第六章 微生物菌种的选育

江南大学生物工程学院江南大学生物工程学院

第一节 从自然界中分离筛选菌种

1 、生产菌株来源 • 索取或购买• 自己选育 用原有菌株进行遗传改造进行育种 向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选 从自然界中分离菌种 从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资

源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。

设计方案→采样→增殖培养 *→ 平板分离 →筛选 ( 初筛、复筛 )→ 单株纯种分离 →性能考察 ( 生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）

从自然界中分离筛选菌种的一般步骤

一、采样 从自然界种采集含目的菌的样品1. 环境条件对土样本中微生物分布的影响• 营养环境• 水分• 温度• 通风• 酸碱度

2 . 采样方法（ 1 ） 去除表层土（ 2 ） 取 5-15cm 土样几十克，装入无菌牛皮

低袋或逆料袋中

3.注意• 记录：时间，地点，环境情况等• 样品袋应封好口，防止水分失去• 土样应在分离前破碎• 尽快分离

二 . 增殖培养（富集培养）

• 适用：样品中目的菌数量不够多时• 目的：提高样品中目的菌的数量和比例• 原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌

得以繁殖和 / 或非目的菌的生长受到抑制

1 、增殖培养的 方法 控制营养成分 控制培养基 pH 控制培养温度 热处理——增殖芽孢细菌 添加抑制剂

三 . 纯种分离 目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获

得纯培养1. 纯种分离的一般方法（ 1 ）稀释平板法 倾注平板或涂布平板（ 2 ）划线法（ 3 ）组织分离法 *

适用于分离高等真菌及植物病原菌

稀释分离涂布平板

稀释分离倾注平板

2 、平皿反应快速检出法——定性或半定量 纸片培养显色法 透明圈法 变色圈法 生长圈法 抑制圈

琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序

3 、厌氧性微生物的分离法（ 1 ）去除培养基中的溶解氧，降低 Eh

（ 2 ）创造无氧环境 物理除氧 空气置换法：干燥器或厌氧培养罐化学除氧 H2 + O2 → H2O ( 钯作催化剂） GASPAK 罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氢钠

化学反应产生 H2 和 CO2 ， H2 与 O2 反应生成水（ 3 ）厌氧分离（培养）技术 高层琼脂柱技术 厌氧罐技术 厌氧手套箱技术

GasPak

厌氧手套箱

厌氧培养装置

四 、筛选• 初筛、复筛： 初 筛 复 筛

种 子 斜 面 菌 种 液 体 种 子

摇 瓶 每 株 1 瓶 每 株 3 - 5 瓶

接 种 量 每 瓶 一 环 3 — 5 %

取 舍 情 况 留 下 产 量 较 高 的 1 0 -- 2 0 % 的 菌 株

每 次 保 留 1 0 — 2 0 % ，直 至 最 后 3 — 5 株

好氧培养

五、培养工艺条件试验与生产试验1 、摇瓶发酵条件 培养基组成、初始 pH 、通风量（装液量）、接种

量、培养温度…2 、小型台式发酵罐发酵工艺条件 溶解氧控制， pH值控制，原料添加模式，消泡剂…

第二节 基因突变

突变（ Mutation ）定义：遗传物质核酸（ DNA 或病毒中的 RNA ）的分子结构或数量突然发生了可遗传的变化。

突变是一种遗传的状态，是基因由于结构发生改变从而由原来的存在状态变为另一种存在状态，即它的等位基因。

突变体：带有突变基因的细胞或个体 突变型：突变体的基因型或表型称为突变型，和其相

对的原存在状态称为野生型。

一、 突变类型按变化范围分突变类型( 一 )染色体畸变（ chromosome aberration)染色体数目的变化或染色体结构发生较大片段的异常改变。

1 、染色体数目的变化1) 整倍体 (euploidy) ：含有完整的染色体组① 单倍体： haploid② 二倍体： diploid③ 三倍体： triploid④ 四倍体： tetraploid

