeigen eine moderate Erhöhung kleiner skipper RNAs (A, B). Zum Vergleich ist RNA von Knockout-Mutanten der Argonauten A und B mit aufgetragen worden (B). SnoRNA 5 (sno5, 81 nt) dient als zusätzliche Ladekontrolle. Die Größe der kleinen RNAs wurde mit Hilfe des microRNA Markers (N2102S, NEB) auf 21 nt bestimmt. Expositionszeiten: Blot A/Blot B. Die RNA der Argonaut-Knockouts wurde von B. Boesler zur Verfügung gestellt.
10.5.2. Analyse der skipper Transkription in DnmA-Mutanten
Inwiefern die gleichzeitige Anreicherung von kleinen skipper RNAs und Volllängetranskripten
korrelieren, wurde mittels quantitativer Real-time PCR (relative Quantifizierung) der skipper-
Transkripte untersucht. Experimente mit gag und RT Primern (Abbildung 53) konnten die von
Kuhlmann et al. beschriebene erhöhte Transkription in dnmAKO und langzeitkultivierten
dnmAKO-Zellen bestätigen (Abbildung 54). In Langzeitkultur gewachsene Wildtyp-Zellen zeigten
A B
10. Ergebnisse
126
im Gegensatz zu den von Kuhlmann et al. verwendeten Zellen keine erhöhte skipper
Transkription (Abbildung 54). Die in dieser Arbeit analysierten Zellen waren 28 Monate
vegetativ in Schüttelkultur gewachsen und hatten nicht wie die in der ersten Studie genutzten
Zellen 16 Entwicklungszyklen durchlaufen (Kuhlmann et al. 2005).
Abbildung 53: Schematische Darstellung des Retrotransposons skipper (nach Genbank: F049230.1) sowie der in dieser Arbeit verwendeten Primerpaare. Skipper gehört zur Familie der gypsy/Ty3 Retrotransposons und zeigt den dafür typisch Aufbau von LTR-GAG-PRO-INT-LTR. LTR: long terminal
repeat, gag: group-specific antigen (Capsid/Nukleocapsid Domäne), pro: Protease, pol: kodiert für die Reverse Transkriptase (RT) und Integrase (IN). Gag und pro werden durch ein einziges Stop-Codon getrennt, pro wird von pol durch einen +1 Frameshift sowie einer Überschneidung des Leserahmens für elf AS separiert (Leng et al. 1998).
Überraschend zeigte der neu generierte dnmAKO“rox“ Stamm (V. Maximov, C. Joppich,
unveröffentlichte Daten) keine verstärkte skipper Transkription (Abbildung 54).
Abbildung 54: Bestimmung des skipper Expressionslevels mittels Real time-PCR in verschiedenen Dictyostelium Stämmen. LZ: Langzeitkultur (28 Monate). Fehlerbalken: Mean with range; gepaarter t-Test: p = 0,151 (*) (wt/dnmAKO), p = 0,0059 (**) (wt/dnmAKO LZ), p = 0,0065 (**) (wt/dnmA-GFP/dnmAKO).
10. Ergebnisse
127
Auch konnte keine Kompensation der erhöhten skipper Transkription durch Überexpression von
DnmA festgestellt werden. Überexpressionen von DnmA-GFP, hDnmt2-GFP sowie GFP im
Wildtyp-Hintergrund verursachten keine abweichende skipper Expression vom Wildtyp-Niveau.
Die in dieser Arbeit ermittelten Daten sprechen damit gegen eine spezifische Rolle von DnmA
bei der skipper Regulation.
10.5.3. Relative Bestimmung der skipper Kopienzahl in DnmA-Mutanten
Quantitative Real-Time PCR mit den gag und RT Primern konnten die von (Kuhlmann et al.
2005) detektierten zusätzlichen skipper-Kopien nicht bestätigen (Abbildung 55). Ein vorläufiges
Experiment mit LTR-Primern entsprach in etwa dem Trend veröffentlichten Daten, konnte aber
in weiterführenden Southern-Blot Experimenten mit anti-LTR Sonde nicht zuverlässig bestimmt
werden (pers. Mitteilung von S. Fuhrmann, Abt. Nellen, Universität Kassel).
10.5.4. In vitro Methylierung von DIRS-1 LTR und skipper RT Fragmenten
Amplikons der Bereiche skipper RT, DIRS-1 LTR sowie doppelsträngiger Homopolymere (28 bp)
konnten in vitro nicht methyliert werden (Daten nicht gezeigt). Der Zusatz von Dictyostelium
Kernlysat zum Methylierungsansatz zeigte ebenfalls keinen Effekt (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 55: Bestimmung der Kopienzahl der skipper Integrationen mittels Real time-PCR in verschiedenen Dictyostelium Stämmen. LZ: Langzeitkultur (28 Monate). Fehlerbalken: Mean with range. LTR: n = 1, *Triplikate wichen mehr als 0,5 Ct-Werte voneinander ab.
10. Ergebnisse
128
10.6. Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen
In einem Pulldown Experiment mit DnmA-TAP und anschließender MS/MS-Analyse
identifizierte V. Maximov das zentrosomale Protein CEP192 (score 1444) als putativen
Interaktionpartner der Methyltransferase. Neben Heat shock Proteinen wurden noch PAN3
poly(A) specific ribonuclease subunit (score 186) und mitotic phosphoprotein N´end (score 555)
mit guter Abdeckung identifiziert. Mit geringem score (40-60) wurden neben DNA assoziierten
Proteinen (structural maintenance of chromosome protein und die DNA Topoisomerase II), ein
RNA bindendes Protein sowie zwei RNA Helikasen nachgewiesen, von denen eine DEAD/H box
Helikase des U5 snRNP ist (Maximov 2010). In weiteren Experimenten mit TAP-DnmA konnten
die Ergebnisse nicht zuverlässig bestätigt werden.
Eine Erweiterung der Experimente von V. Maximov durch Immunopräzipitaionen mit der GFP-
Nanotrap von DnmA-GFP aus Dictyostelium Zellen mit dnmAKO Hintergrund ergab mittels
massenspektrometrischer Analyse (O. Bertinetti, Abt. Herberg, Uni Kassel), dass nahezu
ausschließlich DnmA-GFP präzipitiert wurde (Abbildung 56A).
Abbildung 56: SDS-PAGE (12%) immunopräzipitierter DnmA-GFP und GFP (A) und nach Affinititätschromatographie eluierter DnmA-StrepII (B). Die in der massenspektrometrische Analyse analysierten Banden sind markiert. Ergenisse der MS Analyse aus B sind in Tabelle 21 aufgeführt.
Die Ergebnisse der Massenspektrometrie von DnmA-StrepII (Abbildung 56B) sind in Tabelle 21
aufgeführt. Das Bait-Protein DnmA-StrepII ist in Fettdruck hervorgehoben. Proteine, die
bekanntermaßen Biotin oder an die Matrix binden und damit unspezifisch angereichert wurden,
sind grau hinterlegt. Alle verbleibenden Proteine wurden mit einen score ≤ 45 sowie einer
Abdeckung von nur 1-5 Peptiden detektiert. Keines dieser Proteine entspricht den von V.
Maximov identifizierten Proteinen. Unter der Berücksichtigung, dass die endogene DnmA
A B
10. Ergebnisse
129
Expression sehr gering ist und bei Pulldowns mit überexprimierter DnmA im dnmAKO-
Hintergrund Interaktionspartner vermutlich stöchiometrisch zum endogenen DnmA Level
erwartet werden können, sind Interaktionspartner mit dieser Methode nur schwer
identifizierbar. Von den mit geringer Abdeckung identifizierten Proteinen sind diejenigen, die
mit DNA assoziiert werden oder mit RNA Modfikationen in Verbindung gebracht werden, kursiv
gedruckt.
10. Ergebnisse
130
Tabelle 21: Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse putativer Interaktionspartner von DnmA-StrepII. Bande UniProtKB Genprodukt MW
(kD) Score/ Queries matched
Bemerkung
1 -- 2 Q54TE8
TATA binding protein (TBP)-associated factor A
SNF2-related domain-containing protein, helicase, protein chromatin remodelling complex subunit R
(CHR) protein; SWI2/SNF2 homolog
115 39/2
3 Q553S7 Propionyl-CoA carboxylase 80 539/29 Bindet Biotin Q54KE6 Methylcrotonyl-CoA carboxylase 77 460/25 Bindet Biotin Q55C64 Hsp70 71 78/4 Q557E0 Hypothetical protein (Hsp) 70 62/4 Q54HP6 Transmembrane protein 79 54/1 Q54JH6 DnmA 44 53/4 Bait protein Q55CS9 Atp5b, ATP Synthase subunit (mitoch.) 71 40/2 Q54BE0 Heat shock cognate protein Hsc70-3 70 40/5 Q54SG9 Gxcf, RhoGEF domain-containing protein 105 39/2 Q54Q46 Leucine-rich repeat-containing protein (LRR) 28 37/1 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 36/2 4 Q551S6 Hypothetical protein (BLAST: Acetyl-CoA carboxylase alpha subunit) 61 726/27 Bindet Biotin Q54JH6 DnmA 44 266/14 Bait protein Q8T2J9 Similar to A. tumefaciens Methyl-crotonoyl-CoA carboxylase beta subunit 64 244/15 Bindet Biotin Q54SG9 Gxcf, RhoGEF domain-containing protein 105 43/1 Q54Q46 Leucine-rich repeat-containing protein 28 40/1 Q553S7 Propionyl-CoA carboxylase 80 40/3 Bindet Biotin Q54DG6 Hypothetical protein (BLAST: Methyltransferase like protein 17, SAM-MTase (mitoch. Isoform), rRNA
methylation)
145 39/4
Q54TE8 TBP-associated factor A 115 39/2 5 Q54JH6 DnmA 44 1262/67 Bait protein 6 Q54JH6 DnmA 44 1101/57 Bait protein Q54PL8 Hypothetical protein 28,9 45/6 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 AAA33164 Adenylyl cyclase aggregation protein 98,3 38/1 Q552Q3 Hypothetical protein, weakly similar to ints10, component of a multiprotein mediator of small
nuclear RNA processing
116 36/3
7 Q54JH6 DnmA 44 662/35 Bait protein Q54Q30 RNA-binding region-containing protein (RNP-1) 32 44/2
10. Ergebnisse
131
Q54TE8 TBP-associated factor A 115 39/1 8
Q54JH6
DnmA
44
547/33
Bait protein
O97470 ADP/ATP translocase (mitoch.) 33 48/1 Q54LP0 60S acidic ribosomal protein 32 41/3 Q54WI3 Hypothetical protein 86 37/2 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 37/1 Q86K45 protein KRP-A Similar to Aplysia californica, 40S ribosomal protein S3A (Lysine-rich) 30 36/5 9 Q55C60 Galactose-binding domain-containing protein 29 499/12 Bindet Matrix Q54CX1 Discoidin II 29 285/10 Bindet Matrix Q54JH6 DnmA 44 270/13 Bait protein DLDOIA Discoidin I chain A 28 76/3 Bindet Matrix DLDOIC Discoidin I chain C 28 68/3 Bindet Matrix Q54IG0 Hypothetical protein, Uncharacterized N-acetyltransferase 18 42/4 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 40/3 Q54MA9 ATP-dependent DNA helicase 10 36/2 10 Q54JH6 DnmA 44 293/17 Bait protein Q54CX1 Discoidin II 29 67/3 RpgG, 40S ribosomal protein S3 24 63/1 Q558U1 Eukaryotic translation initiation factor 2 alpha (EIF2alpha) kinase 27 41/4
Q54TE8 TBP-associated factor A 115 39/1 11 Q54JH6 DnmA 44 122/10 Bait protein Q54TE8 TBP-associated factor A 115 41/2 12 Q54JH6 DnmA 44 40/5 Bait protein Q54BQ3 Ribosomal protein L23a 18 37/2 13 Q75JV4 PksA 28 38/3 Q54Q46 Leucine-rich repeat-containing protein 28 37/2 Q54TE8 TBP-associated factor A 115 36/1 14 Q54JH6 DnmA 44 137/11 Bait protein Q55BE6 Ribosomal protein L27 16 40/1 15 Q55EJ4 Hypothetical protein 96 42/3
10. Ergebnisse
132
10.7. Analyse speziesübergreifender Dnmt2 Funktionen
Um konservierte Dnmt2-Funktionen speziesübergreifend besser studieren zu können, wurden
vorbereitende Arbeiten für heterologe Expression verschiedener Dnmt2-Homologe
durchgeführt.
10.7.1. Heterologe Expression humaner Dnmt2 in Dictyostelium
DnmA-GFP in Dictyostelium lokalisiert unabhängig vom Wildtyp- oder dnnAKO-Hintergrund
überwiegend im Zellkern (Abbildung 57 und Kuhlmann et al. 2005). Dnmt2-Überexprimierer in
Drosophila oder Fibroblastenzellen der Maus wurden bisher ubiquitär oder verstärkt im
Cytoplasma angesiedelt (Kunert et al. 2003; Goll et al. 2006). Auch in Dictyostelium lokalisiert
hDnmt2 gleichermaßen nukleär und cytoplasmatisch, wenn sie analog zu DnmA vom pDneo2a-
Vektor mit C-terminalen GFP exprimiert wird (Abbildung 57). Mit Hilfe des SV40-
Kernlokalisationssignals kann hDnmt2-GFP zuverlässig in den Zellkern von Dictyostelium-Zellen
lokalisiert werden (Abbildung 57).
Abbildung 57: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von DnmA-GFP, hDnmt2-GFP und hDnmt2-NLS-GFP überexprimierenden Dictyostelium-Zellen. NLS: nuclear localisation signal
(Die Bilder von hDnmt2-NLS-GFP wurden freundlicherweise von H. Ziegler zur Verfügung gestellt.)
10.7.2. Klonierung von DnmA in einen Drosophila Expressionsvector
Um eine mögliche Kompensation des Verlustes der H4K20me3-Methylierung im Drosophila
dnmt2-/- Stamm zu untersuchen, wurde DnmA in einen pP{GS[vermillion+,UASV5]}-
Expressionsvektor auf der Basis des GAL4/UAS-Systems kloniert (Kapitel 8.18). Nach Injektion
des pP{GS[v+,UASDnmAV5]} in einen Vermillion-Rosy Fliegenstamm (v[1]/Y; +/+;
10. Ergebnisse
133
ry[506]/ry[506], lässt eine vorläufige Beobachtung auf eine dosisabhängige Reduktion von
Lebensfähigkeit und Fertilität durch DnmA schließen (pers. Mitteilung von O. Nickel, AG Reuter,
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg). Zusätzlich wurde in einem ersten Experiment eine
DnmA abhängige partielle Stilllegung des white-Markergen am euchromatisch lokalisierten
Actin/GAL4 Konstrukt beobachtet, die nicht mit Heterochromatin-Spreading in benachbarte
Genombereiche erklärt werden kann (pers. Mitteilung von O. Nickel, AG Reuter, Martin-Luther-
Universität Halle-Wittenberg).
