8 - ÖKARYOTLARDA GEN İFADESİNİN DÜZENLENMESİ

1. Ökaryot gen düzenlenmesi farklı basamaklarda olabilir

2. Kromatin modifikasyonları

3. Transkripsiyonun düzenlenmesi

4. Transkripsiyon sonrası düzenlenme

5. RNA sessizleştirmesi

6. mRNA kararlılığı

Başlıklar

Giriş

3

❖ Çok hücreli ökaryotlarda gen ifadesinin farklı şekillerde

düzenlenmesi, embriyonik gelişim için son derece önemlidir.

❖ Örn; pankreas hücreleri retina pigmenti yapamazken,

retina hücreleri de insülin üretemez.

❖ O halde organizma, farklı hücre tiplerinde farklı gen

takımlarını nasıl çalıştırmaktadır?

Giriş

4

❖ Bu olayın temelinde, genomun özgül kısımlarını etkin

hale getiren ve diğer genleri baskılayanmekanizmalar vardır.

❖Gen ifadesinin düzenlenmesi şu şekillerde

gerçekleşir:

❖ Pozitif (transkripsiyonun aktifleştirilmesi)

❖ Negatif (transkripsiyonun baskılanması)

❖ Bir genin kendisi yapısal olarak normal olsa bile,

yanlış hücre tipinde, yanlış zamanda ve

anormal miktarda ifade edilmesi, sağlıksız bir fenotipe neden olabilir.

1. Ökaryot gen düzenlenmesi farklı basamaklarda gerçekleşir

5

Ökaryotlardaki düzenlenme prokaryotlara göre daha

karmaşıktır:

1. Ökaryotik hücreler daha fazla miktarda genetik

bilgi taşır ve histonlarla ve diğer bazı proteinlerle

kompleks oluşturmuştur.

DNA-protein kompleksi, gen düzenlenmesi için

önemli bir açma-kapama düğmesidir.

2. Ökaryotlarda transkripsiyon ve translasyon, yer ve

zaman açısından birbirinden ayrılmıştır.

6

3. Ökaryotik genlerin transkripsiyon ürünleri,

sitoplazmaya aktarılmadan önce moleküler

işlemlerden geçirilir.

4. Ökaryotik mRNA’ların yarı ömrü, prokaryotlara göre

daha uzundur. mRNA yarı ömrü de hücre tipine ve

zamana göre değişir – bu sayede başka bir kontrol

daha sağlanmış olur

5. Ökaryotlarda translasyon hızı da ayrıca düzenlenebilir

1. Ökaryot gen düzenlenmesi farklı basamaklarda gerçekleşir

1. Kromozom organizasyonu

2. Transkripsiyonel kontrol

3. Transkripsiyon sonrası kontrol

4. Sitoplazmaya aktarım

5. mRNA kararlılığı

6. Translasyonel kontrol (örn; hangi mRNA’nın translasyona uğrayacağınınseçimi)

7. Protein ürünlerinin translasyonsonrası değişimi

7

1. Ökaryot gen

düzenlenmesi farklı

basamaklarda gerçekleşir

❖ Interfaz çekirdeğindeki her kromozom, kromozom

sahası denilen ve onu diğer kromozomlardanayıran bir bölgede bulunur.

❖ Kromozomlar arasında DNA bulunmayan

kanallar bulunur: kromozomlar arası bölmeler.

❖ Kromozomlar büyüklüklerine ve içerdikleri gen

yoğunluğuna göre çekirdekte organize olurlar.

❖ Daha az sayıda gen içerenler dış çevrede

yerleşirken, daha yoğun gen içerenler iç bölgelerde bulunur.

8

2. Kromozom organizasyonu

❖ Kromozomlar devamlı olarak yeniden düzenlenir.

❖ Transkripsiyona uğrayan aktif genler, kromozomlar arası

bölmelerin sınırlarına doğru konumlanırlar.

❖ Bu sayede aktif olan diğer genlerle koordinasyon

sağlandığı düşünülmektedir

❖ Bu bölgelerde transkripsiyon proteinleri toplanmış

durumdadır.

