Post on 15-Apr-2016
description
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
VALIDACIJA FARMACEUTSKIH METODA
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Validacija farmaceutskih metoda je postupak
kojim se potvr đuje da je metoda pogodna za
određenu namenu.
Ovde će biti opisana V-TR2AP
(eng. Validated − Transferable, Robust,
Reliable, Accurate and Precise) metodologija.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Sposobnost metode da se ne menja sa malim i namerno izazvanim promenama
Robusnost
Najmanja koncentracija analita koja se može detektovatiLimit detekcije
Najmanja koncentracija analita koja se može kvantifikovati (odrediti)
Limit kvantifikacije
Slaganje u okviru serije merenjaPreciznost
Slaganje između izmerene i teorijske vrednostiTačnost
Interval koncentracija u kome je metoda precizna, tačna i linearna
Opseg
Proporcionalnost između izmerene vrednosti i koncentracije
Linearnost
Mogućnost da se, pod navedenim uslovima, tačno odredi analizirana supstanca u složenom uzorku
Specifi čnost
DefinicijaParametar
Definicije parametara validacije
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Planiranje i razvoj metodeU toku planiranja potrebno je:
�Definisati svrhu metode i razmotriti zahteve regulative.
�Prikupiti postojeće informacije o aktivnoj farmaceutskoj supstanci, poznatim srodnim supstancama i komponentama formulacije.
�Razmotriti npr. vreme trajanja i troškove analize, postojeću opremu, dostupnost referentnih standarda, hemikalije koje se koriste, obučenost osoblja, lakoću
primene metode, zahtevanu osetljivost, selektivnost itd.
�Na osnovu rezultata iz studija stabilnosti, utvrditi koje nečistoće se prate kao
specificirane srodne supstance (≥ 0,1 %), a koje kao nespecificirane srodne supstance (njihov nivo je obično između 0,05 % i 0,10 %).
�Razmotriti postojeće podatke, odstupanja i izveštaje koji se odnose na prethodne verzije metode.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
(1)procena robusnosti metode,
(2) optimizacija metode,
(3) ispitivanje specifičnosti metode,
(4) provera pogodnosti sistema,
(5) definisanje procedure metode i
(6) uspostavljanje kriterijuma za prihvatanje rezultata
Razvoj metode
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
1) Procena robusnosti metode
�proizvođač HPLC sistema,
�različite serije kolona,
�dobavljači kolona,
�brzina protoka,
�temperatura kolone,
�pH mobilne faze,
�jonska jačina,
�talasna dužina,
�program gradijenta,
�volumen injektovanja,
�koncentracija uzorka.
Tokom procene robusnosti kod HPLC metode mogu se testirati:
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
2) Optimizacija metode
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
3) Specifi čnost metode
Procenom specifičnosti metode osigurava se da je metodom moguće razdvojiti sve prisutne degradacione proizvode kao i nečistoće iz procesa sinteze aktivne farmaceutske supstance.
Specifičnom metodom se postiže tačno određivanje aktivne farmaceutske supstance i nečistoća u prisustvu ekscipijenasa koji ulaze u sastav proizvoda.
Specifičnost metode se određuje preko čistoće pika koja se procenjuje primenom UV detektora zasnovanog na principu fotodioda ili masenogdetektora.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
4) Pogodnost sistema
Pri rutinskoj primeni farmaceutske metode očekuje se da ima
karakteristike koje se uklapaju u postavljene zahteve.
Ispitivanje pogodnosti sistema obezbeđuje odgovarajuće
funkcionisanje celokupnog sistema u bilo kom trenutku.
