Αντιβιοτικά & Αντοχή

by J.G.Routsias, MD, Ph.D

Αντιβιοτικά / Αντιμικροβιακά

Εκλεκτική εξουδετέρωση του εισβάλοντα μικροοργανισμού, χωρίς να βλάπτουν τα κύτταρα του ξενιστή

Σχετική εκλεκτική τοξικότητα (εξαρτάται από την συγκέντρωση του φαρμάκου)

Θέσεις δράσης των αντιβιοτικών

Στόχος κυτταρικό τοίχωμα

Gram (+) Gram (-)

Structure of a peptidoglycan monomer:

Polymerisation of a peptidoglycan monomer:

Formation of crosslinks:

Penicillin-Binding Protein (PBP)

The result of cross linking between peptidoglycan chains:

Inhibition of cell wall synthesis

Vancomycin acts by binding to the D-alanyl-D-alanine peptide termini of the nascent peptidoglycan-lipid carrier.

β-lactams inhibit PBP by bonding to its D-alanyl--D-alanine binding pocket. MRSA has acquired a gene for PBP2’ which has a very low binding affinity to b-lactam antibiotics. As a result the production of a cell wall can continue. This is the basis for Methicillin resistance in S. Aureus.

Βανκομυκίνη (δέσμευση με D-Ala-D-Ala)

β-λακταμικά

(Ιμιπενέμη)

(Αζτρεονάμη)

μοριακή μίμιση με D-Ala-D-Ala

Folic acid synthesis 50 50 50

30 30 30

DNA

mRNA

Ribosomes

PABA

DHFA

THFA

DNA gyrase Quinolones

Protein synthesis inhibition

Protein synthesis inhibition Tetracyclines

Protein synthesis mistranslation

Macrolides & Lincomycins

Cohen. Science 1992; 257:1064

DNA-directed RNA polymerase

Rifampin

Aminoglycosides

Sulfonamides

Trimethoprim

Άλλα αντιβιοτικά & στόχοι

(p-amino-benzoic acid)

Επιλογή αντιβιοτικών

1. Ευαισθησία του μικροοργανισμού (μέθοδο διάχυσης δίσκων, προσδιορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας κλπ)

2. Θέση λοίμωξης πχ αιματεγκεφαλικός φραγμός, προστατικό επιθήλιο

Επιλογή αντιβιοτικών

3. Κατάσταση του ασθενούς: Ανοσοκαταστολή, Νεφρική δυσλειτουργία, Ηπατική δυσλειτουργία, Κακή αιμάτωση, Εγκυμοσύνη, Θηλασμός, Ηλικία

4. Τοξικότητα/ασφάλεια του φαρμάκου 5. Κόστος θεραπείας 6. Βακτηριοστατικά/βακτηριοκτόνα

Βακτηριοκτόνα - Βακτηριοστατικά

Βακτηριοκτόνα. Ονομάζονται τα αντιβιοτικά που προκαλούν γρήγορα τον θάνατο των μικροβίων (πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες, αμινογλυκοσίδες, βανκομυκίνη κ.α.).

Βακτηριοστατικά. Ονομάζονται τα αντιβιοτικά που προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των μικροβίων (σουλφοναμίδες, τετρακυκλίνες, χλωραμφαινικόλη, ερυθρομυκίνη, κλινταμυκίνη κ.α.).

Επιλογή αντιβιοτικών

7. Συνδυασμοί φαρμάκων/συνέργεια

Αναστολείς του μεταβολισμού

Επιλογή αντιβιοτικών

8. Χημειοθεραπευτικό φάσμα – Καταστροφή χλωρίδας. Στενό φάσμα (ισονιαζίδη μυκοβακτηρίδια). Εκτεταμένο φάσμα (αμπικιλίνη gram+ & gram-). Ευρύ φάσμα (τετρακυκλίνη, χλωραμφενικόλη ποικιλία μικροβιακών ειδών). Μελέτη των pie-charts:

Τριμεθοπρίμη - Σουλφαμεθοξαζολη

Επιλογή αντιβιοτικών

9. Ανάπτυξη αντοχής στο αντιβιοτικό (αυτόματες μεταλλάξεις του DNA αλλαγή θέσεων στόχου, μεταβίβαση αντοχής στο φάρμακο ένζυμα που αδρανοποιούν το αντιβιοτικό κλπ)

Prevalence of PCN Resistant S. aureus

Τύποι αντοχής στα αντιβιοτικά

Ενδογενής αντοχή – Μερικά μικρόβια είναι γενετικά ανθεκτικά σε ορισμένα αντιβιοτικά

– πχ, Enterococci και aminoglycosides.

Επίκτητη αντοχή – Μεταλλάξεις (ESBLs, PBPs). – Ανταλλαγή γενετικού υλικού με plasmids, transposons

(VanA) ή μετασχηματισμό. – Επαγώμενη αντοχή με μεταβολή της έκφρασης γονιδίων

(πχ αποκαταστολή στο Enterobacter έπειτα από χρήση cephalosporin).

