XIII Curso de Actualización en Bioquímica Clínica ¨Prácticas Innovadoras en Bioquímica Clínica¨

Hospital Carlos G. Durand

DIVISIÓNLABORATORIO

28 abril de 2016

La espectrometría de masas

en la identificación

bacteriana y su impacto clínico

Marisa Almuzara

Departamento de Bioquímica Clínica.

Laboratorio de Bacteriología.

Hospital de Clínicas.

Facultad de Farmacia y Bioquímica.

Universidad de Buenos Aires

Identificación microbiana en el siglo XXI

1882 2015

Streptococcus pneumoniae

Aislado de Hemocultivos en un paciente con

Diagnóstico clínico de NAC:

Agente etiológico de la Enfermedad Infecciosa.

Devela el agente etiológico

La importancia de la Identificación bacteriana

Streptococcus pyogenes

Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente con

celulitis de sus extremidades inferiores:

Bacteriemia con foco en piel y TCS

Achromobacter xylosoxidans

Aislado de 1:2 Hemocultivos, paciente

pediátrico, con pielonefritis por E. coli:

Pseudobacteriemia por contaminación

Determina la importancia clínica

Con Enfermedad de Base:

Streptococcus agalactiae- Diabetes

Streptococcus gallolyticus ss gallolyticus-Neoplasia

colónica.

Con Enfermedad Infecciosa:

Streptococcus pneumoniae

Neumonía-OMA-Meningitis-PBE

Streptococcus gallolyticus ss gallolyticus

Endocarditis

RELACIONA GENERO-ESPECIE CON ENFERMEDAD

Bacteriemia Primaria por Enterococcus

faecalis en paciente con neutropenia:

Traslocación colónica.

Bacteriemia secundaria por Enterococcus

faecalis: Focos IU alta, infección intra-

abdominal

PERMITE RECONOCER LA PUERTA DE ENTRADA

Permite sospechar la fuente de la infección.

Despierta la sospecha de un brote.

1. Brote por S. equi ss zoopidemicus grupo C:

Consumo de lácteos no pasteurizados

2. Citrobacter freundii

Aislado de materiales quirúrgicos de 7 pacientes

con infecciones protésicas de mama

Los 3 pacientes fueron asistidos por el mismo Equipo de Cirugía

Brote? Fuente de Infección?

La identificación está estrechamente ligada a la

sensibilidad a los antibacterianos y define

muchas veces el tratamiento antimicrobiano

Sensibilidad constante a ciertos antibacterianos:

Streptococcus pyogenes- Streptococcus

agalactiae a penicilina

Resistencia en Enterococcus faecium

Métodos para la identificación bacteriana

Convencionales

1-Pruebas bioquímicas

manuales

Esquema en tableros

Esquemas dicotómicos

(Algoritmos)

2- Identificación serológica

Comerciales

Manuales Automatizados

Fenotípicos

API Rapi ID

Vitek Phoenix

Microscan

Identificación fenotípica convencional

Características microscópicas: Coloraciones

Identificación fenotípica convencional

Características culturales

Tamaño de colonia

Hemólisis

Pigmento

Forma, Aspecto, Borde, Superficie

Identificación fenotípica convencional

Pruebas de identificación preliminar: (lectura inmediata): catalasa, oxidasa

Pruebas rápidas ( < 6h): hipurato, PYR, LAP, glicosidasas, ureasa,

indol, FAL, tributirina, tripsina, coagulasa

Pruebas lentas (24-h a 4-5 días): TSI (F/0), reducción de NO3, utilización de azúcares, Esculina, DNAsa, gelatinasa, CAMP, almidón, RM, VP, decarboxilasas, citrato, otras

Pruebas basadas en caracteres de resistencia: O129, Vancomicina, SPS, fosfomicina, desferrioxamina, colistina, bacitracina, optoquina

ID: 24 horas a 5-7 días

BNF

Algoritmos

GRUPO FLN-

GLUCOSA -

UREA + UREA-

NITRATO

+ ADH

- Cupriavidus pauculus

PYR +

+ Laribacter

-

Etilenglicol/ Etanol

+/+ Oligella

ureolytica

FALA+/GAS NO2+-/ DEF S

-/- Bordetella

bronchiseptica

FALA-+/GAS NO2 -/ DEF R

ACIDO DE XILOSA

+ Achromobacter xylosoxidans

(FRU -)

-

ACIDO DE FRUCTOSA

+ Pseudomonas pseudoalcaligenes

Xilosa -/+

- ESCULINA

-

TRIPSINA +

NITRATO

- MALTOSA/PYR

+ Cupriavidus

taiwanensis (CITRATO +)

+/-

Brevundimonas vesicularis

-/+

Inquilinus limosus

Fenotipo

Mucoso

-

PYR

+

DEF/COL

S/R Brevundimonas

diminuta

R/S

Pseudomonas alcaligenes FAL- PYR -

R/R

Inquilinus limosus

PYR +

Pigmento marrón

difusible. FAL+++

PYR

V(20%+)

