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18/02/2013
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Aplicações de Espectrometria de Massa
Prof. Alan J A McBride
Proteômica
2012.2
Tipos de MS
• GC-MS - Cromatografia gasosa MS• Separa compostos voláteis na coluna de gás e a identificação é por massa
• LC-MS - Cromatografia líquida MS• Separa compostos delicados em coluna de HPLC e a identificação é por massa
• MS-MS - Espectrometria de massa tandem• Separa fragmentos compostos pelo campo magnético e a identificação é por
massa
Ionização por electronspray (ESI)
• Massas moleculares até ca. 1200 Da• Dar origem a íons com uma única carga (M + H)+ ou (M - H)-
• Exemplo do espectro da leucina encefalina pentapeptídeo, YGGFL• C28H37N5O7 = 555,2692 Da• Íons dominantes: m/z 556,1
• M + H+ = 555,27 + 1
• Boa concordância com o valor teórico• Outros íons de menor intensidade:
• m/z 557,2• 12C foi substituído por um átomo de 13C
• m/z 578,1• Aductos íons de sódio (M + Na)+
ESI
• Massas moleculares > ca. 1200 Da • Dar origem a íons com cargas múltiplas (M + nH)n+ ou (M - nH)n-
• As proteínas têm muitos locais adequados para protonação;
• Exemplo de cargas múltiplas, que é o espectro m/z da proteína lisozima de ovo de galinha branca:• m/z varia entre 1101,5 e 2044,6;
• Cada pico é um molécula de proteína
intacta, um número diferente de cargas.
M. Mann, C. K. Meng, J. B. Fenn, Anal. Chem., 1989, 61, 1702
Exemplo: lisozima
• Os valores m/z são expressadas: • m/z = (MW + nH+)/n
• m/z = a razão massa-carga;
• MW = massa molecular da amostra;
• n = o número inteiro de cargas dos íons;
• H = massa de uma próton = 1,008 Da.
Exemplo: lisozima
• m/z = (MW + nH+)/n• Se os íons m/z = 1431,6 ter "n"• As taxas de íons m/z 1301,4 terá "n +1" cargas, • A equação acima pode ser escrita de novo para estes dois íons:• 1431,6 = (MW + nH+)/n e 1301,4 = [MW + (n+1)H+] /(n+1)
• n(1431,6) - nH+ = (n+1)1301,4 - (n+1)H+
• n(1431,6) = n(1301,4) +1301,4 - H+
• n(1431,6 – 1301,4) = 1301,4 - H+
• n = (1301,4 - H+) / (1431,6 – 1301,4) = 10
• 1431,6 = (MW + nH+)/n• 1431,6 x 10 = MW + (10 x 1,008) • MW = 14,316 – 10,08• MW = 14.305,9 Da
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Exemplo: lisozima
• Massa molecular observada, 14.305,9 Da, tem boa concordância com o valor teórico de 14.305,14 Da.
• Precisão usando ionização electrospray ou nanospray:• Dentro de 0,01% da massa molecular
• Representa o ± 1,4 Da
Exemplo: lisozima
• Pode converter o espectro m/z para um perfil de massamolecular:• Dominado pelo pico 14.305,7 Da
• Vários picos menores de massamaior - aductos de sal:• Na (M+23), K (M+39), H2SO4 ou H3PO4
(M+98).
• As massas moleculares podem ser lidos facilmente e sem ambiguidade
• Indicação da pureza da proteína.
Espectrometria de massa tandem
TOF
NANOSPRAY
TIP
ION
SOURCE
HEXAPOLE
COLLISION
CELL
HEXAPOLE
HEXAPOLE
QUADRUPOLE
MCP
DETECTOR
REFLECTRONSKIMMER
PUSHER
Espectrometria de massa tandem
• Finalidade é gerar íons do íon-precursor para fornecer informação estrutural sobre uma molécula.
• Além disso, permite a separação e identificação de compostos em misturas complexas.
• Utiliza dois ou mais analisadores de massa / filtros separados por uma câmara de colisão cheio com árgon ou xénon.
• Célula de colisão é onde os íons selecionados são encaminhados para uma maior fragmentação.
Espectrometria de massa tandem
• Configurações diferentes de MS-MS:• Quadrupolo-quadrupolo (baixa energia)
• Sector magnético-quadrupolo (alto)
• Quadrupolo-TOF (baixa energia)
• TOF-TOF (baixa energia)
• Experimentos de fragmentação também pode ser realizada em instrumentos analisadores individuais, tais como instrumentos de armadilha de íons e instrumentos TOF equipado com pós-fonte de decomposição.
Caracterização de Proteínas
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Por que Proteômica?
• As proteínas são os agentes activos biológicos em células.
• Sequências de DNA não mostram como as proteínas funcionam ou como biológica processos ocorrem.