2) 非整倍体 aneuploidy ：含有不完整状态的染色体组，一般是指二倍体中成对染色体成员的增加或减少。

① 单体（二倍减一， monosomic diploid): 2n-1

② 缺体（二倍减二， nullisomic dilpoid): 2n-2

③ 三体（二倍加一， trisomic diploid): 2n+1

④ 四体（二倍加二， tetrasomic diploid): 2n+2

⑤ 双二倍加一（ double trisomic ） : 2n+1+ 1

⑥ 部分二倍体（ merodiploid ）：细菌等原核生物中由一整条染色体和外来的一个染色体片段所构成的不完整二倍体。

2 、染色体结构的变化

① 缺失 deletion ：② 重复 duplication ：③ 倒位 inversion ：④ 易位 translocation ：

b f

( 二 ) 基因突变（ gene mutation ） ----染色体局部座位内的变化

• 点突变：只涉及 DNA 分子中一对或少数几对碱基的改变。突变发生在一个基因范围内。

• 多位点突变：突变超出一个基因范围。1 、碱基置换 base replacement

DNA链上的某一碱基对为另一碱基对所取代。(1)转换 transition ：(2)颠换 transversion ：

A G

T C 转换 颠换

图 21-1 转换与颠换

(3) 遗传学效应① 错义突变 missense mutation：② 同义突变 silent mutation：③ 无义突变 nonsense mutation：

表 21-2 点突变的类型(以 Tyr 的密码子为例)

无义突变 同义突变 错义突变DNA TAC→ TAA , TAG ↓ ↓ ↓ ↓RNA UAC UAA UAG ↓ ↓ ↓ ↓ aa Tyr Och Amb

TAC → TAT ↓ ↓UAC UAU ↓ ↓Tyr Tyr

TAC→ TCC ↓ ↓UAC UCC ↓ ↓ Tyr Ser

2 、移码突变 frameshift mutation ：由于一对或少数几对（不是三的倍数）核苷酸的插入或缺失而造成此后一系列遗传密码子的阅读框发生移位错误的突变。

Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr5’-TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG-3’ ↓G→A mutation Phe Asp Lys Pro Leu Cys Thr5’-TTC GAT AAG CCC TTG TGC ACG-3’ ↓C→T mutation Phe Asp Lys Pro Leu Cys Thr5’-TTC GAT AAG CCT TTG TGC ACG-3’ ↓C→A mutation Phe Asp Lys Pro Leu Stop Thr5’-TTC GAT AAG CCC TTG TGA ACG-3’

Phe Asp Glu Pro Leu Cys Thr5’-TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG-3’ ↓Insertion of A Phe Asp Lys Thr Leu Val His5’-TTC GAT AAG ACC CTT GTG CAC G-3’

二、按表型效应分突变类型• 野生型 wild type ：表现该物种正常表型的生物。• 突变型 mutant ：由于突变导致其正常的表型发生了改变的生物。

1 形态突变型2 生化突变型• 营养缺陷型 auxotrophic mutant• 抗性突变型 resistant mutant3. 致死突变型 4. 条件致死突变型5. 调节突变型

三、基因突变的规律

不对应性或自发性、 随机性 、 稀有性、 独立性、 稳定性、 可逆性、 诱变性 、

1 、自发突变的证实 随机性、不对应性

1 ）波动实验2 ）涂布实验3 ）影印培养实验

波动实验

E.coli B 抗噬菌体的波动测验结果

培养皿编号培养皿上菌落数

样品来自同一培养物 样品来自不同培养物1 14 46 4 1 1 0

2 15 56 2 0 0 0

3 13 52 2 3 0 0

4 21 48 1 0 7 0

5 15 65 5 0 0 8

6 14 44 2 5 303 1

7 26 49 4 0 0 0

8 16 51 2 5 0 1

9 20 56 4 0 3 0

10 13 47 7 6 48 15

11 107 1 0

12 0 4 0

13 0 19

14 0 0

15 1 0

16 0 17

17 0 11

18 64 0

19 0 0

20 35

平均值 16.7 51.4 3.3 11.35 30 3.8

方 差 15 27 3.8 694 6620 40.8

四、突变的频率：• 突变率（ mutation rate ）：每个细胞每一世代

中发生突变的概率。世代总数 =N2-N1

突变率的测定：• 固体平板法测突变率： m=(M2-M1)/(N2-N1)