Kriterijumi za prihvatanje rezultata za procenu pogodnosti sistema
treba da budu pravilno izabrani, a u isto vreme ne previše strogi za
rutinske analize.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Kontrolni uzorak ili standard u koncentraciji koja odgovara LOQ; očekuje se odgovor u okviru definisanih granicaKontrolni uzorak – proceniti standarde kao "uzorke“
RSD za pet ili šest injektovanja standarda
Izračunava se:�Retencioni faktor�Broj teorijskih platoa�Tailing faktor�Faktor rezolucije nakon injektovanjaodgovarajuće smeše
Injektovanje razblaženja standarda za potvrdu LOQ/LOD
RSD izračunata za seriju injektovanjarastvora standarda
Linearnost
Tačnost
Preciznost
Selektivnost
LOQ/LOD
Stabilnost rastvora
Test pogodnosti sistema Parametar validacije
Testovi pogodnosti sistema za kontinuirano pra ćenje parametara validacije
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Najčešće koriš ćeni parametri za procenu pogodnosti sistema su:
Faktor rezolucije (Rs) je mera razdvojenosti dva pika.
Razdvajanje svih ispitivanih pikova proverava se vizuelno upotrebom
laboratorijske smeše analiziranih supstanci.
Faktor rezolucije ve ći od 1,5 ukazuje da su pikovi razdvojeni na baznoj
liniji.
Faktor rezolucije (R) između dva kritična pika se računa po formuli datoj u
USP i Ph. Eur.
( )21
122
hh
RR
ww
tt
+−
Izraz za izračunavanje Rs po USP glasi :
Rs=
gde je:
– tR1 i tR2 retenciono vreme između 2 susedna pika (tR2 > tR1),– wh1 i wh2 širina pika na baznoj liniji.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Izraz za izračunavanje Rs po Ph. Eur. glasi:
Rs=
gde je:– tR1 i tR2 retenciono vreme između 2 susedna pika (tR2 > tR1),– wh1 i wh2 širina pika na 50 % visine pika.
( )21
1218,1
hh
RR
ww
tt
+−
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Relativna standardna devijacija (RSD) koristi se za procenu ponovljivosti. Često
se na početku svake analize računa relativna standardna devijacija za pet ili šest
injektovanja referentnog standarda. RSD se računa prema sledećem izrazu:
1
)(100(%)
2
−−Σ=
n
yy
yRSD i
gde je:– yi – eksperimentalno dobijene vrednosti odgovora (izmerena apsorbancija, površina pika, itd),– – srednja vrednost dobijenih odgovora,– n – broj merenja.
y
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Faktor simetrije se koristi za ispitivanje pogodnosti sistema u slučaju da postoji
tendencija razvlačenja pika aktivne supstance ili jedne od srodnih supstanci.
Starenjem HPLC kolone razvlačenje pika postaje sve izraženije, pa se ovaj
parametar tada definiše kao kritični parametar.
Faktor simetrije se računa po formuli datoj u USP i Ph.Eur.
d
wAs 2
05,0=
– w0,05 – širina pika na 1/20 visine pika i– d – rastojanje na 1/20 visine pika od početka eluiranja pika do maksimuma pika odnosno od maksimuma pika do završetka eluiranja pika.
Faktor simetrije - As
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Limit kvantifikacije. Injektovanje koncentracije koja odgovara limitu kvantifikacijetokom procene pogodnosti sistema može se koristiti kao provera linearnosti sistema
u okviru opsega od LOQ do 100 % u odnosu na ciljanu koncentraciju aktivne supstance.