9

2. Kromozom organizasyonu

2.1 Kromatin yeniden şekillenmesi

Kromatin iki şekilde değişikliğe uğratılır:

1. Nükleozomlar yani histonlara kimyasal gruplar

eklenerek1. Asetillenme, fosforlanma, metillenme

• Bu sayede DNA-histon arası bağlar zayıflar ve

transkripsiyon proteinlerinin DNA’ya erişimi kolaylaşır

2. İşlem tam tersine de çevrilebilir.• Engelleyici enzimler asetilenmiş histonların asetil

gruplarını keser ve transkripsiyon durdurulur

AsetillenmeDe-asetillenme

2. DNA metillenmesi:

• DNA bazlarına metil grubu eklenmesi veya çıkarılması

• Genellikle CG çiftleri şeklinde bulunan sitozine eklenir = CpG

adaları

• Bunlar genomda rastgele yerleşmemiştir ve genellikle genlerin

promotor bölgelerinde yoğunlaşmışlardır

• Bu bölgelerdeki DNA ne kadar çok metillenmişse o genin ifadesi o

kadar baskılanmıştır.

• Metillenme kalıtılır: Her dokuda farklı bölgeler metillenmiştir ve

hücreler çoğaldığında yeni oluşan hücrelerde de aynı bölgelerin

metillenmiş olduğu görülür

• Nasıl baskılar?

• Metillenmiş DNA’ya transkripsiyon faktörleri bağlanamaz çünkü

başka baskılayıcı proteinler bağlanır

2.1 Kromatin yeniden şekillenmesi

Sitozin 5-metilsitozin

Aktif transkripsiyon İnaktif transkripsiyon

Transkripsiyon faktörü: TF

Gen Gen

Orak hücre anemisi tedavisi

❖ Bir baz analoğu olan 5-azasitidin, DNA’da sitozinin yerine girer.

❖ Bu molekül kimyasal olarak metillenemediği için girdiği bölgelerde metillenme derecesi düşer.

❖ Bu molekülün DNA’ya aktarılması gen ifadesini değiştirir.

❖ ÖR: Bu olay, inaktif X kromozomu üzerindeki allellerin

ifadesini uyarabilir.

14

Orak hücre anemisinin tedavisi

❖ Orak hücre anemisinin tedavisinde klinik denemelerde 5-

azasitidin kullanılmaktadır.

❖ Embriyogenez sırasında - ve -globin genleri ifade olur.

❖ Fakat doğumdan hemen sonra -globin sentezinin

başlaması ile birlikte bu genler inaktif duruma geçer.

❖ Hasta bireylerde -globin geni mutanttır.

❖ Bu bireylerde 5-azasitidin tedavisi ile -globin ve -globin

genlerindeki metillenme oranı düşürülür.

❖ Böylelikle embriyonik ve fetal genlerin yeniden ifadesi

sağlanır.

15

3. Transkripsiyonun düzenlenmesi

❖ Ökaryotik genlerde transkripsiyonu düzenleyen üç adet

sis-etkili bölge bulunmaktadır:

❖ Promotorlar

❖ Sessizleştiriciler

❖ Kuvvetlendiriciler

16

3.1 Promotorların organizasyonu

17

❖ Promotorlar, transkripsiyon için tanıma noktası olarak görev yapan

nükleotit dizileridir.

❖ Bazal seviyede transkripsiyon için şarttır

❖ Kontrol ettikleri genlerin hemen başında (yukarı bölgesinde) yer alırlar.

❖ Genellikle yüzlerce nükleotit uzunluğundadırlar.

Tek tek mutasyonların transkripsiyona etkileri: sis etkili bölgelerdeki mutasyonlar transkripsiyonu azaltır

3.1 Promotor bölge

18

❖ Çoğu promotor bölge; TATA, CAAT ve GC kutuları gibi çok sayıda element içerir.

❖ RNA polimeraz II’nin bağlanacağı bölge TATA kutusu olarak adlandırılır (-25 ila -30)

❖ CAAT kutusu transkripsiyon faktörlerinin DNA’ya

bağlandıkları bölgedir (70-80 bç)

❖ GC kutusu, GGGCGG dizisine sahiptir (-110), transkripsiyon faktörleri bağlanır

Promotorlar dinamik yapılardır

19

Kuvvetlendirici Kuvvetlendirici

Kuvvetlendirici Kuvvetlendirici

3.2 Kuvvetlendirici ve sessizleştirici

diziler

20

❖ Genin iki tarafında da, genden biraz uzakta ya da genin

içinde bulunabilirler.

