Post on 12-Jun-2015
INTRODUCEREINTRODUCERE-acum 10.000 de ani - creşterea plantelor agricole şi a animalelor pentru a obţineacu 0.000 de a c eş e ea p a e o ag co e ş a a a e o pe u a obţ emâncare şi haine.-acum 6.000 de ani - în procesele biologice încep să se utilizeze microorganismele,pentru diversifica gama de produse alimentare (tipuri diferite de pâine, de brânză), şi
1. Ce este biotehnologia?1. Ce este biotehnologia?Bi ă tili l bi l i
pentru a conserva produsele alimentare pe o perioada mai lungă de timp-perioada ’60 – ’70 – utilizarea constituientilor celulari în procesele biotehnologice
Bio –sugerează utilizarea proceselor biologice;Tehnologie –sugerează realizarea produşilor prin utilizarea de diferite tehnici
definiţie de ansamblu utilizarea controlată sau deliberată a “agenţilor biologici”(celule vii sau moarte, sau componente ale acestora) încadrul unor operaţii tehnice, sau în cadrul unor procesetehnologice care duc la obţinerea unui produs finit
d i l d l li h i il bi l i ili î i l ă â ă ldomeniu larg de la totalitatea tehnicilor biologice utilizate în agricultură până lacele utilizate la prepararea mâncării
Federaţia Europeană de Biologie (1978) Utilizarea integrală a biochimiei microbiologiei şi ingineriei în scopulUtilizarea integrală a biochimiei, microbiologiei şi ingineriei în scopulobţinerii unei aplicaţii tehnologice (industriale), cu ajutorulmicroorganismelor, culturilor de celule şi a părţilor componente aleacestora
ExempleExemple::-biotehnologia fermentaţiei, cum este cunoscută astăzi, îşi are originea în introducereapentru prima oară în secolul al IX-lea a agenţilor microbiologici în anumite procesepe u p a oa ă seco u a ea a age ţ o c ob o og c a u e p ocesede fermentaţie şi nu în descoperirea vinului sau a verzei acre sau în înţelegereaproceselor biologice care au loc;-obţinerea de biomasă din noroiuri active, selecţia şi producerea la scară largă amicroorganismului Clostridia pentru obţinerea de acetonă şi butanol
-producerea de biomasă pentru hrana animalelor;a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric acidul
Aplicaţii îAplicaţii în industrien industrie
- a unor compuşi chimici utilizaţi în alimentaţie cum ar fi acidul citric, acidulglutamic, unii aminoacizi, antibiotice şi vitamine;- în industria petrochimică, poate fi utilizată în obţinerea în cantitate mare a etanolului,acetonei butanolului acidului acetic etc;acetonei, butanolului, acidului acetic etc;-este utilizată în obţinerea de produşi celulari din plante şi animale, obţinerea de celulemicrobiene modificate pentru a produce antigene, anticorpi sau agenţi terapeuticidiverşi;ş ;-furnizează agenţi cheie pentru industria alimentară ca de exemplu culturi de celule şienzime care duc la o mai bună înţelegere a proceselor şi tehnicilor specifice acesteiindustrii;- are un rol deosebit în tratarea şi purificarea apelor, şi în volatilizarea substanţelorreziduale.
Definirea termenului din ce în ce mai greu de realizat
Principalele direcţii de dezvoltare a biotehnologiilor moderne sunt determinate:
d d i il- de descoperirilerecente din domeniulbiologiei moleculare;
de cerinţele- de cerinţelesocietăţii faţă deanumite aspecte cucare aceasta secare aceasta seconfruntă, cum ar fi:criza energetică,epuizarea rezervelorpde hrană de peplanetă, problemeecologice şi debioremediere.
Figura 1. Principalele aplicaţii ale biotehnologiei
IntroducereCClasificarea diferitelor tipuri de biotehnologiilasificarea diferitelor tipuri de biotehnologii
microbiene
1. în funcţie de tipul de celule cu care se lucrează:
microbienevegetaleanimale
2. în funcţie de domeniul în care-şi găseşte aplicaţie deosebim următoarele categorii de biotehnologii:
- industriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, deindustriale, includ obţinerea de produşi farmaceutici, de reactivi de laborator, deproduse alimentare;
- agricole, studiază aspecte privind rezistenţa plantelor la anumiţi factori patogenişi a toleranţei faţă de factorii de mediu defavorabili, implicarea în sistemeş ţ ţ psimbiotice la diferite specii de plante, multiplicarea speciilor horticole şiobţinerea de noi hibrizi sexuaţi;
- medical veterinare, se referă în special la nutriţia animală, creşterea rezistenţeianimalelor la atacul agenţilor patogeni, reproducere artificială şi predeterminarea sexului, conservarea resurselor genetice animale;
- ecologice, sunt incluse toate metodele şi tehnicile de epurare biologică a apelort l t l i l il d d t t ţi d i iuzate sau poluate, a aerului sau a solurilor degradate, extracţia de minereuri cu
ajutorul microorganismelor;- sănătate publică, crearea unor sisteme de diagnosticare.
IntroducereRolul cercetării fundamentaleRolul cercetării fundamentale
în viitor cea mai mare parte a industriei va utiliza procedeele desatisticsatisticaa globalăglobală v o cea a a e pa e a dus e va u a p ocedee e defermentaţie, inginerie genetică, biologie moleculară ceea ceimprimă un salt tehnologic covârşitor
s s cs s c g obg ob
nnatura interdisciplinarăatura interdisciplinară etapennatura interdisciplinară atura interdisciplinară 1. manipularea genetică a organismului gazdă
- o genă din ADN animal este clonată într-o celulă a unui microorganism.- se realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniulse realizează în laborator de către cercetători specializaţi în domeniul
biologiei moleculare geneticii şi biochimie;- tehnicile utilizate sunt tehnici specifice de biologie moleculară, biochimie,
culturi de celule;- cercetarea se derulează până când se obţin tulpini recombinante stabile iar
nivelul de expresie este cel dorit2.cultivare- în vederea stabilirii parametrilor optimi - compoziţia mediului, pH,
temperatură, concentraţia oxigenului dizolvat- se porneşte de la cultivarea microorganismului la scară mică, în flacoane
de 250 – 1.000 ml, sub agitare;performanţele organism l i s nt apreciate prin calc larea ratei de- performanţele organismului sunt apreciate prin calcularea ratei decreştere, productivitatea specifică, randamentul de obţinere a produsuluifinit.
Introducere3. etapa pilot3. e apa p o
-un bioreactor de 1, 2 sau 5 litri echipat cu instrumente de măsurare a parametrilorce indică performanţele organismului; pot fi încercate diferite tipuri dep ţ g ; p pbioreactoare;
-În condiţiile creşterii culturii în bioreactor parametri sunt uşor modificaţi, darmonitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care numonitorizarea lor este mai eficientă şi în plus se pot monitoriza parametri care nufac obiectul creşterii în flacoane de cultură, ca de exemplu caracteristicile despumare ale mediului;
- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu este- se identifică limitările impuse de tipul bioreactorului (dacă bioreactorul nu esteaerat celulele mor prin înfometare, dacă agitarea nu este la o viteză optimă celulelese pot sparge şi astfel creşterea se realizează pe alte căi metabolice);se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă timpul-se calculează diferiţi parametri cum ar fi: coeficientul de transfer de masă, timpulde agitare, viteza de dizolvare a oxigenului, puterea de agitare, etc;
-se decide modul de cultivare cel mai avantajos – sistemul „batch” (discontinuu sausubmers) sau sistemul continuu;submers) sau sistemul continuu;
- se realizează un calcul economic de fezabilitate.
4. ridicarea la scară industrială - ingineriei bioproceselor;
bioreactoarele sunt mult mai sofisticate au un volum mult mai mare 100- bioreactoarele sunt mult mai sofisticate, au un volum mult mai mare 100 –1.000 l;
- rezultatele pot fi mai bune sau mai scăzute faţă de cele obţinute în faza pilot; sehotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;hotărăşte dacă se trece sau nu la producţia industrială;
- se proiectează întreaga instalaţie industrială de fabricare a produsului finit;- recuperarea produsului finit din mediul de producţie - izolarea şi purificarea
acestuia până la produsul finit;- etapă dificilă pentru produsele ADN recombinate;- costurile reprezintă 80-90% din costul total al procesului tehnologic, deoarece
metodele aplicate în laborator nu pot fi extrapolate la scară industrială;- filtrări, centrifugări, metode mecanice de distrugere a pereţilor celulari, extracţii
cu solvenţi, metode cromatografice cristalizări, uscări;- sunt mari consumatoare de energie şi timp.
5. Pregătirea pentru introducerea pe piaţă-ambalat şi vândut;-produsele farmaceutice noi - testarea pe animale şi apoi pe om;
d l li t t t ifi-produsele alimentare - teste specifice;-avize oficiale care sunt în conformitate cu standardele existente pentru fiecare tipde produs.
Operaţii biotehnologiceOperaţii biotehnologiceCinci aspecte majore care, în aproape toate instalaţiile industriale corespund
stadiilor de procesareMicrobiologie şi biologie celulară Procese (aspecte)
Sistemică Alegerea culturiiSistemică Alegerea culturii
Proces tehnologic
Genetică Cultivarea celulelor
Fiziologie Răspunsul dat de celule
Procesul tehnologicProcesul tehnologic
Chimie Recuperarea produsului
1. Alegerea culturii: selecţia, creşterea sau crearea de organisme sau populaţii g ţ , ş g p p ţcelulare
2. Cultivarea celulelor
3. Răspunsul dat de celulă
4. Procesul tehnologic
5. Recuperarea produsului
CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR CARACTERISTICILE MICROORGANISMELOR DE INTERES BIOTEHNOLOGICDE INTERES BIOTEHNOLOGICDE INTERES BIOTEHNOLOGICDE INTERES BIOTEHNOLOGIC
De ce microorganismele?De ce microorganismele?- diversitatea acestora este enormă;
i i l fi ili i (b iil )- microorganismele care pot fi utilizate - procariote (bacteriile);- eucariote (drojdiile şi fungi)
DrojdiileDrojdiilela producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte speciala producerea alcoolului etilic şi a dioxidului de carbon prin fermentaţie se foloseşte specia
Saccharomyces cerevisiae;pentru obţinerea vinului se folosesc specii de S. cerevisiae, şi ellipsoideus, fie sub formă de
tulpini selecţionate, fie prin fermentaţie spontană realizată cu drojdii epifite;la fabricarea berii se folosesc cereale germinate ca orzul în Europa, porumbul în America şi
sorgul în Africa. Cele mai utilizate tulpini sunt S. cerevisiae şi S. uvarum care au fostselecţionate treptat în diferite laboratoare;
la fabricarea pâinii se utilizează S cerevisiae care în timpul dospirii pâinii produce ola fabricarea pâinii se utilizează S. cerevisiae, care în timpul dospirii pâinii produce ofermentaţie alcoolică cu degajare de dioxid de carbon ce permite afânarea aluatului;
proteinele furajere se obţin prin cultivarea drojdiei pe subproduse industriale (alcani, metanol)şi reziduuri agricole (zer de lapte, melasă). Adăugate în furajele animalelor, proteinele aduc
d i i iun aport de aminoacizi.
FungiFungiiiMaterii prime :
subproduse ale industriei alimentare şi reziduuri agricole (zer, melasa de la fabricarea zahărului din sfecla de zahăr, drojdia de la distilării, paiele etc.);
multe specii saprofite, care se dezvoltă pe resturile organice animale şi vegetale desăvârşind astfel marele cicl biologic nat ral
în industria brânzeturilor fungii au un rol important în înmuierea şi aromatizarea pastei,tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde)
astfel marele ciclu biologic natural.Aplicaţii
tulpinile cele mai utilizate sunt: Penicillium roquofortii (brânză cu pastă verde),Penicillium camembertii şi Geotrichium candidum (pastă presată);
în industria salamurilor folosirea unui strat alb de Penicillium nalgiovense pe suprafaţasalamurilor previne dezvoltarea microorganismelor care degradează produsul;
hidroliza amidonului din orez care precede fermentaţia se realizează cu amilaze biosintetice deAspergillus oryzae.
în industria chimică şi farmaceutică prin biosinteză se produc:Enzime – proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;Enzime proteaze, amilaze cu tulpini din genul Aspergillus;acizi organici - acid citric cu Aspergillus niger;antibiotice - penicilina cu tulpina Penicillium chrysogenum, cefalosporinele cu tulpini dingenul Cephalosporium;h ihormoni;biomasă în scopul obţinerii unei surse complementare de proteine pentru furaje animale.
BacteriiBacteriiBacteriile acetice (Gluconobacter, Acetobacter)
- fabricarea tradiţională a oţetului de vin, cidru, cartofi;- obţinerea de vitamină C (oxidarea sorbitolului la sorboză)
Bacteriile lactice (Lactobacillus, Lactococus, Treptococcus)- fermentează produsele lactate (iaurt, brânză dulce). Ele sunt prezente în mod obişnuit - în lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);lapte şi au rolul de acidifia laptele (transformă lactoza în acid lactic);- în prepararea brânzeturilor participă la formarea cheagului şi la maturarea lui;- conferă untului gustul şi aroma specifice, prin producerea de acid diacetic;- producerea de acid lactic la scară industrială
B iil b i i (Cl idi b i )Bacteriile butirice (Clostridium butyricum) - intervin în înmuierea inului şi a cânepii deoarece distrug pectina şi astfel elibereazăfibrele textile
Genul Bacillus- Baccilul thuringiensis – în timpul sporulării produce substanţe toxice care sunt toxicepentru larve;- producerea de enzime: proteaze termostabile pentru ind. detergenţilor, α-amilaze,gl co o i omera ăglucozo izomerază
ActinomiceteleBacteriile din genul Corynebacterium şi Brevibacterium şi mutantele derivateBacteriile metilotrofe cultivate pe metan sau metanol PropionibacteriumBacteriile termofile metanogene
CăileCăile dede biosintezăbiosinteză aa constituienţilorconstituienţilor celularicelulari aiai microorganismelormicroorganismelorcreşterea microbiană
Etape:
- faza de creştere logaritmică;faza staţionară;- faza staţionară;
- faza de declin
Figura 2 Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a creşterea celulelor şi biosintezaFigura 2. Diferenţa dintre metabolismul primar şi secundar: a – creşterea celulelor şi biosintezaconstituienţilor are loc aproape simultan; b- după creşterea celulelor şi eliberarea metabolitului primar acestase transformă în metabolit secundar; c- substratul de creştere rămas după finalizarea creşterii celulelor estetransformat în metabolit secundar
Metaboliţii microbieni primari
Procesul microbian tipic în care în timpul fazei de creştere exponenţială (perioada de lag) se formează un metabolit primar se numeşte fermentaţie alcoolică
Exemplu:etanolul este metabolitul primar produs în fermentaţia alcoolică aerobă adrojdiilor sau a unor bacterii în acelaşi timp reprezentând şi un metabolitenergetic
Figura 3. Cinetica procesului de fermentaţie în timpul formării (a) metaboliţilor primari şi (b) a metaboliţilor secundari
Metaboliţii microbieni secundari
Metaboliţii care se formează în timpul fazei staţionare (de creştere sau trofofaza) saula finalul acesteia se numesc metaboliţi secundari
Caracteristici:Caracteristici:
• sunt sintetizaţi de un număr mic de microorganisme;• nu sunt importanţi pentru creşterea şi dezvoltarea microorganismului;• pentru sinteza lor necesită prezenţa unui număr mare de reacţii enzimatice;• formarea lor este dependentă de condiţiile de creştere şi de compoziţia mediului;• se prezintă sub forma unui amestec de compuşi cu structură chimică înrudită;p p ş ;• de obicei se obţin în cantitate mult mai mare decât metaboliţii primari .