10.8. Einzelmoleküluntersuchungen des 5mC-bindenden Proteins EhMLBP aus
E. histolytica
Im Gegensatz zu Säugetieren sind in “Dnmt2-only“-Organismen, außer einem inaktiven Homolog
in Drosophila, bisher keine Methyl-CpG-bindenden Proteinen bekannt. Vor einigen Jahren wurde
in E. histolytica das Protein EhMLBP identifiziert, welches präferenziell methylierte DNA bindet,
aber keine Homologie zu bekannten MBDs zeigt (Lavi et al. 2006). Mittels
Immunopräzipitationen konnten RT-LINE (Long interspersed nuclear elements), rDNA, sowie
vier weitere Gene als Targets für EhMLBP identifiziert werden (Lavi et al. 2009). Genauere
Analysen der Targetsequenzen ergaben, dass alle A/T-reiche Bereiche beinhalten. In weiteren
Bindungsstudien wurde gezeigt, dass Distamycin A, das die kleinere Furche von DNA in
überwiegend A/T reichen Regionen bindet, die Interaktion von EhMLBP zur Ziel-DNAs inhibiert
(Lavi et al. 2008). RT LINE DNA beinhaltet zwei A/T-reiche Regionen, einmal von Nukleotid
20281 bis 20292 „AAAGAAAAGAAA“ und des weiteren von 10447 bis 10461
„AAAAGAAAATCCAAA“ (Lavi et al. 2009). Mittels Rasterkraftmikroskopie (RKM) wurde die
Bindung des Methyl-C-bindenden EhMLBP zur RT-LINE DNA untersucht, um festzustellen, ob
das Protein einen Bereich der DNA präferenziell bindet. Dazu wurde die C-terminale DNA
Bindedomäne des EhMLBP Proteins in E. coli exprimiert und affinitätsgereinigt, da die
Expression des Volllänge Proteins trotz Optimierungsversuchen nicht in ausreichendem Maße
möglich war (Daten nicht gezeigt). Ein Fragment der RT-LINE DNA, welches die beiden A/T-
reichen Regionen enthielt, wurde aus einem pGEM-T-Easy Vektor unter Verwendung von m5C
und dem SP6/T7-Primerpaars amplifiziert, so dass die RT-LINE DNA von Plasmidsequenzen
flankiert wurde (Abbildung 58).
10. Ergebnisse
134
Abbildung 58: Schematische Darstellung des RT-LINE Fragments mit angrenzender Vektorsequenz (516 bp).
In Zusammenarbeit mit M. Bussiek unter Beteiligung von N. Arens und L. Hupfeld wurden
Bindungsereignisse zwischen EhMLBP C-ter und der methylierten RT LINE DNA mittels
Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Abbildung 59).
Abbildung 59: Abbildung der Bindung von EhMLBP C-ter an methylierte RT-LINE DNA mittels RKM. Freie DNA (1), an das RT-LINE Fragment gebundenes EhMLBP C-ter (2), unspezifisches Endbindungsereignis (3).
Da die Orientierung der DNA Fragmente nicht bekannt war, wurde jeweils die Distanz des
Bindungsereignisses zum kürzeren Ende ermittelt. Grundsätzlich ist anzumerken, dass
Bindungsereignisse selten, d. h. bei nur ca. 1 - 2% der abgebildeten DNA Moleküle, auftraten.
Außerdem wurden die Längen der DNA Fragmente bestimmt und ausschließlich
Bindungsereignisse auf Fragmenten, die innerhalb des Fehlerbereichs von 166 ± 16 nm lagen
berücksichtigt (Abbildung 60A). Sieht man von den Endbindungsereignissen ab, die von vielen
DNA bindenden Proteinen als unspezifische Bindungen bekannt sind, liegt der Peak der
Bindungsereignisse im Intervall von 60-70 nm (Abbildung 60B).
10. Ergebnisse
135
Abbildung 60: Längenbestimmung der m5C-RT-LINE DNA (A) und Bestimmung der Bindeposition von EhMLBP C-ter an der m5C-RT-LINE DNA (B), Fehlerbalken: sqrt(Anzahl/Intervall). Die Graphiken wurden freundlicherweise von N. Arens zur Verfügung gestellt.
Bei Umrechnung der kürzesten Distanzen der Bindungsereignisse von nm in bp (0,32 nm/bp)
ergibt sich ein Wert von 188-219 bp. Da die Orientierung des DNA Fragmentes nicht bekannt ist,
kann die präferenzielle Bindung an dieser Stelle sowohl aus Richtung des T7- als auch des SP6-
Primeres erfolgen (Abbildung 58). Betrachtet man die bevorzugte interne Bindestelle aus der
Richtung des SP6-Primers, fällt diese mit der A/T reichen Region „AAAGAAAAGAAA“ (Nukleotid
20281 bis 20292 im RT LINE) zusammen (Abbildung 61).
Abbildung 61: Kartierung der möglicherweise von EhMLBP bevorzugten Bindestelle auf dem untersuchten Fragment der RT-LINE DNA. Flankierende Vektorsequenzen sind kursiv dargestellt, Primerbindestellen sind zusätzlich unterstrichen. Da die Orientierung des DNA Fragmentes nicht bekannt ist, kommen zwei Bereiche auf der DNA als bevorzugte Bindestelle in Frage: Aus Richtung des T7-Primers ist dieser Bereich türkis, aus Richtung des SP6-Primers grün markiert. Die beiden von Lavie et al. identifizierten A/T-reichen Regionen sind rot gefärbt. Es ist nur der +-Strang des DNA Moleküls dargestellt.
T7-PRIMER
TGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTAGCACTCTCC
AGCCTCTCACCGCAGATCCAGCACAGAAATAGGAGAAATGATAGAAGCAATAAAAGAAAATCCAAATGGAATAATTAAAAGAATGAATAA
AGCATTTGGTAAGAAGATTAATTTTAATGAATTAATGAATGTAATAGAATTAAATGAAAGAAAGCACAATGCAAAGGAAATATTTGAATG
GGTAAATAATGAATTAAATGAAAGATATTTAAGTGAATGGAAAGAAAAGAAATGTGGTGAATATATAAGATGTGCAAATGGCACTTTTAA
TGATAAGAAATTAACAGTAGCCACTTGGAGATCTGCGGTGAGAGGCTGGAGAGTGCTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTC
GACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAAT
SP6-PRIMER
A B
11. Diskussion
136
11. Diskussion
11.1. tRNA Methylierung als konservierte Dnmt2 Funktion
11.1.1. DnmA und Pmt1 sind aktive tRNA Methyltransferasen
Nachdem Goll et al. (2006) erstmals zeigen konnten, dass humane Dnmt2 eine deutlich stärkere
Enzymaktivität als tRNA- anstatt als DNA-Methyltransferase hat, ist mittlerweile für die Dnmt2-
Homologe aus D. melanogaster und E. histolytica ebenfalls eine tRNA Methylierungsaktivität
nachgewiesen worden (Meusburger 2008; Tovy et al.). Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt,
dass das Dnmt2-Homolog aus D. discoideum (DnmA) ebenfalls tRNAs methylieren kann.
Überraschend war, dass auch für Pmt1 aus S. pombe tRNA-Methylierungsaktivität detektiert
wurde, da bisher die fehlende DNA-MTase Aktivität dieses Enzyms auf die P zu S Mutation im
Motiv IV zurückgeführt wurde (Wilkinson et al. 1995) (Abbildung 62). Entgegen den
Erwartungen scheint diese Mutation für die Erkennung einer tRNA als Substrat keine
Beeinträchtigung zu sein.
Im Rahmen der in vitro Methylierungsstudien dieser Arbeit wurde für rekombinante DnmA und
hDnmt2 eine optimale Mg2+-Konzentration für die Methylierungsreaktion von 5 mM ermittelt.
Diese konnte bei Reaktionen mit verschiedenen Substraten bestätigt werden. Eine Erhöhung auf
10 mM Mg2+-Ionen in der Reaktion führte zur starken Reduktion der Methylierung
angereicherter kleiner RNA und bei in vitro transkribierter tRNA sogar fast zum vollständigen
Verlust des radioaktiven Signals. Diese Daten weichen von den Beobachtungen von
M. Meusburger ab, die 10 mM Mg2+-Ionen als optimale Magnesiumkonzentration identifiziert
hatte (Meusburger 2008). Magnesiumionen sind in der Reaktion vor allem auch für die korrekte
Faltung der tRNA Struktur verantwortlich. Grundsätzlich geht man davon aus, dass sich
modifizierte und unmodifizierte Transkripte in vitro erst in Anwesenheit von Mg2+-Ionen mit
einer Konzentration von 10 mM in ihren biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften
gleichen (zusammengefasst in Motorin et al. 2011).
11. Diskussion
137
Abbildung 62: Alignment von Dnmt2-Homologen aus verschiedenen Organismen. Die katalytischen Motive sind jeweils unterstrichen und mit der entsprechenden römischen Zahl gekennzeichnet. Die P zu S Mutation im Motiv IV von S. pombe ist mit einem roten Pfeil gekennzeichnet. TRD: Target recognition domain. Die Farbgebung erfolgte nach der Konservierung in Prozent:
I II III
IV V VI
VII VIII
IX X
TRD
11. Diskussion
138
11.1.2. tRNAAsp ist das gemeinsame Hauptsubstrat von Dnmt2-Homologen
Als gemeinsames Hauptsubstrat aller bisher untersuchten Dnmt2-Homologe konnte die
tRNAAsp(GUC) identifiziert werden. Sowohl in vitro als auch in vivo konnte tRNAAsp Methylierung in
den Organismen Drosophila, Mus, Dictyostelium, Schizosaccharomyces und Entamoeba
nachgewiesen werden. Bei Dictyostelium liegt der detektierte m5C-Gehalt an der Position 38 in
Wildtyp-Zellen jedoch bei nur 30%. In Drosophila wurden je nach RNA Präparation zwischen 40-
70% C38-Methylierung in den Wildtyp-Populationen detektiert (pers. Mitteilung, M. Schäfer,
Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg). Inwiefern die cDNA Synthese bei der RNA-Bisulfitsequenzierung
auf wenig oder unmodifizierte tRNAs selektiert, ist unklar (siehe auch Kapitel 11.3). In
Dictyostelium konnte eine leichte Erhöhung der tRNAAsp-Methylierung durch Überexpression der
DnmA und hDnmt2, in S. pombe sogar 100% tRNAAsp-Methylierung durch Überexpression von
Pmt1 erreicht werden (pers. Mitteilung, M. Becker, Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität
Duisburg-Essen).
11.1.3. Endogene Dnmt2-Aktivität unterliegt vermutlich Umwelteinflüssen
Sowohl bei unseren in vitro Studien zur indirekten Detektion der endogenen DnmA Aktivität
sowie Studien anderer Arbeitsgruppen war auffällig, dass die in vivo Methylierung der tRNAs
durch Dnmt2-Homologe variiert. Erste Hinweise, dass tRNA Methylierung in der Erhaltung der
tRNA Stabliltät bei Hitzestress (HS) involviert sein könnte (Schaefer et al. 2010b), führten zu der
Vermutung, dass die tRNA Methylierung bei HS möglicherweise zunimmt. RNA Bisulfitanalysen
mit RNA aus Dictyostelium-Zellen, die über einem Zeitraum von zwei Stunden einem Hitzestress
(30°C) ausgesetzt waren, zeigten jedoch keine Erhöhung der endogenen DnmA Aktivität.
Weiterhin konnten vierstündige Hungerphasen sowie Langzeitkultivierung als Umweltfaktoren
ausgeschlossen werden.
In S. pombe scheint die Pmt1-Aktivität aufgrund des Peptongehalts im Medium zu variieren
(pers. Mitteiliung, M. Becker, Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen). Zugabe von
Pepton zum Medium erzeugt eine Erhöhung der tRNAAsp Methylierung auf 100%. Erste
Vermutungen zielen darauf ab, dass die Eigenschaft von Pepton als Stickstoffquelle der
entscheidende Faktor ist. Die erhöhte Aktivität des Enzyms scheint jedoch nicht mit erhöhter
Expression von Pmt1 einherzugehen.
In E. histolytica wird durch Glucoseentzug die tRNAAsp-Methylierung durch Ehmeth reduziert.
Hingegen konnte gezeigt werden, dass Stickstoffmonoxid zur Erhöhung der tRNAAsp
Methylierung führt, da es die Komplexbildung zwischen Ehmeth und Enolase, die als
Methylierungsinhibitor identifiziert wurde, verhindert (pers. Mitteilung von S. Ankri, Technion,
Haifa, Israel).
11. Diskussion
139
In vegetativ wachsenden Dictyostelium-Zellen wurde mittels qPCR die schwache Expression der
endogenen DnmA nachgewiesen (Kuhlmann et al. 2005 und pers. Mitteilung von I. Windhof).
Das Wachstum von Dictyostelium-Zellen für wenige Tage in einem Minimalmedium führte in
einem ersten Experiment zur Erhöhung der DnmA Expression. Inwiefern diese mit erhöhter
Methylierungsaktivität einhergeht, steht noch aus. Zusätzlich wurde bei DnmA-
Überexpressionsstämmen eine verspätete Entwicklung bei 16 Stunden beobachtet, die sich bis
zur vollständigen Ausbildung der Fruchtkörper nach 24 Stunden aber wieder aufhebt
(persönliche Mitteilung von I. Windhof).
Inwieweit möglicherweise vorhandene DNA-Methylierungsaktivität der Dnmt2-Homologe
Umwelteinflüssen unterliegt, bleibt ebenfalls Spekulation. Kontroverse Ergebnisse
verschiedener Arbeitsgruppen und teilweiser Verlust der Expression der Dnmt2–Homologe aus
Drosophila- und Entamoeba-Laborstämmen (pers. Mitteilung von G. Reuter, Universität Halle-
Wittenberg und S. Ankri, Technion, Haifa, Israel), lassen jedoch vermuten, dass Dnmt2
längerfristige Auswirkungen bei intrazellulären Reaktionen auf Umweltherausforderungen
wildlebender Organismen hat.
11.2. Dnmt2 als Multisubstrat-(t)RNA-Methyltransferase
Die Arbeitsgruppe von F. Lyko (DKFZ, Heidelberg) zeigte, dass in Drosophila zusätzlich zur
tRNAAsp(GUC) die tRNAGly(GCC) und tRNAVal(AAC) durch Dnmt2 in vivo methyliert werden (Schaefer et
al. 2010b). Im Rahmen dieser Arbeit konnte in vitro die tRNAGlu(UUC) aus Dictyostelium als
weiteres tRNA Substrat für DnmA und hDnmt2 identifiziert werden, wenngleich hier die
Methylierungseffizienz im Vergleich zur tRNAAsp deutlich geringer ausfällt. Bisulfitsequenzierung
der tRNAGlu in verschiedenen Dictyostelium Stämmen (Bsp.: wt, OE) konnte diese tRNA als in vivo
Substrat bisher nicht bestätigen. Auch hier ist unklar, inwiefern der Schritt der Reversen
Transkription auf wenig oder unmodifizierte RNAs selektiert (siehe auch Kapitel 11.3). In S.
pombe konnte in vitro und in einem Überexpressionsstamm auch in vivo tRNAGlu als weiteres –
wenn auch schwächeres - Substrat bestätigt werden (pers. Mitteilung, M. Becker, Abt.
Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen).
11.2.1. Ist die RNA Methylierung durch Dnmt2 sequenzspezifisch?
Mark Helm postulierte vor wenigen Jahren, dass hDnmt2 eine tRNA dann an der Position C38
effizient methyliert, wenn im Kontext des Anticodonstem und -loops ein bestimmtes
Sequenzmuster (C32, A37, C40) vorkommt (pers. Mitteilung, M. Helm, Johannes-Gutenberg
Universität, Mainz). Die in vitro Experimente mit verschiedenen Dictyostelium tRNAs bestätigten
11. Diskussion
140
diese Vermutung, da von den getesteten tRNAs ausschließlich die tRNAAsp und tRNAGlu dieses
Sequenzmuster zeigten und bisher auch nur diese beiden sowie eine synthetisch hergestellte
suppressor tRNAGlu als Substrate identifiziert wurden. Die beiden zusätzlichen Substrate
tRNAGly(GCC) und tRNAVal(AAC) aus Drosophila beinhalten ebenfalls das Erkennungsmuster
(Schaefer et al. 2010b). Eine weitere Gemeinsamkeit aller bisher identifizierten natürlichen
tRNA-Substrate ist, dass im Anticodon an der Position 36 ein Cytidin zu finden ist, d.h. es handelt
sich um tRNAs, die Codons erkennen, die mit einem Guanosin beginnen.
Die in vitro Blockierungsexperimente deuten daraufhin, dass möglicherweise noch weitere RNA
Spezies in der Größenordnung einer tRNA methyliert werden können. Im Rahmen des RNA-CLIP
Experiments mit Illumina®-Sequenzierung wurden zusätzlich Fragmente der tRNAGly(GCC) aus
Dictyostelium verstärkt mit DnmA angereichert gefunden. Allerdings fehlt dieser tRNA das C40
für ein vollständiges Erkennungsmuster. Interessanterweise hat auch die tRNAGlu aus S. pombe
ebenfalls nur ein unvollständiges Muster ohne C40, dient aber trotzdem als Substrat (pers.
Mitteilung, M. Becker, Abt. Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen). Die tRNAGly(GCC),
deren Drosophila-Homolog wie beschrieben bereits als Substrat bestätigt wurde, ist damit ein
interessanter neuer DnmA-Substratkandidat.
Allerdings scheinen andere Aspekte wie z. B. strukturelle Eigenschaften der tRNAs die
Enzymaktivität ebenfalls zu beeinflussen, da die bisher identifizierten Substrate mit deutlich
unterschiedlicher Effizienz methyliert werden. Die Beschaffenheit der tRNA-Enden haben jedoch
wenig oder keinen Einfluss auf die Substraterkennung, da auch eine in ein größeres Transkript
(gus-PSTVd) eingebettete tRNA Sequenz als Substrat erkannt wurde.
Dass das Vorkommen des vollständigen Erkennungsmusters in der Primärstruktur einer RNA
nicht allein ausschlaggebend für die Substraterkennung durch Dnmt2-Homologe ist, sondern
auch strukturelle Aspekte der RNA eine Rolle spielen müssen, bestätigen auch die Experimente
zur Methylierung von U-snRNAs. Trotz vollständiger Erkennungssequenz konnte die U4-snRNA
im Gegensatz zur U2-snRNA durch Dnmt2-Homologe in vitro nicht methyliert werden. Da die
U2-snRNA das potientielle Erkennungsmuster zweimal zeigt, wurden jeweils die möglichen
Zielcytosine C73 und C155 (Abbildung 41) zu A mutiert. Die Einzelmutanten zeigten jedoch
keinen Verlust der Methylierbarkeit durch Dnmt2. Inwiefern beide Cytosine parallel als Substrat
dienen, wird in Experimenten mit der U2-snRNA Doppelmutante C73A/C155A adressiert
werden. Eine weitere Hypothese besteht darin, dass ein Cytosin aus dem Stem loop IIa als
Zielnukleotid fungiert. Diese Annahme beruht darauf, dass der Stem loop IIa der U2-snRNA von
Dictyostelium möglicherweise einen U-turn beinhaltet, der von Anticodonloops in tRNAs
bekannt ist. Der U-turn ermöglicht in tRNAs, dass sich die drei Nukleotide des Anticodons durch
eine Drehung um die Phosphodiesterbindungen aus der tRNA herausklappen um so mit mRNAs
paaren zu können. Erstmalig wurde der U-turn im Anticodonloop der tRNAPhe beschrieben
11. Diskussion
141
(Quigley et al. 1976), später auch in anderen RNAs wie z. B. dem T-loop und Anticodonloop der
tRNAAsp (Westhof et al. 1985) sowie im Stem loop IIa der U2-snRNA aus Hefe (Stallings et al.
1997). Ein U-turn tritt auf, wenn in der RNA Struktur ein (Y)UNR-Motiv (Y-Pyrimidin, U – Uracil,
N – beliebiges Nukleotid, R – Purin) vorkommt (Abbildung 63). Sowohl der Stem loop IIa der
humanen als auch der Dictyostelium U2-snRNA zeigt das UNR-Motiv. Zusätzlich fällt in der
Dictyostelium U2-snRNA auf, dass im 3´-Bereich nach dem U-turn ein Cytosin zu finden ist. Geht
man von dieser Position als potentielles Zielnukleotid aus, entsprechen zwei weitere Cytosine
jeweils den Positionen „C32“ und „C40“ aus dem Erkennungsmuster (Abbildung 63).
Abbildung 63: Schematische Darstellung der Sekundärstruktur der U2-snRNA. Zusätzlich ist eine Übersicht über den Stemloop IIa der U2-snRNAs aus S. cerevisiae, H. sapiens und D. discoideum gezeigt. Das Vorkommen eines UNR-Motivs deutet auf einen U-turn hin, der von Anticodonloops aus tRNAs bekannt ist. Bei tRNAs scheinen U-turns auch ohne vollständiges UNR-Motiv aufzutreten. Im Stem loop IIa von D. discoideum tritt ein potientielles Zielcytosin (rot) auf. Vergleicht man die Positionen relativ zu diesem Cytosin mit denen der tRNA, lassen sich in der U2-snRNA je ein äquivalentes Nukleotid zum „C32“ und „C40“ (magenta) der tRNA feststellen.
Möglicherweise ist eine Kombination aus dem U-turn mit Teilen des Erkennungsmotivs
ausreichend um die U2-snRNA aus Dictyostelium mit Dnmt2-Homologen zu in vitro schwach zu
methylieren. Eine entsprechende tRNA mit allen Nukleotiden des Erkennungsmusters außer
dem A37 kommt in Dictyostelium natürlicherweise nicht vor und wurde daher auch in unserer
11. Diskussion
142
Studie nicht berücksichtigt. Die humane U2-snRNA zeigt zwar das UNR-Motiv, hat aber kein
Cytosin als potientielles Zielnukleotid im Loop. Bisher konnte auch keine Methylierung der
humanen U2-snRNA gezeigt werden. Die U4-snRNA diente in den Methylierungsstudien
ebenfalls nicht als Substrat und soweit bekannt, wurden für diese RNA bisher auch keine U-turn
Motive beschrieben.
11.2.2. Methylierung vs. Bindung - dynamische Substraterkennung durch Dnmt2
Die Methylierungsreaktion der Dnmt2 ist durch das Auftreten eines kovalenten
Übergangszustandes gekennzeichnet. Allgemein wird angenommen, dass bei Auftreten dieses
kovalenten Komplexes zwischen Enzym und Substrat die Methylierungsreaktion nur noch in die
Richtung des Transfers der Methylgruppe auf das Substrat ablaufen kann.
V. Maximov charakterisierte den kovalenten Übergangszustand der Methylierungsreaktion von
tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC) mit rekombinanter DnmA und hDnmt2 (Maximov 2010). Analysen
zur Kinetik ergaben, dass die Bildung des kovalenten Übergangszustands zwischen
DnmA/hDnmt2 und den tRNA Substraten zeitabhängig ist (Maximov 2010). Die Zunahme und
darauf folgende Abnahme der Anzahl kovalenter Komplexe spiegelt den Umsatz von nicht-
methylierten zu methylierten tRNAs in der Reaktion wieder. Das Maximum kovalenter
Komplexe wird mit der tRNAGlu deutlich später (nach ca. 10 min Reaktionszeit) als mit der
tRNAAsp (nach ca. 1 min Reaktionszeit) erreicht (Abbildung 64) und entspricht damit dem
Ergebnis der Methylierungsstudien: tRNAAsp ist gegenüber der tRNAGlu das effizientere Substrat.
Abbildung 64: Kinetik der kovalenten Komplexbildung zwischen Dnmt2-Homologen und tRNAAsp , tRNAGlu
und einem ssDNA-Oligo (28nt C). Radioaktiv markierte Substrate wurden mit SAM und rekombinanter DnmA/hDnmt2 inkubiert und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Exposition und Auswertung erfolgte mit Hilfe des Phosphoimagers (Fujifilm FLA-7000) und der Auswertungssoftware Multigauge. Das stärkste Signal wurde auf 100% normalisiert. Diese Graphik wurde zusammengestellt aus Daten der Doktorabeit von V. Maximov (2010) und der Examensarbeit von S. Junk (2010).
11. Diskussion
143
In Zusammenarbeit mit S. Junk wurde die Analyse kovalenter Komplexe auf weitere tRNAs
ausgeweitet (Junk 2010). Abgesehen von tRNALeu(UAG) zeigten nur die tRNAs, die auch als
Methylierungssubstrat dienten, kovalente Komplexbildung (Tabelle 22). S. Junk konnte mit
tRNALeu(UAG) einen schwachen zeitabhängigen kovalenten Komplex nachweisen, der nach ca. 60
min nicht mehr detektierbar war (Junk 2010). Eine signifikante Methylierung dieser tRNA
konnte nicht nachgewiesen werden (Kapitel 10.1.4).
Tabelle 22: tRNAs, die hinsichtlich kovalenter Komplexbildung und Methylierungssubstrat getestet wurden.
Zielnukleotid & Sequenzmuster Aktivität
tRNA
C38 C32, A37, C40 -CH3 Komplex
Asp(GUC-1) + + + +
Asp(GUC-1) C38A - + -
Glu(UUC-5) + + + +
Glu(UUC-5) C38A - + - -
Antisense Glu(UUC-5) - - - -
Sup. Glu(CUA) + - + +
Antisense sup. Glu(CUA) - - - -
Leu(UAG-1) + nur C40 - +
Leu(AAG-8) + - - -
Val(CAC-1) + nur A37 - -
Phe(GAA-1) - nur C32 - -
V. Maximov und S. Junk wiesen zusätzlich mit einzelsträngigen DNA Oligonukleotiden (z. B. 28nt
Cytosin) eine zeitabhängige kovalente Komplexbildung nach. Allerdings bildet sich der Komplex
aus DnmA/hDnmt2 mit dem DNA Oligonukleotid deutlich langsamer und zeigt keinen Rückgang
über einen Zeitraum von 240 min (Abbildung 64). Das Poly-C-DNA Oligonukleotid diente in
Methylierungsstudien mit hDnmt2 und DnmA nicht als Substrat (Daten nicht gezeigt).
Vermutlich werden ssDNA-Oligonukleotide unspezifisch vom aktiven Zentrum des Enzyms
gebunden, da die SDS-resistenten Komplexe auch mit der hDnmt2 E119A-Mutante vorkamen.
Das Glutamat E119 stabilisiert den kovalenten Übergangszustand (Kapitel 6.1.3).
Überraschenderweise waren die Komplexe mit der Mutante hDnmt2 C79A zwar deutlich
reduziert, aber immer noch schwach detektierbar (Junk 2010). Das C79 ist das katalytische
Cystein aus Motiv IV (Kapitel 6.1.3).
11. Diskussion
144
Die gewonnen Daten geben einen Hinweis darauf, dass Substraterkennung durch Dnmt2 ein
hochdynamischer Prozess ist und kovalente Komplexbildung auch nicht-produktiv auftreten
kann (Maximov 2010).
Aus den bisher bekannten Daten lässt sich schlussfolgern, dass Dnmt2-Homologe eine
konservierte Aktivität hinsichtlich der tRNA-Methylierung haben und vermutlich Multisubstrat-
tRNA-MTasen sind. Dabei ist die tRNAAsp Methylierung die robusteste Enzymaktivität. Die
Substraterkennung durch Dnmt2 unterliegt keinem Alles-oder-Nichts-Prinzip, sondern ist ein
hochdynamischer Prozess, bei dem neben einem spezifischen Sequenzmuster vermutlich auch
strukturelle Aspekte eine wichtige Rolle spielen. Ob alle bisher identifizierten RNA-Substrate
biologische Relevanz haben, muss noch gezeigt werden. Die Dnmt2-abhängige tRNA-Stabilität
unter Stress wurde für mehrere tRNA-Substrate in Drosphila bestätigt (Schaefer et al. 2010b).
11.3. Identifizierung von neuen putativen RNA-Substraten mittels RNA-CLIP
Zur Identifikation von potientiellen neuen Dnmt2-Substraten wurden zwei Crosslink-RNA-
Immunopräzipitationen mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung durchgeführt. Da
die Datensätze der beiden Experimente nur wenige Gemeinsamkeiten zeigen, sollen an dieser
Stelle die methodischen Unterschiede zwischen den beiden RNA-CLIP Ansätzen beschrieben
werden (Abbildung 65).
Bei der ersten RNA-Immunopräzipitation wurde Formaldehyd-Crosslinking verwendet.
Formaldehyd ist ein effizienter Crosslinker, jedoch führt dieses Reagenz im Gegensatz zu UV-
Licht häufig zu unspezifischen Vernetzungen (pers. Mitteilung, J. Vogel, Universität Würzburg).
Außerdem wurde zunächst ein mildes Crosslink Reversal durchgeführt um Degradation der RNA
zu vermeiden. Vermutlich war dieses Crosslink-Reversal zu mild, so dass Reste des Proteins an
den assoziierten RNAs verblieben. Dies führte wahrscheinlich zu häufigem Abbruch der
Reversen Transkription bei der für die nachfolgende Sequenzierung benötigten cDNA-Synthese.
Dies könnte eine Erklärung für die kaum vorhandenen tRNA Sequenzen in dem Datensatz des
ersten RNA-CLIP Experiments sein. Endogene tRNAs sind aufgrund der Modifikationen ohnehin
oft nur unzureichend revers transkribierbar. Beispielsweise ist für die Modifikation N1-
Methyladenosin in human tRNAs bekannt, dass Primerextension-Reaktionen an dieser Stelle
abbrechen (Saikia et al. 2010).
11. Diskussion
145
Abbildung 65: Übersicht über die methodischen Unterschiede der beiden RNA-CLIP Experimente.