+

CITRATO

-

COLISTINA

S NITRATO

R Pandoraea

DEF R

+

Comamonas SPP

-

CITRATO CITRATO

C. aquatica/ C kerstersii

-

Cupriavidus gilardi

DEF R

+ Advenella

incenata DEF V

+

NITRATO

N NITRATO

-

DEF DEF

R

Cupriavidus

respiraculii

S

Comamonas

terrigena

+

FENILACETATO/ ClNa

- Bordetella

hinzii

Figura 3, Grupo A: Llave para la identificación presuntiva de los bacilos gram-negativos no fermentadores FLN -, glucosa -

Pig.

rosa

Ox -

-

+

Chryseobacteriumanthropi

+

Indol

-

Roseomonas / Asaia

Urea

+

Roseomonas

-

Asaia

-

Pig. Marrón

difusible

Colonia

pequeña-

Kerstersia

-

B. holmesii+

B. parapertussis

+

Sphingomonas spp(Esc + ONPG +

Mani - Lac +)

EO-5 (Esc -

Pig. Amarillo)

Granullibacterbethesdensis

(Lactosa -)

Urea

+

Bordetella holmesii

B. parapertussis

Kerstersia

-

Mov -

Pig. amarillo

+

Nitrato

V

B. malleiMac Conkey +

Lactosa V

+

rápida

Brucella canisMac Conkey V

Lactosa -

Urea

+

+

C. anthropi

-

Acinetobacter spp

Indol

-

-NO-1

(Fastidioso)

Pig.

rosa

Ox -

-

+

Chryseobacteriumanthropi

+

Indol

-

Roseomonas / Asaia

Urea

+

Roseomonas

-

Asaia

-

Pig. Marrón

difusible

Colonia

pequeña-

Kerstersia

-

B. holmesii+

B. parapertussis

+

Sphingomonas spp(Esc + ONPG +

Mani - Lac +)

EO-5 (Esc -

Pig. Amarillo)

Granullibacterbethesdensis

(Lactosa -)

Urea

+

Bordetella holmesii

B. parapertussis

Kerstersia

-

Mov -

Pig. amarillo

+

Nitrato

V

B. malleiMac Conkey +

Lactosa V

+

rápida

Brucella canisMac Conkey V

Lactosa -

Urea

+

+

C. anthropi

-

Acinetobacter spp

Indol

-

-NO-1

(Fastidioso)

BNF

Acinetobacter spp.

ID Presuntiva: 24 horas

4 pruebas

Cardiobacterium hominis ID presuntiva: 4-5 días ID : 4-5 dias

Métodos fenotípicos de identificación

Comerciales

Automatizados

VITEK PHOENIX Microscan

Manuales

API Rapid ID Remel

ID: 24-48 HS; Rapid: 4 hs ID: 2 a 10 hs

Paneles de identificación

Identificación fenotípica por galerias comerciales

N 188 93,10 % ID correcta (n 175) 32.45 % (n 61): requirió de pruebas adicionales (Vay y col, 2004. RAM)

Tiempo de ID: 48 Horas

Si pruebas adicionales: 3 -4 días

Identificación fenotípica por galerías comerciales

N 178 91 % ID correcta (n 162) 24.7 % requirió de pruebas adicionales ( n 44)

API Coryne Versión (2.0)

Lectura: 24 horas

48-72 hs si pruebas adicionales

Identificación por sistemas comerciales automatizados

ID : menos de 10 hs Base de datos: aprox 659 taxas BGN, 114 CGP; 26 NH; 16 BGP; 47 Anaerobios N: 445 (87 % ID correcta)

64 pocillos de ID

Métodos Genotípicos para la identificación bacteriana

Biología Molecular

PCR convencional: Seq r RNA ribosomal 16 s, otros genes (rpo B, gyr B, rec A) MLSA (Análisis multilocus de secuencias) Hibridación DNA-DNA

Otros métodos de identificación: Proteómica

Perfiles de componentes bacterianos

Espectrométricos

Espectrometría de masa Perfil electroforético de Proteínas totales

(SDS-PAGE)

MALDI TOF

CID, 2013

1996

Haemo-

philus sp.

E. coli

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Number of papers

Mycobacteria

Entero-

bacter-

iaceae

Identificación microbiana Espectrometría de masa

Based on Seng et al. CID 2009;49:543

Listeria sp

Erwinia sp..

Salmonella sp

Clostridium sp.

S. pneumoniae

Vagococcus sp.

Enterococcus sp.

B. cepacia complex

Oral anaerobes

Gram-negative bacilli

Gram-negative bacilli

Pioneering

B. subtilis, E. coli

Bacillus spores

H. pylori

Enterobacteriaceae

S. aureus

Viridans

streptococci

F. tularensis B. cereus

S. aureus

Multiple

Gram-positive

S. aureus

S. aureus

S. aureus

Arthrobacter sp.

S. aureus

Mycobacteria

Mycobacteria

H. pylori

Salmonella

Blood culture bottles

Gram-negative bacilli

R. erythropolis

Bartonella sp.

Neisseria sp.

S. agalactiae

Vibrio sp.