❖ Yapısal genin yanında bulundukları için “sis” düzenleyiciler

olarak adlandırılırlar.

❖ Birçok düzenleyici protein ve transkripsiyon faktörü ile

etkileşirler.

❖ Böylece transkripsiyonun başlama kapasitesini artırabilirya da promotoru aktif hale getirebilirler.

21

❖ Kuvvetlendiricilerin promotor dizilerinden farkları:❖ Kuvvetlendiriciler, kontrol ettikleri genin aşağısında,

yukarısında ya da içinde bulunabilirler.

❖ Işlev üzerinde herhangi bir kritik etki göstermeksizin ters yönlü yerleşim gösterebilirler.

❖ Genomun başka bir bölgesine taşınırsa yeni bölgedeki genin

transkripsiyonu artar.

3.2 Kuvvetlendirici ve sessizleştirici

diziler

❖ Sessizleştirici diziler de benzer şekilde sis etkili dizilerdir ve başlamış olan bir transkripsiyon işleminin yavaşlamasına sebep olurlar.

3.2.1 Immunoglobulin geni(gen içi kuvvetlendirici)

22

❖ Genin içinde bulunan ve bulunduğu geni düzenleyenkuvvetlendirici diziler barındırır

❖ kodlayıcı iki bölge (ekzon) arasındaki bir intronun içine

yerleşmiştir.

❖ Sadece immunoglobulin genlerinin aktif olduğu hücrelerde aktiftir.

3.2.2 -globin geni (gen dışıkuvvetlendirici)

23

❖ Insan -globin ve tavuk timidin kinaz geninde

kuvvetlendiriciler genin sonrasında bulunur (aşağı

kuvvetlendirici)

❖ Tavuklarda -globin ve -globin genleri arasında yer alan

kuvvetlendirici

❖ Embriyonik gelişim sırasında -globin genini artıracak yönde ve

❖ Erişkin dönemde ise -globin genini artırmak üzere ters yönde çalışmaktadır.

3.3 Kuvvetlendiricilerin çalışmamekanizması

24

Kuvvetlendiriciler, zamana ve dokuya özgül gen ifadesindensorumludurlar.

İşlev mekanizmalarını iki grup altında toplamakmümkündür:

1. Transkripsiyon faktörleri bu dizilere bağlanır ve kromatinindüzenini değiştirir.

2. Bu dizilere bağlanan proteinler DNA’yı bükerek ya da halka yapısı oluşturarak, uzaktaki kuvvetlendirici ve promotorları, transkripsiyon faktörleri ve polimerazlar ile kompleksoluşturmasını sağlayacak kadar yakınlaştırırlar.

25

❖ Ökaryotlarda transkripsiyonun kontrolü için, DNA’ya

bağlanan proteinler ile, promotor bölgelerinin yakınındaki DNA dizilerinin birbiri ile teması gereklidir.

❖ Bazal veya genel transkripsiyon faktörleri adı verilen bir seri

protein, transkripsiyonun başlamasının kontrolü için “trans”olarak etki ederler.

❖ Bu proteinler, promotor üzerinde son derece özgül bir

biçimde bir araya gelerek transkripsiyon ön başlama

kompleksini (PIC) oluştururlar

❖ Böylece RNA polimerazın promotoru tanımasını ve

bağlanmasını sağlayacak bir platform oluşturulmuş olur.

3.3.1 Transkripsiyon faktörleri

26

3.3.2 Pozitif/negatif faktörler

27

❖ TATA kutusuna bağlanan transkripsiyon faktörlerinin yanı

sıra, kuvvetlendirici bölgelere bağlanan faktörler de vardır.

❖ Bu faktörler transkripsiyonun etkinliğini artırırsa pozitif faktörler olarak adlandırılırlar.

❖ Eğer transkripsiyonun etkinliğini azaltıyorlarsa negatif faktörler olarak bilinirler.

❖ Bu proteinler, genin ne zaman ve nerede ifade olacağını ve transkripsiyonun oranını kontrol ederler.

❖ Pozitif faktörler, transkripsiyon oranını 100 kat artırabilir

3.3.3 Enhansozom

❖ Aktivatörler (pozitif faktörler) kuvvetlendirici dizilere bağlanarak

enhansozom adı verilen kompleksleri oluştururlar.