Beim Vergleichen von Sequenzhäufigkeiten aus Next-Generation-Sequenzierungen muss
grundsätzlich bedacht werden, dass die cDNA-Synthese durch verschiedene Komponenten
beeinflusst wird und die cDNA-Bibliothek möglicherweise nicht die realen Sequenzhäufigkeiten
widerspiegelt. Beispielsweise inhibiert 2´-O-Methylierung am 3´-Ende einer RNA die Ligation
des Poly-A-Linkers, der als Primer-Bindestelle bei der Reversen Transkription fungiert
(Abbildung 35). RNAs mit der genannten Modifikation sind folglich in cDNA Bibliotheken häufig
nicht repräsentativ vertreten (Munafo et al. 2010).
Bei dem ersten RNA-CLIP Experiment handelte es sich um ein Pilot-Experiment, bei dem nur
20.000 Sequenzen pro Probe (DnmA-GFP und GFP-Kontrolle) erhoben wurden. Da davon ca.
19.000 Sequenzen rRNAs zugeordnet werden konnten, verblieben nur ca. 700 Sequenzen, die zu
genomischer DNA passten. Aufgrund der geringen Datenmenge wurde keine Normalisierung
durchgeführt. Die Illumina®-Sequenzierung des zweiten RNA-CLIP Experiments ergab 5,5 Mio.
Sequenzen pro Probe. Davon ließen sich bei der DnmA-GFP Probe ca. 1 Mio. und bei der GFP-
Kontrolle ca. 500.000 Sequenzen der genomischen DNA zuordnen. Die rDNA Sequenzen sind bei
diesem Experiment in Tabelle 18 mit nur 5000 – 6800 Sequenzen angegeben. Dies entspricht
vermutlich nicht der Realität, da viele rRNA Sequenzen von Dictyostelium in zusätzlichen Contigs
auf der Dictybase gespeichert sind, da diese Sequenzen keiner Position im Genom oder dem
rDNA Palindrom zugeordnet werden konnten. Diese Contigs wurden in der Auswertung der
RNA-CLIP Daten nicht erfasst. Es ist also wahrscheinlich, dass die verbleibenden 4 Mio. bzw. 4,5
Mio. Sequenzen den rRNA-Contigs zugeordnet werden können. Zusätzlich wurde bei der
Auswertung der Daten des zweiten RNA-CLIP Experiments eine Normalisierung der Daten
11. Diskussion
146
durchgeführt um die Sequenzhäufigkeiten zwischen DnmA-GFP und GFP auszugleichen. RNA
Kandidaten, die im Rahmen dieser Auswertung als mit DnmA angereichert identifiziert wurden,
unterlagen damit den strengeren Auswahlkriterien.
Im Folgenden sollen zunächst die in beiden Experimenten vorkommenden snoRNA, snRNA und
intergenischen Sequenzen diskutiert werden, wobei ein Schwerpunkt auf der U2-snRNA liegt.
Inwiefern identische intergenische Transkripte in den beiden RNA-CLIP-Ansätzen angereichert
wurden, wurde bisher nicht analysiert, wird aber ein Schwerpunkt zukünftiger Arbeiten sein. In
einem weiteren Kapitel werden im Anschluss die ausschließlich im zweiten RNA-CLIP
Experiment aufgetreten tRNA Fragmente thematisiert.
11.3.1. U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA Substrat der Dnmt2
In den Daten des ersten RNA-CLIP-Experiments mit 454-Sequenzierung waren vor allem U-
snRNAs, snoRNAs sowie intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Von ausgewählten
RNAs konnte nur für die U2-snRNA (rnu2a/b), aber nicht für die U4-snRNA (rnu4a) sowie die
snoRNA (sno7) und zwei intergenische Sequenzen, schwache Methylierung durch Dnmt2-
Homologe in vitro detektiert werden. Außerdem konnte bisher weder das Zielnukleotid
identifiziert (siehe auch Kapitel 11.2.1) noch ein eine m5C-Methylierung der U2-snRNA in vivo
bestätigt werden. Zusätzlich war die Anreicherung der U2-snRNA mit DnmA mit der zweiten
RNA-CLIP nicht reproduzierbar. Hierbei wurde jedoch die U1b-snRNA deutlich angereichert
gefunden.
Hinweise, dass Dnmt2-Homologe mit dem Spleißosom assoziiert sein könnten, geben allerdings
die in HeLa-Zellen identifizierten Interaktionen von Dnmt2 mit Proteinen der RNA
Prozessierungsmaschinerie (Thiagarajan et al. 2010). Darunter sind u. a. die Proteine NonO und
SfpQ, die bevorzugt mit prä-mRNA assoziiert sind und für die Bildung des Spleißosoms benötigt
werden (Thiagarajan et al. 2010). In einem der Pulldownexperimente von V. Maximov war mit
geringem score eine U5 small nuclear ribonucleoprotein DEAD/DEAH box Helikase (ascc3l)
vertreten (Maximov 2010).
In Vertebraten gilt die U2-snRNA mit einem 5´-Trimethylguanosin-Cap, zehn 2´-O-
Methylierungen und 13 Pseudouridinen als die spleißosomale RNA mit den meisten bekannten
Modifikationen (Yu et al. 1998). Davon kommt die Mehrheit im 5´-Bereich der U2-snRNA vor,
wobei drei Pseudouridine und fünf 2´-O-Methylierungen in den ersten 20 Nukleotiden für die
Assemblierung des spleißosomalen E-Komplexes essentiell sind (Donmez et al. 2004). Ebenfalls
sind Basenmethylierungen wie m6A, m6Am und m2G, jedoch bisher kein m5C, in U-snRNAs
beschrieben worden (zusammengefasst in Massenet et al. 1998).
11. Diskussion
147
Aus den bisherigen Daten kann noch keine eindeutige Aussage getroffen werden, ob Dnmt2-
Homologe die U2-snRNA zuverlässig modifizieren (siehe Kapitel 11.2.1). Unwahrscheinlich, aber
nicht auszuschließen ist, dass die in vitro beobachtete Modifikation durch eine Kontamination
der rekombinanten DnmA und hDnmt2-Präparationen aus E. coli verursacht wird.
Für eine Interaktion von DnmA mit snoRNAs gibt es aus der Literatur keine weiteren Hinweise.
Allerdings wurde - wenn auch mit geringer Abdeckung - in dem Pulldown mit StrepII-DnmA eine
rRNA MTase identifiziert, die einen indirekten Hinweis auf eine Interaktion mit snoRNAs, die in
die 2´O-Methylierung von rRNAs involviert sind, geben könnte.
11.3.2. DnmA ist mit tRNA-Fragmenten assoziiert
Die Ergebnisse des zweiten RNA-CLIP Experiments zeigen eine deutliche Anreicherung von
verschiedenen tRNA-Fragmenten in der DnmA-GFP Fraktion. Diese Fragmente sind ca. 20 –
24 nt lang und stammen überwiegend aus einem Bereich, der im Anticodonloop der tRNA
beginnt und sich bis zum T-Loop erstreckt („mid“-Fragmente). Entsprechend der Annahme, dass
tRNAAsp(GUC) das Hauptsubstrat von DnmA darstellt, sind „mid“-Fragmente dieser tRNA am
häufigsten verteten. Mit abnehmender Sequenzhäufigkeit folgen Fragmente der beiden
tRNAGlu(UUC/CUC) sowie der tRNAGly(GCC) (Abbildung 66). Die Vergleiche der Sequenzhäufigkeiten
der „mid“-Fragmente beruhen auf der Annahme, dass die Effizienz der cDNA-Synthese der
verschiedenen tRNA-Fragmente etwa gleich war.
Auch wenn die tRNAGlu(UUC) bisher nur in vitro als Substrat identifiziert werden konnte, geben die
Daten des RNA-CLIP Experiments einen Hinweis darauf, dass sowohl die tRNAGlu(UUC) als auch die
tRNAGlu(CUC) möglicherweise auch in vivo als Substrate dienen könnten. Dass die tRNAGlu-
Fragmente mit geringerer Sequenzhäufigkeit vertreten sind als die der tRNAAsp(GUC), steht im
Einklang mit den Beobachtungen, dass die Methylierungseffizienz der tRNAGlu(UUC) im Vergleich
zur tRNAAsp(GUC) deutlich reduziert war. Überraschend war die hohe Affinität der DnmA zu
Fragmenten der tRNAGly(GCC), denn im Gegensatz zu den tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) besitzt
die tRNAGly(GCC) das Erkennungsmuster nur unvollständig (siehe Kapitel 11.2.1).
Grundsätzlich besteht die Möglichkeit, dass tRNAGlu und tRNAGly in vivo keine
Methylierungssubstrate sind, aber trotzdem mit DnmA assoziieren. Von den in vitro
Bindungsstudien ist beispielsweise bekannt, dass DnmA Affinität zu allen getesteten
Nukleinsäuren besaß und selbst mit RNAs wie der tRNALeu(UAG), die in vitro nicht effizient
methyliert wurden, unter denaturierenden Bedingungen stabile Komplexe ausbilden konnte
(Junk 2010; Maximov 2010).
Bezüglich der tRNA „mid“-Fragmente kann nicht ausgeschlossen werden, dass diese als Folge
selektiver Reverser Transkription in den Daten überrepräsentiert sind. Aufgrund ihrer geringen
11. Diskussion
148
Länge und damit geringerer Anzahl an möglicherweise störenden Modifikationen können die
Fragmente effizienter in cDNA umgeschrieben werden als Volllänge tRNA. Da Volllänge tRNAs in
im Gegensatz zu den tRNA-Fragmenten meist in der DnmA-GFP-Probe und in der GFP Kontrolle
gleichermaßen verteten waren, deutet dies auf eine spezifische Interaktion zwischen DnmA und
den „mid“-Fragmenten. Allerdings besteht die Möglichkeit, dass spezifisch von DnmA gebundene
Volllänge-tRNAs während des Experiments degradieren und ausschließlich das vom Enzym
gebundene Teilstück intakt bleibt („Footprint“).
Einen indirekten Hinweis für die Spezifität der mit DnmA assoziierten tRNA Fragmente geben
zusätzlich Daten einer Next-Generation-Sequenzierung kleiner RNA aus vegetativ wachsenden
Dictyostelium-Zellen der Arbeitsgruppe von Fredrik Söderbom. Ein Screening der Daten auf
tRNA Fragmente (10 – 35 nt) ergab, dass die meisten tRNA Fragmente eine Größe von ca. 15 nt
hatten (pers. Mitteilung von F. Söderbom, Uppsala Centre for Comparative Genomics, Universität
Uppsala). Ein Vergleich der RNA-CLIP Daten zu den Daten von F. Söderbom zeigt, dass die RNA-
CLIP-Ergebnisse nicht den Durchschnitt der tRNA-Fragmente in vegetativen Zellen
widerspiegeln (Abbildung 66). Nach diesen Daten stellen Fragmente der tRNAIle(AAU), tRNALys(UUU)
und tRNAArg(ACG) die meisten kleinen tRNA-Fragmente in Dictyostelium-Zellen.
Abbildung 66: Darstellung der relativen Häufigkeiten ausgewählter tRNA-Fragmente in vegetativ gewachsenen Dictyostelium-Zellen im Vergleich zu tRNA-Fragmenten aus den RNA-CLIP Daten. Die RNA-CLIP Daten stellen jeweils die Differenz der tRNA-Fragmente aus der DnmA-GFP-Probe und der GFP-Kontroll-fraktion dar. Die Größe und Position der tRNA Fragmente wurden in dieser Darstellung nicht berücksichtigt. Die Daten der tRNA-Fragmente aus vegetativen Zellen wurden freundlicherweise von F. Söderbom (Universität Uppsala) zur Verfügung gestellt.
11. Diskussion
149
tRNA Fragmente und deren Funktion in anderen Organismen
Die Existenz von tRNA-Fragmenten ist mittlerweile in vielen Organismen nachgewiesen.
Meistens handelt sich hierbei aber um Fragmente des 5´- oder 3´-Endes der tRNA oder so
genannte „halbe“-tRNA (~ 30 – 40 nt). In HeLa-Zellen wurden beispielsweise 19 nt große
Fragmente des 5´-Endes verschiedener tRNAs (Lys, Val, Gln, Arg) nachgewiesen, die sich durch
2´-O-Methylierung am 3´-Ende auszeichneten und Dicer-abhängig generiert wurden, aber nicht
mit Argonauten präzipitieren (Cole et al. 2009). Eine weitere Studie berichtet hingegen über
überwiegend mit Argonauten assoziierte tRNA-Fragmente mit 5´-Monophosphat und 3´-
Hydroxylgruppe (Haussecker et al. 2010). Gemeinsam ist den genannten tRNA-Fragmenten, dass
sie überwiegend cytoplasmatisch vorkommen. In Wurzeln von Arabidopsis mit Phosphatdefizit
wurde ebenfalls eine Anreicherung von 19nt-Fragmenten des 5´-Endes von tRNAs detektiert
(Hsieh et al. 2010). In Tetrahymena sind ~18-22 nt lange 3´-tRNA-Fragmente mit dem Piwi-
protein Twi12 assoziiert (Couvillion et al. 2010). Zusätzlich kommen in humanen Zellen durch
RNAseZ generierte 3´-tRNA Fragmente vor, die bevorzugt mit Ago3 und Ago4 interagieren
(Haussecker et al. 2010). Aus der Assoziation mit Argonauten erwächst auch die Vermutung,
dass kleine tRNA-Fragmente (tRFs, tsRNAs) möglicherweise siRNA oder miRNA ähnliche
Funktionen im Rahmen RNA vermittelter Genregulation, wie z.B. dem RNAi-Mechanismus,
spielen könnten (Thompson et al. 2009). Eine weitere Studie weist außerdem daraufhin, dass
sich hinter einigen annotierten humanen miRNAs tRNA-Fragmente verbergen (Schopman et al.).
In dem RNA-CLIP Experiment aus Dictyostelium waren 17nt Fragmente der 5´-Enden der
tRNACys(GCA) und tRNATrp(UGU) mit DnmA leicht angereichert. Deutliche Präferenz für DnmA zeigte
ein 3´-Fragment (20nt) der tRNAAla(AGC) sowie ein 42nt 3´-Fragment der tRNAGly(GCC). Mit welcher
Häufigkeit diese Fragmente in Wildtypzellen vorkommen und ob sie eine biologische Funktion
erfüllen, wird Inhalt zukünftiger Projekte sein.
Grundsätzlich müssen die konstitutiv generierten tRNA-Fragmente jedoch von stress-
induzierten tRNA Fragmenten (tiRNA – tRNA-derived stress-induced RNAs) unterschieden
werden, die Produkte von Ribonukleasen wie RNY1 aus Hefe und Angiogenin im Menschen
darstellen (zusammengefasst in Thompson et al. 2009) und meist im Anticodonloop geschnitten
werden. Für stress-induzierte 5´-tiRNA (aber nicht 3´-tiRNA) ist gezeigt worden, dass diese die
Translation (z. B. durch Beteiligung an der Verdrängung von Translations-Initiationsfaktoren
von der mRNA) inhibieren können (Ivanov et al. 2011). Zusätzlich sind 5´-tiRNAs an der
Induktion von Stressgranula beteiligt (Emara et al. 2010). Der Dnmt2-abhängigen tRNA
Methylierung ist eine Bedeutung bei der Erhaltung der tRNA Stabilität unter Stress
zugesprochen worden und es gibt erste Hinweise, dass Dnmt2 unter Stress in Stressgranula
lokalisiert (Schaefer et al. 2010b; Thiagarajan et al. 2010). Zudem wurde mittels
Immunopräzipitation eine Interaktion von Dnmt2 mit Proteinen aus RNA-
11. Diskussion
150
Prozessierungsmechanismen (u.a. dem Tranlationsinititationfaktor eIF4E) nachgewiesen
(Thiagarajan et al. 2010).
