1

Michele Schlich

Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente Sezione di Scienze del Farmaco

Università degli Studi di CagliariVia Ospedale 72,

09124 Cagliari+39 070 675 8554

mschlich@unica.it

ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI

2

“Farmaci intrinsecamente biologici in natura e realizzati

usando la biotecnologia” [AIFA]

Small molecules Biotecnologici

Anticorpi monoclonali, peptidi, ormoni, enzimi…PROTEINE

ACIDI NUCLEICIGeni, siRNA, aptameri, ribozimi, oligonucleotidi antisenso…

Altri…

3

Nucleotidi

Fosfato + zucchero + base azotata

Ribosio (RNA)Deossiribosio(DNA)

AdeninaGuaninaTimina (DNA)CitosinaUracile (RNA)Complementarietà delle basi

A - T (oppure U) G - C

4

Filamento singolo

Ibridazione

Doppio filamento

DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE

5

DNA

Nucleo

Proteina

TraduzioneRibosomi

RNA

Trascrizione

Singolo filamento

Doppio filamento

Tutte le funzioni vitali per la cellula

(trasporto, struttura, metabolismo..)

PATOLOGIA CON BASI GENETICHE

6

DNA

Nucleo

RNA

Trascrizione

Gene mutato!

• Nessun cambiamento•Funzione ridotta

• Funzione soppressa• Funzione alterata

Proteina

TraduzioneRibosomi

Diversa da quella normale!

ANEMIA FALCIFORME

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-GAG--CTC-

Nucleo

Gene mutato!

Gene sano

-GTG--CAC-

-GAG-

mRNA

Trascrizione

Trascrizione-GUG-

mRNA

TraduzionePRO GLUGLU

Emoglobina sana

TraduzioneVAL GLUPRO

Emoglobina mutata

HIV

8

TERAPIA GENICA (GENE THERAPY)

Somministrazione di acidi nucleici specifici (DNA o RNA) per correggere difetti genetici responsabili di una patologia

9

DNA

Nucleo

Proteina

TraduzioneRibosomi

RNA

Trascrizione

Singolo filamento

Doppio filamento

Gene

TERAPIA GENICA (GENE THERAPY)

Somministrazione di acidi nucleici specifici (DNA o RNA) per correggere difetti genetici responsabili di una patologia

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• Sequenza nota (gene)• Appaiamento di basi complementari• Particolare struttura secondaria

L’acido nucleico terapeutico induce/modifica/blocca l’espressione di

UN SOLO gene

ss = single strandedds = double stranded

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CATEGORIE DI ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI

• Aptameri

• Oligonucleotidi antisenso

• siRNA, miRNA e shRNA

• Ribozimi

• Geni

- espressione genica

espressione genica+

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APTAMERI

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• RNA o DNA a singolo filamento (15-60 nucleotidi)• Struttura secondaria specifica Legame con proteina bersaglio

che permette

APTAMERI ANTICORPI MONOCLONALI

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• Acidi nucleici

• PM ≈ 8-25 kDa

• Non immunogenici

• Termostabili

• Sintesi chimica

• Proteine

• PM > 120 kDa

• Immunogenici

• Termolabili - denaturazione

• Produzione biotecnologica

• farmacocinetica poco conosciuta

• rapida degradazione (nucleasi)

• rapida eliminazione renale

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SELEXSYSTEMATIC EVOLUTION OF LIGANDS BY EXPONENTIAL ENRICHMENT

Libreria di ssDNA(1014 sequenze diverse)

Aptamerospecifico

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APTAMERS – MARKETED & CLINICAL TRIALS

MACUGEN

Pegaptanib (27 nucleotides, PEGylated)Approvato in EU (2006) e USA per degenerazione maculareTarget protein: VEGF

Phase IIIE10030 – Degenerazione maculareREG1 – Anticoagulante per angioplastica coronarica…

Phase IIAS1411 – Leucemia mieloideNOX-E36 – Diabete di tipo 2NOX-A12 – Leucemia linfocitica cronicaNOX-H94 – Anemia of chronic diseases…