• Proteínas sofrem modificações pós-transcricionais.
• Estruturas 3D afetar a função da proteína.
• O splicing alternativo.
The Human Proteome Initiative. (2007) http://ca.expasy.org/sprot/hpi/hpi_desc.html Retrieved March 24, 2009.
Desafios
• As análises de misturas complexas não são completas.
• Difícil preparar uma amostra pura.
• A expressão de proteínas é muito sensível às condições ambientais.
• Difícil de utilizar correntes de íons para determinar a abundância de peptídeos.
Perfil de proteínas
• Gerar mapas de proteoma de grande escala.
• Anotar e corrigir sequências genômicas.
• Analisar a expressão da proteína como uma função do estado celular.
MS-MS e Proteômica MS-MS Metodologia
• 2D-GE + MALDI-MS• Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
• 2D-GE + MS-MS• Sequence Tag/Fragment Ion Searching
• Multidimensional LC + MS-MS• ICAT (marcação com isótopos)
• MudPIT
• 1D-GE + LC + MS-MS
• De Novo Peptide Sequencing (MS-MS)
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MS-MS para identificar proteínas
• As proteínas são isolados (a partir de gel ou HPLC) e submetido a digestão tríptica;
• Peptídeos são enviados através de ionizador e numa célula de colisão, onde os íons duplamente carregados são seleccionados e fragmentados através de decomposição induzido por colisão (CID);
• Os íons resultantes com carga única (íons filha) são analisados para determinar a sequência ou a identidde do peptídeo-precursor.
Porque Tripsina para MS-MS?
• CID de peptídeos menos de 2-3 kDa é mais fiável para estudos MS-MS• A frequência de clivagem tríptica garante que a maioria dos peptídeos será
deste tamanho.
• Tripsina cliva no lado C-terminal da arginina e lisina;
• Os resíduos básicos estão no lado C-terminal;
• Então, os peptídeos fragmentam de um modo mais previsível ao longo do comprimento do peptídeo.
Por que carga dupla?
• É mais fácil de interpretar espectros obtidos a partir de péptideos-precursores duplamente carregadas:• Maioria dos fragmentos de íons têm carga única.
• Precursores com carga dupla fragmenta também de tal modo que a maior parte das ligações peptídicas romper com frequência similar, de fato que é mais provável para derivar uma sequência completa.
MS-MS e Fragmentos de Peptídeos
• Quando os peptídeos ou proteínas são admitidos para uma célula de colisão:• Usualmente fragmenta no ponto mais fraco da ligação (a ligação peptídica);
• Quebra nas ligações CH-NH e CH-CO também ocorre.
• Condições de colisão têm que ser otimizado para cada peptídeo;
• Dois tipos de íons-filha são produzidos:• "b" de íons e "y" de íons.
MS-MS Fragmentação de Peptídeos
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO…CO-NH-CH-CO2H
R1 R2 R3 Rn
yn-1 yn-2 y1
b1 b2 bn-1
b1 y1 b2 y2 b3 y3 b4 y4 b5 y5
MS-MS Fragmentação de Peptídeos
b1 y1 b2 y2 b3 y3 b4 y4 b5 y5
Ala-Gly-His-Leu-……Phe-Glu-Cys-Tyr
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MS-MS
• Peptídeos fragmento ao longo esqueleto do aminoácido para dar informação sobre a sequência.
• Peptídeos ca. 2500 Da ou menos produzir os dados mais úteis.
• A quantidade de informação sobre a sequência peptídica varia de um para o outro.
• Alguns peptídeos pode gerar dados suficientes para uma sequência completa de ser determinado, outros podem gerar uma sequência parcial de 4 ou 5 amino ácidos.
• A proteína digerida pode ser analisada como uma mistura de reação total, sem qualquer separação dos produtos, a partir da qual os peptídeos individuais são selecionados e analisados pelo MS para gerar informação sobre a sequência.
• Cerca de 4 µl de solução necessária para a análise da digestão• Proteína original de ca. 1-10 pmol/µl.
• MS-MS sequenciamento é um sensível técnica que consome pouco amostragem.
• As vezes, a sequência da proteína completa pode ser verificada:• Mas, 70-80% cobertura é razoável.
• Muitas vezes, a sequência de uma cauda de 4/5 aminoácidos de um peptídeo proteolítica único é suficiente para identificar a proteína a partir de um banco de dados.
Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de
fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que
correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.
Sequenciamento de novo de proteínas
A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela
determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do
exemplo, os íons y.
Sequenciamento de novo de proteínas
Sequenciamento de novo de Peptídeos (MS-MS)
• Feito quando a amostra não é susceptível de degradação de Edman;
• Feito quando não tem sequência ou perfil de PMF no bancos de dados;
• Requer um analisador de massa de elevada resolução (FT-ICR, QTofou instrumento QStar) com <20 ppm resolução;
• Normalmente exige que digerir várias enzimas;
• Ainda um processo difícil, mas possível de fazer em quantidades muito mais baixas do que degradação de Edman.