Multiple

Multiple

Yeast

Staphylococci

Viridans

streptococci

E. coli

2009

MALDI TOF en Argentina

MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight

(Vaporización/ionización por láser asistida por matriz a través de la detección de masas acorde al tiempo de vuelo)

5495.0

5417.9

4470.0

6264.1

10835.4

7274.5

7122.5

4736.2

9589.7

7828.2

8021.2

8847.6

8369.5

10259.6

10051.3

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4 x10

5000

6000 7000 8000 9000 10000 m/z

MALDI-TOF es una tecnología que ofrece un patrón de proteínas de un organismo desconocido y compara este patrón con una librería para finalmente presentar un score de esa comparación.

Bruker Daltonics Inc, USA (Base de datos propia) Shimadzu Corporation, Japón (Base de datos SARAMIS) Otra Base de datos: Andromas

MALDI-TOF Hospital de Clínicas José de San Martín. UBA

(1) Aislamiento de cultivo primario

(6) Interpretación de resultados

(6) Interpretación de datos por MALDI Biotyper

(2) Seleccionar 1 colonia (3) Realizar extendido (capa fina) en un pocillo de la placa metálica: 96 a 384 pocillos

(5) Generar perfil de espectro por MALDI-TOF

(4) Agregar Matriz (sc de ác α ciano 4 hidroxi cinámico, acetonitrilo y ácido trifluoroacético)

Flujo de trabajo

Tiempo de resultado por muestra: 3-5 minutos

Preparación de la muestra

a. Extendido directo o extracción directa con fórmico

b. Extracción con etanol-ácido fórmico-acetonitrilo

10 min

H2Od Etanol

Etanol

FA,

Acetonitrile

Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization

+ + +

+

Medición en MALDI TOF

Tabla de resultados

Qué tipo de score aceptamos?

• Fabricante

• > 2 nivel de especie

• > 1,7 - < 2 nivel de género

• < 1,7 Identificación no confiable: No se acepta

Se puede modificar este score:

Mediante la validación de grupos

De Bel et al, propone criterio LAC > 1,8 (25% más de iD correcta) JMM, 2011

MALDI TOF

Semejante al método molecular

(Gold standard)

Identificación fenotípica

ClNa 6,5%+

PYR+

Bilis esculina +

ADH + Piruvato -

Estreptococos no β hemolíticos vancomicina S

+ E. casseliflavus

- E. mundtii

+ MOVILIDAD

+

E. haemoperoxidus

-

TELURITO

- a Me GLUCÓSIDO

+ E. gallinarum a Me glu +

Xil +

- E. faecium a Me glu -

Xil -

+ MOVILIDAD

ARABINOSA

-

+ PIGMENTO

+ E. faecium

+/+ E. hirae (ONPG+)

S. urinalis (ONPG-)

-/-

TREHALOSA /

XILOSA

- RAFINOSA/ SACAROSA

- ARABINOSA

MANITOL

+ w E. sanguinicola

- Lactococcus spp

CLINDA S L. lactis

CLINDA R L. garvieae

-/+ E. canintestini

+/+ E. villorum -/-

E. ratti

+/- E. durans

• Maldi-tof:

• 2,328 Lactococcus lactis

Seq 16 s Lactococcus lactis 99%

Evaluación de la espectrometría de masa

(MALDI-TOF) en la identificación de bacterias de impacto clínico.

MALDI TOF Y BNF

39

25

13

2

3 P. fluorescens/P. putida

P. aeruginosa

P. stutzeri group

P. fulva

P. oryzihabitans

n 82

46 4

8

2 9

n 69 Achromobacter spp

A. faecalis

Bordetella spp.

Kerstersia gyorium

Oligella urethralis

Incluye: B. bronchiseptica 3; B. hinzii 2; B. trematum 2; B. parapertussis 1

34

6

2 4 1 1

Complejo B.cepacia

Burkholderiagladioli

Ralstonia picketti

Pandoraea spp.

Cupriaviduspauculus

Inquilinus limosus

n 48

34 15

25

77

52

n 201 Flia Flavobacteriaceae

Flia Comamonadaceae

S. maltophilia

Acinetobacter spp.

Otros BNF

Otros BNF: Rhizobium radiobacter (4), Pannonibacter phragmitetus (14), Shewanella spp. (13), Ochrobactrum (8), Brevundimonas

spp. (9), , Wohlfahrtiimonas chitiniclastica(1); Sphingomonas paucimobilis (2)

Aislados: n: 396. Período: 2009-2013

MALDI-TOF en la identificación de BNF

256

112

24 4

Identificación

ID especie

ID genero/grupo

ID erronea

ID no confiable

n 396

Tiempo ID: 3 a 5 min

93 % ID género + especie

6 % ID errónea

1 % no ID

Identificación de BNF por MALDI TOF Limitaciones

• Achromobacter spp no identifica a nivel de especie (idem id 16S rRNA)

• Identifica Pseudomonas grupo putida y P. grupo fluorescens

• Identifica especies del complejo BC. En ocasiones no identifica B.cepacia, B. contaminans, B. lata

• Identifica a nivel especie los géneros de flia Flavobacteriaceae excepto Elizabethkingiae (meningoseptica/miricola)

• Dificultad en la identificación de Ochrobactrum spp.