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

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• DNA a singolo filamento (13-25 nucleotidi)• Sequenza nucleotidica specifica Ibridazione con mRNA bersaglio

che permette

Traduzione

mRNAAsODN

AS-ODN: EXON SKIPPING

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Splincingesoni

introni

trascritto primario mRNA

1 2 3 4 mRNA maturo

1 2 3 4

Splicing degli introni

DNA

Nucleo

Proteina

TraduzioneRibosomi

RNA

Trascrizione

Singolo filamento

Doppio filamento

AS-ODN: EXON SKIPPING

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trascritto primario mRNA

Splincing

1 2 4

1 2 3 4

AsODN

OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

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1978 – scoperta [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75 (1978) 285–288]

• accessibilità mRNA

• rapida degradazione (nucleasi)

• rapida eliminazione renale

• ingresso cellulare impedito

• elevata specificità

• costi di produzione ridotti

mRNA

http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/

ASODN – MARKETED

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VITRAVENE

FomivirsenApprovato in US (1998) e EU per retinite da citomegalovirus pazienti affetti da HIV. Ritirato(2002) in seguito a riduzione casi per HAART

KYNAMRO

MipomersenApprovato in US (2013) per ipercolesterolemia familiareAIC rifiutata dall’EMA (2013) per insufficiente valutazione eff. indesiderati a lungo termine

EXONDYS 51

Eteplirsen (30 morpholino nucleotides)Approvato in US (2016) per distrofia muscolare di Duchenne.$300.000 / patient / year

SPINRAZA

Nusinersen (chemically modified AsODN)Approvato in US (2016) per atrofia muscolare spinale.

ASODN – CLINICAL TRIALS

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Phase IIIAlicaforsen – ulcerative colitisAganersin – corneal neovascularizationCustirsen – non small cell lung cancerPlazomicin – bloodstream infections,

complicated urinary tract infections…Phase IIATL1102 – multiple sclerosis…

www.clinicaltrials.govwww.genetherapynet.com/clinicaltrialsgov.html

SIRNA – SHORT INTERFERING RNA

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• RNA a doppio filamento (19-22 coppie di basi)

• “Silenziamento” dell’espressione genica attraverso RNAi

“L’interferenza a RNA è un meccanismo naturale, conservato dal punto di vista

evolutivo, altamente efficiente e specifico attraverso il quale un RNA a doppio filamento

(dsRNA) media l’inibizione dell’espressione di un gene”

[Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 672–703]

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DNA

Trascrizione

pri-miRNA

Drosha

pre-miRNA

Exportin 5

Nucleo

pre-miRNADicer

miRNAAgo2

Guide strand

Passenger strand

mRNA

RISC

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DNATrascrizione

pri-miRNA

Drosha

pre-miRNA

Exportin 5

Nucleo

pre-miRNA Dicer miRNA Ago2

Guide strand

Passenger strand

mRNA

RISC

shRNA expressing plasmids siRNA

• DNA codificante per un pri-miRNA• silenziamento genico stabile nel tempo• azione nel nucleo• competizione con RNAi endogeno

• siRNA duplex• silenziamento genico transitorio• azione nel citosol• no competizione con RNAi

sh = short hairpinsi = small interfering

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shRNA expressing plasmids – viral vectors

• elevata efficienza• penetrazione delle barriere• tossicità• immunogenicità

siRNA

• elevata specificità• no competizione con RNAi endogeno• produzione per sintesi chimica• potenziale elevato

• accessibilità mRNA• rapida degradazione (nucleasi)• rapida eliminazione renale• rischio di off-target effects• ingresso cellulare impedito• durata del silenziamento transitoria

miRNA-like off target

A G C C U G A A G A C U U C A A G G G C

U G C C U G A A G C C G A C A A U G G C

U C G G A C U U C U G A A G U U C C C G

mRNAtarget

altro mRNA

siRNA

U C G G A C U U C U G AA G U U C C C G

silencing

miRNA-like silencing

seed region (nucleotidi 2-8)

siRNA

SIRNA – CLINICAL TRIALS & PERSPECTIVES

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No marketed products (May 2017)

Phase IICand5 – diabetic macular edemaSYL040012 – open angle glaucomaAtu027 – metastatic pacreatic cancer