Provera referentnim standardima. Za proveru tačnosti standardne procedure merenja mogu se koristiti rastvori referentnih standarda. Sadržaj referentnih
standarda treba da bude od 98,0 % do 102,0 %. Takođe, mogu se pratiti promene u odgovoru sistema preko površine pika referentnog standarda. U toku hromatografske sekvence, promene ne smeju biti veće od ± 2 %, a preporučeno je
da se prate nakon 10 – 12 injektovanja.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
5) Procedura metode
1. uvod u kome se definiše namena metode,
2. spisak reagenasa i njihove specifikacije (stepen čistoće); gde je
potrebno navesti odgovarajuće mere opreza,
3. spisak potrebnih standarda,
4. spisak potrebnog laboratorijskog posuđa,
5. spisak potrebne opreme,
6. opis pripreme rastvora (mobilna faza, standardi, uzorci),
7. uslove metode (protok, talasna dužina detekcije, program gradijenta,
proces ekvilibracije, itd),
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
8. proceduru za pripremu standardnih rastvora i uzoraka,
9. kriterijume za prihvatanje rezultata pogodnosti sistema i način izračunavanja,
10.šemu sekvence, uključujući redosled i broj injektovanja rastvora
standarda, rastvora za proveru pogodnosti sistema, kontrolnih
uzoraka i analiziranih uzoraka,
11.kompletne preračune, uključujući učestalost i način izvođenja kalibracije,
12.tabelu sa relativnim retencionim vremenima analita i relativnim
faktorima odgovora (eng. relative response factors − RRFs),
uključujući i retenciona vremena za pikove ekscipijenasa,
13.reprezentativni hromatogram adekvatno obeležen; može se zahtevati i hromatogram provere pogodnosti sistema.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
6) Prevalidacija
Metoda se proverava ispitivanjem:
1. LOQ,
2. Selektivnosti metode nakon:
injektovanja rastvora placeba ili stres uzoraka placeba,
injektovanja rastvora stres uzoraka ispitivane supstance,
injektovanja rastvora poznatih nečistoća i degradacionih proizvoda i
3. Procene čistoće pika uz korišćenje diode array detektora,
4. Linearnosti aktivne supstance u opsegu 50 % – 150 % i
5. Linearnosti srodnih supstanci u opsegu 0,05 % – 2,0 %.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Validacija – eksperimentalni deo
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Određivanje specifičnosti metode
Procena specifičnosti se vrši preko "čistoće pika" (eng. peak purity) tj. potvrđuje se da srodne supstance i ekscipijensi ne koeluiraju i ne interferiraju u postupku kvantifikovanja ispitivane komponente.
a. Kada su nečistoće dostupne koriste se za opterećivanje placeba kako bi se odredilo da li postoji interferencija komponenti placeba i ispitivane nećistoće.
b. Kada nečistoće nisu dostupne, FDA smernica Guideline for submitting samplesand analytical data for methods validation navodi nekoliko stres uslova kojima različite aktivne farmaceutske supstance i gotovi proizvodi treba da budu izloženi.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Linearnost i opseg
Opseg za aktivnu farmaceutsku supstancu mora biti najmanje od 50 % do 150 % u
odnosu na ciljanu koncentraciju.
Za nečisto će se pripremaju rastvori standarda u sledećim koncentracijama:
a) koncentracija koja odgovara LOQ,
b) dve intermedijerne koncentracije,
c) koncentracija koja odgovara specifikaciji i
d) koncentracija koja je iznad specifikacijske
(npr. 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75% i 1,0%).
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Na osnovu dobijenih rezultata, konstruiše se kalibraciona kriva koja
predstavlja zavisnost između eksperimentalno dobijenih rezultata i
koncentracije analita, a matematički se može prikazati na sledeći način:
y = a x + b
gde je:
y – odgovor instrumenta;
x – koncentracija standarda;
a – nagib krive i
b – odsečak na ordinati.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Linearnost se procenjuje na osnovu koeficijenta korelacije i značajnosti
odsečka na ordinati.
Koeficijent korelacije (r) predstavlja stepen rasipanja tačaka oko idealne
prave i mora imati vrednost ≥≥≥≥ 0,9990.
Odsečak b treba što manje da odstupa od nule i njegova značajnost
procenjuje se Studentovim t – testom .
Za svaku tačku na kalibracionoj krivoj treba izračunati odnos površina
pika/koncentracija kao i RSD.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Određivanje limita detekcije i limita kvantifikacije
Limit detekcije (LOD) i limit kvantifikacije (LOQ) određuju se samo za nečisto će i degradacione proizvode.
U protokolu se jasno mora naglasiti kako se određuju LOD i LOQ. Preporuka je da kod eksperimentalnog određivanja LOD bude koncentracija sa odgovorom oko tri puta većim od šuma, a LOQ sa koncentracija sa odgovorom deset puta
većim od šuma.