• Identifica especies de Pandorae, Shewanella (-S. algae), Ralstonia (-R. mannitinolytica)

• Identifica especies poco frecuentes: Wautersiella falsenii, W. chitiniclastica, C. kerstersii, K. gyorium, Bordetella spp, P. phragmitetus

• TSI Sin cambio

• Oxidasa +

• Inmóvil

• Glucosa +

• Indol +

• Gelatina +

• Almidon +

• Esculina +

• Manitol -

• ONPG +

• Colistina R

• Vancomicina Halo

• Pigmento Amarillo intenso

Chryseobacterium gleum indologenes

12 Pruebas

Tiempo de ID: 4-5 días

Enterobacterias y Malditof

57

1

30

16 4

2 Escherichia coli

Escherichiavulneris

ComplejoCitrobacterfreundiiCitrobacter koseri

Citrobacteramalonaticus

Citrobacter farmeri

80

16 90

39

2 1 2 Klebsiellapneumoniae

Klebsiellaoxytoca

E. cloacaecomplex

Serratiamarcescens

Serratialiquefaciens

E. gergoviae

E. agglomerans

31

18 5

26

15

10

2 Proetus mirabilis

Proteus vulgaris

Proteus penneri

Morganella morganii

Providencia stuartii

Providencia retgeri

Providenciaalcalifaciens

1

7

8

8

4 1

Edwarsiella tarda

Yersinia enterocolytica

Salmonella enterica

L. adecarboxylata

Hafnia alvei

Ewingella americana

N: 476

Enterobacteriaceae

MALDI-TOF en la identificación de Enterobacteriaceae

15

399

60

1

Identificación ID genero

ID especie

Bajadiscriminacion

ID incorrecta

No ID

n 476

Tiempo ID: 3 a 5 min

83.8 % ID especie 99.79 % ID género 12.60 % BD 0.21 % ID Incorrecta 0.21 % No ID

Identificación de Enterobacteriaceae por Malditof

Excelente performance para la ID de Enterobacteriaceae excepto:

Enterobacter cloacae complex

Proteus vulgaris/Proteus penneri

Serratia marcescens-Serratia ureolytica

Complejo K. pneumoniae/Complejo K. oxytoca

Citrobacter amalonaticus/Citrobacter farmeri

Complejo Citrobacter freundii

Shigella-E. coli

Enterobacterias y Malditof CGP Catalasa negativa y MALDI TOF

20

20

11

11

9

7

7

2

1 5

1

E. faecalis

E. faecium

E. raffinosus

E. casselifalvus

E. avium

E. gallinarum

E. hirae

E. mundtii

E. devresei

E. durans

E. malodoratus

ID Especie : 95,6 % (Score > 2.00) ID Especie 100 % (Score > 1.7)

N 96

Enterococcus spp.

8

3

4

9

1

5

10

2

5

1 1 6

N 55 L. mesenteroides

L. pseudomesenteroides

L. lactis

Lactococcus lactis

Lactococcus garvieae

Abiotrophia defectiva

Granulicatella adiacens

Granulicatella elegans

Globicatella sanguinis

Facklamia hominis

Weissella viridescens

Vagococcus spp.

11

5

7 3

5

2

1 4

1

n 39

Aerococcus viridans

Aerococcus urinae

Helcococcus kunzii

Gemella morbillorum

Gemella haemolysans

Gemella sanguinis

Pediococcusacidilactici

Pediococcuspentosaceus

Facklamia languida

ID especie: 64.89 (score > .2.0) 88,29(score > 1.7) ID No confiable: 4.25 %

N total: 94

Conclusiones

Los puntos de corte más bajo permiten aumentar el porcentaje de

ID correcta a nivel de especie, particularmente en los cocos cat neg

infrecuentes a expensas de Aerococcus viridans.

La extracción etanólica no muestra diferencias significativas con el

método directo de extracción con ácido fórmico.

Bacilos gram-positivos y MALDI TOF

Corynebacterium spp.

Otros: C. afermentans ss lipophilum 4; C. grupo F; C. mucifaciens; C. diphtheriae; C. simulans; C.

afermentans ss liphophilum; C. coyleae; C. imitans; C. kroppenstedtii; C. bovis; C.durum, C.

macginlenyi; C. minutissimum; C. pseudotuberculosis; C. riegelii; C. ulcerans, C . xerosis

Identificación por MALDI-TOF

4 Género: C. aurimucosum/ C. minutissimum

5NID: C. urealyticum, C. afermentans, Cafermentans ss lipophilum, C. tuberculostearicum

5 ID incorrecta: C. amycolatum/ aurimucosum, C pseduodiphteriticum/ propinquum, C.

afermentans ss lipophilum/ C. jeikeium, C. minutissimum/ C. amycolatum, C. coylae/ C

afermentans

Nivel género 97,7% género y Nivel especie 93,5 %

Algoritmo de identificación de BGP

LLAVE 6b

CAMP I

Indol

- I

Nitrato / Urea

+ P. acnes

+ / + I

FAL

- / + I

a glucosidasa

+ / - I

FAL

- / - I

FAL

- C. durum (manitol +)