Phase IIIPatisiran – amyloidosis (results expected in 2017)Revusiran – amyloidosisQPI-1002 - Prevention of Delayed Graft Function in Kidney TransplantQPI-1007 - Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy

“I think they are potentially superdrugs. The fact is that siRNAs can be developed tosilence any gene; can be developedincredibly fast; can have picomolar efficacyand can have an effect that lasts for weeks.”Judy Lieberman, Harvard Medical School

A naked siRNA, injected into the eye, couldblock angiogenesis in mouse models of age-related macular degeneration regardless of itssequenceNature 452 (2008) 591-597

GENI

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Introduzione di DNA che contiene un gene in grado diprodurre una versione funzionante della proteina danneggiata/mancante

Vettori viraliVettori non virali

GENI

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estrazione delle cellule

trasfezione del gene

impianto delle cellule che

esprimono il nuovo gene

EX VIVO GENE THERAPY

IN VIVO GENE THERAPY

GENE THERAPY – MARKETED

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GENDICINE

Approved in China (2003) for head and neck squamous cell carcinomaP-53 gene in adenoviral vector.In vivo gene therapy

ONCORINE

Approved in China (2005) for late stage refractory nasopharyngeal cancer

NEOVASCULGEN

Approved in Russia (2012) for peripheral arterial disease.VEGF gene in plasmid vector

GLYBERA

Approved in EU (2012) for lipoprotein lipase deficiencyLPL gene in adenoviral vector + immunosuppressive therapy

STRIMVELIS Approved in EU (2016) for adenosine deamidase deficiency (ADA-Scid)

1.100.000 € / treatment

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SVANTAGGI COMUNI

Instabilità in circoloDegradazione da parte delle nucleasiRapida eliminazione renale

Ingresso cellulare impedito Site specific delivery

Immunogenicità

CATEGORIE DI ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI

• Aptameri

• Oligonucleotidi antisenso

• siRNA, miRNA e shRNA

• Geni

- espressione genica

espressione genica+

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Michele Schlich

Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente Sezione di Scienze del Farmaco

Università degli Studi di CagliariVia Ospedale 72,

09124 Cagliari+39 070 675 8554

mschlich@unica.it

GENE DELIVERY

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Somministrazione EV

Stabilità in circolo

Distribuzione al tessuto bersaglio

Ingresso nella cellulaUscita dall’endosomaIngresso nel nucleo (se necessario)

Idealmente…

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Somm. EV Stabilità in circolo Distribuzione al tessuto Ingresso nella cellula Uscita dall’endosoma Ingresso nel nucleo

Barriere cinetiche• Interazioni con proteine del plasma e matrice

• Captazione da parte degli organi del MPS• Eliminazione renale

• Degradazione da parte di nucleasi

Barriere fisiche• Parete dei vasi

• Barriere d’organo (BBB)• Membrana cellulare

• Membrana dell’endosoma• Membrana nucleare

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Interazioni con proteine del plasma e matrice

Nanoparticella diAcido nucleico

Opsonine

OpsonineProteine plasmatiche (laminina, fibronectina, albumina…)Componenti della matrice (collagene tipo I…)Immunoglobuline (IgG, IgM…)

La opsonizzazione dipende dalle proprietà chimico fisiche della nanoparticella e influisce

pesantemente sulla sua distribuzione

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Captazione da parte degli organi del MPS

MPS = mononuclear phagocite system

Kuppfer cell

MPSMonociti e macrofagi nei linfonodi, nel tessuto connettivo e nella milzaCellule di Kuppfer nel fegatoMacrofagi alveolari nei polmoni…

Necessarie modifiche che impediscano l’opsonizzazione e

l’uptake da parte del MPS

Rapida eliminazione renale

Necessario aumentare le dimensioni per impedire il passaggio del filtro renale

Drug Metabolism and Disposition (2006) 34(8):1393-1397

A causa del basso PM e dell’assenza di trasportatori per il riassorbimento gli acidi nucleici corti vengono eliminati in <10 minuti

Degradazione da parte di nucleasi

A G C C U G A A G A C U U C A A G G G C EsonucleasiTaglio all’estremità del filamento

EndonucleasiTaglio all’interno del filamento

Nucleasi: enzimi capaci di rompere il legame fosfodiesteretra due nucleotidi

Degradazione da parte di nucleasi

Resistenza alle nucleasi: DNA>RNA

Ribonucleasi (RNAsi) selettive per RNA, molto più efficienti e difficili da inattivare

Necessario conferire resistenza alle nucleasi/proteggere gli acidi

nucleici

Preparazione formulazioni contenenti siRNALavoro in condizioni RNAse-free

Extravasazione e accumulo nel tessuto bersaglio

Gli acidi nucleici somministrati come tali vengono degradati e/o si accumulano nei reni, nel fegato e nel tessuto linfatico.