Etape de obţinere:
• trofofaza - este faza de creştere (prefixul „trofo” în limba greacă înseamnă„creştere”);• idiofaza este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul idio” în limba• idiofaza – este faza în care se sintetizează metabolitul (prefixul „idio în limbagreacă înseamnă „ceva propriu”);
Interrelaţia dintre căile de biosinteză ale metabolitului primar (diferiţiacizi organici şi aminoacizi) şi a metaboliţilor secundari (o serie deantibiotice))
Figura 4. Relaţia dintre calea metabolică de obţinere a aminoacizilor şi a unor acizi
i i iorganici şi formarea unor antibiotice cu nucleu aromatic
Biosinteza şi creştereaBiosinteza şi creşterea
Figura 5. Prezentarea sintetică a principalelor căi anabolice şi catabolice. Sunt prezentate într-oversiune simplificată numai căile majore de biosinteză şi conexiunile acestora cu căile catabolice
Controlul metabolismuluiControlul metabolismuluiNecesarul de nutrienţi
Majoritatea nutrienţilor, cu excepţia oxigenului şi a câtorva surse de carbon, suntpreluate din mediul de cultură prin sisteme de transport specifice. Aceste procesepot fi controlate deoarece o dată ce celula şi-a luat nutrientul în cantitatea necesară
l d i fi î d ă di i l ă l f l î â ărestul de nutrient poate fi îndepărtat sau direcţionat pe o altă cale astfel încât să nufie în detrimentul celulei. Aceste sisteme de transport active necesită un aport deenergie.
Compartimentareareprezintă a doua formă de control metabolic
exemple:- mitocondria celulelor eucariote care separă reacţiile ciclului acizilor tricarboxilici dealte reacţii din citoplasmă;
î i i ă i d d ă i ii i i t t d
exemple:
- în peroxizomi se găsesc enzime care degradează acizii graşi şi care sunt separate deenzimele din citoplasmă care determină sinteza acizilor graşi. Separarea celor douăseturi de enzime previne reciclarea oricărui intermediar comun;- alte organite (vacuole nucleu cloroplaste etc ) controlează în mod similar alte- alte organite (vacuole, nucleu, cloroplaste etc.) controlează în mod similar altereacţii care au loc în celulă.
Figura 6. β-Oxidarea acizilor graşi
Controlul sintezei enzimaticeMulte dintre enzime sunt prezente în celulă indiferent de condiţiile de creştere ale
t i O t di i ” t i â d t fi d lacesteia. O parte din enzime „apar” atunci când este necesar cum ar fi de exempluizocitrat liaza din şuntul glioxilatului care apare numai atunci când celulele suntcrescute pe un substrat C2. Acest proces este denumit „inducerea” sintezei enzimei.
Figura 7. Ciclul glioxilatului.
Unele enzime pot să „dispară” atunci când nu mai sunt necesare. Deexemplu enzimele din calea de biosinteză a histidinei încetează a mai fi produseatunci când concentraţia de histidină din celulă este suficientă pentru a satisfacea u c câ d co ce aţ a de s d ă d ce u ă es e su c e ă pe u a sa s acenecesităţile celulei. Acest proces este numit represie. Astfel într-o celulă există unpermanent echilibru între procesele de inducţie şi represie a anumitor enzime cheie,în funcţie de necesităţile celulei. În sistemul de cultivare în suspensieÎn sistemul de cultivare în suspensie
(„batch”) celulele se multiplică într-un sistem închispână când se termină unii din nutrienţi sau pânăcând unii produşi acumulaţi determină efectecând unii produşi acumulaţi determină efecteinhibitorii asupra unor enzime reglatoare sau,numărul de celule formate au ocupat întreg spaţiulde cultivare şi astfel noile celule nu mai au spaţiu săş p ţcrească. În momentul în care în timpul creşteriicelulare unele din componentele celulare semodifică sau unii compuşi moleculari se consumă,celula îşi modifică forma – se alungeşte.
Figura 8. Reprezentarea schematică a schimbărilor ideale în ă i l l i ( ll i ht) ă l d l l t t lămărimea celulei (cell weight), numărul de celule, masa totală
uscată şi compoziţia chimică în timpul creşterii unei bacterii în sistemul de cultivare submers. În stânga este scală logaritmică
Controlul sintezei enzimatice
Eficienţa globală de creştere microbiană este discutată întermeni termodinamici. Empiric, este în mod uzual exprimată în termeni de:producţia de celule formate pornind de la o unitate masică de substrat de carbonconsumat.producţia molară de creştere (Ys) este producţia de celule per mol de substrat,
fi i t l d i b l i it i ăcoeficientul de conversie a carbonului care permite o mai uşoară comparareîntre numărul de moli de substratele diferite, este producţia de celule per gramde substrat de carbon.
ATENŢIE! valoare scăzută a producţiei de creştere atunci cândorganismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în celorganismele sunt transferate din sistemul de cultivare aerob în celanaerob, fenomen care evident este direct legat de reducerea fluxuluienergetic şi astfel o producţie scăzută de ATP.
Substrat Organism Producţia molară de creştere (g organism uscat/g-mol substrat)
Coeficientul de conversie al carbonului (g organism
uscat/g carbon din substrat)Tabelul 3.Randamentul de
metan Methylomonasmethanooxidans
17,5 1,46
metanol Methylomonas methanolica 16,6 1,38
creştere a unormicroorganismecrescute pediferite substrate
etanol Candida utilis 31,2 1,30
glicerol Klebsiella pneumoniae(Aerobacter aerogenes)
50,4 1,40
glucoză Escherichia coli:aerobanaerobSaccharomyces cerevisiae:
95,025,8
1,320,36
aerobanaerobPenicillium chrysogenum
90,021,081
1,250,291,13
sucroză Kelbsiella pneumoniae (A.aerogenes)
173 1,20
xiloză Kelbsiella pneumoniae (A.aerogenes)
52,2 0,87
acidacetic
Pseudomonas sp.Candida utilis
23,521 6
0,980 90acetic Candida utilis 21,6 0,90
hexadecan
Saccharomycopsis(Candida) lipolyticaAcinetobacter sp
203251
1,061,31
RRandamentul de creştere a celulelor depinde de andamentul de creştere a celulelor depinde de următorii factoriurmătorii factori::
1. natura sursei de carbon;2. calea catabolică pe care o urmează substratul;3. proviziile de substrate complexe (îndeosebi unele căi anabolice);4 l d i t i il t i ţil î i l l t l i (4. necesarul de energie pentru asimilarea nutrienţilor în special al azotului (se
administrează mai puţin azot dacă se administrează aminoacizi şi mai multazot dacă sursa este reprezentată de ionii nitrat);
5 variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;5. variaţia eficienţei reacţiilor generatoare de atp;6. substanţele inhibitoare, contrabalansarea echilibrului ionic, sau alte
componente ale mediului care interacţionează cu sistemul de transport;7. statusul fiziologic al organismului – aproape toate microorganismele îşi7. statusul fiziologic al organismului aproape toate microorganismele îşi
modifică mecanismele de creştere în funcţie de condiţiile mediului de cultură(ca de exemplu formarea sporilor).
8. natura substratelor care limitează creşterea – cea mai eficientă este sursa decarbon care limitează creşterea , deoarece catabolizarea excesului de carbonpoate urma anumite căi metabolice care sunt din punct de vedere energeticutile biotehnologului deoarece opresc creşterea;
9. viteză de creştere prestabilită;10. înclinaţia microbilor de a creşte şi competenţa microbiologului.
BIOREACTOAREBIOREACTOAREIntroducereIntroducere
Procesul de bază în biotehnologie este „procesul biologic”, şi se realizează înbioreactor
“bioingineria” - se ocupă cu studiul bioproceselor din punctul de vedere al unui biolog, al unui chimist fizician şi al unui inginer
Bioreactorul - instalaţie tehnologică în interiorul căreia are loc transformareamateriilor prime cu ajutorul sistemului enzimatic pus la dispoziţie de microorganismelevii, celulele animale şi vegetale, sau de enzimele izolate din acestea.
CONDIŢIILE CREATE ÎN BIOREACTOR PENTRU CREŞTEREAORGANISMELOR
Randamentul cu care procesul biotehnologic are lorRandamentul cu care procesul biotehnologic are lor
Pe măsură ce celulele cresc ele se adaptează noilor condiţii de creştere şi-şi moduleazăactivitatea în funcţie de condiţiile de mediu.ţ ţ
Avantaj: monitorizarea permanentă a parametrilor creşterii
Etapa de prelucrare
fizică
Etapa de prelucrare biochimică
Etapa de prelucrare
fizico
Materii prime
fizică biochimică fizico-chimică Produs
• pregătirea mediului • biosinteza • separarea produsuluip gde cultură,
• sterilizarea utilajelor,• sterilizarea aerului
propriu-zisă• monitorizarea
parametrilor
• separarea produsuluiprincipal,
• concentrarea,• pregătirea pentru
Figura 9. Reprezentarea schematică a unui proces biotehnologic
introducerea pe piaţă
Etapa pilot Etapa industrială Modelul similitudinii
C i ii i l l i il fi i l i l i
- tipul de organism;
Criterii care permit calcularea mărimilor fizice ale sistemuluila scară mare, pe baza rezultatelor obţinute în etapa pilot
Alegerea bioreactorului
p g ;În funcţie de: - sistemul de cultivare;
- caracteristicile biochimice ale întregului proces
SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor2 sisteme majore: - sistem submers
- culturi de suprafaţăcu u de sup ţÎn sistem submers
mediul de cultură este lichid, agitat şi aeratalimentarea cu energie se realizează continuu în scopul menţinerii
i t f ţ i li hidtrei moduri de operare: discontinuu,
semicontinuu şicontinuu
interfaţei gaz – lichid
continuuOperarea în sistem discontinuuCultivarea - în şarje (sistemul batch);începe la t = 0 şi se termină la t = t’;p şla început, creşterea celulelor are loc în condiţii nelimitate; în timp se atingedensitatea maximă; începe creşterea în condiţii limitate de substrat şi acumularea produsului final.
se notează DC şi este reprezentată grafic astfel:
caracteristică - sistem de agitare performant omogenitatea ; uniformitateatuturor parametrilor
SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor
Operarea în sistem semicontinuureactorul este construit astfel încât concentraţia sustratului limitativ să fie păstrată constantă prin aprovizionarea continuă („fed batch”)
se notează SC şi se reprezintă graficse notează SC şi se reprezintă grafic astfel:
Operarea în sistem continuul i f l î â ă li i i i ăreactorul este construit astfel încât să se realizeze o aprovizionarea continuă
cu nutrienţi şi o evacuare permanentă a unei cantităţi echivalente de mediude cultură
două tipuri de bioreactoare ideale:
Figura 10. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor tip R (cu recirculare) şi tip D (cudeplasare)
SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor
Bioreactoarele submerse pot fi:- cu agitare mecanică
Figura 11. Prezentarea sistemelor de operare continuă. S – substrat, C – celule
cu agitare mecanică, - cu convecţie forţată (cu pompă de recirculare a lichidului),- cu aer comprimat.
SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor
Culturi de suprafaţă
- au fost primele sisteme de fermentaţie folosite;
- mediul de cultură este solid, semisolid sau este reprezentat de starturi lichide aflate în repaus;- în sisteme omogene – compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă înîn sisteme omogene compoziţia mediului de fermentaţie este uniformă în orice colţ al bioreactorului, în orice moment;- în sisteme heterogene – gradiente de celule sau substrat; microorganismele
t l dif it d d di- nu depind de sistemul exterior decât în mică măsură;sunt expuse la diferite cond. de mediu;
- sunt utilizate mai mult în laboratoar pentru întreţinerea culturilor, decât industrial pentru biosinteză.
SistemeSisteme dede cultivarecultivare aa microorganismelormicroorganismelor
microorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorulmicroorganismele se dezvoltă la atât la suprafaţă cât şi în interiorulmediului de cultură. În mediul nutritiv la care s-a adăugat un agentgelifiant şi s-a usucat la 45 – 500C, se inoculează microorganismulla temperatura ambiantă Coloniile formate după incubare permitla temperatura ambiantă. Coloniile formate după incubare permitselecţia microorganismelor dorite. Condiţiile de cultivare pot fistabilite prin schimbarea compoziţiei mediului. Aerarea se
li ă i i i t il D bi i l ă îrealizează prin aprovizionarea cu aer steril. De obicei se lucrează înincubatoare cu CO2.
tipuri de bioreactoare : cu tăvi, tip coloană cu umplutură,în strat fluidizat şi cu strat fixîn strat fluidizat şi cu strat fix
ConfiguraţiaConfiguraţia bioreactoarelorbioreactoarelor
Aspecte care trebuiesc urmărite la alegerea bioreactorului
configuraţia biorectorului;mărimea bioreactorului;condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;condiţiile bioprocesului din interiorul bioreactorului;sistem de operare utilizat (sistem submers/de suprafaţă;continuu/discontinuu);
l / l î i lt bi tcuplare/necuplare în serie cu alte bioreactoare.
În funcţie de natura procesului biotehnologic
bioreactoare biologice - un proces de fermentaţie (cu biomasă);- pot fi: pentru fermentaţii anaerobe,
aerobe;aerobe;bioreactoare biochimice - procesele enzimatice.
- Pot fi: cu enzime libere,cu enzime imobilizate şicu fază solidă
ConfiguraţiaConfiguraţia bioreactoarelorbioreactoarelor
Au forme constructive şi moduri de operare variate, funcţie de tipul procesului tehnologic
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Clasificare:
după modul de introducere a energiei necesareamestecării fazei lichide (substrat şi microorganisme) şidispersării fazei gazoase (aer):
- cu amestecare mecanică;- cu pompă de recirculare;- cu aer comprimat
Figura 12. Bioreactoare cu agitare mecanică.(a) cu motorul aşezat la baza vasului; (b) cu motorul la baza vasului şi cu draft interior; (c) bioreactor cu agitator cu turaţie mare
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 13 Bioreactoare
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 13. Bioreactoarecu agitare mecanică cubarbotare cu aer (prinaxul agitatorului sauseparat).