Prema ICH Q2(R1) smernici ovi parametri se mogu izračunati prema izrazima:
a
SLOD b×= 3,3
a
SLOQ b×
=10
gde je Sb standardna devijacija odsečka kalibracione krive u opsegu
koncentracija od 0,05 %– 1,0 %, a a je nagib ove kalibracione krive.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Procena tačnosti metode
Tačnost metode je mera usaglašenosti eksperimentalno dobijenih rezultata predloženom metodom sa pravim vrednostima. Procena tačnosti često se naziva i Recovery eksperiment . Izražava se kao procenat prinosa (Recovery) određivanja za poznatu, dodatu količinu ispitivanog analitaplacebo smeši.
Tačnost se određuje primenom metode na laboratorijsku smešu ekscipijenasa i dodate određene količine analita.
Preporučuje se da dodate koncentracije analita budu 80 %, 100 % i 120 %u odnosu na propisanu. Potrebno je uraditi najmanje po tri merenja za svaku koncentraciju, izračunati Recovery i prikazati odstupanja koja će odrediti tačnost metode.
Postojanje odstupanja može ukazati na interakcije analita sa ekscipijensima. Dozvoljeno odstupanje iznosi ±±±± 2 %.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Procena preciznosti metode
Preciznost instrumenta ili ponovljivost injektovanja je preciznost procenjena ponovljenim analiziranjem (deset ponavljanja) jednog uzorka radi testiranja karakteristika aparata koji se koristi. RSD mora biti < 1 %.
Ponovljivost (intra–assay precision) dobija se ponovljenim analiziranjem nezavisno pripremljenih homogenih uzoraka u jednojlaboratoriji, od strane jednog istog analitičara, na istoj aparaturi i sa istim setom reagenasa. Procenjuje se u tri koncentracje (80 %, 100 % i 120 % u odnosu na propisanu koncentraciju) sa najmanje tri ponavljanja ili u jednoj koncentraciji sa najmanje šest ponavljanja. Preporuka je da vrednost RSD ne bude veća od 2 %.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Srednja preciznost (intermediate precision) je preciznost procenjena od strane više analitičara, u više različitih dana, na različitim aparaturama, sa različitim setom reagenasa, u jednoj laboratoriji.
Reproduktivnost (inter–laboratory precision) je bitno proceniti ako će se metoda primenjivati u više različitih laboratorija. Izvodi se kako bi se procenilo variranje između rezultata dobijenih u više različitih laboratorija.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Kriterijumi za prihvatanje rezultata
50 % – 150 %70 % – 130 %80 % – 120 %90 % – 110 %
srednja vrednost Recovery za svaki nivo, ukoliko je:0,05 % ≤ x < 0,1 %0,1 % ≤ x < 0,5 %0,5 % ≤ x < 1,0 %x ≥ 1,0 %
Srodne supstance
98,0 % – 102,0 %srednja vrednost Recovery za svaki nivo (80 %, 100 % i 120 %)
Aktivna supstanca
Tačnost
linearnolinearnovizuelna procena linearnosti
≤ 10 %≤ 3 %RSD za RRF
± 15 %± 2 %odsečak na ordinati
> 0,98> 0,99koeficijent korelacije
Linearnost
Nečisto ćeKriterijumi za prihvatanje
rezultata
Aktivna supstancaKriterijumi za prihvatanje
rezultata
Parametar
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
25 %15 %10 %5 %
RSD, ukoliko je:0,05 % ≤ x < 0,1 %0,1 % ≤ x < 0,5 %0,5 % ≤ x < 1,0 %x ≥ 1,0 %
Srodne supstance (analiza preciznosti – ponovljivosti)
1 %2 %3 %
RSDPreciznost aparataPreciznost – ponovljivostSrednja preciznost
Aktivna supstanca
Preciznost
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Ukoliko jedan ili više parametara validacije metode ne zadovolji
postavljene kriterijume za prihvatanje rezultata, rukovodstvo laboratorije treba
da odluči da li:
1. Rezultati ipak mogu biti prihvaćeni uz opravdanje.
2. Treba sprovesti re-testiranje istih uzoraka.
3. Test treba ponoviti (re-analiza).
4. Metoda zahteva ponovni razvoj, jer je odstupanje značajno, nakon čega se
validacija ponavlja.