+ C. amycolatum

(manitol - )

+ C.

sundsvallense

- I

b NAG

- C. durum

(adherente)

+ I

Tirosina

+ I

Tirosina

- I

Maltosa

+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)

- I

PYR

+ I

Etilenglicol

- I

Maltosa

+ I

Maltosa

- Sacarosa

+ C. singulare

- I

Pigmento amarillo

+ C. falsenii (Nitrato - ,

PYZ + d é bil)

- C. amycolatum

(Nitrato v,

PYZ +)

+ / + C. striatum

- / - C. simulans

- C. confusum

+ I

Col punti (<0.5)

No lipof í lico

+ C. freneyi

- I

H+ glu 42 º

+ / + C. amycolatum

- / + C. xerosis

+ C.

argentoratense

- C.

hansenii

+ I

DNasa

- +

C. amycolatum (col. seca)

- I

a quimiotripsina

- C. tuscani

C. amycolatum

+ C. argentoratense

+ C. minutissimum

(col. lisa)

- C. aurumucosum

(col. mucosa)

LLAVE 6b

CAMP I

Indol

- I

Nitrato / Urea

+ P. acnes

+ / + I

FAL

- / + I

a glucosidasa

+ / - I

FAL

- / - I

FAL

- C. durum (manitol +)

+ C. amycolatum

(manitol - )

+ C.

sundsvallense

- I

b NAG

- C. durum

(adherente)

+ I

Tirosina

+ I

Tirosina

- I

Maltosa

+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)

- I

PYR

+ I

Etilenglicol

- I

Maltosa

+ I

Maltosa

- Sacarosa

+ C. singulare

- I

Pigmento amarillo

+ C. falsenii (Nitrato - ,

PYZ + d é bil)

- C. amycolatum

(Nitrato v,

PYZ +)

+ / + C. striatum

- / - C. simulans

- C. confusum

+ I

Col punti (<0.5)

No lipof í lico

+ C. freneyi

- I

H+ glu 42 º

+ / + C. amycolatum

- / + C. xerosis

+ C.

argentoratense

- C.

hansenii

+ I

DNasa

- +

C. amycolatum (col. seca)

- I

a quimiotripsina

- C. tuscani

C. amycolatum

+ C. argentoratense

+ C. minutissimum

(col. lisa)

- C. aurumucosum

(col. mucosa)

CAMP I

Indol

- I

Nitrato / Urea

+ P. acnes

+ / + I

FAL

- / + I

a glucosidasa

+ / - I

FAL

- / - I

FAL

- C. durum (manitol +)

+ C. amycolatum

(manitol - )

+ C.

sundsvallense

- I

b NAG

- C. durum

(adherente)

+ I

Tirosina

+ I

Tirosina

- I

Maltosa

+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)

- I

PYR

+ I

Etilenglicol

- I

Maltosa

+ I

Maltosa

- Sacarosa

+ C. singulare

- I

Pigmento amarillo

+ C. falsenii (Nitrato - ,

PYZ + d é bil)

- C. amycolatum

(Nitrato v,

PYZ +)

+ / + C. striatum

- / - C. simulans

- C. confusum

+ I

Col punti (<0.5)

No lipof í lico

+ C. freneyi

- I

H+ glu 42 º

+ / + C. amycolatum

- / + C. xerosis

+ C.

argentoratense

- C.

hansenii

+ I

DNasa

- +

C. amycolatum (col. seca)

- I

a quimiotripsina

- C. tuscani

C. amycolatum

+ C. argentoratense

+ C. minutissimum

(col. lisa)

- C. aurumucosum

(col. mucosa)

CAMP I

Indol

- I

Nitrato / Urea

+ P. acnes

+ / + I

FAL

- / + I

a glucosidasa

+ / -

I FAL

- / -

I FAL

- C. durum (manitol +)

+ C. amycolatum

(manitol - )

+ C.

sundsvallense

- I

b NAG

- C. durum

(adherente)

+ I

Tirosina

+ I

Tirosina

- I

Maltosa

+ C. thomsenii ( Dnasa + 48 h)

- I

PYR

+ I

Etilenglicol

- I

Maltosa

+ I

Maltosa

- Sacarosa

+ C. singulare

- I

Pigmento amarillo

+ C. falsenii (Nitrato - ,

PYZ + d é bil)

- C. amycolatum

(Nitrato v,

PYZ +)

+ / + C. C. striatum

- / - C. simulans

- C. confusum

+ I

Col punti (<0.5)

No lipof í lico

+ C. freneyi

- I

H+ glu 42 º

+ / + C. amycolatum

- / + C. xerosis

+ C.

argentoratense

- C.

hansenii

+ I

DNasa

- +

C. amycolatum (col. seca)

- I

a quimiotripsina

- C. tuscani

C. amycolatum

+ C. argentoratense

+ C. minutissimum

(col. lisa)