• 液体培养法测突变率： m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)

• 液体稀释法测突变率： P0=e-mN

细胞分裂非同步性效正：突变率 =ln2m=0.69m

五、自发突变的机制

环境因素的影响微生物自身产生的代谢物的影响转座子所造成的插入突变DNA 复制过程中偶尔发生错误

六、诱变剂及其诱变机制

诱变是指通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微生物而引起的突变。

( 一 ) 物理诱变剂1 ）辐射： uv ， x-射线 γ-射线等 效应：点突变或染色体畸变 机制：直接作用和间接作用 间接作用：辐射作用于染色体外物质，产 生 具有诱变作用的物质； 直接作用：辐射直接作用于染色体，2 ）热：机理复杂3) 离子束 : 能量传递、动量交换，离子沉积与电荷积累

过程

1 、紫外线 UV• 有效波长 2650Å ，紫外灯波长 2537 Å

• 作用机理 嘧啶二聚体、嘧啶水合物、交联作用、 DNA链断裂

• 效应： 移码突变，碱基置换

紫外线诱发胸苷二聚体 O O UV O O H CH3 H CH3 H CH3 CH3 H N N N N

O N H O N H O N H H N O

Thymine Thymine Thymine dimer O O

4 5 4 5 3 6 6 2

1

Fig. 21- Production of thymine dimer by ultraviolet light irradiation.

2 、电离辐射： x-射线， -射线• 作用机理直接作用：打断化学键间接作用：通过自由基打断化学键• 效应：染色体畸变，碱基置换，移码突变3 、热• 作用机理：脱嘌呤• 效应：碱基置换，移码突变4 、离子束

( 二 ) 化学诱变剂1. 碱基类似物：是指其分子结构同 DNA 分子中的碱基非常类似，因此能取代碱基参入到 DNA 分子中的一类化合物。

主要诱变剂： 5-溴尿嘧啶和 2-氨基嘌呤； 可诱发 AT GC 的转换。

碱基类似物 base analog5-溴尿嘧啶 (5-BU ， BU), 5-氟尿嘧啶 (5-FU ， FU),

5-氨基尿嘧啶 (5-AU ， AU), 2-氨基嘌呤 (2-AP ， AP)

8-氮鸟嘌呤（ 8-NG ， NG ）例： BU

烯醇式： BUe ，高频出现， BUe ≡G

酮式： BUk ，低频出现， BUk=A

A A G G T BUK BUE C 酮式 烯醇式

5-BU掺入后的掺入错误

G ≡ C

G ≡ BUe

G ≡ C

G ≡ BUe

G ≡ C

A=T

A=BUk

A:T

A: BUk

A:T

G ≡ BUe

A:T

G ≡C

G ≡ BUe

G ≡ C→A=T

5-BU 复制错误

A: T → G ≡ C

2. 移码诱变剂嵌入 DNA 分子相邻碱基对之间，从而

有利于核苷酸的环出，因此可提高移码突变的突变率。

主要诱变剂：吖啶类化合物；溴化乙锭(ethidium bromide) ， ICR系列化合物等

部分移码诱变剂

DNA插入剂

(a) 增加碱基 插入剂分子 模板链 5’ ATCAG TTACT3’

新合成链 3’ TAGTC G AATGA5’ 0．68nm 随机选择碱基 嵌入插入剂处 下一轮复制 5’ ATCAG C TTACT 3’

3’ TAGTC G AATGA 5’

(b)缺失碱基

模板链 5’ ATCAG T TACT3’