Odstupanje od rezultata
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Dokumentacija za validaciju
Protokol za validaciju treba da sadrži sledeće:
1) Princip/namenu metode;
2) Spisak laboratorija koje su uključene i njihova uloga u validaciji;
3) Kategorizaciju metode u skladu sa ICH ili USP (metoda za identifikaciju,
metoda za određivanje sadržaja, metoda za ispitivanje nečistoća, metoda za
ispitivanje brzine oslobađanja);
4) Spisak reagenasa i standarda, uključujući brojeve njihovih serija;
5) Procedure za procenu svakog parametra validacije i predložene kriterijume za
prihvatanje rezultata;
6) Plan ili proceduru za slučaj da kriterijumi za prihvatanje rezultata nisu
zadovoljeni;
7) Zahteve za finalni izveštaj.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Transfer metoda
Transfer farmaceutske metode se sprovodi kako bi se obezbedilo da:
1. laboratorije koje učestvuju u ispitivanju na pravi način shvate metodu
koja se primenjuje;
2. istraživači u laboratoriji koja primenjuje metodu budu adekvatno obučeni;
3. se pripremi neophodna dokumentacija o uspešnom i potpunom
transferu.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Revalidacija
Izmene metode i dopuna validacije (revalidacija) se mogu zahtevati kada postoje:
1. Izmene opreme (instrumenta);
2. Izmene u sastavu gotovog leka;
3. Izmene u procesu sinteze aktivne supstance;
4. Modifikacije metode;
5. Izmene u analitičkoj proceduri.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Primer validacije RP-HPLC metode
Validacija RP-HPLC metode za odre đivanje
pramipeksola i njegovih ne čisto ća u tabletama
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Struktura analiziranih supstanci
pramipeksol dihidrohlorid
Nečisto će
BI-II 751 xx BI-II 820 BS
BI-II 546 CL 2-aminobenzotiazol
BI-II 786 BS
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
– Tečni hromatograf: Waters Breeze System
– Pumpa: Waters 1525 Binary HPLC Pump
– Detektor: Waters 2487 UV/VIS detector
– Grafička obrada: Breeze Software, Windows XP
Aparatura i reagensi
Hromatografski uslovi
– Kolona: Zorbax Extend - C18 4,6 mm x 150 mm, 5 µm– Mobilna faza: acetonitril–vodena faza (1% TEA, pH 7,0), 15:85 V/V
– Volumen injektovanja: 20 µl– Protok: 1,0 mL min-1
– Temperatura: 25 °C
– UV detekcija: 262 nm za pramipeksol, BI-II 751 xx, 2aminobenzotiazol, BI-II 786 BS i BI-II 820 BS
326 nm za BI-II 546 CL
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Hromatogram: BI-II 820 BS (1,435 min), pramipeksol (1,738 min), nepoznata nečistoća 1 (2,010 min), nepoznata nečistoća 2 (2,338 min), BI-II 546 CL (2,929 min), BI-II 786 BS (3,439 min), BI-II 751 xx (5,112 min) i 2-aminobenzotiazol (15,012 min)
Hromatogram smeše standarda
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Testiranje robusnosti primenom Plackett-Burman-ovog d izajna
Analizirani faktori i njihovi nivoi
+10–1Dummy 5
+10–1Dummy 4
+10–1Dummy 3
+10–1Dummy 2
+10–1Dummy 1
Zorbax Extend
Zorbax Extend
Zorbax Eclipse
Kolona* C18
302520Temperatura (°C)
1,11,00,9Protok (mL min-1)
7,27,06,8pH mobilne faze
1,11,00,9Sadržaj TEA (%)
161514Acetonitril (%)
Promenljiva
Gornji(+1)
Nominalni(0)
Donji(–1)
Faktorski nivoi
*4,6 mm × 150 mm, 5 µm kolona
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Plackett-Burman-ov dizajn eksperimenta
Faktori
+1–1+1+1–1+1–1–1–1+1+112
–1+1+1+1–1+1+1–1+1–1–111
+1+1+1–1+1+1–1+1–1–1–110
–1–1+1+1+1+1+1+1+1+1+19
+1+1–1+1–1–1–1+1+1+1–18
–1+1+1–1+1–1–1–1+1+1+17
–1–1–1+1+1+1–1+1+1–1+16
+1–1–1–1–1–1+1+1+1–1+15
–1+1–1–1–1+1+1+1–1+1+14
+1–1–1–1+1+1+1–1+1+1–13
+1+1–1+1+1–1+1+1+1+1+12
–1–1–1–1–1–1–1–1–1–1–11
LKJHGFEDCBAEksp.