(a,b) cubarbotare prin axulagitatorului; (c) cuagitatorului; (c) cubarbotator separat cuagitare pe sus; (d) cu tubde aspiraţie a aerului.
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 14.Figura 15. Bioreactor cu pompă de recirculare a fazei lichide.(a) cu recirculare externă; (b) cu buclă de recirculare; (c) curecirculare cu jet; (d) cu recirculare internă, inversată
Bioreactor cu agitare la mai multe nivele
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 16.Bioreactoare cu aer comprimat (a)comprimat. (a) bioreactor tip coloană cu bule; (b) bioreactor tip turn cu i f ( )site perforate; (c)
bioreactor tip „air –lift”; (d) bioreactor tip “air lift” cu pcoloană cu bule
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 17. Bioreactoare biochimicebiochimice.
(a) în sistem discontinuu, cu enzime libere;
(b) în sistem continuu, cu i libenzime libere;
(c) în pat fluidizat (cu enzime libere;
(d) cu enzime imobilizate (d) cu e e ob atepe suport
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 18.Alte tipuri constructive de bioreactoarebioreactoare. (a) cu film lichid; (b) pentru culturi de suprafaţă
BioreacBioreactoare cu agitare mecanicătoare cu agitare mecanică
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 19. Bioreactor cu agitare tip pentru culturi g p paerobe
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Figura 20 Tipurile deFigura 20. Tipurile de rotoare utilizate la realizarea agitatoarelor pentru amestecarea mediului de cultură din bioreactor. (a) ancoră, (b) elice, (c) turbină cu palete plane (d) cupalete plane, (d) cu palete tip zbatură, (e) ancoră complexă, (f) şurub elicoidal
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Caracteristicile bioreactorului:Ca acte isticile bio eacto ului:
Amestecarea şi dispersia bulelor de aer – agitare mecanică;Omogenizarea mediului – şicane;gDegajarea bulelor de aer – spărgător de spumă;Transferul de căldură – prin agitare şi turbulenţă,
o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor)o în timpul sterilizării (când se realizează în bioreactor),o în timpul fermentaţiei (sterilizarea se realizează în alt vas);
Preluarea căldurii de reacţie degajată în timpul fermentaţiei
- sistem de răcire, cel mai des cu serpentine; dezavantaj – greu de spălat şi sterilizat, incomodează sistemul de agitare;
sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior- sistem de răcire cu schimbător de căldură exterior
Utilizare
l l lib i bili t i- celule libere sau imobilizate şi- reacţii enzimatice cu enzime libere sau imobilizate
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobeBioreacBioreactoare cu agitare mecanică toare cu agitare mecanică
şi cu draft interiorşi cu draft interior
creşte coeficientul de transfer de masă
şi cu draft interiorşi cu draft interior
circulaţia lichidului este modificată prin introducerea unui cilindru metalic axial fără fund şi capac numit draft”fără fund şi capac numit „draft
Figura 23. Circulaţia lichidului într-un g ţbioreactor cu draft. (a) complet imersat în lichidul de cultură, (b) cu revărsare (adaptat după Keitel, 1978)
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
BioreacBioreactoare cu aer comprimattoare cu aer comprimatBioreactoare tip „coloană cu bule”.Bioreactoare tip „coloană cu bule”.
i ă bi l i i ăvariantă a bioreactoarelor cu agitare mecanică
agitarea mediului de cultură se realizează exclusiv prin barbotare de aerexclusiv prin barbotare de aer
Caracteristicile hidrodinamice şi transferul de masă depind în totalitate de
l b l l lib dcomportamentul bulelor eliberate de barbotor
utilizată în industria drojdii de bere, în industria berii, a vinului şi în tratarea apelor reziduale
Figura 24. Bioreactor tip coloană cu bule
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Si t b l l ă iSistem omogen - bulele urcă cu aceeaşi viteză şi nu se amestecă între ele, iar agitarea lichidului este limitată,
Sistem eterogen - viteza de barbotareeste mai mare; circulaţie haotică acelulelor; bulele şi lichidul tind să seridice prin centrul coloanei, curentul delichid coboară pe lângă pereţiibioreactorului, antrenează bulele,amestecarea aerului cu mediul decultură.
avantaj - cost de construcţie mic,transfer de masă şi căldură satisfăcătorprobleme d di l i Figura 25. Circulaţia fluidului într-o coloană
cu bule aflată în regim eterogen
probleme - de spumare a mediului
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
Pentru îmbunătăţirea caracteristicilor de curgere şi amestecare seconstruiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multeconstruiesc bioreactoare tip coloană cu bule în mai multetrepte. Astfel întâlnim:- coloane cu bule divizate în câteva secţiuni prin site perforate şi
l b l t ă t it t l l- coloane cu bule care sunt prevăzute cu agitatoare locale.Introducerea sitei perforate sau a agitării locale reduce intensitateaamestecării axiale a lichidului şi creşte coeficientul de transfer demasă.
Datorită varietăţii mari de configuraţii de bioreactoare tipcoloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,coloană cu bule (diametrul găurilor, secţiunea transversală liberă,numărul de site perforate, varietatea compoziţiei mediului) nu s-auelaborat relaţii generale de calcul şi control a parametrilor.
BioreacBioreactoare “air lift”toare “air lift”
Bioreactoare pentru fermentaţii aerobe
formă de turnuri cu buclă;o „air lift” cu circulaţie internă
circulaţia lichidului se datoreazădiferenţei de densitate a fazei aerate din
o „air lift” cu circulaţie externă
diferenţei de densitate a fazei aerate dinturn şi a zonelor nearerate;
culturi de celule vegetale,utilizateculturi de celule animale,culturi de celule imobilizate biosinteza proteinelor microbienet t t l bi l i l ă l iltratamentul biologic al nămolurilor
Figura 26. Configuraţia bioreactoarelor „air lift”
BioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializăMotivaţii: membranele de dializă sunt un mijloc eficient de îndepărtareotivaţii: e b a e e de d a ă su u j oc e c e de depă a e
continuă a inhibitorilor sau a produşilor toxici rezultaţi în timpulfermentaţiei
alimentarea cu substrat a culturii microbiane se realizează prinmembrană
se pot obţine concentraţii mari de microorganisme, deoarecesubstratul este separat de microorganism şi nu poate exercita efectei hibi iiinhibitorii
Utilizare: cultivarea sistemelor de două sau mai multe tipuri de microorganismecultivarea celulelor umane
Modele:Modele:Primul tip două vase între care schimbul de substrat sau produs se realizează
prin pomparea conţinutului printr-un modul de dializă situat între l d ăcele două vase.
dezavantaje – sterilizarea sistemului (sistem multi-component);
suspensia fermentată este pompată prin by pas- suspensia fermentată este pompată prin by-pas
BioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializă
Figura 28. Reprezentarea schematică a bioreactoarelor cu membrană de dializă
Al doilea tipBioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializă
două tuburi flexibile care sunt fixate în interiorul bioreactorului de oţel, de fund şi de capac Tubul mare care formează peretele fermentatorului este confecţionat dinde capac. Tubul mare, care formează peretele fermentatorului, este confecţionat din folie de poliamidă cu o grosime a porilor de 80µm, în timp ce tubul mic formează un cilindru în interiorul bioreactorului. Tubul mic este o membrană de dializă a căror pori au dimensiunea de 20µm. Bioreactorul este echipat cu două unităţi de agitare cu motoare separate ceea ce face ca turaţia motorului să poată fi controlată separat. Aeraţia se poate realiza în ambele incinte în acelaşi timp. Fermentatorul p ţ p ş ppoate fi sterilizat in situ ca un fermentator obişnuit, la 1210C, în timpul sterilizării pereţii din folie de poiamidă putând fi protejaţi de o manta din cilindri de oţel.
BioreacBioreactoare toare cu membrancu membrană de dializăă de dializă
Figura 29. Bioreactor cu dializă
BioreacBioreactoare toare cu cu tăvităvi
Aplicaţiile sunt limitate la microorganismele care se dezvoltă la suprafaţă şi formează peliculă
În industrie s-au construit bioreactoare cu mai multe tăvi, aşezate una deasupra celeilalte, astfel încât sterilizarea şi inocularea să poată fi efectuate automat. În interior se introduce aer steril. Bioreactorul este exploatat în regim discontinuu.
O variantă a acestui tip de bioreactor a fost descrisă de Kybal şi Vlcek (1976)care au propus utilizarea unor perne gonflabile de plastic, care pot fi umplutecu mediu nutritiv, inoculate şi aerate prin tubul de fixare.
BioreacBioreactoare toare cu cu tăvităvi
Figura 30 Bioreactor cuFigura 30. Bioreactor cu tăvi, sterilizabil, cu răcire, cu alimentare prin partea superioară
BioreacBioreactoare tip coloană toare tip coloană cu cu umpluturăumpluturăO coloană verticală, umplută cu granule de biocatalizator sau cu biocatalizatorimobilizat.Alimentarea cu mediu se face prin partea de sus - se formează o fază de lichidcontinuă printre particule. Datorită frecării particulelor, deteriorarea celulelor, este
i i ă i bi l iminimă comparativ cu bioreactoarele cu agitare.Transferul de masă dintre faza lichidă şi catalizatorul solid se realizează relativ uşordacă viteza de trecere a acestuia prin coloană este mare, iar pentru a fi îmbunătăţitmediul lichid este recirculatmediul lichid este recirculat.Aerarea mediului este bine să fie realizată separat. Dacă aerul este barbotat direct seproduce coalescenţa bulelor, apar canale prin umplutură şi distribuţia nu esteuniformă Din acelaşi motiv bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentruuniformă. Din acelaşi motiv, bioreactoarele cu umplutură nu sunt potrivite pentrubioprocesele din care rezultă CO2 sau alte gaze. De obicei, aerul circulă încontracurent cu lichidul pentru a intensifica înlăturarea căldurii degajate în timpulfermentaţiei sau a reacţiei enzimatice.ţ ţ
Când se lucrează cu microorganisme acestea formează un „film biologic” în jurulparticulelor de umplutură.
Bioreactoarele cu umplutură se utilizează şi în cazul enzimelor sau celulelorimobilizate.
Figura 31. Bioreactor tip coloană cu umplutură cu recirculare a mediului
BioreacBioreactoare în strat fluidizattoare în strat fluidizat
Când bioreactorul cu umplutură este operat cu stratul în suspensie, atunci else numeşte „strat fluidizat”.
pentru prima oară, a fost descris de Moebus în 1981, şi a fost folosit lafermentaţia glucozei la etanol folosind un strat fluidizat format din granule dedrojdie.
Gazul de fluidizare păstrează în acelaşi timp granulele în mişcare şi le usucă.Aerul este introdus pe la partea inferioară a bioreactorului şi menţine în
i lt d l l i i bili t U i f l t i isuspensie cultura de celule sau enzime imobilizate. Uneori se foloseşte nisipsau un alt material care se amestecă cu celulele microbiene.
Procedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate în fabricarea beriiProcedeul este uneori folosit cu microorganisme floculate, în fabricarea beriişi a oţetului.
BioreacBioreactoare în strat fluidizattoare în strat fluidizat
Figura 32.Bioreactor în pat fluidizatfluidizat
BioreacBioreactoare cu strat fixtoare cu strat fix
Reprezintă o variantă a bioreactoarelor cu umplutură, deosebirea constând în introducerea şi distribuirea mediului lichid prin partea superioară a bioreactorului
lichidul circulă în jos cu viteză mică, scurgându-se pe particulele de umplutură. Acest tip de bioreactor este mult mai utilizat în tratamentelor apelor reziduale, când configuraţia bioreactorului se modifică prin introducerea unor „biofiltre” (figura ).
A l ăt d i f t l d l t i f i ă bi t l iAerul pătrunde prin ferestrele de la partea inferioară a bioreactorului, se ridică prin convecţie naturală şi alimentează cultura de microorganisme cu oxigen.
Dezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării uneiDezavantaje: utilizarea volumului reactorului în scopul creării unei interfeţe cât mai mari; repartizarea uniformă a lichidului peste umplutură pentru ca întreaga suprafaţă de lichid să lucreze uniform.
BioreacBioreactoare cu strat fixtoare cu strat fix
Figura 33. Bioreactor cu flux fix
BioreacBioreactoare cu strat fixtoare cu strat fix
Figura 34. Biofiltru utilizat la purificarea apelor reziduale
BioreacBioreactoare cu enzime imobilizatetoare cu enzime imobilizateavantaje la transformarea substanţelor în cataliză eterogenă :v je s o e subs ţe o c e e oge :
• permite utilizarea repetată a enzimei;• permite lucrul în instalaţii semicontinue şi continue (volumul micp ţ ş (ocupat de instalaţie permite automatizarea proceselor);• se elimină faza de inactivare termică deoarece enzima nu se regăseşteamestecată cu produsul;• se pot trata soluţii diluate de substrat (ape reziduale, subproduse);• scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse;•nu se formează produşi secundari.
Avantaje faţă de procesul de transformare a substratului cu ajutorulmicroorganismelor:
BioreacBioreactoare cu enzime imobilizatetoare cu enzime imobilizate
• se elimină faza de inactivare termică• se pot trata soluţii diluate de substrat•Scade timpul de contact între enzimă, substrat şi produse
c oo g s e o :
• nu se formează produţi secundari•în procesul de transformare se utilizează întreaga cantitate de substrat (în cazul proceselor fermentative 1% din cantitatea de substrat este utilizată la d l i i l )dezvoltarea microorganismelor);•datorită existenţei unei singure enzime există posibilitatea efectuării unei singure reacţii enzimatice specifice (în cazul proceselor fermentative microorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformărimicroorganismele produc un complex de enzime care pot duce la transformări secundare);•costurile sunt reduse deoarece este eliminată faza de cultivare a microorganismelormicroorganismelor.
tehnici de imobilizare a enzimelor:Procedee fizice: Procedee chimice:
i l i l l- adsobţia pe suporturi solide;- includerea în structuri macromoleculare;- microîncapsularea;
- reticularea intramoleculară;- legarea covalentă pe suporturiinsolubile reactive
BioreacBioreactoare cu enzime imobilizatetoare cu enzime imobilizate
Cantitatea de enzimă care se cuplează la suport variază de la 1mg – 1gproteină/g preparat imobilizat
R i i l i bili i fl ă d ă ii f iReactivitatea preparatelor imobilizate este influenţată de următorii factori:
• granulometria –;• masa moleculară a substratului –masa moleculară a substratului• pH mediului de reacţie –• stabilitatea preparatelor enzimatice imobilizate -
Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:Bioreactoarele conţinând preparate enzimatice imobilizate se clasifică în:
• Discontinue cu agitare;• Continue cu agitare;
C ti d ti l ă• Continue de tip coloană;• Continue în pat fluidizat
Alegerea tipului de bioreactor depinde de caracteristicile fizice aleg p ppreparatului imobilizat, de capacitatea de producţie a instalaţiei şi de naturasubstratului ce trebuie transformat.