新合成链 3’ TAGTC ATGA5’ 插入剂失去

后复制 插入剂 5’ ATCAGTACT 3’

3’ TAGTCATGA 5’

图 21-15 插入突变导制碱基的增加(a)和减少(b)

3. 化学修饰碱基的诱变剂1 ）烷化剂：使 DNA 分子的碱基发生烷化反应，从而更容易发生错配，是最常用的一类诱变剂。

常用的有：硫酸二乙酯 (DES) ，甲基磺酸乙酯 (EMS) ，亚硝基乙基尿 (NEU), 亚硝基胍 (NTG),

乙烯亚胺 (EI) 等。 NTG （亚硝基胍）诱变作用特强，作用于复制叉，可诱发多基因并发突变，被称为超诱变剂。

Chemical reactivity of bases is responsible for some DNA lesion

Alkylated bases

部分烷化剂和烷化碱基

alkylating agents

DNA 的脱嘌呤

烷化鸟嘌呤的碱基配对

烷化鸟嘌呤的交联作用

• 如甲基黄酸乙脂（ EMS ） 使 G 的第 6 位烷化，使 T 的第 4 位上烷化，结果产生的 O-6-E-G 和 O-4-E-T 分别和 T 、 G 配对，导致 G C∶ 对转换成 A T∶ 对；T A∶ 对转换成 C G∶

G O-6-E-G A T O-4-E-T C

C T T A G G

2) 亚硝酸（ introus acid, NA ）有氧化脱氨作用，可使 G 第 2 个碳原子上的氨脱去，产生黄嘌呤（ xanthine,x ），次黄嘌呤 (H) 仍和C 配对，故不产生转换突变。但 C 和 A 脱氨后分别产生 U 和次黄嘌呤 H ，产生了转换，使 C G∶ 转换成 A T∶ ， A T∶ 转换成 G C∶

HNO2

A H G G A A

T C C C U T HNO2

3) 羟胺（ NH2OH ）只特异地和胞嘧啶起反应，在第 4个 C原子上加 -OH，产生 4-OH-C，此产 物可以和 A 配对，使 C∶G转换成 T∶A

• 作用：与 C 反应，造成 GC→AT转换

HA C 4-OH-C T

G A A

七、 DNA 损伤的修复1 、光复活作用 photoreactivation

2 、切补修复 excision repair （暗复活）

Damage Mutant base is mismatched and/or distorts stractur Incision Endonuclease cleaves on both sides of damaged ba

Excision Exonuclease removes DNA Between nicks Synthesis Polymerase synthesizes Replacement DNA

Ligase seals nick

Fig. 21- Excision repar removes and replaces a stretch of DNA that includes the dameged base (s)

第三节     诱变育种

一、诱变育种的一般步骤出发菌株↓纯化、活化、同步培养培养液↓离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液（玻璃株打散、过滤）单细胞或单孢子悬液↓活菌计数，诱变预备试验诱变处理↓活细胞计数，致死率计算中间培养 (后培养 )

↓

平板分离 ↓变异率计算初筛→复筛→ 保藏及扩大试验

（一） 出发菌株的选择1. 出发菌株的类型2. 对诱变剂的敏感性3. 具有特定生产性状的可能性：4. 要尽量选择单倍体，单核细胞（孢子 )

（二）菌悬液的制备

1. 细胞的生长状态2. 菌悬液的均一性：3. 菌悬液细胞浓度 酵母、霉菌孢子： 106~107个 /ml

细菌、放线菌孢子： 108个 /ml

4. 菌悬液介质：

（三）诱变处理

1. 诱变剂的选择对于低产或野生菌， uv 线往往是首选，烷化剂等也是常用的诱变剂；对于经多次诱变处理的菌株，常需要强辐射进行处理。

碱基置换易回复，染色体畸变、移码等不易回复细胞的透性和生理状态经常变换诱变剂或复合处理

2.剂量选择最适剂量因诱变剂的类型、出发菌株及其生理状态的 不同而不同。亚硝基胍在低死亡率剂量时突变率较 高，而 uv 则在高致死率时才有较高的突变率。高产菌株在低剂量时效果较好，而对多核细胞处理剂 量不宜过低。质量性状宜选用高剂量。经多次诱变处理已钝化的菌株可用一次高剂量处理来 激活