Protocolos para Sequenciamento MS-MS
• Normalmente não pode identificar a um íon "b" de um íon "y";
• Assumir a menor massa visível no espectro é uma lisina ou arginina:• É o íon y1
• Tripsina cliva após uma lisina ou arginina
• A massa y1 deve ser 147,113 para a lisina ou arginina para 175,119:• O íon y1 é calculado adicionando 19,018 u (três hidrogênios e um de oxigénio)
para as massas de resíduos de lisina e arginina.
Massas das Amino Ácidos
Glicina 57,02147Alanina 71,03712Serina 87,03203Prolina 97,05277Valina 99,06842Treonina 101,04768Cisteína 103,00919Isoleucina 113,08407Leucina 113,08407Asparagina 114,04293
Aspártico 115,02695Glutamina 128,05858Lisina 128,09497Glutâmico 129,04264Metionina 131,04049Histidina 137,05891Fenilalanina 147,06842Arginina 156,10112Tirosina 163,06333Triptofano 186,07932
Massa monoisotópico
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Anotar:
• Gly + Gly = 114.043 u e Asn = 114.043 u
• Ala + Gly = 128.059 u e Gln = 128.059 u and Lys = 128.095 u
• Gly + Val = 156.090 u e Arg = 156.101 u
• Ala + Asp = Glu + Gly = 186.064 e Trp = 186.079 u
• Ser + Val = 186.100 u e Trp = 186.079 u
• Leu = Ile = 113.084u
Protocolo
1. Preparação de amostra
2. Separação
3. Espectrometria de massa
Visão geral
Aebersold, R & Mann, M. (2003). Mass spectrometry based proteomics. Nature. 422, 198-207
Preparação de amostra
• A preparação da amostra inclui tudo o que se encontra entre a amostra e a primeira dimensão do gel 2D:• Células e culturas de células – multiplicar;
• Homogeneização e isolamento das proteínas;
• Remoção de contaminantes / limpeza;
• Fracionamento.
Remoção de contaminantes / limpeza
• Limpeza geral;
• melhorar a resolução;
• Melhorar a reprodutibilidade;
• Fracionamento;
• reduzir a complexidade;
• Melhorar a faixa de detecção;
• Enriqueça proteínas de baixa-abundância.
www.expressionproteomics.com
2. A segunda dimensão (separação por massa)
1. Tira de gel da 1ª dimensão é carregada
num gel de SDS-Page
2. SDS desnatura as proteínas (para
fazer o movimento dependente apenas
da massa, não de forma) e elimina a
efeito de carga.
1. A primeira dimensão (foco isoelétrica)
1. Gel com um gradiente de pH
imobilizado
2. Corrente causa as proteínas carregadas
para se mover até que atinja o ponto
isoeléctrico
Pode discriminar: ~1500-2500 proteínas
Gel SDS-Page em 2D
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Marcação
• Coloração:• Prata
• Coomassie blue
• Corantes fluorescentes
• Sypro Ruby• $$$
• Maracação radioisotópica
Movie
http://www.childrenshospital.org/research/_proteomics/index.html
Amostra de peptídeo Identificação dos Peptídeos
MS-MS e Proteômica
Vantagens
• Fornece dados precisos e específico da sequência.
• Mais informativos do que métodos PMF (> 90%).
• Pode ser usado para seqüenciamento de-novo (não totalmente dependente da base de dados).
• Pode ser usado para identificação de modificações.
Prejuízos
• Requer manipulação e manuseio da amostra.
• Requer equipamento mais caro e complicado.
• Exige conhecimentos de alto nível.
• Mais lenta, não geralmente larga-escala.
Quantificação de proteínas
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Proteômica Quantitativa Moderno
• Isotope-coded affinity tag (ICAT):• Isótopos pesados ou leves e a cauda de biotina pode modificar peptídeos
contendo cisteína;
• Grupo Aebersold, aplicou esta tecnologia para células de Saccharomyces cerevisiae.
• Proteómica quantitativa é a identificação e quantificação precisa da expressão de proteína total num genoma ou um complexo sistema híbrido:• Detectar as alterações quantitativas nas proteínas.
Descoberta da Proteômica vs. Proteômica Refinada
• Discovery versus targeted proteomics
• Proteômica de descoberta:• Otimiza a identificação de proteínas por gastar mais tempo e esforço por
amostra e reduzir o número de amostras analisadas.