Targeting

Passivo – diretto agli organi del MPS, ai tumori per effetto EPR

Attivo – agenti direzionanti (anticorpi, peptidi, zuccheri, aptameri…)

Fisico – pH, temperatura, campo magnetico esterno…

Se non sono questi i tessuti bersaglio

Ingresso cellulare

Carica superficiale degli acidi nucleici a pH fisiologico

Ingresso cellulare

Membrana cellulare

Proteoglicani, eparan solfato(carichi -)

Inoltre:• No diffusione passiva• No trasportatori specifici

Necessario permettere uptakecellulare

Uptake impedito

Uscita dall’endosoma (endosome escape)

Caratteristica che devono possedere i carrier per gli acidi nucleici (es. nanoparticelle)

lisosoma

endosomeescape

endosoma

Necessarie caratteristiche che inducano la permeabilizzazionedell’endosoma o l’uscita del carico prima della sua degradazione

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Gene delivery ideale•Impedire l’opsonizzazione•Impedire uptake da parte del MPS•Rallentare eliminazione renale•Conferire resistenza alle nucleasi•Indurre extravasazione nel tessuto bersaglio•Permettere uptake cellulare•Indurre endosome escape

Approccio chimicoModifica della struttura dell’acido nucleicoConiugazione con un’altra molecola

Inclusione in un nanocarrierPolimericoLipidicoMisto

• Legame con una proteina

• Blocco traduzione

• Danno mRNA e blocco traduzione

• Espressione genica

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PER VALUTARNE L’EFFICACIA

CATEGORIE DI ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI

• Aptameri

• AsODN

• siRNA/shRNA

• Geni

- espressione genica

espressione genica+

Concentrazione proteinaWestern BlotImmunoistochimica

Attività proteinaSaggi enzimatici

Concentrazione mRNARNA extraction + RT-PCRIbridazione in situ

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Modifica della struttura dell’acido nucleico

Obiettivi:Incrementare la resistenza alle nucleasiRidurre immunogenicità

APPROCCIO CHIMICO

49

PER VALUTARE LA RESISTENZA ALLE NUCELASI

1. Miscelare l’acido nucleico con RNAsi2. Fare dei prelievi dal mix a diversi minuti3. Disattivare le RNAsi per bloccare la degradazione4. Elettroforesi su gel di agarosio

0’ 2’ 6’ 0’ 2’ 6’ 10’ 20’

A-G-C-C-U-G-A-A-G-A-C-U-U-C-A-A-G-G-G-C

50

Coniugazione con altre molecole

Mediante creazione di legami covalenti.

Obiettivi:Incrementare la resistenza alle nucleasiRidurre immunogenicitàProlungare emivita plasmaticaMigliorare uptake cellulareTargeting attivo

APPROCCIO CHIMICO

Coniugazioni possibili:• colesterolo o lipidi• anticorpi o aptameri• cell penetrating peptides• PEG

siRNA

cholesterol

cholesterol-siRNA conjugate

51

Coniugazione con altre molecole - lipidi APPROCCIO CHIMICO

lipid-siRNA conjugate

+ uptake cellulare

52

Coniugazione con altre molecole - lipidi APPROCCIO CHIMICO

=

+ uptake cellulare

53

Coniugazione con altre molecole – targeting agent APPROCCIO CHIMICO

+ uptake cellulare+ targeting

J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 8848–8849

54

Inclusione in un nanocarrier NANOCARRIER

+ polimero cationico

+ lipidi cationici

Acido nucleico

POLIPLESSO

LIPOPLESSO

Mediante attrazione elettrostatica, incapsulazione, interazioni supramolecolari…

Obiettivi:Incrementare la resistenza alle nucleasi Ridurre immunogenicitàProlungare emivita plasmatica Migliorare uptake cellulareTargeting attivo (agente direzionante)