Die Interaktion von DnmA mit antisense-tRNA-Fragmenten
Ein überraschendes Ergebnis war die Entdeckung kurzer antisense-tRNA-Fragmente, die
ausschließlich mit DnmA-GFP präzipitierten. Inwiefern die as-Fragmente der tRNAGlu tatsächlich
deutlich verstärkt zu anderen as-tRNA-Fragmenten vorkommen, wird Gegenstand zukünftiger
Untersuchungen sein. Auch unter der Annahme, dass die RNA-CLIP-Daten aufgrund der
methodischen Grenzen nicht exakt die Stöchiometrie zwischen sense und antisense tRNA-
Fragmenten widerspiegeln, ist unwahrscheinlich, dass es sich bei den tRNA-Fragmenten um
Dicer-Produkte handelt. Geht man von einem Hybrid aus sense und antisense Fragmenten aus,
sind die as-Fragmente an jeder Seite ein paar Nukleotide kürzer. Klassische Dicerprodukte
hingegen würden sich durch 2nt 3´-Überhänge an jedem Ende des Hybrids auszeichnen. Das
Auftreten von kleinen antisense tRNA-Fragmenten wurde meines Wissens in der Literatur
bisher noch nicht beschrieben.
11.4. Biologische Funktionsanalyse von Dnmt2
11.4.1. Einfluss der tRNAAsp Methylierung auf die Translationseffizienz
Die Untersuchung des Einflusses der tRNAAsp Methylierung auf die Translationseffizienz sollte
gleichzeitig zwei Fragen beantworten:
a) Führt der Verlust der tRNAAsp-Methylierung durch DnmA zu einer Reduktion der
Translationseffizienz von Aspartat-reichen Regionen?
b) Inwiefern beeinflusst die DnmA-abhängige tRNA-Modifikation das „Wobbling“ der
tRNAAsp, da in Dictyostelium nur eine tRNAAsp(GUC)-Spezies bekannt ist, die das seltene GAC
Codon erkennt, aber keine tRNAAsp(AUC), die komplementär zum häufig benutzten GAU
Codon ist?
Das Experiment resultierte entgegen der Erwartung in einer leicht effizienteren Translation der
Asp-Leader-GFP-Reportergene in dnmAKO-Zellen im Vergleich zum Wildtyp. Grundsätzlich
scheint die Translationseffizienz zwischen Populationen mit dem gleichen genetischen
Hintergrund von Transformation zu Transformation jedoch stark zu variieren. Nur bei
paarweiser Betrachtung der Populationen mit Wildtyp- und Knockout-Hintergrund, die an einem
11. Diskussion
151
Tag entstanden sind, waren die Differenzen in der Translationseffizienz des Reportergens
zwischen Wildtyp- und dnmAKO-Zellen signifikant. Zusätzlich wurde entgegen der Erwartung das
seltenere GAC-Codon sowohl im Wildtyp als auch in den dnmAKO-Mutanten im Vergleich zum
GAU-Codon verstärkt translatiert. Inwiefern die beschriebenen Beobachtungen tatsächlich
vorliegen oder aufgrund der verwendeten Methoden resultiert, kann derzeit nicht eindeutig
geklärt werden.
Ein methodischer Einfluss könnte von der Bestimmung der mRNA Menge der Zellpopulationen
ausgegangen sein, die mittels relativer Quantitfizierung (qPCR) mit der ΔΔCt-Methode erfolgte.
Ein limitierender Faktor dieser Auswertungsmethode besteht darin, dass beispielsweise leichte
Unterschiede zwischen zwei Zellpopulationen verstärkt dargestellt werden, da von einer
Verdopplung des PCR-Produktes pro Zyklus ausgegangen wird. Da die Translationseffizienz als
Quotient aus der Fluoreszenz des GFP-Reportergens und dem zugehörigen mRNA Gehalt
definiert wurde, führt ein möglicherweise zu gering berechneter mRNA Gehalt zu einer
Erhöhung der Translationseffizienz. Ein nächster Schritt zur Überprüfung der Daten könnten
Kompensationsexperimente mit heterolog exprimierter DnmA in dnmAKO-Zellen sein.
In mehreren Wachstumsexperimenten, in denen Dictyostelium Wildtyp- und dnmAKO-Zellen über
mehrere Wochen cokultiviert wurden, überwuchs die Mutante den Wildtyp-Stamm (pers.
Mitteilung von S. Kasten). Ob eine erhöhte Wachstumsrate der Mutanten mit potentiell erhöhter
Translationseffizienz einhergeht, ist noch unklar.
Nakamura et al. (2006) stellten mit Hilfe eines in vitro Translationssystems fest, dass in
Chloroplasten von Tabakpflanzen die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens mit
vorgeschaltetem Codon-Block nicht unbedingt mit der Häufigkeit der Codons korreliert.
Beispielsweise wurden das Phenylalanin-Codon UUU sowie das Tyrosin-Codon UAC doppelt so
gut translatiert, obwohl es sich hierbei um die seltenen Codons der jeweiligen Codon-Familie
handelte. Zusätzlich hatte das GCU von den getesteten Alanin-Codons die höchste
Translationseffizienz, obwohl das Chloroplastengenom für keine tRNAAla(AGC) kodiert (Nakamura
et al. 2007).
In dem eukaryotischen Modellorganismus S. cerevisiae wurde ebenfalls mit Hilfe eines
Reportergens eine codonspezifische Rolle bei der Translationselongation für die TRM9-
vermittelte Modfikation der Position U34 beschrieben (Begley et al. 2007). TRM9 katalysiert den
letzten Schritt bei der Bildung von mcm5U34 und mcm5s2U34 der tRNAArg und tRNAGlu. Zur
Messung der Translationseffizienz wurde hier ein lacZ-Reportergen generiert, welches fünf-
oder zehnmal die Arginin-Codons AGA oder AGG enthielten. Bei gleicher Transkriptmenge ging
die Menge des Reporterenzyms ß-Galactosidase in TRM9-Mutanten um den Faktor 6 – 10
zurück. Weiterführende Experimente deuten daraufhin, dass die TRM9-abhängige Modifikation
vor allem die Translationseffizienz des AGA-Codons beeinflusst (Begley et al. 2007).
11. Diskussion
152
Ein Translationssystem der Arbeitsgruppe von A. Jeltsch, bei dem die Menge eines Asp-leader
Fluoreszenzproteins gegen ein Referenzprotein ohne Leader bestimmt wurde, zeigte in
vorläufigen Experimenten eine reduzierte Fluoreszenz des Reporterproteins in dnmt2-/- MEF-
Zellen (pers. Mitteilung von A. Jeltsch, Abt. Biochemie, Jacobs University, Bremen) und
widerspricht damit den in dieser Arbeit generierten Daten. Ein zweiter Ansatz dieser
Arbeitsgruppe adressiert außerdem die Beladung der tRNAAsp durch die Aminoacyl-tRNA-
Synthetase, da die Dnmt2-abhängige tRNA Modifikation die Translation auch auf diese Weise
beeinflussen könnte.
11.4.2. Protein-Protein-Interaktionen
Mittels Pulldown-Experimenten und nachfolgender Massenspektrometrie konnten in
Dictyostelium bisher keine Protein-Interaktionspartner von DnmA identifiziert werden. Die in
dieser Studie mit StrepII-DnmA leicht angereicherten Proteine, z. B. ein SNF2 ähnliches Protein
als Bestandteil eines Chromatin-remodeling-Komplex, eine eIF2a Kinase, eine ribosomale SAM-
MTase sowie RNA bindende Proteine, die in RNA Prozessierung im Kern involviert sind, ließen
sich aufgrund ihres thematischen Kontext als potentielle Dnmt2-Interaktionspartner einordnen.
Beispielsweise führten Mutationen in Proteinen aus Chromatin-remodeling-Komplexen wie der
SNF2-Familie zu veränderten DNA Methylierungsmustern in Pflanzen und Tieren (Jeddeloh et al.
1999; Gibbons et al. 2000). eIF2-Kinasen phosphorylieren den Translationsinitiationsfaktor eIF2
im Rahmen von zellulären Stressantworten, was zu globaler Translationsreduktion sowie
induzierter Translation spezifischer mRNAs spezieller Transkriptionsfaktoren führte (Wek et al.
2006). Insgesamt kommen die oben genannten Proteine aber mit zu geringerer Abdeckung vor
um eindeutig identifiziert zu werden. Möglicherweise ist dies auf die geringe endogene DnmA
Expression zurückzuführen, sofern Interaktionspartner in stöchiometrischen Mengen erwartet
werden. Ähnliche Interaktionsstudien mit Pmt1 aus S. pombe sowie ein Synthetic-lethal-Screen
konnten ebenfalls keine Interaktionspartner identifizieren (pers. Mitteilung, M. Becker, Abt.
Ehrenhofer-Murray, Universität Duisburg-Essen).
Für das Dnmt2-Homolog Ehmeth ist eine Interaktion mit dem glykolytischen Protein Enolase
beschrieben, welches inhibitorisch auf die tRNAAsp Methylierung durch Ehmeth wirkt (Tovy et al.
2010). Außerdem wurden kürzlich Troponin ähnliches Protein (keine Homologe in anderen
Organismen) und Krip1, ein Protein das in die Pathogenität von Entamoeba involviert ist, als
potentielle Interaktionspartner von Ehmeth entdeckt (pers. Mitteilung von S. Ankri, Technion,
Haifa, Israel). Wie im Kapitel 11.3 angesprochen, konnte außerdem gezeigt werden, dass Dnmt2
aus HeLa-Zellen mit Proteinen der RNA Prozessierungsmaschinerie interagiert (Thiagarajan et
al. 2010).
11. Diskussion
153
11.4.3. Beeinflusst DnmA die Aufnahme von Fremd-DNA?
Beobachtungen, dass Transformationen von Dictyostelium dnmAKO-Zellen mit integrierenden
Plasmiden häufig ineffizienter ausfielen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen und dass andere
Arbeitsgruppen über reduzierte DNA Aufnahme in Säugerzellen mit Dnmt2-Deletion berichteten
(pers. Mitteilung von M. Schäfer, Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg und T. Jurkowski, Abt. Jeltsch,
Jacobs University, Bremen), gaben Anlass dieses Phänomen systematisch zu untersuchen. Die
Hypothese bestand darin, dass DnmA möglicherweise in die DNA Reparatur involviert ist, wenn
das Transgen ins Genom inseriert, da in vorherigen Versuchen bereits gezeigt wurde, dass die
Anzahl an Integrationen von Transgenen in den dnmAKO-Stamm reduziert ist (Kapitel 10.3.4).
Über eine Methyltransferase aus Aspergillus, die an RAD5-ähnliche SWI2/SNF2 ATPasen
gekoppelt ist, wurde berichtet, dass die MTase Aktivität vermutlich auf bestimmte
Gegebenheiten wie z.B. DNA Reparatur beschränkt ist (Iyer et al. 2011). Dnmt1 wird
beispielsweise ebenfalls zu DNA Reparaturstellen gebracht um dort die Methylierung wieder
herzustellen (Mortusewicz et al. 2005).
Entgegen der Erwartung zeigte ein zweiter dnmAKO–Stamm (dnmAKO „rox“) keine reduzierte
Transformierbarkeit mit einem integrierenden Plasmid im Vergleich zur zuerst untersuchten
dnmAKO-Mutante. Gleichzeitig zeigte der dnmAKO „rox“- Stamm auch keine Mobilisierung des
Retrotransposons skipper (Kapitel 9.5.2 und 10.5.2 10.5.3). Die dnmAKO „rox“-Zellen wurden
durch ein anderes Konstrukt generiert und die Resistenzkassette im Nachhinein entfernt. Der
Knockout-Status wird durch ein einziges Stop-Codon erhalten. Wie der dnmAKO-Stamm ist der
dnmAKO „rox“-Stamm durch RT-PCR und Southern-Blot bestätigt worden (Daten nicht gezeigt
und pers. Mitteilung von C. Joppich und I. Windhof). Außerdem ist in beiden Stämmen die C38
Methylierung der tRNAAsp nicht detektierbar und im Rahmen der Translationsstudien verhielten
sich beide Stämme ähnlich, so dass es bisher keine Erklärung für das unterschieliche Verhalten
der beiden Stämme bezüglich der Transformierbarkeit und der skipper-Regulation gibt. Ob das
instabilere Genom durch die Mobilisierung des Retrotransposons im dnmAKO-Stamm mit der
reduzierten Transformationsfähigkeit mittels integrierender Plasmide in Verbindung steht, ist
bisher nicht untersucht. Eine systematische Untersuchung verschiedener Klone eines Stammes
zur Bestimmung der biologischen Varianzen genetisch identischer Organismen ist
möglicherweise erforderlich.
Im Vergleich zu den oben diskutierten Ergebnissen war ebenfalls unerwartet, dass der dnmAKO
„rox“- Stamm bezüglich der Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids signifikant
reduzierte Transformierbarkeit zeigte. Für das unterschiedliche Verhalten des dnmAKO „rox“-
Stammes bezüglich der verschiedenen Plasmide gibt es bisher ebenfalls keine Erklärung. Die
beiden Plasmide werden mit unterschiedlichen Antibiotika selektiert. Inwiefern die Ausbildung
11. Diskussion
154
der verschiedenen Resistenzen gegen Blasticidin und Geniticin (G418) die
Transformationseffizienz beeinflusst, ist ebenfalls nicht untersucht.
11.4.4. DnmA - ein Regulator des Retrotransposons skipper?
Die in dieser Arbeit erhobenen Daten lassen keine eindeutige Zuordnung der skipper
Mobilisierung als DnmA-Funktion zu. Nur der dnmAKO–Stamm, aber nicht der Stamm
dnmAKO „rox“, zeigt erhöhte Expression des Retrotransposons skipper. Im Gegensatz zu den
veröffentlichten Daten (Kuhlmann et al. 2005) konnten außerdem keine zusätzlichen
genomischen Integrationen von skipper gefunden werden. Erhöhte Transkriptionslevel von
Transposons ohne nachfolgende Transposition sind von Arabidopsis-Setzlingen bekannt, die im
Syntheseweg für 24nt-siRNA mutiert sind (Ito et al. 2011). 24 nt-siRNA sind an RNA vermittelter
DNA Methylierung beteiligt. In Arabidopsis können Teile von Transposons – meist einzelne LTRs
– als zirkuläre extrachromosomale Kopien vorkommen. Ob Retrotransposons in Dictyostelium
einzeln extrachromsomal vorliegen, ist bisher nicht bekannt. Experimente mit einer synthetisch
hergestellten Form des Retrotransposon TRE5-A integrierten jedoch reproduzierbar in das
extrachromosmale rDNA Palindrom (Siol et al. 2011). Sollten in den dnmAKO-Zellen zusätzliche
skipper-Kopien in einer extrachromosomalen Form vorliegen, ist wahrscheinlich, dass diese bei
der zur DNA Präparation genutzten Methode nicht erfasst wurden. Inwiefern die in dieser Arbeit
ermittelten vorläufigen qPCR-Daten tatsächlich auf zusätzliche LTR-Kopien in dnmAKO-Zellen
hinweisen, wird in Folgeexperimenten geprüft werden.