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Faktor A – sadržaj acetonitrila (%)
Faktor B – sadržaj TEA (%)
Faktor C – dummy 1
Faktor D – pH mobilne faze
Faktor E – dummy 2
Faktor F – protok mobilne faze (mL min-1)
Faktor G – dummy 3
Faktor H – temperatura (°C)
Faktor J – dummy 4
Faktor L – dummy 5
Faktor K – kolona
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Dobijeni odgovori za faktore rezolucije
24,087,901,339,722,6812
20,264,402,007,751,5411
23,292,363,1211,542,0110
14,167,428,0524,264,259
12,914,564,781,192,428
24,011,040,001,911,317
15,204,825,5816,063,636
25,871,584,3715,683,385
22,62,472,1210,342,294
25,4712,343,028,602,203
20,685,110,935,521,472
25,8011,501,706,702,571
R5R4R3R2R1Eksp.
R1 – faktor rezolucije između BI-II 820 BS i pramipeksolaR2 – faktor rezolucije između pramipeksola i BI-II 546 CLR3 – faktor rezolucije između BI-II 546 CL i BI-II 786 BSR4– faktor rezolucije između BI-II 786 BS i BI-II 751 xxR5 – faktor rezolucije između BI-II 751 xx i 2-ABT
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Efekti faktora i rezultati za E critical i ME
4,77095,62502,976611,5448
1,6152ME (0,995; m)
3,22473,95472,09278,18101,1446ME (0,975; m)
4,53404,55701,695310,9523
0,4537E critical ( α=α=α=α=0,01)
2,71502,72881,01516,55830,2717E critical ( α=α=α=α=0,05)
1,71200,3670–0,3160–2,4620–0,2380Dummy 5
–1,1400–4,2700–1,8500–7,1280–1,2780Kolona
1,5020–2,68300,12303,74200,0983Dummy 4
–6,62500,48701,39001,62200,3712Temperatura (°C)
–1,45200,11300,73402,7520–0,0017Dummy 3
1,24500,5130–0,44401,4580–0,1750Protok (mL min-1)
0,62500,19000,66304,17200,0850Dummy 2
–4,3480–0,31803,17306,47801,0350pH
–1,1480–1,33700,4160–2,8150–0,1320Dummy 1
–1,31200,99330,2665–1,20500,0917TEA (%)
1,758–3,2770–1,3890–0,1350–0,0383Acetonitril (%)
R5R4R3R2R1Faktori
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Procena efekata faktora
D+H–HD+H–DR5
–––K–A+D+KR4
D–DDD+KA+D+H+KR3
–––––KR2
K+D––K––R1
(f)(e)(d)(c)(b)(a)Odgovor
(a) Značajni efekti za α=0,05 procenjeni primenom metode „efekata koji se mogu zanemariti“(b) Značajni efekti za α=0,01 procenjeni primenom metode „efekata koji se mogu zanemariti“(c) Značajni efekti za α=0,05 procenjeni primenom Dong-ovog algoritma(d) Značajni efekti za α=0,01 procenjeni primenom Dong-ovog algoritma (e) Značajni efekti procenjeni primenom half-normal probability grafikona(f) Značajni efekti procenjeni primenom Pareto dijagrama
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Intervali „nezna čajnosti“ za zna čajne faktore (dummy promenljive i Dong-ova metoda)
6,85 – 7,1521,35 – 28,65
6,88 – 7,12–
DH
R5
––
14,17 – 15,836,83 – 7,17
AD
R4
–6,87 – 7,13
–
14,27 – 15,736,94 – 7,06
21,35 – 28,65
ADH
R3
–––R2
–––R1
Interval na osnovu Ecritical iz Dong-ovog algoritmaαααα = 0,05
Interval na osnovu Ecritical za dummypromenljiveαααα = 0,05
Značajni faktorOdgovor
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
OdgovoriFaktori
–1+1+1+1+1Kolona
+1–1–1+1–1Temperatura (°C)
–1–1–1–1–1Protok (mL min-1)
+1–1–1+1–1pH mobilne faze
+1+1+1+1+1Sadržaj TEA (%)
–1+1+1–1+1Acetonitril (%)
R5R4R3R2R1
Faktorski nivoi za „najgori slu čaj“
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Vrednosti SST limita za „najgori slučaj“
33333n
0,0950,0850,0760,0560,055Sd
14,261,140,081,241,36Mean
14,271,200,101,301,363
14,351,170,151,231,422
14,161,040,01,191,311
R5R4R3R2R1Eksp.