3 处理方法单一诱变剂处理 ;复合处理

02468

101214161820

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

试验号

/ %

突变率

乙烯亚胺与紫外线复合诱变处理结果

1- 对照；2-乙烯亚胺（浓度 1:7000 ）；3, 5, 7, 9-紫外线；4, 6, 8, 10-乙烯亚胺加紫外线

紫外线的剂量（ erg/mm2 ）：3, 4-2000； 5, 6-4000；7, 8-6000； 9, 10-10000

X-射线的照射剂量与亚热带链霉菌白霉素高产菌株 39# 变异的关系

形态突变型

负突变型

正突变型

紫外线照射剂量与龟裂链霉菌土霉素高产菌株 293# 变异的关系

（四）后培养目的使突变基因纯合并表达，消除表型延迟。

后培养培养基：营养要求丰富，酪素水解液 ( 或蛋白胨 ) 可提供大量氨基酸，酵母膏可提供各种生长因子。

（五）变异菌株的分离及筛选

• 筛选：包括初筛，复筛和终筛等。• 明确筛选目标：产量突变还是其它突变型；

产量准备提高多少等；• 一次诱变目标不要太高• 制定筛选方案：筛选准备分几步；筛选采

用的培养方法和培养条件；每一步准备筛选多少菌株；每一步准备采用的分析方法等。

诱变育种工作中应注意的问题 安全问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应

时刻注意安全问题：个人安全和环境安全。个人安全：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如 γ-射线辐射防护要求较高， uv 要求较低，而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触；

环境安全：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。

要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。

诱变育种技术要和其他育种手段相结合。 诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十

分大，因此要对整个工作进行合理的设计并结合新技术提高其工作效率。

二 、营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型（ auxotroph ）突变株： 是指丧失了合成一种或多种必需生长因子能力

的菌株，它们只能在补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。

营养缺陷型突变株的用途 科研上：研究代谢途径；基因重组的遗传标记菌种；AA 、碱基、维生素生物测定的试验菌种生产上：发酵法生产氨基酸，核苷酸的生产菌种；生产菌株杂交育种的亲本进行遗传标记

完全培养基 Complete Medium （ CM ） 含有满足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌

株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。 基本培养基 Minimal Medium （ MM ）： 不含生长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生

长需要的最低成分合成培养基。补充培养基 Supplemented Medium(SM) ： 补充了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加 AA 、碱基或维生素而提供。

( 一 ) 筛选方法 后培养淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型

1 、淘汰野生型

原理：限制营养成分使缺陷型细胞生长受抑制，野生型细胞在生长过程中被杀死或生长后被除去

方法： 抗生素法： 菌丝过滤法：适用于丝状真菌 差别杀菌：

抗生素淘汰野生型 饥饿培养：培养细胞经离心、洗涤后，悬浮

于无氮基本培养基中培养 1-2 小时，耗尽细胞内氮源，防止加抗生素后的“误杀”；

加抗生素处理：加入等体积的 2N 基本培养基（两倍浓度氮源的基本培养基），同时加入抗生素，培养一定时间，野生型细胞由于生长而被杀死，缺陷型细胞处于休止状态而得以保留。

制霉菌素可用于处理酵母菌和霉菌。 注意：培养基应添加渗透压稳定剂而制成高渗培养基，可避免由于细胞破裂而给缺陷型提供营养物质。

2 、检出缺陷型1 ）限量补充法2 ）夹层培养法3 ）逐个检出法4 ）影印培养法

3 、鉴定缺陷型 ---- 生长谱法大类的鉴定：营养因子：A 、酪素水解液（ AA 混合物）B 、水溶性维生素混合液C 、酵母核酸水解液（碱基）D 、酵母膏水溶液制备平板：缺陷型菌经 CM液体培

