Post on 04-Apr-2015
ADN fœtal ADN fœtal
dans le sang materneldans le sang maternel
> J.M. COSTA Laboratoire Cerba
Colloque ATC Aix-en-Provence
20 Septembre 2010
Diagnostic prénatal Diagnostic prénatal in utero in utero en France : rappelsen France : rappels
Principales indications
• Anomalies chromosomiques 94.375
• Maladies et caractéristiques génétiques 2.881
– Mucoviscidose
– Hémoglobinopathies
– Amyotrophie spinale
– Achondroplasie…
• Foetopathies infectieuses 6.443
– Toxoplasmose
– Cytomégalovirus, parvovirus B19, varicelle…
Données Agence de la Biomédecine année 2007
Diagnostic des anomalies chromosomiques : 94.375
Indication
• Age maternel ( 38 ans) 30.677
• Marqueurs sériques 38.377
Soit de 345 à 690 pertes fœtales pour 895 trisomies 21
détectées
Diagnostic prénatal Diagnostic prénatal in utero in utero en France : rappelsen France : rappels
Données Agence de la Biomédecine année 2007
Les acides nucléiques circulants ou cellules fœtales ?
Diagnostic prénatal à partir du sang maternelDiagnostic prénatal à partir du sang maternel
ADN fœtal plasmatiqueADN fœtal plasmatique
Physiopathologie
• Origine cellulaire: les cellules
trophoblastiques
• Apparition précoce dans la circulation
maternelle ≈ 5-6SA
• Augmentation de la concentration
tout au long de la grossesse
• Disparition rapide (< 48 h) après
accouchement (1/2 vie 16 min)
• Pas de persistance après grossesse
ADN fœtal plasmatiqueADN fœtal plasmatique
Méthode d’étude de concept simple
• Recueil du plasma/sérum
• Extraction des acides nucléiques
• Analyse par biologie moléculaire
ADN fœtal plasmatiqueADN fœtal plasmatique
Difficultés et limites
Analyse moléculaire
• Séquençage…
• MLPA, QF-PCR…
• Caryotype moléculaire (CGH-array, SNP-
array)
ADN fœtal plasmatiqueADN fœtal plasmatique
Difficultés et limites d’analyse
• Ne représente que 3 à 6% de l’ADN
plasmatique
• Quantité faible au 1er trimestre : 20-30
Geq/ml
• Analyse restreinte à la détection de
séquences
absentes du génome maternel
Analyse de l’ADN fœtal plasmatiqueAnalyse de l’ADN fœtal plasmatique
Recherche de séquences absentes du génome maternel
XY
Détermination du sexe fœtal :Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gèneSRY)
Sérum positif (x4)
Sérum négatif (x4)
Diagnostic de sexe fœtal par analyse de l’ADN fœtal Diagnostic de sexe fœtal par analyse de l’ADN fœtal circulantcirculant
Détermination du sexe foetalDétermination du sexe foetal
Intérêts
– Maladies génétiques liées à l’X
– Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque)
– Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase)
– Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile)
– Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie
– Aide à la prise en charge.
Analyse de l’ADN fœtal plasmatiqueAnalyse de l’ADN fœtal plasmatique
Recherche de séquences absentes du génome maternel
RHD+
Génotypage RHD fœtal :séquences dérivées du gène RHD
RHD-
Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage génotypage RHDRHD
Les bases moléculaires du système rhésus
Gène RHD
Gène RHCE
98 % d’homologie au niveau nucléotidique
92 % d’homologie au niveau protéique
3’UTR
Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage génotypage RHDRHD
Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif
Phénotype RhD-positif 85 %
Phénotype RhD-négatif 15 %
+
+
del
+
del
del 43 %
42 %
Génotypage Génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang maternel: fœtal à partir du sang maternel: principeprincipe
Génome paternel RhD-positif
Sang maternel
Fœtus RhD-négatif
Génome maternel+
Génome foetal Fœtus RhD-positif
Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD
Génome maternel+
Génome foetal
Ex5 Ex7 Ex10
Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal non invasif fœtal non invasif
Indications
– Les patientes RhD-négatives allo-immunisées
• Eviter un geste invasif qui risque de réactiver l’immunisation
– Les patientes RhD-négatives devant subir un geste invasif
• Eviter une prophylaxie anti-D inutile
• Mise en place d’une prophylaxie immédiate
Intérêt: environ 30% des fœtus sont RhD-négatifs
o Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang
o Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités)
o Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111:8982-902). Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter:
– 278 femmes en l’absence de génotypage
– 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif
Diagnostic prénatal non invasif des maladies Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques monogéniques (ou caractéristique génétique)(ou caractéristique génétique)??
Un défi technologique majeur-1
Délétion/insertion, réarrangement complexe and expansion de triplets : IMPOSSIBLE (?)