Ανταλλαγή γενετικού υλικού ανάμεσα σε βακτήρια

Multi-Drug Resistant Bacteria

Staphylococcus aureus 2 Nafcillin R Levofloxacin R Cefazolin R Clindamycin R Rifampin R Tetracycline R Tmp-sulfa R Vancomycin S

Staphylococcus aureus 1 Nafcillin R Levofloxacin S Cefazolin R Clindamycin S Rifampin S Tetracycline S Tmp-sulfa S Vancomycin S

Mechanisms of Multi-Drug Resistant S. aureus

ß lactamase (Penicillin)

Altered penicillin binding protein (nafcillin, cefazolin)

Efflux pump (quinolones)

Transposon encoded dfrA gene codes for altered DHFR (∆ιυδροφυλλική αναγωγάση) (trimethoprim-sulfamethoxazole)

Altered 23S rRNA (macrolides and clindamycin)

Έλεγχος ευαισθησίας

Φάρμακα για έλεγχο ευαισθησίας: – Set 1: Φάρμακα πρώτης εκλογής που χρησιμοποιούνται ευρέως

– Set 2: φάρμακα που χρησιμοποιούνται μόνο όταν:

ο μικροοργανισμός είναι ανθεκτικός στα 1ης εκλογής φαρμάκα

ή υπάρχουν άλλοι λόγοι όπως αλλεργία, νεφροτοξικότητα, ηπατοτοξικότητα, μη διαθεσιμότητα

Table 1: Basic sets of drugs for routine susceptibility test (http://w3.whosea.org/)

Set 1 Set 2 Staphylococcus Benzyl penicillin

Oxacillin Erythromycin Tetracycline Chloramphenicol

Gentamicin Amikacin Co-trimoxazole Clindamycin

Intestinal Ampicillin Chloramphenicol Co-trimoxazole Nalidixic acid Tetracycline

Norfloxacin

Enterobacteriaceae Urinary

Sulfonamide Trimethoprim Co-trimoxazole Ampicillin Nitrofurantoin Nalidixic acid Tetracycline

Norfloxacin Chloramphenicol Gentamicin

Blood and tissues Ampicillin Chloramphenicol Cotrimoxazole Tetracycline Gentamicin

Cefuroxime Ceftriaxone Ciprofloxacin Piperacillin Amikacin

Pseudomonas aeruginosa Piperacillin Gentamicin Tobramycin

Amikacin

Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων – vary amount of antimicrobial substances

incorporated into liquid or solid media – followed by inoculation of test bacteria

Μέθοδος διάχυσης – Put a filter disc, or a porous cup/a bottomless

cylinder containing measured quantity of drugs on the a solid medium that has been seeded with test bacteria

Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά

Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων

Broth dilution/ Agar dilution methods Permit quantitative results:

– Indicating amount of a given drug necessary to inhibit (bacteriostatic activity) or kill (bactericidal activity) the microorganisms tested

Minimum Inhibition Concentration (MIC) Minimum Bactericidal Concentration (MBC)

Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων

Minimum Bactericidal Concentration (MBC) : Ως ελάχιστη βακτηριοκτόνος συγκέντρωση ορίζεται η ελάχιστη συγκέντρωση των αντιβιοτικών που είναι αναγκαία για να φονεύσει ένα μικρόβιο (επιβιώνει <0.1% των μικροβίων).

Minimum Inhibition Concentration (MIC): Ως ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση ορίζεται η ελάχιστη συγκέντρωση των αντιβιοτικών που είναι αναγκαία για να αναστείλει την ανάπτυξη ενός μικροβίου.

Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων

Day 1

Add 1 ml of test bacteria (1*106 CFU/ml) to tubes containing 1 ml broth and concentration of antibiotic (mg/l)

Controls:

C1 = No antibiotic, check viability on agar plates immediately

C2 = No test bacteria

Bacterial conc.= 5*105 CFU/ml Incubate 35 oC, o/n

128 64 32 16 8 4 2 C1 C2

64 32 16 8 4 2 1 C1 C2

Day 2

Record visual turbidity

Subculture non-turbid tubes to agar plates (use 0.01 ml standard loop)

MIC = 16 mg/l

64 32 16 8 4 2 1 C1 C2

0.01 ml (spread plate), Incubate 35 oC, o/n

64 32 16

Day 3 Determine CFU on plates: At 16 mg/ = 700 CFU/ml > 0.1% of 5*105 CFU/ml MBC = 32 mg/l

Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων

Μέθοδος μικροαραιώσεων

Visualize turbidity – Light box/ mirror reader – Automated reader

Μέθοδος διάχυσης δίσκων

Disc diffusion method : The Kirby-Bauer test – Antibiotic-impregnated filter disc* – Susceptibility test against more than one

antibiotics by measuring size of “inhibition zone ” – 1949: Bondi and colleagues paper disks – 1966: Kirby, Bauer, Sherris, and Tuck filter

paper disks Demonstrated that the qualitative results of filter disk

diffusion assay correlated well with quantitative results from MIC tests

Μέθοδος διάχυσης δίσκων

Μέθοδος διάχυσης δίσκων

Procedure – Place the appropriate drug-

impregnated disc on the surface of the inoculated agar plate

– Invert the plates and incubate them at 35 oC, o/n (18-24 h)

– Measure the diameters of inhibition zone in mm

Bacterial growth

Μέθοδος διάχυσης δίσκων

Εκτίμηση των αποτελεσμάτων: – Σύγκριση των διαμέτρων με “standard tables”

– Ευαίσθητό – Ενδιάμεσης ευαισθησίας

Low toxic antibiotics: Moderate susceptible High toxic antibiotics: buffer zone btw resistant and susceptible

– Ανθεκτικό

Ε-test

E-Test – Antibiotic was applied to one

side – Interpretive scale printed on

another side

– The strip is placed on the surface of agar that has been inoculated with a lawn of test bacteria

Ε-test

E-Test – MIC = The point (read from scale) where the zone of

inhibition intersect the strip

MIC

The end

Αντιβιοτικά & Αντοχή by J.G.Routsias, MD, Ph.D