• Proteômica refinada:• Estratégias limita o número de recursos que serão monitorados;
• Otimizar os métodos de cromatografia de afinação e aquisição de alcançar a maior sensibilidade
• Rendimento para centenas ou milhares de amostras
Proteômica Quantitativo Relativo e Absoluto
• MS é inerentemente não quantitativo:• Diferenças na eficiência de ionização;
• Detecção de muitos peptídeos numa determinada amostra
• Provocou o desenvolvimento de métodos para determinar a abundância relativa e absoluta de proteínas em amostras.
• A intensidade de um pico de espectro de massa não é um bom indicador da quantidade de substância a analisar na amostra.
Proteômica Quantitativo Relativo
• Separadamente analisar amostras por MS e comparar o espectro para determinar a abundância de péptidos em uma amostra em relação a um outro:• Estratégias de etiqueta sem quantificação
• Amostras diferentially marcadas são combinados e analisados em conjunto, e as diferenças nas intensidades dos picos dos pares isotópicos refletem com precisão a diferença na abundância das proteínas correspondentes.
Proteômica QuantitativoRelativo
• SILAC• Stable isotope labeling with amino
acids in cell culture
• ICAT• Isotope-coded affinity tag
• ITRAQ• Isobaric tags for relative and
absolute quantitation
• Marcação enzimática
Proteômica Quantitativo Absoluto
• Selected reaction monitoring (SEM)• Monitoramento de reação selecionada.
• Íon de massa particular é seleccionado na primeira fase de MS-MS• Íon-percursor.
• O íon-produto da fragmentação do íon-precursor é seleccionado para a segunda fase MS para detecção.
• ESI-Quadrupolo triplo MS:• Peptídeos marcados pesados (Ex. D, 13C, or 15N) para formar a curva de
calibração;• Número de cópias por célula do peptídeo nativo leve, e, por extensão, a sua
proteína parental.
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Analise de Glicanos
Glicobiologia
• Glicanos N-ligados são extremamente importantes na dobragem de proteínas em células eucarióticas.
• Células tumorais fazer glicanos N-ligados que são anormais e são reconhecidos pelo receptor CD337 nas células NK.
• Glicanos O-ligados são importantes no desenvolvimento de microflora intestinal normal.
• Outro tipo de glicano celular é os glicosaminoglicanos:• Heparina
MS no Glicobiologia
• Predominantemente utilizado na glicobiologia para caracterização e elucidação das estruturas de glicano.
• É um método complementar de HPLC para a análise de glicanos.
• Glicanos intactas são detectadas directamente:• Íons carregados individualmente por MALDI-MS;
• Ou, seguindo permetilação ou peracetylation, por bombardeamento com átomos rápidos de espectrometria de massa (FAB-MS’.
• ESI-MS dá bons sinais para os glicanos menores
Modificações pós-traducionais (PTM)
PTM
• Amino ácido alvos para PTM.
Deteção de Fosfoserina
200 600 1000 1400
m/z
10
30
50
Rela
tive A
bundance 843.9794.7
257.9128.9 445.8686.4
1331.2
174.1559.0 1262.5758.1326.3 1061.6961.4
629.91459.81175.2 1430.1
[M+2H]2+ - 49
y8y7
y6y5
y4
y1
y9
y12y13
y14-H3PO4
y14y10
b1 b2
b3-phos
846.7
y11 y15-H3PO4
b-ions 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
NH- K E s* S N T D S A G A L G T L R -OH
y-ions 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
s* = phosphoserine
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Identificação de Patógenos
Identificação de Patógenos
• MALDI-MS para identificar proteínas produzidas por bactérias;
• Bancos de dados de espectros MALDI para identificar as bactérias;
• Neste ponto, não há grande base de dados consistente está disponível.
• Teste respiratório da uréia para identificar Helicobacter pylori• Pacientes engolher uréia marcado com um isótopo raro, ex. 13C;• detecção de CO2 marcado com 13C no ar expirado indica que a ureia foi
clivado, que indica a presença de urease do H. pylori;• 13C é detectado por razão isotopo MS.
Aplicações de GC-MS
• Monitoramento ambiental e limpeza
• Forense criminal
• Antidoping
• Segurança, ex. aeroportos
• Análise de alimentos, bebidas e perfumes
• Astroquímica
• Medicina
GC-MS
• Doenças metabólicas congênitas que afetam os níveis sanguíneos de ácidos orgânicos;
• Sistema de análise integrada GC-MS, que é possível testar um recém-nascido por mais de 100 desordens metabólicas genéticas.
Outras aplicações de MS
• Isótopo datação e rastreamento
• Análise de vestígios de gás
• O mapeamento da localização dos átomos individuais
• Farmacocinética
• Exploração espacial
Conclusões
• Proteômica é extremamente valioso para a compreensão de processos biológicos e avançar o campo da biologia de sistemas.
• O principal objetivo da biologia de sistemas é a integração de dados de estas observações em modelos que possam, eventualmente, representar e simular a fisiologia da célula.