Zwischen dem Auftreten kleiner skipper RNAs und der Expression von Volllängetranskripten
konnte bisher kein Zusammenhang hergestellt werden. Die Synthese moderater Mengen kleiner
skipper RNAs ist nicht DnmA spezifisch.
Weitere Expressionsanalysen des Retrotransposons DIRS-1 sowie TRE5, das überwiegend in der
Nähe von tRNA-Genen inseriert, zeigten im dnmAKO-Stamm keine erhöhte Transkription (pers.
Mitteilung B. Boesler, Universität Kassel und T. Winckler, Friedrich-Schiller-Universität Jena).
In Drosophila wurde vor einigen Jahren die Deletion von Dnmt2 mit dem Verlust von H4K20me3-
Methylierung und der damit verbundenen Mobilisierung von Retrotransposons in somatischem
Gewebe in Verbindung gebracht (Phalke et al. 2009). Neueste Daten der Arbeitsgruppe von
F. Lyko bestätigen die erhöhte Expression von Retrotransposons in Drosophila-Dnmt2-
Mutanten. Außerdem konnten mittels inverser PCR neue genomische Insertionen lokalisiert
werden (pers. Mitteilung, M. Schäfer, Abt. Lyko, DKFZ, Heidelberg). Inwiefern die beschriebenen
Effekte mit DNA Methylierung in Verbindung stehen oder ob die Dnmt2-abhängige tRNA-
Modifikationen Auswirkungen auf möglicherweise auftretendes tRNA-Priming bei der
Retrotransposition hat, bleibt momentan Spekulation.
11. Diskussion
155
11.5. Das Bindeverhalten des Methylated-LINE-Binding-Proteins aus E. histolytica
Die mittels Rasterkraftmiksroskopie erhobenen Daten geben einen ersten Hinweis darauf, dass
das Methylated LINE Binding-Protein aus E. histolytica (EhMLBP) bevorzugt eine der beiden A/T-
reichen Regionen der RT-LINE DNA bindet. EhMLBP weist damit nicht nur keine Homolgien zu
„klassischen“ Methyl-CpG-bindenen Proteine (MBDs) auf, sondern zeigt zusätzlich mit der
Präferenz für asymmetrische C-Atome, die in A/T reiche Sequenzen eingebettet sind, eine
weitere Besonderheit. In Dicytostelium wurden bisher keine MBD-Homologe beschrieben. Die
selektive Bindung an asymmetrisch methylierte CpA/T-Dinukleotide des MBD2-Homologs aus
Drosophila konnte nicht zuverlässig reproduziert werden (Roder et al. 2000; Marhold et al.
2004), so dass EhMLBP auch unter den „Dnmt2-only“ Organismen eine Sonderrolle spielt. In
weiteren RKM-Studien kann die genaue Bindungsposition ermittelt werden, wenn biotinylierte
Primer verwendet werden und so ein Ende des RT-LINE Fragments spezifisch definiert werden
kann.
12. Literaturverzeichnis
156
12. Literaturverzeichnis
Agoston, A. T., P. Argani, et al. (2005). "Increased protein stability causes DNA methyltransferase 1 dysregulation in breast cancer." J Biol Chem 280(18): 18302-10.
Alexandrov, A., I. Chernyakov, et al. (2006). "Rapid tRNA decay can result from lack of nonessential modifications." Mol Cell 21(1): 87-96.
Anspach, N. (2009). Nukleinsäure–Proteinkomplexe der epigenetischen Genregulation: rasterkraftmikroskopische Einzelmoleküluntersuchungen. Genetics. Kassel, University of Kassel. PhD.
Ashraf, S. S., E. Sochacka, et al. (1999). "Single atom modification (O-->S) of tRNA confers ribosome binding." Rna 5(2): 188-94.
Banerjee, S., O. Fisher, et al. (2005). "Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR)." Mol Biochem Parasitol 139(1): 91-7.
Barat, C., V. Lullien, et al. (1989). "HIV-1 reverse transcriptase specifically interacts with the anticodon domain of its cognate primer tRNA." Embo J 8(11): 3279-85.
Barr, H., A. Hermann, et al. (2007). "Mbd2 contributes to DNA methylation-directed repression of the Xist gene." Mol Cell Biol 27(10): 3750-7.
Barrows, L. R. and P. N. Magee (1982). "Nonenzymatic methylation of DNA by S-adenosylmethionine in vitro." Carcinogenesis 3(3): 349-51.
Bartee, L., F. Malagnac, et al. (2001). "Arabidopsis cmt3 chromomethylase mutations block non-CG methylation and silencing of an endogenous gene." Genes Dev 15(14): 1753-8.
Begley, U., M. Dyavaiah, et al. (2007). "Trm9-catalyzed tRNA modifications link translation to the DNA damage response." Mol Cell 28(5): 860-70.
Bertinetti, D., S. Schweinsberg, et al. (2009). "Chemical tools selectively target components of the PKA system." BMC Chem Biol 9: 3.
Bestor, T., A. Laudano, et al. (1988). "Cloning and sequencing of a cDNA encoding DNA methyltransferase of mouse cells. The carboxyl-terminal domain of the mammalian enzymes is related to bacterial restriction methyltransferases." J Mol Biol 203(4): 971-83.
Birnboim, H. C. (1983). "A rapid alkaline extraction method for the isolation of plasmid DNA." Methods Enzymol 100: 243-55.
Bonin, M., J. Oberstrass, et al. (2001). "Binding of IRE-BP to its cognate RNA sequence: SFM studies on a universal RNA backbone for the analysis of RNA-protein interaction." Biol Chem 382(8): 1157-62.
Borst, P. and R. Sabatini (2008). "Base J: discovery, biosynthesis, and possible functions." Annu Rev Microbiol 62: 235-51.
Bostick, M., J. K. Kim, et al. (2007). "UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells." Science 317(5845): 1760-4.
Bourc'his, D. and T. H. Bestor (2004). "Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L." Nature 431(7004): 96-9.
Bourc'his, D., G. L. Xu, et al. (2001). "Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints." Science 294(5551): 2536-9.
Braconi, C., N. Huang, et al. "MicroRNA-dependent regulation of DNA methyltransferase-1 and tumor suppressor gene expression by interleukin-6 in human malignant cholangiocytes." Hepatology 51(3): 881-90.
Bradford, M. M. (1976). "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding." Anal Biochem 72: 248-54.
Cannon, S. V., A. Cummings, et al. (1988). "5-Hydroxymethylcytosine DNA glycosylase activity in mammalian tissue." Biochem Biophys Res Commun 151(3): 1173-9.
Cao, X. and S. E. Jacobsen (2002). "Role of the arabidopsis DRM methyltransferases in de novo DNA methylation and gene silencing." Curr Biol 12(13): 1138-44.
Chan, C. T., M. Dyavaiah, et al. (2010). "A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress." PLoS Genet 6(12): e1001247.
12. Literaturverzeichnis
157
Chedin, F. (2011). "The DNMT3 family of mammalian de novo DNA methyltransferases." Prog Mol Biol Transl Sci 101: 255-85.
Chen, L., A. M. MacMillan, et al. (1991). "Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methyltransferase." Biochemistry 30(46): 11018-25.
Chen, T., Y. Ueda, et al. (2003). "Establishment and maintenance of genomic methylation patterns in mouse embryonic stem cells by Dnmt3a and Dnmt3b." Mol Cell Biol 23(16): 5594-605.
Cheng, X. and R. M. Blumenthal (2011). "Introduction--Epiphanies in epigenetics." Prog Mol Biol Transl Sci 101: 1-21.
Cheng, X. and R. J. Roberts (2001). "AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping." Nucleic Acids Res 29(18): 3784-95.
Chernyakov, I., J. M. Whipple, et al. (2008). "Degradation of several hypomodified mature tRNA species in Saccharomyces cerevisiae is mediated by Met22 and the 5'-3' exonucleases Rat1 and Xrn1." Genes Dev 22(10): 1369-80.
Chiang, P. K., R. K. Gordon, et al. (1996). "S-Adenosylmethionine and methylation." Faseb J 10(4): 471-80.
Chomczynski, P. (1993). "A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples." Biotechniques 15(3): 532-4, 536-7.
Chubb, J. R., G. Bloomfield, et al. (2006). "Developmental timing in Dictyostelium is regulated by the Set1 histone methyltransferase." Dev Biol 292(2): 519-32.
Ciccone, D. N., H. Su, et al. (2009). "KDM1B is a histone H3K4 demethylase required to establish maternal genomic imprints." Nature 461(7262): 415-8.
Cirio, M. C., S. Ratnam, et al. (2008). "Preimplantation expression of the somatic form of Dnmt1 suggests a role in the inheritance of genomic imprints." BMC Dev Biol 8: 9.
Cohn, W. E. (1960). "Pseudouridine, a carbon-carbon linked ribonucleoside in ribonucleic acids: isolation, structure, and chemical characteristics." J Biol Chem 235: 1488-98.
Cole, C., A. Sobala, et al. (2009). "Filtering of deep sequencing data reveals the existence of abundant Dicer-dependent small RNAs derived from tRNAs." Rna 15(12): 2147-60.
Couvillion, M. T., R. Sachidanandam, et al. (2010). "A growth-essential Tetrahymena Piwi protein carries tRNA fragment cargo." Genes Dev 24(24): 2742-7.
Davis, F. F. and F. W. Allen (1957). "Ribonucleic acids from yeast which contain a fifth nucleotide." J Biol Chem 227(2): 907-15.
DeLano, W. L. ( 2002). "The PyMOL Molecular Graphics System." Delk, A. S. and J. C. Rabinowitz (1975). "Biosynthesis of ribosylthymine in the transfer RNA of
Streptococcus faecalis: a folate-dependent methylation not involving S-adenosylmethionine." Proc Natl Acad Sci U S A 72(2): 528-30.
Denhardt, D. T. (1966). "A membrane-filter technique for the detection of complementary DNA." Biochem Biophys Res Commun 23(5): 641-6.
Dhayalan, A., A. Rajavelu, et al. (2010). "The Dnmt3a PWWP domain reads histone 3 lysine 36 trimethylation and guides DNA methylation." J Biol Chem 285(34): 26114-20.
Dingermann, T., N. Reindl, et al. (1990). "Nonsense suppression in Dictyostelium discoideum." Dev Genet 11(5-6): 410-7.
Dominissini, D., S. Moshitch-Moshkovitz, et al. "Adenosine-to-inosine RNA editing meets cancer." Carcinogenesis.
Dong, A., J. A. Yoder, et al. (2001). "Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA." Nucleic Acids Res 29(2): 439-48.
Donmez, G., K. Hartmuth, et al. (2004). "Modified nucleotides at the 5' end of human U2 snRNA are required for spliceosomal E-complex formation." Rna 10(12): 1925-33.
Dubin, M. (2010). Nuclear organisation and epigenetic regulation of gene expression in Dictyostelium discodeum. Department of Genetics. Kassel, Kassel University.
Dubin, M., J. Fuchs, et al. (2010a). "Dynamics of a novel centromeric histone variant CenH3 reveals the evolutionary ancestral timing of centromere biogenesis." Nucleic Acids Res 38(21): 7526-37.
12. Literaturverzeichnis
158
Dubin, M. and W. Nellen (2010b). "A versatile set of tagged expression vectors to monitor protein localisation and function in Dictyostelium." Gene 465(1-2): 1-8.
Easwaran, H. P., L. Schermelleh, et al. (2004). "Replication-independent chromatin loading of Dnmt1 during G2 and M phases." EMBO Rep 5(12): 1181-6.
Eggermann, T., K. Eggermann, et al. (2008). "Growth retardation versus overgrowth: Silver-Russell syndrome is genetically opposite to Beckwith-Wiedemann syndrome." Trends Genet 24(4): 195-204.
Ehrlich, M., G. G. Wilson, et al. (1987). "N4-methylcytosine as a minor base in bacterial DNA." J Bacteriol 169(3): 939-43.
Eichinger, L., J. A. Pachebat, et al. (2005). "The genome of the social amoeba Dictyostelium discoideum." Nature 435(7038): 43-57.
Emara, M. M., P. Ivanov, et al. (2010). "Angiogenin-induced tRNA-derived stress-induced RNAs promote stress-induced stress granule assembly." J Biol Chem 285(14): 10959-68.
Emmerich, B., E. Zubrod, et al. (1985). "Relationship of queuine-lacking transfer RNA to the grade of malignancy in human leukemias and lymphomas." Cancer Res 45(9): 4308-14.
Engel, E. and C. D. DeLozier-Blanchet (1991). "Uniparental disomy, isodisomy, and imprinting: probable effects in man and strategies for their detection." Am J Med Genet 40(4): 432-9.
Esteve, P. O., H. G. Chin, et al. (2009). "Regulation of DNMT1 stability through SET7-mediated lysine methylation in mammalian cells." Proc Natl Acad Sci U S A 106(13): 5076-81.
Fabbri, M., R. Garzon, et al. (2007). "MicroRNA-29 family reverts aberrant methylation in lung cancer by targeting DNA methyltransferases 3A and 3B." Proc Natl Acad Sci U S A 104(40): 15805-10.
Fabrizio, P., S. Hoon, et al. (2010). "Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation." PLoS Genet 6(7): e1001024.
Feinberg, A. P. and B. Tycko (2004). "The history of cancer epigenetics." Nat Rev Cancer 4(2): 143-53.
Ferre-D'Amare, A. R. and J. A. Doudna (1996). "Use of cis- and trans-ribozymes to remove 5' and 3' heterogeneities from milligrams of in vitro transcribed RNA." Nucleic Acids Res 24(5): 977-8.
Finnegan, E. J., W. J. Peacock, et al. (1996). "Reduced DNA methylation in Arabidopsis thaliana results in abnormal plant development." Proc Natl Acad Sci U S A 93(16): 8449-54.
Fisher, O., R. Siman-Tov, et al. (2004). "Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica." Nucleic Acids Res 32(1): 287-97.
Fisher, O., R. Siman-Tov, et al. (2006). "Pleiotropic phenotype in Entamoeba histolytica overexpressing DNA methyltransferase (Ehmeth)." Mol Biochem Parasitol 147(1): 48-54.
Flusberg, B. A., D. R. Webster, et al. (2010). "Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing." Nat Methods 7(6): 461-5.