ETAPE PRELIMINARE ÎNTRETAPE PRELIMINARE ÎNTR--UN UN PROCES BIOTEHNOLOGICPROCES BIOTEHNOLOGICPROCES BIOTEHNOLOGICPROCES BIOTEHNOLOGIC
totalitatea paşilor necesari în vederea recuperării produsului final în orice tip de industrie
Ex.: procesul de fermentatie clasicLa sfârşitul fermentaţiei - separarea fazei solide (de obicei celule, dar şi celule împreună cu enzime pe un
i i d l di l i d l ) d li hidanumit tip de suport, sau componente ale mediului de cultură) de cea lichidă care în 90% din cazuri este apoasă.
Proprietăţi Bacterii Drojdii Fungi
formă baghete, sfere, sfere, elipsoidice, filamente
Tabelul 4. Proprietăţile celulelor cu referire la procesul de separare
catene filamente
mărime 0.5µm – 3 µm 1 – 50 µm 5 –15 µm diametru50 – 500 µm lungime
greutate specifică
1,05 –1,1 1,05 – 1,1 1,05 – 1.1
greutatea celulei
10-12 g 10-11 g -
IntroducereIntroducere Principiul de separare
Metoda de separare Mărimea particulelor (µm)
mărimea particulelor
Filtrarea pe fibreMicrofiltrarea
>200 – 1020 – 0,5
ă i l fil 2 0 00
Tabelul 5.
Mărimea moleculei
UltrafiltrareHiperfiltrareGel cromatografieDializă
2 – 0,0050,008 – 0,00025
2 – 0,00030,002 – 0,00025
Clasificarea metodelor de separare
Temperatură Cristalizare <0,002
Solubilitate Adsorbţie <0,002Extracţie <0,002
Sarcina electrică
ElectroforezăElectrodializă
2 –0,020,02 – 0,00025
Cromatografie de schimb ionic
0,02 – 0,00025
Densitate Sedimentare >1000DecantareCentrifugareultracentrifugare
1000 – 51000 – 0,5
2 – 0,02
FiltrareaFiltrarea- separarea filamentelor de fungi şi bacteriilor filamentoase de bulionul de fermentatie- separarea floculelor de fungiîn toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.
Tipuri de filtrare:filtrare de suprafaţă,filtrare de adâncime,
separarea floculelor de fungiîn toate cazurile se foloseşte vacuum sau suprapresiune.
vacuum / suprapresiunefiltrare de adâncime,filtrare prin centrifugare;
Parametri filtrarii:1. Rata de filtrare –
p p
2. Rezistenţa filtrelor –Tipuri de filtre:
simple, plate, ansamblu de filtre
Exemple:1. Separarea microorganismelor din bulionul de fermentatie
b t i d filt t ti- baterie de filtre rotative2. filtrarea mediilor de biosinteza
- cu ajutorul adjuvantilor de filtrare:- în strat subţire pe materialul filtrant;- în strat subţire pe materialul filtrant;- amestecarea adjuvantului cu suspensia de filtrat;- raclarea stratului de adjuvant - in cazul filtrelor rotative
variantă - filtrarea sterilizantă.prefiltrare grosieră,filtrarea sterilizantă propriu-zisă.
se montează în filtru plăci din acetat de celuloză,b li i i i i di d l ilazbest sau polimeri sintetici cu diametru redus al porilor,
Avantaj: temp. scăzută, consum mic de energie, integrareafiltrării cu spălarea, îndepărtarea parţială a apei
Dezavantaj: contaminarea cu aer
Cel mai adesea pentru separarea microorganismelor de bulionul de
Dezavantaj: contaminarea cu aer
fermentaţie se utilizează o baterie de filtre rotative menţinute sub presiunea exercitată din interiorul reactorului – presiune constantă
Filtrele sub formă de centură - potrivite pentru precipitatele deja filtrateşi care necesită o spălare mai îndelungată. Dacă acest tip de filtrare serealizează într-o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapidrealizează într o presă îndepărtarea apei se va realiza mai rapid.
FiltrareaFiltrarea
Figura 34. Reprezentarea schematică a filtru rotativ menţinut sub vacuum
Filtrarea pe membraneFiltrarea pe membranemetodă versatilă - utilizată pentru separarea şi concentrarea diferitelor molecule sauparticule
Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membrane
particule.În ultrafiltrare membranele pot fi considerate ca o „sită” (membrane microporoase) acăror mărime a porilor guvernează separarea.
Tabelul 7. Aplicaţiile filtrării pe membraneTipul de filtrare
Aplicaţia Masa molecularărelativă a particulelor ce
pot fi separatemicrofiltraremicrofiltrare concentrarea bacteriilor şi
virusurilor>1 000 000(sau particule)virusurilor (sau particule)
ultrafiltrareaultrafiltrarea fracţionare;dializă;producerea de enzime;producerea de proteine;
>10 000(macromolecule)
producerea de proteine;producerea zerului
osmozaosmoza inversăinversă concentrarea produselorfarmaceutice;producerea lactozei;desalinizarea parţială a soluţiilor;
>200(compuşi organici)
electrodializaelectrodializa purificarea şi fracţionareasubstanţelor ionice;desalinizarea
>100(compuşi organici)
microfiltrarea – sistem închis- avantaj: se lucrează în condiţii sterile- se separă celule şi metaboliţi specifici
ultrafiltrarea - apare fenomenul de “polarizare a concentrării”
Filtrarea pe membraneFiltrarea pe membrane
Figura 39. Secţiune transversală printr-un modul de ultrafiltrare „plate and frame” (The Danish Sugar Co). 1 – grătar central; 2 – fereastră; 3 – membrană; 4 –hârtie de filtru; 5 – suport plat pentru membrană
Filtrarea pe membraneFiltrarea pe membrane
Figura 40. Reprezentarea schematică a unui modul de ultrafiltrare „hollow-fibre” (romicon). 1 – hollow fibre; 2 –( )lagăr; 3 - suport pentru fibre.
Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:
CentrifugareaCentrifugarea
Performanţa unei centrifugări poate fi caracterizată de expresia:Q = d2∆ρgZF/18η
şiZ R 2/ R 2/900Z = Rω2/g ≅ Rn2/900
unde: Q – rata de încărcare volumetrică;d – diametrul particulei;∆ dif ţ d d it t∆ρ - diferenţa de densitate;g – acceleraţia gravitaţională;F – volumul păstrat în centrifugă;η - vâscozitatea;η - vâscozitatea;R – radius;ω - viteza unghiulară;N – numărul de revoluţii/minutţ
Funcţia Σ = FZ, este utilizată în compararea diferitelor centrifugări. Deoarece F creşte cu lungimea axială a rotorului şi Z cu diametrul şi viteza rotorului, performanţele utilizării unor rotoare mai lungi (F), mai rapide sau mai largi (Z) sunt superioare. Valorile lui Z sunt limitate de natura materialului din care este construit rotorul.
CentrifugareaCentrifugarea
Figura 35. Exemple de centrifugi solide: (1) scobitură tubulară, (2) scobitură solidă multicamerală, (3) centrifugă cu scobitură în formă de disc
Tabelul 6
Tipul de centrifugă Avantaje Dezavantaje Detalii tehnice
coş perforatcoş perforat bună îndepărtare a apei;uşor de curăţat;
capacitate limitată pentrusolide;
n – 500 – 2500 min-1
Z – 300 - 1500
CentrifugareaCentrifugarea
Tabelul 6. Proprietăţile diferitelor tipuri de centrifugi
ş ţ ;posibila spălare a filtrelor
;recuperare laborioasă asolidelor;forţă centrifugă mică;funcţionare discontinuă
Σ - 900 – 1800
centrifugă cu centrifugă cu utilizată la separareasolidelor;
forţă centrifugă mică n – 500 – 1000 min-1
Z 300 1500sită rotativăsită rotativă solidelor;posibilă spălare a filtrelor;funcţionare continuă
Z - 300 – 1500
coş tubularcoş tubular bună îndepărtare a apei;forţă centrifugă mare;
capacitate limitată pentrusolide;
n - 13000 – 18000 min-1
d – 75 – 150 mmţ guşor de curăţat;uşor de îndepărtat coşul
recuperare laborioasă asolidelor;funcţionare discontinuă
Z – 13000 - 17000Σ - 1500 - 4000
coş coş multicameralmulticameral
capacitate mare pentrusolide;
i d fi i ţă â ă l
recuperare laborioasă asolidelor;f ţi di ti ă
n – 5000 – 10000 min-1
d – 125 – 530 mmZ 6000 11400multicameral multicameral
solidsolidnu pierde eficienţă până lacompleta încărcare acamerelor
funcţionare discontinuă Z - 6000 - 11400
centrifugă cu centrifugă cu descărcare descărcare
trecere rapidă simultan cuo concentrare mare;funcţionare continuă
forţă centrifugă mică n – 700 – 2500 min-1
Z – 350 – 1400Σ - 900 - 2300
rotativărotativăţ
centrifugă cu centrifugă cu scobitură în scobitură în formă de discformă de disc
funcţionare discontinuă;forţă centrifugă mare;eliminarea lichidului subpresiune;curăţare ieftină
îndepărtare slabă a apei;funcţionează numai cusolide mici în suspensie
n – 3000 – 10000 min-1
Z – 4000 - 7500Σ > 270000
curăţare ieftină
centrifugă cu centrifugă cu tub de elimitub de elimin.n.a sola sol.. apoaseapoase
funcţionare continuă;forţă centrifugă mare
îndepărtare slabă a apei; n - > 10000 min-1
Z > 14000Σ > 80000
Aducerea în suspensieAducerea în suspensieÎn cazul celulelor bacteriene cu dimensiuni miciMetode: - formarea de floculi
Dezintegrarea celulelorDezintegrarea celulelor- metoda de plutire
Microorganisme:
Figura 36. Metode de rupere a microorganismelor
Celule animale şi vegetale – metode mecanice- îngheţare rapidă şi tăiere – cel. anim.- liză enzimatică – cu celulaze şi hemicelulaze- cel. Veg.
Metode de extracţieMetode de extracţie
termenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentraretermenul de extracţie se referă atât la separare cât şi la concentrareDistribuţia substanţei între cele două faze este guvernată de un coeficient de partiţie caracteristic, K:
K =Concentratia substantei in faza A
K Concentratia substantei in faza B
Figura 37. Procesul tehnologic de recuperare a antibioticelor
Metode de concentrareMetode de concentrare
- trebuie să nu afecteze structura şi activitatea produsului- printr-o etapă de separare sau extracţie-ca o ultimă etapă înainte de purificarea economică;p p ;-- tipuri:extracţia, evaporarea,
- procesarea pe membrane,- cromatografia de schimb ionic,- cromatografia de adsorbţie
EvaporareaEvaporarea
Se aplică la soluţiile obţinute în urma extracţiei cu solvenţi, caz în care evaporareaSe ap că a so uţ e obţ u e u a e acţ e cu so ve ţ , ca ca e evapo a easolventului este obligatorie.Evaporarea directă a mediului de cultură - în cazul produşilor secundari, de obiceiprin folosirea unui spray de uscare;Evaporarea în timp scurt (min.) – este continuă; permite concentrarea produselorinstabile cu ajutorul unor filme de evaporare;Evaporarea cu filme subţiri sub formă de peliculă – concentrarea amestecurilor
f fi l d d l ivâscoase, sau în faza finală de uscare a produsului.
Filtrarea pe membraneFiltrarea pe membrane
Răşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţieRăşini schimbătoare de ioni şi de adsorbţieRăşini schimbătoare de ioni: - concentrarea puternică într-o singură etapă.
Tabelul 8 Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichiziTabelul 8. Natura chimică a schimbătorilor de ioni solizi şi lichiziSchimbător de ioni
Matrix Grupări funcţionale
Răşini schimbătoare de
Stiren-divinil.benzen;Acrilat;
Carboxil;Acid sulfonic;schimbătoare de
ioni solidesolideAcrilat;Metacrilat;Poliamina;Celuloză;Dextran
Acid sulfonic;Amine primare, secundare şi terţiare;Amine cuaternare
Schimbători de ioni Solventul este folosit pentru Amine primare secundare şiSchimbători de ioni lichizilichizi
Solventul este folosit pentru transportul grupelor funcţionale
Amine primare, secundare şi terţiare;Monoesterul acidului fosforic;Diesterul acidului fosforic
Tabelul 9. Proprietăţile răşinilor de adsorbţieSuprafaţă 20 – 800 m2g-1
Răşini de adsorbţie: - sunt utilizate în locul procedeelor de extracţie
Proprietăţi fiziceVolumul porilor 0,5 – 1,2 ml g-1
Mărimea medie a porilor 5 – 130 nm
i i i i
Proprietăţi chimice
Nepolar: stiren-divinil benzen;Semipolar: ester acrilic;Polar: sulfoxid, amide, grupările N-O
PurificareaPurificarea şişi stabilizareastabilizarea amesteculuiamesteculuiÎn fiecare din etape se realizează o purificare a produsului finit. În final se ajunge cu un produs al cărui grad de puritate nu este întotdeauna satisfăcător motiv pentru care este necesară introducerea unei etape finale de purificare şi stabilizare. În prezent se utilizează două metode de purificare: cristalizarea şi
ficromatografia.
CristalizareaCristalizarea
Este folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică cum sunt deEste folosită la purificare compuşilor cu masă moleculară mică, cum sunt de exemplu antibioticele.
La o scară mai mare cristalizarea este etapa finală de purificare a unor produşi p p p şca actinomiceina A, penicilina G, acidul citric, glutamatului de sodiu etc.
CromatografiaCromatografia
purificarea compuşilor cu masă moleculară mică care într-adevăr necesităparcurgerea unei astfel de etape (de exemplu antibioticele), a macromoleculelor, aenzimelor atunci când sunt însoţite de compuşi de aceiaşi natură.
Purificarea şi stabilizarea Purificarea şi stabilizarea amesteculuiamestecului
Figura 41. Izolarea şi purificare actinomicinei
Purificarea şi stabilizarea Purificarea şi stabilizarea amesteculuiamestecului
Echipamentul constăb i d lîntr-o baterie de coloane
cu diferite matrixuri,rezervoare, sisteme depompare a eluentului şipompare a eluentului şio serie de colectoare defracţii.