- C. aurumucosum

(col. mucosa)

ID C. striatum

ID algoritmo: 16 pruebas bioquímicas (viene de 2 llaves previas)

Tiempo ID: 4- 5 días

Actinomyces y géneros relacionados

7 11

6

5 5 10

10

6

11

n 71 A. turicensis

A. radingae

A. urogenitalis

A. odontolyticus

A. naeslundii/A.viscosusA. neuii

A. schalii

A. haemolyticum

Otros

Otros: A. graevenitzii; Varibaculum cambriense; T. bernardiae; Propionibacterium spp.; Bifidobacterium scardovii

Identificación por MALDI-TOF

65

2 3 1

Actinomyces y géneros relacionados (n: 71)

ID correcta

ID incorrecta

No ID

ID género

Nivel Género: 95,8% Nivel Especie: 91,5 %

Tiempo ID: 3-5 min

Presentan exigencia nutricional

Escasa reactividad en las pruebas bioquímicas

Géneros Actinomyces, Arcanobacterium y

Actinobaculum spp.

Tiempo de Identificación: aprox 7 días

Actinomyces europaeus

Actinobaculum schaalii

Algoritmo de identificación fenotípico para Actinomyces y relacionados

Llave 2

b hemólisis marcada

-

I

Esculina / Urea

+

Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes(PYR - , b gur +)

+ / +

Actinomyces naeslundiiincluye A. naeslundii,

A. oris, A. johnsonii

- / +

I

b gur

+ / -

I

Nitrato

- / -

Llave 2a

+

Actinobaculum

urinale

(hipurato +)

-

Actinomyces

naeslundii

+

I

bNAG

-

I

Glucosa

-

I

b gal

+

Actinomyces

urogenitalis(colonia semejante

a estafilococo)

-

Actinomyces

nasicola

+

I

Xilosa

-

Rothia aeria /dentocariosa

+

I

Pigmento rojo

-

I

Rafinosa

+

I

b gal

+

Actinomyces

Odontolyticus

-

- Actinomyces israelli

- Actinomyces naeslundi

/ viscosus

+

I

Melibiosa

-

Actinomyces

europaeus

-

Actinomyces bovis

+

I

b NAG

+

Actinomyces

dentalis

-

Actinomyces

oricola

-

I

Rafinosa

+

Actinomyces

radingae

-

Actinomyces georgiae

+

Actinomyces gerencseriae

Llave 2

b hemólisis marcada

-

I

Esculina / Urea

+

Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes(PYR - , b gur +)

+ / +

Actinomyces naeslundiiincluye A. naeslundii,

A. oris, A. johnsonii

- / +

I

b gur

+ / -

I

Nitrato

- / -

Llave 2a

+

Actinobaculum

urinale

(hipurato +)

-

Actinomyces

naeslundii

+

I

bNAG

-

I

Glucosa

-

I

b gal

+

Actinomyces

urogenitalis(colonia semejante

a estafilococo)

-

Actinomyces

nasicola

+

I

Xilosa

-

Rothia aeria /dentocariosa

+

I

Pigmento rojo

-

I

Rafinosa

+

I

b gal

+

Actinomyces

Odontolyticus

-

- Actinomyces israelli

- Actinomyces naeslundi

/ viscosus

+

I

Melibiosa

-

Actinomyces

europaeus

-

Actinomyces bovis

+

I

b NAG

+

Actinomyces

dentalis

-

Actinomyces

oricola

-

I

Rafinosa

+

Actinomyces

radingae

-

Actinomyces georgiae

+

Actinomyces gerencseriae

b hemólisis marcada

-

I

Esculina / Urea

+

Trueperella (Arcanobacterium)pyogenes(PYR - , b gur +)

+ / +

Actinomyces naeslundiiincluye A. naeslundii,

A. oris, A. johnsonii

- / +

I

b gur

+ / -

I

Nitrato

- / -

Llave 2a

+

Actinobaculum

urinale

(hipurato +)

-

Actinomyces

naeslundii

+

I

bNAG

-

I

Glucosa

-

I

b gal

+

Actinomyces

urogenitalis(colonia semejante

a estafilococo)

-

Actinomyces

nasicola

+

I

Xilosa

-

Rothia aeria /dentocariosa

+

I

Pigmento rojo

-

I

Rafinosa

+

I

b gal

+

Actinomyces

Odontolyticus

-

- Actinomyces israelli

- Actinomyces naeslundi

/ viscosus

+

I

Melibiosa

-

Actinomyces

europaeus

-

Actinomyces bovis

+

I

b NAG

+

Actinomyces

dentalis

-

Actinomyces

oricola

-

I

Rafinosa

+

Actinomyces

radingae

-

Actinomyces georgiae

+

Actinomyces gerencseriae

ID: 16 Pruebas bioquímicas Tiempo ID: 5 a 7 días

Actinomyces radingae

Microorganismo

Leifsonia spp (n:1)

Exiguobacterium spp (n:3)

Brevibacterium spp (n:3)

Microbacterium spp (n:6)

Arthrobacter spp (n: 1)

Cellulosimicrobium spp (n:2)