Détection de mutation ponctuelle: ENVISAGEABLE …
si développement de techniques sensible de détection de séquences minoritaires• Real-time PCR (PNA, allele-specific…)
• PCR-dHPLC
• PCR-High Resolution Melting
• PCR et primer extension (MALDI-TOF)….
1% 0%2.5%
5%
Détection d’une population minoritaire d’allèle muté: Détection d’une population minoritaire d’allèle muté: exemple de la PCR-HRMexemple de la PCR-HRM
Proportion de l’allèle muté au sein d’un background « sauvage »
Analyse de l’ADN fœtal plasmatiqueAnalyse de l’ADN fœtal plasmatique
Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus
Mutation de novo : achondroplasie Recherche de la mutation G380R du gène FGFR3
Ce qui va changer ? (validation clinique en cours)
• Complément à l’analyse échographique
Ce qui pourrait se faire ?
• Hypochondroplasie• Nanisme thanatophore• Syndrome d’Apert
Analyse de l’ADN fœtal plasmatiqueAnalyse de l’ADN fœtal plasmatique
Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus
SNP paternel : génotypage KEL (K1) Recherche du variant Thr193Met du gène KEL
Ce qui va changer ? (validation clinique en cours)
• Plus de recours à l’amniocentèse chez les patientes allo-immunisées pour évaluation fœtale
Ce qui pourrait se faire ?
• Génotypage plaquettaire (HPA1…)• Diagnostic des maladies autosomiques dominantes
(paternelle)• Test de paternité
K1 K2
Diagnostic prénatal non invasif des anomalies Diagnostic prénatal non invasif des anomalies chromosomiques chromosomiques (trisomie 21)(trisomie 21)??
Un défi technologique majeur-2
Remaniements chromosomiques complexes: IMPOSSIBLE (?)
Aneuploïdies (trisomie 13, 18 et/ou 21) : POSSIBLE … par quantification du nombre de chromosomes du fœtus :
• Marqueurs non spécifiques
• Marqueurs spécifiques du foetus: ARN (fœtaux) placentaires ou marqueurs épigénétiques
Quantification de marqueurs NON-SPECIFIQUES
Chr21 mère
Foetus Euploïde Foetus T21
Chr21 foetus
ADN fœtal plasmatique et trisomieADN fœtal plasmatique et trisomie
Dosage chromosomique relatif (RCD) par Digital PCR
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
Quantification par « massively parallel sequencing »
“bridge amplification”
“by synthesis”
Massive parallel sequencing
“PCR emulsion” “by ligation”
Single molecule amplification
ADN fœtal plasmatique et trisomieADN fœtal plasmatique et trisomie
chromosomesreads
15 patientes (terme médian: 14 semaines)
Tous les cas (9) correctement identifiés
Quantification par « massively parallel sequencing »
18 patientes (terme médian: 18 semaines)
Tous les cas (9) correctement identifiés
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
Quantification par « massively parallel sequencing »
• Avantages• Démonstration pour la détection des trisomies 13, 18 et 21• Approche indépendante de polymorphismes
• Inconvénients• Coût et quantité de données générées (stockage)• En l’état actuel, formats inadaptés à un haut débit
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
Chr21
ADN/ARN fœtal plasmatique et trisomieADN/ARN fœtal plasmatique et trisomie
Foetus euploïde Foetus T21
Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ARNs placentaires
ARN fœtal circulant et trisomieARN fœtal circulant et trisomie
CGGGATAAATATCGACTC 5866.8 Da
CGGGATAAATATCGACTC 6035.0 Da
A
CT
CGGGATAAATATCGACTC 5359.6 Da
CGGGATAAATATCGACTC 5762.8 Da
C
MassARRAY® (Maldi-Tof)
Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs
ARN fœtal circulant et trisomieARN fœtal circulant et trisomie
Sensibilité: 90 % (valeur prédictive négative 96,5 %)
57 patientes fœtus à caryotype normal(mean gestation 13.0 weeks)
10 patientes fœtus trisomie 21(mean gestation 14.7 weeks)
Rati
o
Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs
ChrRef
ADN fœtal plasmatique et trisomieADN fœtal plasmatique et trisomie
Foetus euploïde Foetus T21
Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ADN hyperméthylé
Chr21
Ratio de HLCS /ZFY ADNs hyperméthylés
29 patientes (1er, 2nd and 3ème trimestre)
Tous les cas (5) correctement identifiés
Quantification par dosage chromosomique relatif
ADN fœtal plasmatique et trisomie 21ADN fœtal plasmatique et trisomie 21
Aspects règlementairesAspects règlementaires
L’analyse de l’ADN fœtal circulant est un acte de diagnostic prénatal
Laboratoires : Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH
Praticiens : Agrément par l’Agence de la Biomédecine
Déclaration annuelle des activités diagnostiques