❖ Enhansozom oluştuktan sonra buradaki proteinler,

transkripsiyon kompleksindeki proteinlerle etkileşir.

❖ https://www.youtube.com/watch?v=vRBOv4RR7y8

❖ https://www.youtube.com/watch?v=MkUgkDLp2iE

28

4. Transkripsiyon sonrası düzenlenme

29

❖ Pekçok organizmada görülen bir kontrol mekanizmasıdır.

❖ Ökaryotik hücrelerin çekirdeklerinde sentezlenen RNA molekülleri, translasyon öncesinde bazı değişikliklere uğrar.

❖ Intron dizileri çıkarılırken, kalan ekzonlar birleştirilir.

❖ mRNA’nın 5’ ucuna bir şapka ve 3’ ucunapoliA kuyruğu takılır.

❖ Daha sonra bu olgun mesaj sitoplazmaya geçirilir.

❖ Bu basamakların her biri birer düzenlenme basamağıdır.

4.1 mRNA’nın seçenekli kesilme yolları

30

❖ Seçenekli kesilme ile tek bir öncül mRNA molekülünden

farklı formlarda pek çok olgun mRNA oluşması sağlanır.

❖ Böylece tek bir genin ifadesi ile, benzer ya da farklı

işlevleri olan bir protein ailesi meydana gelir.

❖ Küçük değişiklikler;

❖ Enzimatik aktiviteyi

❖ Reseptör bağlama kapasitesini

❖ Hücre içinde proteinin yerleşimini değiştirebilir.

31

❖ Kesilmenin doğru yapılmasını etkileyen mutasyonlar birçok

genetik hastalığın temelini teşkil eder.

❖ Seçenekli kesilme, her bir genden meydana gelen protein

sayısını artırır.

❖ Dolayısıyla hücrenin yapabildiği protein sayısı,

genomundaki genlerin sayısı ile doğrudan bağlantılı değildir.

❖ Böylece insan genomundaki 25.000-30.000 genden

yüzbinlerce farklı protein oluşabilmektedir.

4.1 mRNA’nın seçenekli kesilme yolları

32

4.1 mRNA’nın seçenekli kesilme yolları

Sıplays = kesilme

❖ Kulaklarımız, çevremizdeki sesleri işitmek için binlerce

frekans aralığındaki ses dalgalarını algılar.

❖ Iç kulaktaki kohlea’nın bazal membranında dört sıra tüy

hücresi bulunur.

33

4.1.1 Örnek

❖ Her hücre, farklı ve dar bir frekans aralığındaki seslere yanıt verir.

❖ SLO adlı genden elde edilen öncül mRNA’nın seçenekli kesilmesi ile

tüylü hücrelerinin farklı frekansları almak üzere ayarlanması kontroledilir.

❖ SLO’dan elde edilen öncül mRNA’da en az sekiz seçenekli

kesilme noktası vardır.

❖ Bu mRNA’daki kombinasyonları ile 500’den fazla farklı mRNA

oluşabilir.

34

4.1.1 Örnek

SLO proteinlerinin bazı şekilleri, çok geniş bir frekans

aralığındaki sesleri işitmemizi sağlar.

35

4.1.1 Örnek

Aynı öncül mRNA’dan kaç farklıpolipeptit üretilebilir?

❖ Drosophila’da bulunan Dscam geni, akson gelişimini

yönlendiren, nöronların birbiri ile doğru bağlantı kurmasını

sağlayan bir proteini şifreler.

❖ Dscam öncül mRNA’sındaki;

❖ Ekzon 4 için 12 seçenek

❖ Ekzon 6 için 48 seçenek

❖ Ekzon 9 için 33 seçenek

❖ Ekzon 17 için 2 seçenek bulunmakta.

❖ Eğer bu seçeneklerin tümü kullanılırsa Dscam geni 38.016

farklı protein oluşturur.

36

ÖRNEK ‘para’ geni

37

❖ Drosophila’ya ait diğer bir uç örnektir.

❖ Bu gende 13 tane seçenekli ekzon vardır.

❖ Ayrıca bu yapı, 11 noktada editing (düzeltme) adı verilen

transkripsiyon sonrası modifikasyona uğrar.

❖ Bu işlem transkripsiyondan ve kesilmeden sonra yapılan

baz değişimini içermektedir.

❖ Bu iki işlem birlikte düşünüldüğünde ‘para’ geninden 1

milyondan fazla farklı transkript oluşturulabilir.