55

Inclusione in un nanocarrier NANOCARRIER

+ polimero cationico

+ lipidi cationici

Acido nucleico

POLIPLESSO

LIPOPLESSO

• Elevato uptake cellulare• Ottima incapsulazione degli acidi nucleici

• Rapida opsonizzazione e captazione da parte del MPS• Nessuna specificità tissutale• Tossicità

Nanoparticelle (NP) cationiche

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Nanocarriers polimerici NANOCARRIER

Polietilenimina (PEI)

Protamina

PAMAM dendimers

Chitosan

Micelle-forming co-polymers

Cyclodextrins

…

Caratteristiche importanti

Biocompatibilità

Peso molecolare

Carica

Possibilità di modifiche chimiche (PEGylazione, inclusione di un agente direzionante)

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NANOCARRIERSPOLIMERICI

POLIETILENIMINA

Linear polyethylenimine (LPEI) Branched polyethylenimine (BPEI)

• Carica del poliplesso dipendente da N/P ratio• Efficace protezione dalle nucleasi e ingresso cellulare• Endosome escape per proton sponge effect• BPEI associato a tossicità su alcune linee cellulari e in vivo

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Proton sponge effect

H+H+

H+

H+ H+

H+ H+

H+

H+H+

Il polimero maggiormente protonato dovrebbe avere un’affinità maggiore per l’acido nucleico

NANOCARRIERSPOLIMERICI

59

NANOCARRIERSPOLIMERICI

POLIETILENIMINA

SNCA = α sinucleinasiSNCA = siRNA per α sinucleinasiNC = siRNA controllo negativoLipo = lipofectamine 2000 (potente agente di trasfezione usato come controllo positivo)

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NANOCARRIERSPOLIMERICI

PROTAMINA

• Proteine di origine naturale ricche in aminoacidi basici (Arg)• Carica netta positiva (a pH fisiologico le Arg sono protonate)

Sono in grado di condensare gli acidi nucleici

TS1/22 = anticorpo monoclonaleTS1/22-P = anticorpo legato alla protaminaCCR5 = gene da silenziare

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NANOCARRIERSPOLIMERICI

CHITOSANO

• Polisaccaride con gruppi amminici protonabili• Forma nanoparticelle con gli acidi nucleici• Buon uptake cellulare ma…

…nessun meccanismo di endosome escape.

CYS-HIS CYS-HIS CYS-HIS

CYS-HIS =

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NANOCARRIERSPOLIMERICI

CHITOSANO

CYS-HIS CYS-HIS CYS-HIS

Bafilomycin A1 = inibitore della pompa protonica sulla membrana degli endosomiChi-CH = chisosano modificato con Cisteina-Istidina Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1087–1095

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Nanocarriers lipidici NANOCARRIER

Fosfolipidi

Sfingolipidi

Lipidi anfifilici di sintesi

Colesterolo

…

Caratteristiche importanti

Biocompatibilità

Carica

Comportamento in ambiente acquoso (formazione di micelle, doppi strati…)

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Nanocarriers lipidici NANOCARRIERSLIPIDICI

DNA : lipid ratio

DNA : lipid ratio DNA : lipid ratio

DNA : lipid ratio

Gene expression Toxicity

Journal of Controlled Release 66(2000) 255-269

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Nanocarriers lipidici NANOCARRIERSLIPIDICI

Carica positiva

Cell uptakeSmall size

ToxicityAspecific

interactions

Per ridurre/mascherare la carica positiva:• Rivestimento con PEG• Mix con lipidi neutri

circulation lungs

liver tumour

Cationic lipoplexesPEGylated lipoplexes

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Nanocarriers lipidici NANOCARRIERSLIPIDICI

Alcune strategie di endosome escape per i nanocarriers lipidici

Helper lipidsDOPE

Fusogenic peptidesTAT, GALA, Penetratin…

Liang, Lam - Endosomal Escape Pathways for Non-Viral Nucleic Acid Delivery Systems (2012)

Random coil Alpha helix

H +

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