Figura 42. C=PHARMACIA 1501 segment de coloană din oţel: P –filt S S filt t il Fl flfiltru, S1, S2 - filtre sterile, Fl – flow-metru, UV – spectrofotometru UV
Purificarea şi Purificarea şi stabilizarea amesteculuistabilizarea amestecului
Figura 43. Procesul tehnologic de purificare a proteinelor plasmatice umaneproteinelor plasmatice umane (Curling, 1980)
Prin cromatografie de afinitate se purifică în special enzimele dintr-unamestec de proteine Folosindu-se o soluţie tampon cu pH diferit de cel al
Purificarea şi stabilizarea amesteculuiPurificarea şi stabilizarea amestecului
amestec de proteine. Folosindu se o soluţie tampon cu pH diferit de cel alenzimei, enzima poate fi eluată selectiv de pe coloană. Astfel de efectorispecific sau molecule complementare care pot fi separate prin acest procedeusunt: enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);enzime/inhibitori enzimatice (sau vice-versa);
anticorpi/antigene sau haptene (şi vice-versa);lectine/glicoproteine sau polizaharide;acizi nucleici/secvenţe de baze complementare;ţ p ;hormoni/receptori;vitamine/proteine transportoare etc.
exemplu:principiul de separare a dehidrogenazele se bazează pe interacţiile specifice
cu coenzima sa (NAD+). Ca matrix se foloseşte sepharoză la care este legat NAD+.Interferonul din leucocitele umane este recuperat prin cromatografie de
fi i d l ă d d l f l i l l lafinitate, de pe o coloană de dextran la care a fost legat anticorpul monoclonal împotriva interferonului.
Dezavantaj: cost mare al efectorilor imobilizaţiC t fi d fi it t d ifi î li t i l iCromatografia de afinitate de grup specific: în separarea glicoproteinelor şi nucleotidelorCromatografia covalentă: separarea proteineor care contin grupări -SH
UscareaUscarea
Este modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fiEste modalitatea prin care bioprodusul este adus în formă stabilă pentru a putea fimanipulat, ambalat, transportat. Deoarece majoritatea produşilor biologici suntsensibili se descompun uşor sau îşi pierd activitatea atunci când se găsesc latemperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creşteretemperaturi înalte, singura metodă de uscare este îndepărtarea apei cu o creştereminimă a temperaturii. În cazul enzimelor şi a produselor farmaceuticetermostabilitatea este asigurată prin adăugarea de zaharuri sau alţi stabilizatori inerţi.
Pentru a elimina apa sub formă de vapori, energia rezultată în urma încălziriitrebuie transferată prin convecţie, radiaţie, sau ambele procedee combinate şicontrolată strict pentru a nu permite depăşirea pragului de temperatură. Cele maip p p ş p g putilizate tehnici sunt:
• uscare la vacuum • uscare cu jet de gaz • uscare prin îngheţare rapidă
BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ BIOMASA MICROBIANĂ CA SURSĂ DE OBŢINERE A PROTEINELORDE OBŢINERE A PROTEINELORDE OBŢINERE A PROTEINELORDE OBŢINERE A PROTEINELOR
IntroducereIntroducere„single„single cellcell protein”protein” (SCP)(SCP) -- o singură proteină celulară -- termen utilizat şi„single„single cellcell proteinprotein (SCP)(SCP) o singură proteină celulară termen utilizat şiacceptat pentru materialul celular microbian folosit ca hrană şi furaj. Termenulnu este în totalitate corect - proteina obţinută ca produs al unui procesbiotehnologic nu este 100% pur. Termenul a fost atribuit ţinând cont de faptulcă o proteină se poate obţine dintr-o varietate de microorganisme mono – şimulticelulare, bacterii, drojdii, fungi filamentoase sau alge
Tabelul 10 Exemple de microorganisme care pot fi
Caracteristica Paecilomycesvarioti
Fusariumgraminearum
Candidautilis
Material uscat (%) 96 94,2 91
Tabelul 10. Exemple de microorganisme care pot fiutilizate ca sursă de obţinere a SCP
Material uscat (%) 96 94,2 91Proteină crudă (% N x 6,25) 55 54,1 48
Grăsimi (%) 1,0 1,0 1,35Cenuşă (%) 5 6,1 11,2Li ină (g/16g N) 6 5 3 5 7 2Lizină (g/16g N) 6,5 3,5 7,2Metionină (g/16g N) 1,9 1,23 1,0Cistină şi cisteină (g/16g N) 1,0 0,75 1,0
IntroducereIntroducereproducerea microorganismelor la scară industrială în vederea obţinerii unor
produse alimentare - în Germania, în timpul Primului Război Mondial -producerea de drojdie „Torula”.
SUA şi Marea Britanie -P i C f i ţă 1967 l I tit t l d T h l i di M h ttPrima Conferinţă - 1967 la Institutul de Tehnologie din Massachusetts;
majoritatea proiectelor prezentate au fost la nivel de cercetare. O singurăprezentare, cea a cercetătorilor de la „British Petroleum” (BP) a scos în evidenţă,aplicaţiile fermentaţiei SCP la scară industrialăaplicaţiile fermentaţiei SCP la scară industrială.
De ce să producem SCP?creşterea cerinţelor pieţei pentru hrană mai sănătoasăfuraje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr o tehnologiefuraje în compoziţia cărora intră proteine înalt purificate printr-o tehnologie
avansatăavantajele producerii la scară largă a biomasei microbiene:
rată mai mare de multiplicarerată mai mare de multiplicare,conţinut proteic ridicat (30 – 80% proteine în masă uscată),utilizarea unui număr mai mare de surse de carbon,sitele de cernere se pot construi din materiale mai bune şi relativ uşor,p ş ş ,instalaţiile de producţie ocupă suprafeţe mici şi duc la creşterea randamentului
de producţie,producţia microbiană este independentă de anotimp, variaţii climaterice.
Procesul de obţinere a SCPProcesul de obţinere a SCPEtapele procesului de obţinere a SCP se stabilesc în funcţie de substratul şi organismul utilizat
Figura 44. Reprezentarea schematică a unui proces general de producere a SCP
Procesul de obţinere a SCPProcesul de obţinere a SCPEtape de bază:pe de b :
combinarea fizică şi tratamentul chimic al materiilor prime de bază;prepararea mediului corespunzător care conţine surse de carbon, azot, fosfor, şialţi nutrienţi esenţiali;alţi nutrienţi esenţiali;prevenirea şi contaminarea mediului sau a plantelor;cultivarea microorganismului necesar;separarea biomasei microbiene de mediul consumat;
recuperarea biomasei –spargerea celulelor –
tratamentul final al biomasei cu sau fără etape de purificare finală,îndepărtarea excesului de substrat sau a componentelor acestuia –,reducerea concentraţiei ARN –reducerea concentraţiei ARNtratarea reziduurilor –
se recuperează între 18 şi 45 x 106 litri funcţie de substrat şi microorganism la o producţie de 100.000 t SCP/anp ţ
Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelorCaracteristici de bază ale microorganismul utilizat pentru obţinerea uneiC c e s c de b a e c oo ga s u u a pe u obţ e ea u eanumite proteine:
să nu fie patogenic pentru instalaţie, animal sau om;să aibă o valoare nutriţională bună;să fie acceptat pentru hrană şi furaje;să nu conţină compuşi toxici;producerea la scară largă să necesite costuri minime.
De reţinut: costul de producţie depinde de:viteza şi randamentul de creştere,conţinutul în proteina ţintăconţinutul în proteina ţintă,necesarul de nutrienţi suplimentari,utilizarea unui mediu avantajos,proprietăţile de uscare şi separarep p ţ ş p
Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelorTabelul 11. Compoziţia în aminoacizi a drojdiilor şi a unor alimente selectate
Aminoacid
Conţinutul de aminoacizi (g/16g N) în:
SCPProteine tradiţionale
din componente furajere
Proteine alimentare
T iT i P kilP kil S h iS h i Făi ăFăi ă E t tE t t didi OO R f i ţR f i ţToprinaToprina PekiloPekilo SacharomicSacharomiceses cerevisiaecerevisiae
FăinăFăinădedepeştepeşte
ExtractExtract dindinfasolefasole dede soiasoia
OuOu ReferinţeReferinţeFAOFAO
izoleucină 5,1 4,8 4,6 4,6 5,4 6,7 4,2
leucină 7,4 7,4 7,0 7,3 7,7 8,9 4,8, , , , , , ,
fenilalanină 4,3 4,0 4,1 4,0 5,1 5,8 2,8
tirozină 3,6 3,5 - 2,9 2,7 4,2 2,8
treonină 4,9 4,1 4,8 4,2 4,0 5,1 2,8
triptofan 1,4 1,1 1,0 1,2 1,5 1,6 1,4
valină 5,9 5,1 5,3 5,2 5,0 7,3 4,2
arginină 5,1 5,3 - 5,0 7,7 - -
histidină 2,1 1,9 - 2,3 2,4 - -
lizină 7,4 6,5 7,7 7,0 6,5 6,5 4,2
cisteină 1,1 1,0 - 1,0 1,4 2,4 2,0
metionină 1,8 1,9 1,7 2,6 1,4 5,1 2,8
aminoacizi cusulf
2,9 2,9 - 3,6 2,8 7,5 4,8
Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelor
Algele –genurile Chlorella, Scenedesmua sau SpirulinaAlgele genurile Chlorella, Scenedesmua, sau Spirulina.cresc prin procedee fotosintetice şi autotrofice sau heterotroficcultivare la scară largă - în eleştee deschise, la lumina soarelui.Probleme:Probleme:
Risc crescut de contaminare,densitate celulară mică,alge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltarealge unicelulare → costuri ridicate pentru procedeele de recoltare
compoziţia în proteineconţinutul total de proteine native (ntotal x 6,25) ≥60% → profilul în
aminoacizi al SCP este în general bunaminoacizi al SCP este în general bun.algele cu un conţinut bogat de pigmenţi fotosensibili → la producerea de SCPpentru furaje, dar nu şi pentru alimente.
i l l tili t t bţi d t i diti d î t ţimicroalgele- utilizate pentru obţinerea de proteine aditive, dar nu în concentraţiemare şi în anumite condiţii de calitate.incorporarea algelor Chlorella şi Scenedesmus în dieta umană → numeroase
bl S i li f d ili ăprobleme; Spirulina este foarte des utilizată
Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelor
Bacteriile –rată mare de creştere,numărul de bacterii utilizate în producerea de SCP este în continuă creşterestandard ridicat de sterilitate în întreg procesul tehnologicrecuperarea bacteriilor prin centrifugare este o problemă - noi metode care săp p g ppermită omorârea acestora şi nu deversarea în mediuconţinut proteic de aproximativ 80%,conţinut ridicat de ARN care trebuie îndepărtatţ pprofilul în aminoacizi al SCP este în general bun; câteodată prezintă unconţinut mic de aminoacizi cu sulf
Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelor
Drojdiile –genurile Saccharomyces, Torulopis şi Candidaviteza mare de creştere a culturilorviteza mare de creştere a culturilorrisc redus de contaminare cu agenţi patogenirecuperare – din reziduuri, uşor, prin centrifugare continuă.conţinutul în proteine este de aproximativ 55 60%conţinutul în proteine este de aproximativ 55-60%,conţinutul în acizi nucleici este >15% din greutatea de bază (este necesară oetapă de reducere a concentraţiei acestora)
fil l i i il di t t SC î l bprofilul aminoacizilor din structura SCp - în general bun
Selectarea microorganismelorSelectarea microorganismelorFungii filamentoşi –
sistem de cultivare - culturi în suspensie sub formă de filamente sau de pelete,viteză de creştere mai mică decât a bacteriilor şi drojdiilor; microfungii pot
atinge o viteză de creştere apropiată de cea a drojdiilorg ş p p jrisc redus de contaminare cu agenţi patogeni (cresc la un domeniu de ph mai
larg, între 3 şi 8 ceea ce permite cultivarea lor la ph 5)risc de contaminare cu drojdiijrecuperarea fungilor - filtrare.conţinutul în proteine variabil; 50 – 55% din total substanţă uscată.conţinut în ARN - până la aproximativ 15% din masa uscată,conţinut în ARN până la aproximativ 15% din masa uscată,conţinut în chitină - până la aproximativ 15% din masa uscatăprofilul aminoacizilor din structura SCP – bună (săracă în aminoacizi cu sulf)
Alegerea substratuluiAlegerea substratului
Sursele de compuşi cu conc. mici de carbond ă i “f il ”două grupuri: - “fosile”
- “reînnoite”
Alegerea substratuluiAlegerea substratului
( )Hidrocarburi lichide –n-alcanii (saturaţi, cu catenă liniară) C9 - C180 -30 % în uleiurile naturale şi în kerosenbenzina - numai 10% fermentează, restul trebuie recuperat, separat de SCP, şi
returnat la rafinărie pentru o procesare ulterioară- posibilă contaminare cu policicluri aromatice
transferul n-alcanilor C10 – C18 în celulă –macro – emulsia care este transformată într-o micro – emulsie →
obţinerea agenţilor de emulsionare - surfactanţisursă de energie şi carbon -Compania „Britisch Petroleum” (BP) - două procese de producţie:
benzinan-alcanii puri.„Toprina” - produs omologat de BP şi comercializat
Instalaţie de cultivare a Candida utilizând ca substrat benzina
Alegerea substratuluiAlegerea substratului
Hidrocarburile gazoase –cel mai des utilizat este metanulavantaje:
•disponibil la puritate mare;• uşor îndepărtat în urma procesului de fermentaţie• nu lasă reziduuri;• cultivare continuă → randament bun, productivitate ridicată
probleme de producţietransferarea a două gaze – metan şi oxigenformarea în mediu a unor produşi de inhibiţieexplozie dacă concentraţia de oxigen depăşeşte 12% (v/v)foarte costisitor
microorganisme capabile să utilizeze metanul ca substrat - bacteriilePseudomonas methanica, Methanomonas methanica, bacteriile termofileMethylococus capsulatus şi Pseudomonas methanitrificans.y p f
Alegerea substratuluiAlegerea substratului
Metanol - alternativă a producerii de biomasă din metanse fabrică din metan prin conversie salvându-se astfel surplusul de gaz
natural, dar şi din alte surse cum ar fi cărbunele, motorina, lemnul şi naftalinaeste utilizat de bacteriile metanifere şi de Methylomonas methanolica,
Pseudemonas utilis, Pseudomonas extorquens, hydromicrobium sp;actinomicite: Streptomyces sp, drojdii Hansenula polymorpha, Candidaboidinii, Torulopsis glabatra.
avantaje:jperfect solubil în apă,puţine posibilităţi de explozie,numărul de microorganisme care poate fi cultivat este mareg p
produs de Imperial Chemical Industries Ltd (ICI) (UK) → bacteriaMethylophilus methylotrophus
P li h id hid li l l i id l
Alegerea substratuluiAlegerea substratului
Polizaharide hidrolizate – celuloza şi amidonulhidoliza se poate realiza enzimatic sau prin tratament acidceluloza - hidroliza se realizează sub acţiunea celulazei din fungi, ca de exemplu
Trichoderma viride- proces scump
amidonul - procesul tehnologic este prea scump- Rank Hovis McDougall (RHM) → proces bazat pe hidroliza amidonului;
ca microorganism a fost selectat mucegaiul Fusarium graminearum- pus în fabricaţie sub denumirea de „Mycoprotein”- dezavantaj - se transformă în gelatină- se preferă creşterea microorganismului pe materiale solide, în absenţa
lichidelor - „fermentaţie semi-solidă”
DIGESTIA ANAEROBĂDIGESTIA ANAEROBĂ111. 1. IntroducereIntroducere
Definiţie: procesul anaerob de producere a metanului şi a dioxidului de carbondi t i l i i tili i t d i idin materiale organice prin utilizarea unui amestec de microorganisme.