Gaudet, F., W. M. Rideout, 3rd, et al. (2004). "Dnmt1 expression in pre- and postimplantation embryogenesis and the maintenance of IAP silencing." Mol Cell Biol 24(4): 1640-8.
Gaudet, P., K. E. Pilcher, et al. (2007). "Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA." Nat Protoc 2(6): 1317-24.
Gibbons, R. J., T. L. McDowell, et al. (2000). "Mutations in ATRX, encoding a SWI/SNF-like protein, cause diverse changes in the pattern of DNA methylation." Nat Genet 24(4): 368-71.
Glockner, G., K. Szafranski, et al. (2001). "The complex repeats of Dictyostelium discoideum." Genome Res 11(4): 585-94.
Goll, M. G. and T. H. Bestor (2005). "Eukaryotic cytosine methyltransferases." Annu Rev Biochem 74: 481-514.
Goll, M. G., F. Kirpekar, et al. (2006). "Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2." Science 311(5759): 395-8.
Goodwin, T. J. and R. T. Poulter (2004). "A new group of tyrosine recombinase-encoding retrotransposons." Mol Biol Evol 21(4): 746-59.
12. Literaturverzeichnis
159
Gou, D., M. Rubalcava, et al. (2005). "SETDB1 is involved in postembryonic DNA methylation and gene silencing in Drosophila." PLoS One 5(5): e10581.
Gowher, H. and A. Jeltsch (2002). "Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases." J Biol Chem 277(23): 20409-14.
Goyal, R., R. Reinhardt, et al. (2006). "Accuracy of DNA methylation pattern preservation by the Dnmt1 methyltransferase." Nucleic Acids Res 34(4): 1182-8.
Hata, K., M. Okano, et al. (2002). "Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice." Development 129(8): 1983-93.
Hattman, S. (2005). "DNA-[adenine] methylation in lower eukaryotes." Biochemistry (Mosc) 70(5): 550-8.
Haussecker, D., Y. Huang, et al. (2010). "Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing." Rna 16(4): 673-95.
Heim, R. and R. Y. Tsien (1996). "Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer." Curr Biol 6(2): 178-82.
Hermann, A., S. Schmitt, et al. (2003). "The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5) methyltransferase activity." J Biol Chem 278(34): 31717-21.
Hinas, A., P. Larsson, et al. (2006). "Identification of the major spliceosomal RNAs in Dictyostelium discoideum reveals developmentally regulated U2 variants and polyadenylated snRNAs." Eukaryot Cell 5(6): 924-34.
Hinas, A., J. Reimegard, et al. (2007). "The small RNA repertoire of Dictyostelium discoideum and its regulation by components of the RNAi pathway." Nucleic Acids Res 35(20): 6714-26.
Hirasawa, R., H. Chiba, et al. (2008). "Maternal and zygotic Dnmt1 are necessary and sufficient for the maintenance of DNA methylation imprints during preimplantation development." Genes Dev 22(12): 1607-16.
Hodges, E., A. D. Smith, et al. (2009). "High definition profiling of mammalian DNA methylation by array capture and single molecule bisulfite sequencing." Genome Res 19(9): 1593-605.
Holliday, R. and J. E. Pugh (1975). "DNA modification mechanisms and gene activity during development." Science 187(4173): 226-32.
Honda, S. and E. U. Selker (2008). "Direct interaction between DNA methyltransferase DIM-2 and HP1 is required for DNA methylation in Neurospora crassa." Mol Cell Biol 28(19): 6044-55.
Horsthemke, B. (2008). "Elterliches Tauziehen im Genom." Biospektrum 06.08: 584-588. Horwich, M. D., C. Li, et al. (2007). "The Drosophila RNA methyltransferase, DmHen1, modifies
germline piRNAs and single-stranded siRNAs in RISC." Curr Biol 17(14): 1265-72. Hotchkiss, R. D. (1948). "The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by
paper chromatography." J Biol Chem 175(1): 315-32. Howard, P. K., K. G. Ahern, et al. (1988). "Establishment of a transient expression system for
Dictyostelium discoideum." Nucleic Acids Res 16(6): 2613-23. Howell, C. Y., T. H. Bestor, et al. (2001). "Genomic imprinting disrupted by a maternal effect
mutation in the Dnmt1 gene." Cell 104(6): 829-38. Hsieh, L. C., S. I. Lin, et al. (2010). "Abundance of tRNA-derived small RNAs in phosphate-starved
Arabidopsis roots." Plant Signal Behav 5(5). Huang, B., M. J. Johansson, et al. (2005). "An early step in wobble uridine tRNA modification
requires the Elongator complex." Rna 11(4): 424-36. Huntriss, J., M. Hinkins, et al. (2004). "Expression of mRNAs for DNA methyltransferases and
methyl-CpG-binding proteins in the human female germ line, preimplantation embryos, and embryonic stem cells." Mol Reprod Dev 67(3): 323-36.
Ito, H., H. Gaubert, et al. (2011). "An siRNA pathway prevents transgenerational retrotransposition in plants subjected to stress." Nature 472(7341): 115-9.
Ito, S., A. C. D'Alessio, et al. (2010). "Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification." Nature 466(7310): 1129-33.
Ivanov, P., M. M. Emara, et al. (2011). "Angiogenin-Induced tRNA Fragments Inhibit Translation Initiation." Mol Cell 43(4): 613-23.
12. Literaturverzeichnis
160
Iyer, L. M., S. Abhiman, et al., Eds. (2011). Natural history of eukaryotic DNA methylation systems. Prog Mol Biol Transl Sci.
Jablonowski, D., S. Zink, et al. (2006). "tRNAGlu wobble uridine methylation by Trm9 identifies Elongator's key role for zymocin-induced cell death in yeast." Mol Microbiol 59(2): 677-88.
Jackson, J. P., A. M. Lindroth, et al. (2002). "Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase." Nature 416(6880): 556-60.
Jeanpierre, M., C. Turleau, et al. (1993). "An embryonic-like methylation pattern of classical satellite DNA is observed in ICF syndrome." Hum Mol Genet 2(6): 731-5.
Jeddeloh, J. A., T. L. Stokes, et al. (1999). "Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein." Nat Genet 22(1): 94-7.
Jeffery, L. and S. Nakielny (2004). "Components of the DNA methylation system of chromatin control are RNA-binding proteins." J Biol Chem 279(47): 49479-87.
Jeltsch, A. (2002). "Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases." Chembiochem 3(4): 274-93.
Jeltsch, A., W. Nellen, et al. (2006). "Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases." Trends Biochem Sci 31(6): 306-8.
Jia, D., R. Z. Jurkowska, et al. (2007). "Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation." Nature 449(7159): 248-51.
Junk, S. (2010). In vivo und in vitro Analyse der Dnmt2-Methyltransferase DnmA aus Dictyostelium discoideum. Genetics. Kassel, University of Kassel. Examensarbeit.
Jurkowska, R. Z., N. Anspach, et al. (2008). "Formation of nucleoprotein filaments by mammalian DNA methyltransferase Dnmt3a in complex with regulator Dnmt3L." Nucleic Acids Res 36(21): 6656-63.
Jurkowski, T. P., M. Meusburger, et al. (2008). "Human DNMT2 methylates tRNA(Asp) molecules using a DNA methyltransferase-like catalytic mechanism." Rna 14(8): 1663-70.
Kadaba, S., A. Krueger, et al. (2004). "Nuclear surveillance and degradation of hypomodified initiator tRNAMet in S. cerevisiae." Genes Dev 18(11): 1227-40.
Kaller, M., U. Euteneuer, et al. (2006a). "Differential effects of heterochromatin protein 1 isoforms on mitotic chromosome distribution and growth in Dictyostelium discoideum." Eukaryot Cell 5(3): 530-43.
Kaller, M., W. Nellen, et al. (2006b). "Epigenetics in Dictyostelium." Methods Mol Biol 346: 491-505.
Kaneda, M., M. Okano, et al. (2004). "Essential role for de novo DNA methyltransferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting." Nature 429(6994): 900-3.
Kareta, M. S., Z. M. Botello, et al. (2006). "Reconstitution and mechanism of the stimulation of de novo methylation by human DNMT3L." J Biol Chem 281(36): 25893-902.
Katoh, M., T. Curk, et al. (2006). "Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum." Eukaryot Cell 5(1): 18-25.
Kawai, G., Y. Yamamoto, et al. (1992). "Conformational rigidity of specific pyrimidine residues in tRNA arises from posttranscriptional modifications that enhance steric interaction between the base and the 2'-hydroxyl group." Biochemistry 31(4): 1040-6.
Kessin (2001). Dictyostelium - Evolution, Cellular Biology & Development of Multicellularity, Cambridge University Press.
Kinney, S. R. and S. Pradhan (2011). "Regulation of expression and activity of DNA (cytosine-5) methyltransferases in mammalian cells." Prog Mol Biol Transl Sci 101: 311-33.
Ko, M., Y. Huang, et al. "Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2." Nature 468(7325): 839-43.
Kouzminova, E. and E. U. Selker (2001). "dim-2 encodes a DNA methyltransferase responsible for all known cytosine methylation in Neurospora." Embo J 20(15): 4309-23.
Krauss, V. and G. Reuter (2011). "DNA methylation in Drosophila--a critical evaluation." Prog Mol Biol Transl Sci 101: 177-91.
Kriaucionis, S. and N. Heintz (2009). "The Nuclear DNA Base 5-Hydroxymethylcytosine Is Present in Purkinje Neurons and the Brain." Science.
12. Literaturverzeichnis
161
Kuhlmann, M., B. E. Borisova, et al. (2005). "Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi." Nucleic Acids Res 33(19): 6405-17.
Kuhlmann, M., B. Popova, et al. (2006). "RNA interference and antisense-mediated gene silencing in Dictyostelium." Methods Mol Biol 346: 211-26.
Kunert, N., J. Marhold, et al. (2003). "A Dnmt2-like protein mediates DNA methylation in Drosophila." Development 130(21): 5083-90.
Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature 227(5259): 680-5.
Lafontaine, D., J. Delcour, et al. (1994). "The DIM1 gene responsible for the conserved m6(2)Am6(2)A dimethylation in the 3'-terminal loop of 18 S rRNA is essential in yeast." J Mol Biol 241(3): 492-7.
Lavi, T., E. Isakov, et al. (2006). "Sensing DNA methylation in the protozoan parasite Entamoeba histolytica." Mol Microbiol 62(5): 1373-86.
Lavi, T., R. Siman-Tov, et al. (2008). "EhMLBP is an essential constituent of the Entamoeba histolytica epigenetic machinery and a potential drug target." Mol Microbiol 69(1): 55-66.
Lavi, T., R. Siman-Tov, et al. (2009). "Insights into the mechanism of DNA recognition by the methylated LINE binding protein EhMLBP of Entamoeba histolytica." Mol Biochem Parasitol 166(2): 117-25.
Lehnertz, B., Y. Ueda, et al. (2003). "Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin." Curr Biol 13(14): 1192-200.
Lei, H., S. P. Oh, et al. (1996). "De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells." Development 122(10): 3195-205.
Leng, P., D. H. Klatte, et al. (1998). "Skipper, an LTR retrotransposon of Dictyostelium." Nucleic Acids Res 26(8): 2008-15.
Li, E., C. Beard, et al. (1993a). "DNA methylation, genomic imprinting, and mammalian development." Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58: 297-305.
Li, E., C. Beard, et al. (1993b). "Role for DNA methylation in genomic imprinting." Nature 366(6453): 362-5.
Li, E., T. H. Bestor, et al. (1992). "Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality." Cell 69(6): 915-26.
Li, J., Z. Yang, et al. (2005). "Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis." Curr Biol 15(16): 1501-7.
Lin, I. G., L. Han, et al. (2002). "Murine de novo methyltransferase Dnmt3a demonstrates strand asymmetry and site preference in the methylation of DNA in vitro." Mol Cell Biol 22(3): 704-23.
Lin, M. J., L. Y. Tang, et al. (2005). "DNA methyltransferase gene dDnmt2 and longevity of Drosophila." J Biol Chem 280(2): 861-4.
Lindroth, A. M., X. Cao, et al. (2001). "Requirement of CHROMOMETHYLASE3 for maintenance of CpXpG methylation." Science 292(5524): 2077-80.
Lindroth, A. M., D. Shultis, et al. (2004). "Dual histone H3 methylation marks at lysines 9 and 27 required for interaction with CHROMOMETHYLASE3." Embo J 23(21): 4286-96.
Lister, R., M. Pelizzola, et al. (2009). "Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences." Nature 462(7271): 315-22.
Liu, Y. and D. V. Santi (2000). "m5C RNA and m5C DNA methyl transferases use different cysteine residues as catalysts." Proc Natl Acad Sci U S A 97(15): 8263-5.
Livak, K. J. and T. D. Schmittgen (2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method." Methods 25(4): 402-8.
Lyko, F., B. H. Ramsahoye, et al. (2000). "DNA methylation in Drosophila melanogaster." Nature 408(6812): 538-40.
Maas, S., Y. Kawahara, et al. (2006). "A-to-I RNA editing and human disease." RNA Biol 3(1): 1-9. Malagnac, F., L. Bartee, et al. (2002). "An Arabidopsis SET domain protein required for
maintenance but not establishment of DNA methylation." Embo J 21(24): 6842-52.
12. Literaturverzeichnis
162
Malchow, D., B. Nagele, et al. (1972). "Membrane-bound cyclic AMP phosphodiesterase in chemotactically responding cells of Dictyostelium discoideum." Eur J Biochem 28(1): 136-42.
Marhold, J., K. Kramer, et al. (2004). "The Drosophila MBD2/3 protein mediates interactions between the MI-2 chromatin complex and CpT/A-methylated DNA." Development 131(24): 6033-9.
Martens, H., J. Novotny, et al. (2002). "RNAi in Dictyostelium: the role of RNA-directed RNA polymerases and double-stranded RNase." Mol Biol Cell 13(2): 445-53.
Massenet, S., A. Mougin, et al. (1998). Posttranscriptional modifications in the U small nuclear RNAs. Modification and Editing of RNA. H. Grosjean and R. Benne, Washington DC: ASM press: 201-227.
Maximov, V. (2010). Charakterisierung von DnmA, dem Dnmt2-Homolog in Dictyostelium discoideum. Genetics. Kassel, University of Kassel. PhD.
Meilinger, D., K. Fellinger, et al. (2009). "Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells." EMBO Rep.
Mertineit, C., J. A. Yoder, et al. (1998). "Sex-specific exons control DNA methyltransferase in mammalian germ cells." Development 125(5): 889-97.
Meusburger, M. (2008). Characterization of the substrate specificity of the Dnmt2 Methyltransferase. Combined faculties for Natural sciences and for Mathematics. Heidelberg, Ruperto-Carola University. Doctor of Natural Science.
Mortusewicz, O., L. Schermelleh, et al. (2005). "Recruitment of DNA methyltransferase I to DNA repair sites." Proc Natl Acad Sci U S A 102(25): 8905-9.