4.2 RNA sessizleştirmesi (siRNA)

38

❖ Bitkilerde keşfedilen 21 nükleotit uzunluğunda kısa RNA molekülleri, sitoplazmadaki mRNA’nın transkripsiyonunu baskılamaktadır.

❖ Bu yolla sitoplazmik mRNA’nın yıkımını sağlamakta ve gen ifadesini düzenlemektedirler.

❖ Son zamanlarda, çekirdekte de buna benzer RNA’ların

kromatin yapısını değiştirdikleri ve gen sessizleştirmesini

sağladıkları gösterilmiştir.

❖ RNAaz aktivitesi olan bir proteinDicer), çift zincirli RNA moleküllerine

bağlanır.

❖ Onları, siRNA’lar adı verilen 21

nükleotitlik moleküllere parçalar.

❖ siRNA’lar, RISC kompleksleri

tarafından tek zincirli RNA

moleküllerine dönüştürülürler.

❖ Bunlar da, mRNA’daki

tamamlayıcı dizilere bağlanarak, onları, parçalanmak üzere hedef

haline getirir.

39

4.2 RNA sessizleştirmesi (siRNA)

4.2.1 MikroRNA (miRNA)

❖ Dicer aracılığıyla gerçekleştirilen bir başka sessizleştirme yöntemidir.

❖ Kısmi çift zincirli bir RNA molekülü Dicer tarafından işlenerek miRNA oluşturulur.

40

miRNAsiRNA

❖ Bu miRNA, mRNA’nın 3’-

translasyona uğramayan bölgesindeki (UTR) tamamlayıcı

dizilere bağlanır.

❖ Bu sayede translasyon engellenir.

5. mRNA kararlılığı

41

❖ Tüm mRNA moleküllerinin yaşam süreleri karakteristiktir.

❖ Sentezlendikten bir süre sonra sitoplazmada parçalanırlar.

❖ Farklı mRNA moleküllerinin ömürleri de farklıdır.

❖ Bazıları sentezlendikten sonra birkaç dakika içinde parçalanır.

❖ Bazılarının ömrü ise saatler, aylar, hatta yıllarca sürebilir (oositte

saklanan mRNA gibi).

❖ mRNA molekülünün kararlılığı ve buna bağlı olarak yıkım hızı,

mRNA’nın nükleotit dizisine özgüdür.

❖ poliA kuyruğundaki bazı diziler mRNA’nın enzimlerce kesilmesini

yönlendirir.❖ bu diziler ne kadar fazlaysa o mRNA o kadar çabuk parçalanır.

6 Translasyon düzeyinde kontrol

42

❖ mRNA kararlılığının diğer bir kontrol mekanizmasıtranslasyondur.

❖ Mesajın translasyonu, mRNA’nın kendi kararlılığını kontrol eder.

6.1 - ve - tübülin sentezi

43

❖ Translasyon seviyesinde kontrolün en iyi çalışılmış örneğidir.

❖ - ve - tübülin, hücre iskeleti yapısında ve iğ ipliklerinde bulunan mikrotübüllerin alt birimleridir.

❖ Eğer hücre kolçisin adı verilen madde ile muamele edilirse, mikrotubuller hızla bozunur.

❖ Ortamdaki - ve - alt birimlerinin sayısı artar.

❖ Bu durumda - ve - tubulinlerin sentezi belirgin oranda

düşer.

44

❖ Ancak hücreler vinblastin ile muamele edilirse tübülinlerin

sentezi artar.

❖ bu madde, serbest - ve - alt birimlerinin çökmesine neden

olarak konsantrasyonlarını azaltmaktadır.

❖ Düşük konsantrasyonda tübülinlerin sentezi hızlanırken, yüksek konsantrasyonda sentez engellenir.

❖ Bu tip translasyonel düzenlenmeye, otodüzenlenme adı verilir.

6.1 - ve - tübülin sentezi

❖ ortamda yoğunluğu artan - ve -tubulin alt birimleri, RNAaz’ı harekete

geçirerek tübülin mRNA’sının

parçalanmasını ve tubulin biyosentezinin

durdurulmasını sağlamaktadır.

❖ Ortamda serbest - ve - altbirim

bulunmadığında RNAaz etkin değildir ve tübülin sentezi devam eder.

45