Turicella spp (n: 2)

Rothia spp (n:2)

Dermabacter spp (n:10)

Clostridium tertium (n:1)

Listeria monocytogenes (n:4)

Lactobacillus spp (n:3)

Rhodococcus equi (n:2)

Gordonia spp (n:3)

Dietzia spp (n: 3)

Identificación por MALDI-TOF

Bacilos Gram-positivos aerobios n= 46

Nivel Género: 93,5%

Nivel Especie: 86,9%

No ID: Leifsonia (1), Exiguobacterium (1), Dietzia (1) Género: Microbacterium (2), Gordonia (1)

Rothia aeria R. equi Microbacterium

ID 322

96,9% (IC95% 94,5-98,6)

ID 307

ID incorrecta 7

92,2% (IC95% 88,8-94,8)

n: 333 BGP

Tiempo ID: 3 a 5 min

Conclusiones Se obtuvo aproximadamente más del 20% de aislados identificados

con MALDI-TOF a nivel de especie utilizando score >1,7

(Corynebacterium spp: 22,7%; Actinomyces spp: 33,8%; Otros BGP:

17,4%) por lo tanto se puede disminuir el score recomendado por el

fabricante para aumentar el % de ID

La ID por MALDI-TOF permitió reconocer especies atípicas: C.

amycolatum y C. simulans lipofílicos y C. urealyticum urea negativa,

que no pueden ID por métodos convencionales

Los errores en la ID a nivel de especie ocurrieron principalmente

entre especies relacionadas filogenéticamente

HACEK y MALDI TOF

MALDITOF y HACEK

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%A

. ure

ae A.…

A. a

ph

rop

hilu

s

A. s

egn

is

Ca

pn

ocy

top

ha

ga

sp

p

Cardiobacterium…

Dysgonomonas…

Dys

go

no

mo

na

s g

ad

ei

Eike

nel

la c

orr

od

ens

Ha

emo

ph

ilus

infl

uen

zae

Haem

ophilu

s…

Haem

ophilu

s…

Kin

gel

la s

pp

.

Lep

totr

ich

ia t

ravi

san

i

ID Erronea

No ID

Especie

Genero

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Incorrecto

No id

Especie

Genero

MALDITOF y HACEK

MALDI TOF y HACEK

152 144

2

HACEK

Genero

Especie

ID noconfiable

ID incorrecta

N 155 98.% genero

92.9 % especie

1.3 % no confiable

0.6 % ID incorrecta

Scores: > 1.5 (Género) > 1.7 (Especie) < 1.5 (No ID confiable) 3 a 5 minutos!!

Eikenella corrodens

LDC ODC

T

T

e

s

t

i

g

o

G

l

u

c

o

s

a

b-

Tpo ID: 3 a 4 días

A. aphrophilus ONPG

Lactosa

cb-

Tiempo de ID: 3 a 5 días

MALDI TOF y HACEK. Conclusiones

MALDI-TOF MS es una herramienta poderosa

para la identificación de los miembros del grupo

HACEK y otros bacilos fastidiosos.

La tasa de identificación no se mejora con

procedimiento de extracción etanol-ácido

fórmico (FA)- Acetonitrilo.

La disminución de los scores de identificación

puede mejorar el rendimiento de MALDI-TOF.

Identificación directa a partir de hemocultivos

• Separación de células (leucocitos, eritrocitos) por centrifugación

• Lisis de las células (Agua destilada, saponina, cloruro de amonio, SDS)

• Centrifugación y lavado

• Precipitación de las proteínas con etanol

• Extracción proteica con AN y AF

MALDI TOF DIRECTO SOBRE BOTELLAS POSITIVAS DE HEMOCULTIVO

• Identificación directa sobre botellas de hemocultivos positivas

• 1 mL de hemocultivo

• 300 mL de buffer de lisis.

• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante

• 900 mL de buffer de lavado.

• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante

• 300 mL etanol

• 900 mL agua pura

• Centrifugar 1´ Extraer sobrenadante

• Extracción con ácido fórmico

Tiempo de

procesamiento

20 minutos

kit comercial MALDI Sepsityper(Bruker Daltonic)

SDS/Ac Fórmico

Agua/Etanol/Formico/Acetonitrilo

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

• Paciente con linfoma, febril, sin tratamiento antibiótico

• Gram de 1 de 2 frascos de hemocultivos: BGP corineformes

• ID por Malditof a partir del frasco:

• Tiempo de informe: 30 minutos • El paciente recibe tratamiento con

Ampicilina + gentamicina No Contaminante. Cambio de conducta

terapéutica

Listeria monocytogenes

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

Paciente con linfoma, febril, sin tratamiento antibiótico

Gram a partir de 1 de 2 frascos de hemocultivos: BGP corineformes

ID por Malditof a partir del frasco:

Punta de cateter: Negativa

Corynebacterium striatum

Interpretación: probable contaminante. No cambio de conducta terapéutica

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter

• Tratamiento empirico: vanco + imipenem

• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos

• ID por Malditof a partir del frasco:

Frasco 1: S. epidermidis

Frasco 2: S. simulans

Retrocultivo: negativo

• Tiempo de informe: 30 minutos hay modificación de la conducta terapéutica

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

• Paciente neutrópenico, febril con sospecha de bacteriemia asociada a catéter

• Tratamiento empírico: vanco + imipenem

• ID a partir de 2 frascos de hemocultivos: Gram: CGP en racimos

• ID por Malditof a partir del frasco:

Frasco 1: S. epidermidis

Frasco 2: S. epidemidis

Retrocultivo: S. epidermidis

• Tiempo de informe: 30 minutos Hay modificación de la conducta terapéutica

Tres Hemocultivos positivos por bacilos

gram-positivos pleomórficos en paciente

pediátrico con sospecha de EI de válvula nativa.

MALDITOF: Granulicatella adiacens

Impacto clínico: se instauró : penicilina +

gentamicina a dosis de EI 4 semanas (las 2 drogas)

Impacto clínico de la identificación rápida a partir de hemocultivos

MALDITOF en la emergencia de nuevos patógenos

Cultivo: 72 horas de incubación

Coloración de Gram del urocultivo Importancia de la identificación rápida en la jerarquización clínica

Paciente masculino. 22 años.

Sindrome nefrotico. HTA por

glomerulonefritis. Reagudización de

su IRC. Dialisis trisemanal. TTO

empírico. TMS

99 % identidad con Actinobaculum schaalii

Identificación molecular:

Secuenciación del 16S rRNA

Identificación por Espectrometría de masa:

MALDITOF

Algoritmo de identificación fenotípico

Llave 1

CAMP –

MRS /Vanco

Algoritmo de identificación

Esc -/urea- /NO3-

- Pyz /PYR / Hip /Trib

+ / V /-/nd

A. bernardiae

- / - /+/-

A. turicensis

v / v /+/+

Actinobaculum schaalii

+++/ R

Lactobacillus (II III)

(+) / S

Lactobacillus (I)

Bifidobacterium Alloscardovia

- /S

No β

hemólisis

Gram

4 -5 días

15 pruebas

Actinobaculum schaalii: identificación

Vancomicina

MRS

Nitrato urea Esculina

Pyr Hipurato Tributirina

SPS

Identificación por MALDITOF. Impacto clínico

• Permitió modificar la conducta terapéutica:

• Se suspendió el tratamiento con TMS y el

paciente recibio penicilina 1.500.000 UI c/12h por 14 días

• Permite atribuir el verdadero significado clínico a estos microorganismos en casos de piuria crónica inexplicable

1997: Descripción de una nueva especie: paciente sexo masculino, 64

años, pielonefritis crónica

2003: Pielonefritis en niño con obstrucción pieloureteral

(Eur J Clin Microbiol Inf Dis. 22, 438-40)

2005: ✓A. schaalii y A. urinale en paciente con falla renal crónica

✓10 casos de IU en pacientes con factores predisponentes

2010: Un patógeno común en Dinamarca

1era publicación en Estados Unidos

(Diagnostic Microbiology & Infectious Disease 67, 282-285)

2011: Observación de 20 casos (Suiza)

2012: Primer reporte de IU, paciente 75 años, masculino, en Canadá

IU en niño de 8 meses (Suiza)

2013: Actinobaculum schaalii: an emergent uropathogen in Argentina

Métodos de Identificación

Identificación convencional: 24 horas a 5-7 días.

Identificación por galerías comerciales: Lectura rápida: 4 horas Lectura habitual: 24 a 48 horas Identificación por sistemas automatizados:

2 a 10 Horas Maldi tof: 3 a 5 min!!! (96 muestras/hora)

Base de datos L imitada

MALDI TOF: Otras Aplicaciones en Microbiología

• Aplicación directa sobre muestras

clínicas (urocultivo, hemocultivos)

• Detección de factores de virulencia

(Toxinas)

• Detección de mecanismos de resistencia

• Tipificación molecular

MALDI TOF: Elección de un equipo

Conclusiones MALDI TOF

Identificación rápida y precisa Base de datos para un amplio espectro de bacterias

Herramienta útil para identificar especies “raras” o infrecuentes en infecciones humanas

La aplicación de MALDI TOF sobre muestra directa en particular los HC es una de las aplicaciones más prometedoras

Conclusiones

MALDI TOF supera por la exactitud y

rapidez a la identificación fenotípica y

molecular hasta ahora conocida

Conclusiones MALDI TOF

Por la rapidez y fiabilidad EM está destinada a convertirse en un técnica básica de identificación de bacterias y hongos en el Laboratorio de Microbiología Clínica, desplazando en una parte muy importante a las técnicas de rutina actuales.

Aunque las técnicas genéticas probablemente sigan siendo las de referencia, su uso se verá reducido a aquellos microorganismos cuya identificación no se consiga con EM.

5495.0

5417.9

4470.0

6264.1

10835.4

7274.5

7122.5

4736.2

9589.7

7828.2

8021.2

8847.6

8369.5

10259.6

10051.3

4

5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/

z

MUCHAS GRACIAS