Fermentaţia - proces catabolic anaerob în care energia se obţine în urmadegradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori dedegradării compuşilor organici care pot fi atât donori cât şi acceptori deelectroni.
- microorganisme anaerobe şi facultativ anaerobe,- substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),substraturi: polizaharidele (celuloză, amidon, chitină),
dizaharidele (zaharoză, lactoză, manoză), hexozele (glucoză, fructoză,galactoză), pentozele, polialcoolii (glicerol, manitol), aminoacizi, aciziorganici, purine şi pirimidine.
- produşi: alcooli, acizi, esteri şi diferiţi compuşi în staregazoasă (H2, CH4, CO2).
- beneficii comerciale: producerea de energie, reducereapoluării şi controlul diferitelor mirosuri
2.2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobeCaracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobe2 1 Interacţii specifice2.1. Interacţii specifice
realizarea unui complex omogen interdependent de culturi bacteriene;formarea metanului, acetatului, H2 şi CO2:
b t ii tili ă ă li it t d b t t i• bacterii utilizează un număr limitat de substraturi• acţiunea bacteriile fermentative şi hidrolitice asupra deşeurilor organice → substratele metanogene;• producerea H :• producerea H2:
- bacterii fermentative- bacterii acetogenice → acetat + H2- bacterii metanogene → CH4 + CO2bacterii metanogene CH4 CO2
• avantajele metodei:- organismul introdus în bioreactor poate utiliza protonii sau acceptorii de electroni generând H22- H2 poate fi utilizat de bacteriile metanogene
• presiunea parţială scăzută a H2 permite creşterea bacteriilor pe substrate reduse
-Bryant (anii ’60) → cultură pură de methanobacillus omelianskii• probleme: dificil de identificat speciile de microorganisme din bioreactor
2.2.Caracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobeCaracteristici biochimice şi microbiologice ale digestiei anaerobeConcept: în toate procesele de digestie care utilizează ca substrat deşeuri complexe întâlnim toate grupurile de microorganisme troficeîntâlnim toate grupurile de microorganisme trofice
anii ’60: o cultură pură de metanogene poate utiliza ca sursă de energie unpoate utiliza ca sursă de energie un număr limitat de compuşi;anii ’80: McInerney şi col. -clasificarea taxonomică a metanogenelor - toate gspeciile pot obţine energie în urma reacţiei:4H2 + CO2→CH4 + 2H2O ∆G0’ = - 139 kJmol-1
Figura 47 Populaţia microbianăFigura 47. Populaţia microbiană prezentă în bioreactorul de digestie
3. 3. Tipuri de bioreactoare de digestieTipuri de bioreactoare de digestiedeşeurile produse într-o fermă obişnuită;i t l ţii b t t it di t i l l l t f ţiinstalaţii robuste, construite din materiale locale, care pot funcţiona
în sistem batch sau continuu, prin alimentare cu deşeuri o dată pe zi;nu sunt încălzite, sunt amestecate manual şi sunt izolate cu materiale
locale
Bioreactoare clasice:
locale
Bioreactoare batch:
bioreactorbioreactor cece funcţioneazăfuncţionează înîn sistemsistem continuu,continuu, cucu agitareagitare (CSTRCSTR ––„continuously„continuously stirredstirred tanktank reactor”reactor”)
este un sistem continuu în bioreactor va exista în permanenţă un amestecformat din deşeuri noi care se adaugă, material nedigerat şi câteva populaţiimicrobiene active;
i tăexistă:bioreactoare tubulare numite „plug flow”bioreactoare în care are loc reţinerea microorganismelor
este necesar un vas de stocare a gazului;este necesar un vas de stocare a gazului;întâlnit în tratamentul noroiurilor
4.4.Tipuri de Tipuri de deşeuri utilizate ca substratdeşeuri utilizate ca substrat
în funcţie de consistenţă: deşeuri de consistenţă joasă,medie şicrescută şi
d i lid
Clasificare
deşeuri solide.în funcţie de conţinutul în masă uscată de substanţe solide (TS):
0,2 –1%, 1 5% 5 12%1-5%, 5-12% 20-40% substanţă solidă.
Metode
determinare volatilităţii solidului (VS) care implică încălzirea materialului uscatla 500 0C pentru a îndepărta materialul organic ca CO2 şi
determinarea necesarului de oxigen (COD „chemical oxigen demand”) care înmod uzual se aplică deşeurilor cu o consistenţă mare şi implică o oxidare chimicăcantitativă a materialului organic.BOD5 „biochemical oxygen demand measused over a 5-day period”,TOC t t l i b ” tili tă t t i l l l bilTOC „total organic carbon” – utilizată pentru materialele solubile.
4.4.Tipuri de Tipuri de deşeuri utilizate ca substratdeşeuri utilizate ca substrat
Caracteristici: di d t b t l ţi i t i ţi d bi iCaracteristici: un mediu de creştere bun pentru populaţie şi nutrienţi - de obiceise utilizează un raport între atomii de C şi N de 40:1;
un pH care să varieze în jurul lui 7;trebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitoritrebuie notată concentraţia potenţialilor inhibitori
industriale şi alimentare –Surse de deşeuri:
industriale şi alimentare –bălegarul animal –biomasa agricolă –deşeurile din apele reziduale orăşeneştideşeu e d pe e e du e o şe eş
5. 5. Parametri digestieiParametri digestieibacteriile mezofile : 20 – 250C şi 40 – 450Cbacterii termofile 50 – 550C şi 60 – 650C pentru,trecerea de la temperatura mezofilă la cea termofilă care poate fi
accidentală şi pentru o scurtă perioadă de timp poate duce lal i i l i d d l i â ă ă â i
Temperatura:Temperatura:prelungirea timpului de producere a gazului cu câteva săptămâni.
similar în cazul adaptării populaţiilor mezofile la condiţiile detemperatură termofile.
digestia termofilă este mai puţin stabilă;digestia termofilă este mai puţin stabilă;avantaj - distrugerea patogenilor şi a animalelor parazite
Timpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere a apeiTimpul de reţinere hidraulică (HRT) = perioada de timp cât lichidul rămâne în bioreactor;
Volumul bioreactoruluiHRT =
Volumul de deşeuri adăugate zilnicIndicele de încărcare a bioreactorului Indicele de încărcare a bioreactorului --Acizii graşi volatiliAcizii graşi volatili -Digestia în două etape Digestia în două etape --
6. 6. Obţinerea acizilor organici şi a aminoacizilorObţinerea acizilor organici şi a aminoacizilor22 IntroducereIntroducere
Acizi organici: acidul citric, gluconic, itaconic, 2-cetogluconic,eritorbic, tartaric, lactic şi acetic şi acizii graşi volatili;Aminoacizi: acidul L glutamic L lizina acidul L aspartic LAminoacizi: acidul L-glutamic, L-lizina, acidul L-aspartic, L-triptofanul şi D-arilglicina (care este folosită în producereasemisintetică a penicilinei);cei mai importanţi sunt acidul citric acidul glutamic şi lizinacei mai importanţi sunt acidul citric, acidul glutamic şi lizina.
Produs Unităţi Producţia totală
Tabelul 12. Producţia mondială a principalilor acizi de fermentaţie
($/kg) (t/an)
Acid glutamic 3,5 – 4,0 300 000
Acid citric 1,5 300 000
Lizină 5,0 – 5,5 40 000
Acid lactic 1,0 – 1,5 40 000
IntroducereIntroducere
Aspecte de urmărit:
1. Procesele chimice de obţinere a unor astfel de compuşi competiţioneazăcu căile metabolice, ultimele fiind mai eficiente şi mai economice;
2 f i fi i ă ă l i2. pentru o fermentaţie eficientă este necesară alegerea cu atenţie aorganismului, a speciei sau a mutaţiei şi a căii de creştere în condiţiinutriţionale corecte, deoarece preţul de cost al procesului biotehnologicdepinde de costurile utilizării substratelor;
3. în cazul majorităţii proceselor fermentative de obţinere a produşilorchimici este necesar un control real al tuturor condiţiilor de fermentare şichimici este necesar un control real al tuturor condiţiilor de fermentare şide recuperare a produsului finit;
4. în toate cazurile un proces biotehnologic de succes este acela în cared l t bţi t î t ţi d ită l it t i ă i d ăprodusul este obţinut în concentraţia dorită, la puritatea maximă şi după
un proces de recuperare mai puţin laborios.
AplicaţiiAplicaţiiAcidul citric
este obţinut primordial din sucul de lămâie sau citrice;este obţinut primordial din sucul de lămâie sau citrice;o producţie mondială de 300 000 t/an;agent de acidulare a sucurilor şi produselor de
cofetărie,agent de complexare, de reducere a proceselor, g p , poxidative şi de decapare a metalelor. organism de fermentare- mucegaiul din rasa Aspergillus niger şi câteva rase dedrojdii;
substrate: melasa din sfeclă, sucroza, melasa din tulpină detrestie, sau sirop de glucoză purificat din porumb;
n-parafină şi rase de Candida sau alte drojdii -i d i ii l i d il li ineeconomice datorită creşterii preţului produşilor petrolieri;
nu au fost aplicate la scară largă
Mecanismul biochimic care stă la baza obţinerii acidului citric din AspergillusMecanismul biochimic care stă la baza obţinerii acidului citric din Aspergillusniger nu este pe deplin elucidat, dar se ştie că implică o versiune incompletă ametabolismului acizilor tricarboxilici.
AplicaţiiAplicaţii
Figura 48. Formarea acidului citric. Linia punctată indică punctele de control ale procesului
AplicaţiiAplicaţii
Figura 49. Reprezentarea schematică a unui proces tehnologic, submers de obţinere aacidului citric din melasă.
AplicaţiiAplicaţii
Acidul gluconic Aplicaţii:agent de complexareagent de complexare,medicina veterinară,eliberarea de lungă durată a acidului în procesul de coacere
Obţinere:Obţinere:oxidarea electrolitică a glucozeioxidare cu aer sau oxigen pe catalizator de platinăprocese fermentative - ca substrat A. Nigeroxidare catalitică a glucozei - glucozoxidază imobilizată
Etape:Obt. substratului:
glucozoxidazaGlc glucono –δ-lactonei ac.gluconicgluconolactonaza
Fermentaţia:mediulmediul: sol. de Glc monohidratată (amidon hidrolizat), nutrienţi (sursă de N, PO43-, Mn2+, elem.min), lichior moale de cereale (extract de drojdii)inoculinocul: spori de A.niger (inocul vegetal)t i d f t ţit i d f t ţi
acidul gluconic; gluconatul de calciu, glucono-δ-lactona
tancuri de fermentaţietancuri de fermentaţieRecuperarea
AplicaţiiAplicaţii
Acidul tartricAplicaţii:
acidifiant în industria alimentarăObţinere: acid tungstic
sinteză chimică: acidul maleic + apa oxigenată amestec racemicintermediar: formarea acid. cis-eposuccinic, stoparea reacţiei prin
controlul temperaturii.di id il l l d d i l i
g
din reziduurile acumulate în vanele de producere a vinuluimetoda fermentativă
specii de Acetobacter capabile să producă alături de 5 –cetoglutarat şicantităţi mici de acid tartric dar numai în anumite condiţiicantităţi mici de acid tartric, dar numai în anumite condiţii.
în anii ’80, Yamada şi colab. - mutanţi de Gluconobacter suboxydanshidroliza enzimatică - rezultatele nu au depăşit nivelul de staţie pilot
- hidroliza stereospecifică a cis-eposuccinatului (bacterii)hidroliza stereospecifică a cis eposuccinatului (bacterii)- trecerea celulelor spălate sau a extractului apos de celule peste unsubstrat de cis-eposuccinat
produs în soluţie: îndepărtarea celulelor sau a enzimei imobilizate.p ţ pRecuperare
sub formă de tartrat de calciu; fosfatul de calciu; săruri insolubile de calciu
AplicaţiiAplicaţiiAcidul lactic
A li ţiiAplicaţii:ind. alimentară – acidifiantmedicinăalte industriialte industrii
Obţinere:proces de fermentare anaerobă;
Procese fermentative heterolactice: produşi finali – lactat, etanol, dioxid deProcese fermentative heterolactice: produşi finali lactat, etanol, dioxid decarbon şi eventual acetat;
Figura 50. Calea fosfoketolazei
AplicaţiiAplicaţiiFosfoketolazaFosfoketolaza – Ba. heterofermentative Lactobacillus şi Acetobacter
- acţionează asupra glucidelor fosforilate C5 şi C6 acetil fosfat şiacţionează asupra glucidelor fosforilate C5 şi C6 acetil fosfat şi gliceraldehid 3 fosfat sau eritrozo 4 fosfat.
- se formează acetil fosfat etanol cu regenerarea NAD+;acetat printr-o reacţie care produce ATP;p ţ p
-gliceraldehid 3 fosfat piruvat lactat- este prezentă şi la drojdii: xiloza xilitol xiluloză xilulozo 5 P
- la Ba. care cresc pe xiluloză: xiloză xilulozăizomerazăp- calea C5-fosfoketolazei nu înlocuieşte glicoliza dar oferă
organismului o cale eficientă de convertire a pentozelor la unităţi C2 şi C3 pentru metabolizarea lor ulterioară
Procese fermentative homolactice - Lactobacillus bulgaricus şi L. delbrückii. - substrat: - lactoză (zer), glucoză (sirop), sucroză în stare pură sau din melasă de sfeclă;- proces clasic anaerob: dizaharidele hexoze piruvat acidul L(-) lactic-nutrienţi: carbohidraţi, nutrienţi anorganici, surse de azot (organic; anorganic –lichior din tulpină de cereale malţ de muguri extract de drojdii) vitaminelichior din tulpină de cereale, malţ de muguri, extract de drojdii), vitamine
AplicaţiiAplicaţiiEtape: - prima etapă: formarea suspensiei active de Lactobacillus care creşte până ajunge la faza de inoculum vegetativ- parametri fermentaţiei: proces continuu; vase mari din inox sau lemn; fără agitare; 6 – 7 zile; temp. diferite (Ba. L. Delbrückii – > 500C, Ba. L. bulgaricust < 440C) fă ă t ă li i ă d t ili di l i H [5 8 6 0]
P d fi l
temp < 440C) fără etapă preliminară de sterilizare a mediului; pH = [5,8 – 6,0]; η = 80 – 90g acid lactic/100g carbohidraţi.