Motorin, Y. and H. Grosjean (1999). "Multisite-specific tRNA:m5C-methyltransferase (Trm4) in yeast Saccharomyces cerevisiae: identification of the gene and substrate specificity of the enzyme." Rna 5(8): 1105-18.
Motorin, Y. and M. Helm (2011). "RNA nucleotide methylation." Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA: n/a-n/a.
Mouaikel, J., C. Verheggen, et al. (2002). "Hypermethylation of the cap structure of both yeast snRNAs and snoRNAs requires a conserved methyltransferase that is localized to the nucleolus." Mol Cell 9(4): 891-901.
Mullis, K., F. Faloona, et al. (1986). "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction." Cold Spring Harb Symp Quant Biol 51 Pt 1: 263-73.
Munafo, D. B. and G. B. Robb (2010). "Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA." Rna 16(12): 2537-52.
Nakamura, M. and M. Sugiura (2007). "Translation efficiencies of synonymous codons are not always correlated with codon usage in tobacco chloroplasts." Plant J 49(1): 128-34.
O'Gara, M., S. Klimasauskas, et al. (1996). "Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implications of new crystal structures for HhaL methyltransferase-DNA-AdoHcy complexes." J Mol Biol 261(5): 634-45.
Oda, M., A. Yamagiwa, et al. (2006). "DNA methylation regulates long-range gene silencing of an X-linked homeobox gene cluster in a lineage-specific manner." Genes Dev 20(24): 3382-94.
Okano, M., D. W. Bell, et al. (1999). "DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development." Cell 99(3): 247-57.
Okano, M., S. Xie, et al. (1998). "Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases." Nat Genet 19(3): 219-20.
Ooi, S. K., C. Qiu, et al. (2007). "DNMT3L connects unmethylated lysine 4 of histone H3 to de novo methylation of DNA." Nature 448(7154): 714-7.
Otani, J., T. Nankumo, et al. (2009). "Structural basis for recognition of H3K4 methylation status by the DNA methyltransferase 3A ATRX-DNMT3-DNMT3L domain." EMBO Rep 10(11): 1235-41.
Panning, B. and R. Jaenisch (1996). "DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence X-linked genes." Genes Dev 10(16): 1991-2002.
12. Literaturverzeichnis
163
Phalke, S., O. Nickel, et al. (2009). "Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2." Nat Genet 41(6): 696-702.
Pinarbasi, E., J. Elliott, et al. (1996). "Activation of a yeast pseudo DNA methyltransferase by deletion of a single amino acid." J Mol Biol 257(4): 804-13.
Pradhan, M., P. O. Esteve, et al. (2008). "CXXC domain of human DNMT1 is essential for enzymatic activity." Biochemistry 47(38): 10000-9.
Pradhan, S., A. Bacolla, et al. (1999). "Recombinant human DNA (cytosine-5) methyltransferase. I. Expression, purification, and comparison of de novo and maintenance methylation." J Biol Chem 274(46): 33002-10.
Privat, E. and L. C. Sowers (1996). "Photochemical deamination and demethylation of 5-methylcytosine." Chem Res Toxicol 9(4): 745-50.
Puig, O., F. Caspary, et al. (2001). "The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification." Methods 24(3): 218-29.
Purdy, M. M., C. Holz-Schietinger, et al. (2010). "Identification of a second DNA binding site in human DNA methyltransferase 3A by substrate inhibition and domain deletion." Arch Biochem Biophys 498(1): 13-22.
Putz, J., C. Florentz, et al. (1994). "A single methyl group prevents the mischarging of a tRNA." Nat Struct Biol 1(9): 580-2.
Quigley, G. J. and A. Rich (1976). "Structural domains of transfer RNA molecules." Science 194(4267): 796-806.
Rahl, P. B., C. Z. Chen, et al. (2005). "Elp1p, the yeast homolog of the FD disease syndrome protein, negatively regulates exocytosis independently of transcriptional elongation." Mol Cell 17(6): 841-53.
Rai, K., S. Chidester, et al. (2007). "Dnmt2 functions in the cytoplasm to promote liver, brain, and retina development in zebrafish." Genes Dev 21(3): 261-6.
Randerath, E., L. L. Chia, et al. (1974). "Transfer RNA base composition studies in Morris hepatomas and rat liver." Cancer Res 34(3): 643-53.
Ratnam, S., C. Mertineit, et al. (2002). "Dynamics of Dnmt1 methyltransferase expression and intracellular localization during oogenesis and preimplantation development." Dev Biol 245(2): 304-14.
Reik, W., W. Dean, et al. (2001). "Epigenetic reprogramming in mammalian development." Science 293(5532): 1089-93.
Renart, J., J. Reiser, et al. (1979). "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure." Proc Natl Acad Sci U S A 76(7): 3116-20.
Riggs, A. D. (1975). "X inactivation, differentiation, and DNA methylation." Cytogenet Cell Genet 14(1): 9-25.
Robertson, K. D., K. Keyomarsi, et al. (2000). "Differential mRNA expression of the human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b during the G(0)/G(1) to S phase transition in normal and tumor cells." Nucleic Acids Res 28(10): 2108-13.
Roder, K., M. S. Hung, et al. (2000). "Transcriptional repression by Drosophila methyl-CpG-binding proteins." Mol Cell Biol 20(19): 7401-9.
Rothbauer, U., K. Zolghadr, et al. (2008). "A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins." Mol Cell Proteomics 7(2): 282-9.
Rydberg, B. and T. Lindahl (1982). "Nonenzymatic methylation of DNA by the intracellular methyl group donor S-adenosyl-L-methionine is a potentially mutagenic reaction." Embo J 1(2): 211-6.
Saikia, M., Y. Fu, et al. (2010). "Genome-wide analysis of N1-methyl-adenosine modification in human tRNAs." Rna 16(7): 1317-27.
Schaefer, M., S. Hagemann, et al. (2009a). "Azacytidine inhibits RNA methylation at DNMT2 target sites in human cancer cell lines." Cancer Res 69(20): 8127-32.
Schaefer, M. and F. Lyko (2009b). "Solving the Dnmt2 enigma." Chromosoma.
12. Literaturverzeichnis
164
Schaefer, M. and F. Lyko (2010a). "Lack of evidence for DNA methylation of Invader4 retroelements in Drosophila and implications for Dnmt2-mediated epigenetic regulation." Nat Genet 42(11): 920-1; author reply 921.
Schaefer, M., T. Pollex, et al. (2009c). "RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing." Nucleic Acids Res 37(2): e12.
Schaefer, M., T. Pollex, et al. (2010b). "RNA methylation by Dnmt2 protects transfer RNAs against stress-induced cleavage." Genes Dev 24(15): 1590-5.
Schaefer, M., J. P. Steringer, et al. (2008). "The Drosophila cytosine-5 methyltransferase Dnmt2 is associated with the nuclear matrix and can access DNA during mitosis." PLoS One 3(1): e1414.
Schmitz, K. M., C. Mayer, et al. "Interaction of noncoding RNA with the rDNA promoter mediates recruitment of DNMT3b and silencing of rRNA genes." Genes Dev 24(20): 2264-9.
Schöne, A. (2009). Strukturanalyse von Dictyostelium discoideum Centrosomen und Interaktion von centrosomen-modifizierenden Proteinen mit
Nukleinsäuren. Rasterkraftmikroskopische Untersuchungen. Genetics. Kassel, University of Kassel. Diploma thesis.
Schopman, N. C., S. Heynen, et al. "A miRNA-tRNA mix-up: tRNA origin of proposed miRNA." RNA Biol 7(5): 573-6.
Schotta, G. and G. Reuter (2000). "Controlled expression of tagged proteins in Drosophila using a new modular P-element vector system." Mol Gen Genet 262(6): 916-20.
Sharif, J., M. Muto, et al. (2007). "The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmt1 to methylated DNA." Nature 450(7171): 908-12.
Siol, O., T. Spaller, et al. (2011). "Genetically tagged TRE5-A retrotransposons reveal high amplification rates and authentic target site preference in the Dictyostelium discoideum genome." Nucleic Acids Res 39(15): 6608-19.
Sittka, A., S. Lucchini, et al. (2008). "Deep sequencing analysis of small noncoding RNA and mRNA targets of the global post-transcriptional regulator, Hfq." PLoS Genet 4(8): e1000163.
Smith, S. S. and D. I. Ratner (1991). "Lack of 5-methylcytosine in Dictyostelium discoideum DNA." Biochem J 277 ( Pt 1): 273-5.
Stallings, S. C. and P. B. Moore (1997). "The structure of an essential splicing element: stem loop IIa from yeast U2 snRNA." Structure 5(9): 1173-85.
Stein, R., Y. Gruenbaum, et al. (1982). "Clonal inheritance of the pattern of DNA methylation in mouse cells." Proc Natl Acad Sci U S A 79(1): 61-5.
Suetake, I., J. Miyazaki, et al. (2003). "Distinct enzymatic properties of recombinant mouse DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b." J Biochem 133(6): 737-44.
Sussman, R. and M. Sussman (1967). "Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic medium." Biochem. Biophys. Res. Commun. 29: 53-55.
Suzuki, M. M. and A. Bird (2008). "DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics." Nat Rev Genet 9(6): 465-76.
Svedruzic, Z. M. (2008). "Mammalian cytosine DNA methyltransferase Dnmt1: enzymatic mechanism, novel mechanism-based inhibitors, and RNA-directed DNA methylation." Curr Med Chem 15(1): 92-106.
Svedruzic, Z. M. (2011). "Dnmt1 structure and function." Prog Mol Biol Transl Sci 101: 221-54. Szyf, M., V. Bozovic, et al. (1991). "Growth regulation of mouse DNA methyltransferase gene
expression." J Biol Chem 266(16): 10027-30. Tahiliani, M., K. P. Koh, et al. (2009). "Conversion of 5-Methylcytosine to 5-
Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by the MLL Fusion Partner TET1." Science. Tamaru, H. and E. U. Selker (2001). "A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation
in Neurospora crassa." Nature 414(6861): 277-83. Thiagarajan, D., R. R. Dev, et al. (2010). "The DNA methyltranferase Dnmt2 participates in RNA
processing during cellular stress." Epigenetics 6(1). Thompson, D. M. and R. Parker (2009). "Stressing out over tRNA cleavage." Cell 138(2): 215-9.
12. Literaturverzeichnis
165
Thrall, S. H., J. Reinstein, et al. (1996). "Evaluation of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase primer tRNA binding by fluorescence spectroscopy: specificity and comparison to primer/template binding." Biochemistry 35(14): 4609-18.
Tovy, A., R. Siman Tov, et al. (2010). "A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity." PLoS Pathog 6(2): e1000775.
Towbin, H., T. Staehelin, et al. (1979). "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications." Proc Natl Acad Sci U S A 76(9): 4350-4.
Trowbridge, J. J., J. W. Snow, et al. (2009). "DNA methyltransferase 1 is essential for and uniquely regulates hematopoietic stem and progenitor cells." Cell Stem Cell 5(4): 442-9.
Urbonavicius, J., Q. Qian, et al. (2001). "Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications." Embo J 20(17): 4863-73.
Urbonavicius, J., S. Skouloubris, et al. (2005). "Identification of a novel gene encoding a flavin-dependent tRNA:m5U methyltransferase in bacteria--evolutionary implications." Nucleic Acids Res 33(13): 3955-64.
Vervoort, E. B., A. van Ravestein, et al. (2000). "Optimizing heterologous expression in dictyostelium: importance of 5' codon adaptation." Nucleic Acids Res 28(10): 2069-74.
Waddington, C. H. (1942). "The epigenotype." Endeavour 1. Walsh, C. P., J. R. Chaillet, et al. (1998). "Transcription of IAP endogenous retroviruses is
constrained by cytosine methylation." Nat Genet 20(2): 116-7. Wang, J., S. Hevi, et al. (2009). "The lysine demethylase LSD1 (KDM1) is required for
maintenance of global DNA methylation." Nat Genet 41(1): 125-9. Watts, D. J. and J. M. Ashworth (1970a). "Growth of myxameobae of the cellular slime mould
Dictyostelium discoideum in axenic culture." Biochem. J. 119: 171-174. Watts, D. J. and J. M. Ashworth (1970b). "Growth of myxameobae of the cellular slime mould
Dictyostelium discoideum in axenic culture." Biochem J 119(2): 171-4. Wek, R. C., H. Y. Jiang, et al. (2006). "Coping with stress: eIF2 kinases and translational control."
Biochem Soc Trans 34(Pt 1): 7-11. Westhof, E., P. Dumas, et al. (1985). "Crystallographic refinement of yeast aspartic acid transfer
RNA." J Mol Biol 184(1): 119-45. Wilkinson, C. R., R. Bartlett, et al. (1995). "The fission yeast gene pmt1+ encodes a DNA
methyltransferase homologue." Nucleic Acids Res 23(2): 203-10. Wittschieben, B. O., G. Otero, et al. (1999). "A novel histone acetyltransferase is an integral
subunit of elongating RNA polymerase II holoenzyme." Mol Cell 4(1): 123-8. Wu, J. C. and D. V. Santi (1987). "Kinetic and catalytic mechanism of HhaI methyltransferase." J
Biol Chem 262(10): 4778-86. Wyatt, G. R. (1950). "Occurrence of 5-methylcytosine in nucleic acids." Nature 166(4214): 237-8. Xu, G. L., T. H. Bestor, et al. (1999). "Chromosome instability and immunodeficiency syndrome
caused by mutations in a DNA methyltransferase gene." Nature 402(6758): 187-91. Yang, Z., Y. W. Ebright, et al. (2006). "HEN1 recognizes 21-24 nt small RNA duplexes and deposits
a methyl group onto the 2' OH of the 3' terminal nucleotide." Nucleic Acids Res 34(2): 667-75.
Yoder, J. A. and T. H. Bestor (1998). "A candidate mammalian DNA methyltransferase related to pmt1p of fission yeast." Hum Mol Genet 7(2): 279-84.
Yoder, J. A., N. S. Soman, et al. (1997). "DNA (cytosine-5)-methyltransferases in mouse cells and tissues. Studies with a mechanism-based probe." J Mol Biol 270(3): 385-95.
Yu, B., Z. Yang, et al. (2005). "Methylation as a crucial step in plant microRNA biogenesis." Science 307(5711): 932-5.
Yu, F., N. Zingler, et al. (2001). "Methyl-CpG-binding protein 2 represses LINE-1 expression and retrotransposition but not Alu transcription." Nucleic Acids Res 29(21): 4493-501.
Yu, Y. T., M. D. Shu, et al. (1998). "Modifications of U2 snRNA are required for snRNP assembly and pre-mRNA splicing." Embo J 17(19): 5783-95.
Zuker, M. (2003). "Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction." Nucleic Acids Res 31(13): 3406-15.
12. Literaturverzeichnis
166
Internetquellen
Genomic tRNA database: http://gtrnadb.ucsc.edu/GtRNAdb
Dictybase: http://dictybase.org
13. Erklärung
167
13. Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne unerlaubte
Hilfe angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt
habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten
Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in
einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden.
Kassel, 27.10.2011