1,36 –
2,92 3
055,0=
1,27
1,24 –
2,92 3
056,0
= 1,15
0,08 –
2,92 3
076,0 =
0,0
1,14 –
2,92 3
085,0 =
0,99
14,26 –
2,92 3
095,0 =
14,09
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Parametri za procenu kalibracionih krivih zapramipeksol i njegove ne čisto će
1,2921,1170,1221,6250,3250,332tb
0,99950,99990,99971,0000,99890,9999r
– 2,260,259– 0,0510,220,516,38Odsečak (b)
166,761,2551,95105,80100,7226,62Nagib (a)
0,02–2,04 – 400Opseg koncentracija
(µg mL-1)
2-aminobenzotiazol
BI-II 751 xx
BI-II 786 BS
BI-II 546 CL
BI-II 820 BS
PramipeksolParametar
a – nagib, b – odsečak prave y = ax + b
r – koeficijent korelacije
tb – statistički parametar sa vrednošću nižom od tabelarne (ttab)
ttab = 2,364 (p = 0,05; n = 8)
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Preciznost RP-HPLC metode
1,960,204±0,0040,22-aminobenzotiazol
1,490,201±0,0030,2BI-II 751 xx
2,050,195±0,0040,2BI-II 786 BS
1,970,203±0,0040,2BI-II 546 CL
1,520,198±0,0030,2BI-II 820 BS
0,7739,4±0,31*40Pramipeksol
RSD(%)
Određeno(µg mL -1)
Injektovano(µg mL -1)
Supstanca
* Standardna devijacija, SD (n = 6)
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaTačnost RP–HPLC metode
102,20,245±0,0030,24
101,10,202±0,0020,20
98,20,157±0,003*0,162-aminobenzotiazol
98,50,236±0,0040,24
101,00,202±0,0040,20
101,60,163±0,004*0,16BI-II 751 xx
100,70,242±0,0020,24
101,60,203±0,0020,20
101,40,162±0,003*0,16BI-II 786 BS
98,90,237±0,0070,24
101,20,202±0,0080,20
100,10,160±0,004*0,16BI-II 546 CL
100,40,241±0,0050,24
97,90,196±0,0050,20
103,20,165±0,001*0,16BI-II 820 BS
102,649,25±0,4348
100,740,28±0,0540
102,232,70±0,13*32Pramipeksol
Recovery(%)
Određeno(µg mL -1)
Injektovano(µg mL -1)
Supstanca
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova
Za sve nečistoće: LOD je 5 ng mL–1, a LOQ 15 ng mL–1.
Limit detekcije i limit kvantifikacije
Na kraju, validirana RP–HPLC metoda je primenjena za analizu pramipeksola i
njegovih nečistoća u Mirapexin® tabletama.
Sadržaj pramipeksola bio je 96,8 %.
Utvrđeno je da je sadržaj nečistoće BI-II 820 BS 0,46 %, što je u skladu sa
zahtevanim okvirima (< 0,5 %).
Sadržaj ostalih nečistoća bio je ispod limita detekcije predložene i validirane
RP–HPLC metode.
Primena metode na tablete
Katedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekovaKatedra za analitiku lekova