Produs final;prin încălzirea şi concentrarea produsului final de fermentaţie se obţin doi produşi
secundari de condensare, acidul lactoillactic care este un produs liniar şi dilactida care este un produs ciclic Cei doi produşi împiedică formarea acidului lacticcare este un produs ciclic. Cei doi produşi împiedică formarea acidului lactic cristalin în formă pură;
Recuperarea acidului lactic -lactatul este tratat cu acid sulfuric; se precipităRecuperarea acidului lactic lactatul este tratat cu acid sulfuric; se precipităsulfatul de calciu împreună cu organismul microbian utilizat care sunt îndepărtateprin filtrare. Soluţia de acid lactic este tratată la temperatură înaltă cu cărbune activ,filtrată şi evaporată în vederea concentrării până la aproximativ 50%, sau este trecutăpe o coloană cu schimbători de ioni, sau extrasă cu solvenţi organici şi apoievaporată.
AplicaţiiAplicaţiiAcidul acetic şi alţi acizi volatili
se produce în principal din petrol; nu prin proces de vinificare ( oxidarei bi ă t l l i l id ti )microbiană a etanolului la acid acetic).anii ‘80 - noi procese de fabricare a acidului acetic şi a altor acizi alifatici
volatili (VFAs), prin fermentarea anaerobă a materialelor celulozice şi a altordeşeurideşeuri.
Mecanismul de acumulare a VFASubstratSubstrat - deşeurile celulozice sunt hidrolizate la glucoză de către celulaze
care sunt produse de bacteriile anaerobe. Din glucoză se obţine acid acetic şicare sunt produse de bacteriile anaerobe. Din glucoză se obţine acid acetic şiacid butiricun mol de glucoză trei moli de acid acetic
CulturaCultura - amestec de bacterii anaerobe (Clostridium thermocellum, C.(Thermoaceticum)
- amestec de organisme obţinute printr-un procedeu de selecţie dinape uzate (de ex. două tipuri de organisme unul care converteşte materialulorganic la VFA şi altul care converteşte VFA la metan şi dioxid de carbon)
MecanismMecanism – prezentat în figura 51InstalaţiaInstalaţia industrialăindustrială - tancuri cu deschidere mare, închise din care aerul sel d î ţă A t li ă j t l i it texclude în permanenţă. Amestecarea se realizează cu ajutorul unui agitator
mecanic. Procesul are loc continuu, recircularea parţială a organismelor fiind înavantajul creşterii vitezei de conversie şi a cantităţii de biomasă.
AplicaţiiAplicaţii
Figura 51. Calea de formare a VFA din glucoză (reprodusăglucoză (reprodusă după Zeikus, J. G., 1980, Ann. Rev.Microbiol., 34, 423-464)464)
AplicaţiiAplicaţii
L-lizina
diferite procedee chimice sau enzimatice;cel mai eficient d.p.d.v. economic – procesul de fermentaţie (Toray Industries -
L lizina
p p ţ ( yPatent englezesc 1334970 şi 1352860).
substratsubstrat - n-parafină, acizi alifatici şi alcooli;MecanismulMecanismul dede acumulareacumulare a L-lizinei.
Figura 52. Mecanismul de acumulare a L-lizine. Linia punctată reprezintă căile de
inhibiţie.
AplicaţiiAplicaţii
Fermentare aerobăFermentare aerobă, - reactor cu agitare aerat- pH sistemului este menţinut neutru,p ţ ,- temperatura -280C. - inocul – cantit. mică; creştere pe agar turnat în pantă, timp de 6 ore, într-un proces discontinuu, 40 – 45 g L-lizină/litru atunci când se pleacă de la o concentraţie de melasă de 200 g/l (100 g zahăr);
d l i fi lRecupereaRecuperea produsului final: - acidifiere cu HCl- trecere pe o coloană schimbătoare de ioni în care au fost grefate grupări amoniumgrefate grupări amonium- eluare cu HCl, - cristalizarea L-lizinei hidroclorice
AplicaţiiAplicaţii
Figura 53. Schema operaţiilorprincipale din procesul de izolare şiprincipale din procesul de izolare şipurificare a L-lizinei din mediile debiosinteză
AplicaţiiAplicaţii
Figura 54. Schema tehnologică deobţinere a L-lizinei de uz farmaceutic.1- vas preparare mediu, 2- pompăîncărcare, 3- vas de fermentaţie, 4,12-rezervor HCl 5- debimetru HClrezervor HCl, 5 debimetru HCl,6,9,15,17,19- pompă centrifugă, 7-filtru rotativ cu raclare, 8- vas tampon,10- rezervor lichid de fermentaţie, 11-
NH 13 d bi 14rezervor NH3, 13- debitmetre, 14-coloană schimbători de ioni, 16-concentrator, 18- vas dizolvare şipurificare, 20- cristalizor, 21- filtrup , ,Nutsche, 22- uscător
PRODUCEREA DE ANTIBIOTICEPRODUCEREA DE ANTIBIOTICEIntroducereIntroducereIntroducereIntroducere
cele mai importante produse comerciale obţinute prin biosinteză;substanţe chimice care sunt produse de microorganisme şi omoară sau inhibă creşterea altor
microorganisme.produşi secundari de metabolism, în majoritatea cazurilor, fiind produse prin fermentaţii
microbiene din tulpini bacteriene al căror potenţial de biosinteză este relativ scăzut.La început, erau produse din fungi filamentoşi sau bacterii din grupa actinomicetelor
Antibioticul Microorganismul producător Tipul de microorganism
Tabelul 13. Cele mai importante antibiotice comerciale şi tulpinile microbiene din care se produc
g p p g
Bacitracină Bacillus licheniformis Bacterii sporulate
Cefalosporină Cephalosporium sp. Fungi
Cloramfenicol Streptomyces venezuelae (nu se mai foloseşte)Sinteză chimică
-
Ci l h i idă St t i ti i tCicloheximidă Streptomyces griseus actinomicete
Cicloserină Streptomyces orchidaceum actinomicete
Eritromicină Streptomices erythreus actinomicete
Kanamicină S. lincolnensis actinomicete
Neomicină S. fradiae actinomicete
Nistatină S. noursei actinomicete
Penicilină Penicillium chrysogenum fungi
Streptomicină S. griseus actinomicete
Tetraciclină S. rimosus actinomicete
IntroducereIntroducereClasificare - în funcţie de structura lorClasificare în funcţie de structura lorchimică şi de proprietăţileantibacteriene
Tabelul 14. Clasificarea antibioticelor în funcţie de structura lor chimicăîn funcţie de structura lor chimică
Realizarea unui proces Realizarea unui proces de producţiede producţie Tipul operaţiei Etapele procesului Accesorii
i filiLiofilizareUscare pe silicagel în pantăStocare în N2 lichid
Stocarea culturiiImprovizarea instalaţieiDezvoltarea metodelor
< 10L
Tabelul 16. Reprezentareaschematică a etapelor cheie
< 10LFlaskuriVase de inox pentru inocul
Prepararea inocululuiTeste de contaminarePreparea mediului
Fermentatoare din inox Prepararea mediuluipdintr-un proces deproducţie de antibiotice
< 20m3
Etapa de fermentare
Derularea procesuluiTeste de contaminareMonitorizarea parametrilor biochimici şi icrobiologicg
Fermentatoare de inox de10 – 100 m3
Etapa finală de fermentare
Prepararea mediuluiDerularea procesuluiTeste de contaminareMonitorizarea parametrilor biochimici şi icrobiologic
FiltrareCentrifugareExtracţia din bulion
hrănirea
Teste de contaminareMonitorizarea parametrilor biochimici şiExtracţia din bulion parametrilor biochimici şi icrobiologic
Extracţia şi purificarea
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou
i i lpre-necesitate esenţială • instalaţie performantă• creşterea eficienţei procesului de producţie• modificarea continuă a condiţiilor de lucru• modificarea continuă a condiţiilor de lucru• introducerea de noi tehnologii şi instalaţii de producţie
creşterea culturii•creşterea pe mediu de cultură solid sau lichidcreşterea pe mediu de cultură solid sau lichid •formarea inoculului•transferarea inoculului în mediul de fermentaţie• fermentatia•limitarea creşterii•adăugarea unui nutrient cheie care modifică calea metabolică•modificarea căilor metabolice obţinerea unei cantităţi mari de produs secundar•păstrarea culturilor:•pentru o eventuală inoculare
l i lt b t i l•se vor lua una sau mai multe probe pentru inoculare.
Procedeul tipic utilizat la producerea unui antibiotic nou
fermentaţia –• alimentare continuă•controlul permanent al condiţiile de cultivare şi de fermentaţiel fâ i l f i i b li l i ibi i l i i l•la sfârşitul fermentaţiei bulionul conţine antibioticul, microorganismul
utilizat şi un număr mare de alte componente chimice ale mediului decultură•antibioticul o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi•antibioticul - o componentă minoră din compoziţia bulionului ( între 3 şi35%)
recuperarea şi purificarea:•separarea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugaresepararea de faza lichidă prin filtrare şi centrifugare• extragerea antibioticul direct din bulionul de fermentaţie• extracţia în solvenţi,•cromatografie de schimb ionic,g ,•ultrafiltrare,•osmoză inversă •precipitare•cristalizare• uscare
Producerea penicilineiRealizarea unui proces de producţieRealizarea unui proces de producţie
Penicilina G - primul antibiotic descoperit- activă faţă de Ba gram pozitive-structura de bază - acidul 6-aminopenicilanic (A-6-AP) format dintr-un inel
i lidi i d i l ltriazolidinic condensat cu un inel β-lactam- penicilinele naturale se formează prin fermentaţie- peniciline de biosinteză se formează prin adăugarea controlată în mediul a catenei laterale a nucleului β lactamlaterale a nucleului β-lactam - 100 de tipuri de peniciline de biosinteză- penicilina G şi V sunt comercializate
-producerea industrială: procesul fermentativ a fost cuplat cu un proces de sinteză chimică
-penicilina G obţinută prin fermentaţie scindată chimic sau p ţ p ţenzimatic (penicilinaza) La acidul 6-aminopenicilanic obţinut printr-un proces de condensare se adaugă catena laterală care diferă de cea a penicilinei G şi care în acest fel conferă penicilinei proprietăţi antibactericide noi- materia primă – lactoza, glucoza, ac. lacitc
Figura 55. Profilul tipic al producţiei de antibiotice prin fermentaţie cu indicarea concentraţie limită a unui nutrientd ca ea co ce t aţ e tă a u u ut e t
Prepararea inoculului• monitorizarea creşterii pentru realizarea unei transferări eficiente ainocululuiinoculului•transfer în timpul creşterii logaritmice• metode de apreciere a creşterii şi a activităţii metabolice• analizarea prezenţei altor organismeanalizarea prezenţei altor organisme• în cazul de contaminare inoculul este transferat în fermentator• când condiţiile de creştere sunt optime se realizează transferul unui volumcuprins între 0,1 şi 20% din volumul final de fermentare.p , ş
Fermentaţiaf i l l iformarea inoculului• aclimatizarea microorganismelor producătoare de antibiotice la noile condiţii dedezvoltare• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide sau• cantităţi mici din linia celulară sunt amplificate prin creştere pe medii solide saulichide.• cultivare pe medii solide• în funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, înîn funcţie de proces, suspensia de spori trebuie să fie utilizată în câteva zile, încaz contrar este posibil să se formeze conglomeratele
Fermentaţia
•transferarea suspensiei din bioreactorîn container se realizează la o presiune
i l b i ă fimare containerul trebuie să fiemetalic
Figura 56. Sistem de transfer al suspensiei de spori din containerul de păstrare în bioreactorul de fermentare
suspensia de spori este trecută în bioreactorul de fermentare:
Instalaţia de fermentaţie
•prin tubulatură unde sterilizarea are loc cu aburi sub presiune•suflare în vasul de fermentaţie utilizând aer steril;•dacă tubul de transfer este suficient de larg iar vasul de fermentared i i d i fi lă ă ă i î l d f idepresurizat suspensia de spori poate fi lăsată să intre în vasul de fermentaţiesub propria forţă gravitaţională;•tubul trebuie un timp suficient pentru răcire•risc mic de contaminare a suspensiei de spori•risc mic de contaminare a suspensiei de spori
Deşi vasele de realizare a mediului şi de sterilizare nu sunt esenţiale în procesultehnologic, atâta timp cât mediul poate fi în condiţii submerse (batched) iarg p p ţ ( )sterilizarea se realizează direct în vasul de fermentare aceste vase sunt inclusepentru a obţine un preţ de cost mai mic prin asigurarea condiţiile optime defermentaţie. Un singur vas „batcheing” şi un sterilizator pot servi unui număr maimare de fermentatoare, permiţând astfel fiecărui fermentator să fie utilizat lamaximum pentru producerea antibioticului dorit. Scurtarea timpului între procesefermentative succesive permite realizarea unui număr mai mare de procesef t ti â d tf l tit t d tibi ti bţi di fifermentative pe an, crescând astfel cantitatea de antibiotic care se obţine din fiecarefermentator.
Instalaţia de fermentaţie
Criterii pentru alegerea fermentatoarelor:•trebuie să asigure transferul de gaz şi lichid;•un transfer al nutrientului între faze;f t t l t ă t i t•fermentatorul este prevăzut cu un sistem
de agitare performant;•fermentatorul trebuie să asigure un transfer bun de energie;transfer bun de energie;•este esenţial să ne asigurăm că organisme nedorite nu pătrund în vasul de fermentare, mai ales acum cândde fermentare, mai ales acum când organismele sunt modificate genetic şi prin natura lor pot deveni poluante sau pot afecta sănătatea lucrătorilor;p•pentru a asigura condiţiile aseptice fermentatorul trebuie să fie presurizat;
Figura 57. Reprezentarea schematică a unei instalaţii tipice de fermentare a antibioticelor
Instalaţia de fermentaţie
Fermentatoarele:•volum - 30 - 200 m3.•fabricate din oţel foarte bine finisat
i t ipe interior• înălţimea - de 2 - 4 ori mai maredecât diametrul• 4 – 6 sisteme de întârziere a• 4 – 6 sisteme de întârziere afermentaţiei, fixate de pereţi.•sistem de cuţite (BLANDERE)orizontale (Rushton) sau sistemul( )de agitare cu aer sub presiune.
Figura 58. Fermentatorul tradiţional utilizat la producerea de antibiotice
Etapa de creştere
ac m larea de biomasă miceliană•acumularea de biomasă miceliană•utilizarea intensivă a componentelor mediului de cultură;•necesarul de oxigen este maxim;•activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;activitatea respiratorie (eliberarea de dioxid de carbon) este ridicată;•pH optim de 4,5 – 5,0
Etapa de producere a antibioticului
Caracteristici:• încetinirea creşterii miceliului,• scăderea consumului de oxigen, •menţinerea pH la valoarea optimă,•acumularea de penicilină
miceliul foloseşte nutrientul şi produce energia necesară bioprocesului.•asigurarea necesarului de substanţe minerale
ţi t t ii ti•menţinerea temperaturii optime
Etapa de producere a antibioticului
Factori de care depinde gradul de acumulare al antibioticului:
•potenţialul productiv al tulpinii•potenţialul productiv al tulpinii•folosirea unor constituenţi adecvaţi şi a unui echilibru corect în proporţiile acestora•menţinerea pH în condiţii optimemenţinerea pH în condiţii optime•raport corect între diferitele surse de carbon•adăugarea de precursori care vor determina tipul de antibiotic ce urmează a se forma•asigurarea necesarului de substanţe minerale•menţinerea temperaturii optime
În practica industrială nu este permisă prelungirea fermentaţiei până la faza de autoliză!
Etapa autolitică
până la faza de autoliză!
• când microorganismul se epuizează ca urmare a activităţii metabolice prelungite sursele de carbon din mediu sunt consumate şi conţinutul de azotprelungite, sursele de carbon din mediu sunt consumate, şi conţinutul de azot scade. pH creşte peste valoarea optimă. În acest punct încetează producerea de antibiotic şi se induce procesul de hidroliză alcalină a antibioticului dejaformat.• Controlul fermentaţiei se realizează prin determinarea sterilităţii mediului, gradului de dezvoltare morfologică a microorganismului, pH mediului, concentraţiei deantibioticului din mediul de cultură şi a consumului de glucide. Probele se iau la intervale regulate de timp iar procesul se consideră terminat atunci când conţinutul în sursă de carbon al mediului ajunge la 0,2 –0,6% iar concentraţia soluţiei rămâne practic nemodificată.
C i ibi i l i î l i i ă d i d d i l l d i• Concentraţia antibioticului în soluţia nativă depinde de potenţialul productiv al tulpinii şi de respectarea condiţiilor optime de fermentaţie.
ENENZIMELE ŞI PRODUCEREA LA ZIMELE ŞI PRODUCEREA LA SCARĂ LARGĂ A ACESTORASCARĂ LARGĂ A ACESTORA
IntroducereIntroducere•fabricarea preparatelor enzimatice interes practic deosebit îl au microorganismele h t t fheterotrofe;•microorganism poate ataca un substrat natural şi-l metaboliza, dacă posedă enzimele capabile care să realizeze aceste căi metabolice, în condiţii de mediu proprii pentru dezvoltare;dezvoltare;•sunt enzime intracelulare care nu sunt secretate în mediul de cultură, în care microorganismele se dezvoltă;•drojdiile, bacteriile lactice, nu conţin decât enzime intracelulare eliberarea j , , ţenzimelor are loc în urma proceselor de autoliză metabolizează doar substraturi nutritive solubile;•bacteriile din genul Bacillus sau fungii din genul Aspergillus enzime intracelulare şi extracelulare; ex: hidrolaze şi au rolul de a degrada substratele insolubile sau solubile cu molecule mari la compuşi solubili uşor asimilabili•rol important: substratul (sursăd e carbon - aminoacizi, vitamine, diferiţi cationi)i d f i i ifi d d ii i l i b iinduce formarea enzimei specifice degradării respectivului substrat inductor
IntroducereIntroducereTipuri de enzime: enzime constitutive
enzime adaptativeEnzimele constitutivese sintetizează în celule în mod permanent;C i l î i fl dConcentraţia lor este însă influenţată de:
- prezenţa sau absenţa în mediul de cultură a substratelor pe care ele le metabolizează;
sursa de azot sursa de carbon factorii de creştere sărurile minerale- sursa de azot, sursa de carbon, factorii de creştere, sărurile minerale, temperatura, pH-ul etcBiosinteza are loc atunci când:
- este prezent substratul; biosinteza porneşte de la substanţe cu structurăeste prezent substratul; biosinteza porneşte de la substanţe cu structură simplă;
- decurge cu consum de energie se introduce şi o sursă de carbon(glucid);(g );
- are loc în timpul fazei logaritmice de creştere celulară, dar şi în faza staţionară, în prezenţa inductorului şi a substraturile de biosinteză;
- este inhibat de inhibitori specifici (cloramfenicolul) şi de metaboliţii rezultaţi (represie) procesul de biosinteză a unei enzime induse este rezultatul acţiunii antagoniste a inductorului şi a metaboliţilor
Tabelul 13. Cele mai importante enzime comerci
IntroducereIntroducere
Selecţia tulpinilor şi ameliorarea lorSelecţia tulpinilor şi ameliorarea lorAlegerea tulpinii producătoare
Trebuiesc avute în vedere următoarele aspecte:- este enzimă intra- sau extracelulară – de preferat acel tip de enzime care
sunt stabile, care nu necesită un mediu de cultivare complex şi care se eliberează uşor din celule în vederea purificării;din celule în vederea purificării;
- dacă produşii de sinteză reprezintă o ameninţare pentru tulpina producătoare;
- dacă există tulpini patogene sau cu toxine provenite de la microorganismul p p g p gproducător de enzime se preferă microorganismele care prin tradiţie sunt folosite în alimentaţia umană (tulpini din genurile Bacillus şi Aspergillus);
- microorganismul să fie capabil să crească în medii de cultură cu compoziţie simplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabilsimplă; ieftine; să nu necesite adăugarea de promotori de creştere scumpi; să fie stabil din punct de vedere genetic; să producă cantităţi mari din enzima dorită în cel mai scurt timp posibil; să fie uşor de separat din bulionul de ferementaţie.
•Surse de microorganisme:- din natură – ex: microorganismele care hidrolizează lactoza pot fi
izolate din produse lactate, iar microorganismele celulolitice din produse l t it t l d t j lt i î tităţi i ilemnoase putrezite natural dezavantaj: culturi pure în cantităţi mici;
- colecţiile de microorganisme avantaj: tulpinile sunt cataloage sunt trecute tulpinile şi se prezintă caracteristicile lor. Ex: ATCC, WFCC, IFO
Ameliorarea tulpinii producătoare•Pentru tulpinile izolate din natură ameliorare genetică în etapa de laborator p g pse stabilesc principalele caracteristici ale procesului de biosinteză a enzimei:
creşterea producţiei în enzima dorită;reducerea sau eliminarea enzimelor obţinute ca produşi secundari;produsul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utilizaprodusul dorit să fie biosintetizat în cantităţi mai mari fără a se utiliza
inductori scumpi;producerea enzimei să se realizeze în condiţii normale de inhibiţie
enzimatică.•trei metode de ameliorare:
ameliorarea prin mutaţie şi selecţie –- ag. mutageni: radiaţii electromagnetice, mutageni chimici- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea- supravieţuitorii sunt izolaţi şi separaţi pentru ameliorarea
caracterului dorit- ex: β-galactozidază, D-serindeaminază, ribitoldehidrogenază,
penicilinamidază, proteaze alcaline.ib idi difi ii l i ii d iHibridizarea – modificarea structurii ADN a tulpinii producătoare prin
transferarea unui fragment de ADN dintr-o altă tulpină. Tipuri:- conjugarea –- transformarea –transformarea - transducţia –- fuziunea protoplaştilor -
Tehnologia ADN-recombinant: manipulare directă a ADN-ului prin clonare moleculară -
Tabelul 14. Prezentarea unorgene manipulate genetic învederea obţinerii unor enzimede interes comercial
Creşterea producţiei de enzime prin ameliorarea tulpinilorPublicaţii rare - secrete de fabricaţie;
FermentaţiaFermentaţia•Sistem de cultivare “batch”Sistem de cultivare batch•Păstrarea culturii – în azot lichid, cu efectuare periodică de teste de viabilitate;•Inoculul – se transferă din flaskuri în fermentatorul din etapa pilor şi de aici în cel din etapa de de fermentare ppropriuzisă periodic;p pp p p ;
- în proporţie de 1 – 5% în volume•În etapa de propagare celulară – se utilizează un mediu îmbogăţit pentru a determina o creştere bună;ΕÎn etapa de creştere logaritmică - compoziţia mediului este ajustată în funcţie de
producţia dorită
Figura 56. Obţinerea computerizată a datelor din procesul tehnologic în urma controlului întregului sistem în vederea optimizării procesului de fermentaţie
AplicaţiiAplicaţiiEnzimele amilolitice
G lităţi•Utilizare: în procese fermentative sau în alte procese biochimice• hidroliza amidonul solubil şi granulele de amidon aflate în suspensie apoasă
Generalităţi
•hidroliza poate fi parţială sau totală – funcţie de gradul de hidroliză dorit se aleg diferite amestecuri de enzime amilolitice;•produşii finali rezultaţi exercită un efect de inhibiţie competitivă sau necompetitivă, sau inhibiţie exponenţială simplă;sau inhibiţie exponenţială simplă;•Enzime:
α-Amilaza [E.C.3.2.1.1] sau glicogenaza sau α(1,4)-D-glucan glucanohidrolază;glucanohidrolază;
- acţionează asupra glicogenului, oligo- şi polizaharidelor înrudite;- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice interioare
β-Amilaza [E.C.3.2.1.2] sau glicogenaza sau α(l,4)-D-glucan β [ ] g g ( , ) gmaltohidrolază
- hidrolizează α(1,4)-D-glicozidice marginalesurse de amilaze: - cartofi, cereale, fasole, soia, boabe de orez,
boabele de fasole germinate, pancreas şi la unele specii în salivă- microorganismele: Bacillus subtilis, bacterii,
drojdii, fungi
Modul de acţiune al enzimelor amilolitice
α-amilazaα(1,4)-glicozidică
β-amilazaα(1,3)-glicozidică
amiloglucozidaza(glucoamilază)(g )
α(1,6)-glicozidică
glucozidaza
hidroliza enzimatică a amidonului se efectuează practic în două etape:prima etapă – dextrinzarea - fragmentare rapidă a macromoleculelorprima etapă dextrinzarea fragmentare rapidă a macromoleculelor
de amiloză şi amilopectină până la fracţiuni cu greutăţi moleculare mai mici –dextrinele; amidonul se lichefiază
a doua etapă - zaharificare - dextrinele sunt hidrolizate complet la p poligozaharide şi apoi la maltoză şi glucoză în funcţie de compoziţia preparatului utilizat; dextrina se dizolvă în apă
Determinarea conţinutului în glucide reducătoare: după acţiunea α-amilazelor, concentraţia în glucide reducătoare este de aproximativ 1/3 din concentraţia iniţială a amidonului; după etapa a doua de hidroliză efectuată cu β-amilaze, dacă hid li t l tă t ţi î l id d ăt t lăhidroliza este completă, concentraţia în glucide reducătoare este egală cu cea a amidonului Biosinteza Biosinteza αα--amilazelor bacterieneamilazelor bacteriene: •α-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;•α-amilazele bacteriene sunt enzime termostabile;•speciile din genul Bacillus şi anume Bacillus subtilis şi B. amyloliquefaciens, B. lichenifonnis şi B. stearothennophilus;•gradul de hidroliză calculat prin determinarea cantităţii de glucide reducătoare g adu de d o ă ca cu at p dete a ea ca t tăţ de g uc de educătoa eobţinute în urma hidrolizei enzimatice raportate la cantitatea totală de substrat (amidon) utilizat, este aproximativ acelaşi (20-25%)
•cultivată în sistem discontinuu, submers•enzima este produsă în mod normal după ce a atins faza maxima de creştere şi începe faza staţionară;începe faza staţionară;•nivelul de producere a enzimei este limitat de concentraţia sursei de carbon datorită procesului de inhibiţie prin catabolit ) - demonstrat pe B. licheniformis.•Bacillus subtilis – producerea este influenţată de particularităţile morfo-fiziologiceBacillus subtilis producerea este influenţată de particularităţile morfo fiziologice corelate cu potenţialul productiv al tulpinii
Figura 59. Dinamica acumulării α-amilazei în culturi submerse de Bacillus subtilis. a) – dinamica acumulării de biomasă; b) – dinamica activităţii enzimatice; c) – evoluţia pH-ului
Parametrii digstiei:•starea fiziologică a microorganismului utilizat;•potenţialul productiv al tulpinii folosite;potenţialul productiv al tulpinii folosite;•compoziţia mediului de biosinteză;•parametrii de biosinteză (temperatură, pH, viteză de agitare, viteza de aerare, durata cultivării).Biosinteza α-amilazelor cu tulpini modificate genetic•studiile de inginerie genetică efectuate până în prezent au demonstrat posibilitatea transferării genelor de la o specie la alta;•cele mai des utilizate sunt bacteriile din genul B. subtilis ; se mai utilizează B. sterothermophilus în B. subtilis•atunci când genele α-amilazei sunt donate în E. coli, ele se exprimă, enzima acumulându-se în spaţiul periplasmatic;•biosinteza α-amilazelor este influenţată de compoziţia mediului nutritiv şi de condiţiile de cultivare a microorganismului
sursă de carbon - varietăţi de amidon, glicogenului, maltotetraozelor, maltotriozele, maltoza (de cinci ori mai slabe decât la glicogen)
sursele de azot - săruri de amoniu, aminoacizi, cazeină3 vitamine;7 aminoacizi
•mediul de reacţiefăină de peşte, şprot de soia – mai multă protează decât α-amilază
di b d id ilmediu pe bază de amidon - α-amilazamediu se adaugă glucoză - biosinteza α-amilazei este inhibată parţial sau
total•ionii de calciu şi amoniu
•temperatura de cultivare:variază de la o specie la alta:între 30 şi 370C pentru B. subtilisî 0 i 6 0C l i h h lîntre 50 şi 650C pentru B. coagulans şi B. stearothennophilus
•pH-ul optim:6,0 şi 7,5controlat şi menţinut constant pe toată durata biosintezei
i l î b ă ă i d di l iproteinele îmbunătăţesc capacitatea de tamponare a mediului•proces intens aerob:
oxigenul insuflat o data cu aerul sterilizat este utilizat numai ca oxigen dizolvat
i d i â i â i d dcantitatea de oxigen este cu atât mai mare cu cât perioada de creştere a unei generaţii este mai mică •Proprietăţile fizico-chimice ale mediului de cultură:
vâscozitateadi dtendinţa de spumare
Figura 60. Variaţia concentraţiei de O2 dizolvat pe parcursul biosintezei Figura 61. Influenţa logaritmică şi a debitului de aer
asupra biosintezei α-amilazei cu B. subtilis