养后，离心洗涤，制成 107~108个 /ml 菌悬液。取 0.1ml 涂布至MM平板上

A

BC

D

方法：分别用无菌小滤片沾取少许各种营养因子后，放入接种的 MM上，适宜温度下培养

判断： A 、 D 生长， AA缺陷型 B 、 D 生长，维生素缺陷型 C 、 D 生长，碱基缺陷型 A~B 、 D 生长， AA 、维生素双缺 A~C 、 D 生长， AA 、碱基双缺 B~C 、 D 生长，维生素、碱基双缺

组 生长因子

甲 1 2 3 4 5 6

乙 2 7 8 9 10 11

丙 3 8 12 13 14 15

丁 4 9 13 16 17 18

戊 5 10 14 17 19 20

己 6 11 15 18 20 21

详细鉴定生长因子组合法

营养缺陷型的生长谱鉴定

天冬氨酸

天冬氨酰磷酸

天冬氨酸半醛

Hse

Met Thr

Ile

二氨基庚二酸

Lys

AKase

钝齿棒杆菌 L-赖氨酸生物合成途径及调节

不同类型突变株积累 L-赖氨酸的水平突变菌株 突变型 产量 (mg/ml)

钝齿棒杆菌 Hse- 17.93

钝齿棒杆菌 Thr - 2.33

钝齿棒杆菌 Thr - +Met - 2.00

钝齿棒杆菌 AECr 20.0

AECr, Hse- 50.0

北京棒杆菌 Hse- 36.6

Hse-,AECr 45.0

三、 其它类型突变型的筛选（一）抗代谢类似物突变型的筛选抗反馈调节突变株：是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型突变株，或兼而有之的突变株。

代谢类似物：结构与代谢物类似，因此可起到代谢物所具有的调节作用的一类化合物。

1 、抗反馈抑制突变发生基因突变的细胞：酶的结构基因发生突变导致调节酶的调节部位发生改变，不再与结构类似物（或产物）结合，从而解除了产物的反馈抑制作用，使产物得以合成。

突变前 突变后 抗反抗反馈抑制突变的机制馈抑制突变的机制

2 、抗反馈阻遏突变型• 由于调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不再能和辅阻遏物结合，或由于操纵基因发生突变，被激活的阻遏蛋白不能作用于已突变的操纵基因，从而解除产物的阻遏作用，使产物得以过量积累。

抗反馈阻遏突变的机制抗反馈阻遏突变的机制

3 、 筛选方法（ 1 ）将经过诱变的细胞直接涂布在含有

一定浓度结构类似物的基本培养基平板上，长出的菌落即为抗结构类似物突变株；

（ 2 ）将经过诱变的细胞涂布在基本培养基平板上，在平板的中央加少量结构类似物，在抑菌圈内长出的个别菌落即为抗结构类似物突变株；

注意：• 如果是协同反馈抑制，则要在基本培养

基中添加起协同反馈抑制作用的产物• 抗结构类似物突变是数量性状，可通过逐渐提高结构类似物的浓度使产物的积累水平逐渐提高

结构类似物和代谢终产物终产物 结构类似物 过量积累产物精氨酸 D- 精氨酸 精氨酸

苯丙氨酸 对氟苯丙氨酸 , 噻吩丙氨酸 苯丙氨酸赖氨酸 AEC 赖氨酸酪氨酸 对氟苯丙氨酸 ,D- 酪氨酸 酪氨酸色氨酸 5- 碱基色氨酸 ,6- 甲基色氨

酸色氨酸

脯氨酸 3,4- 二氢脯氨酸 , 磺胺胍 脯氨酸腺苷酸 2- 氟腺嘌呤 腺苷酸葡萄糖 2- 脱氧葡萄糖 - 葡萄糖苷酶

蔗糖 , 麦芽糖 2- 脱氧棉子糖 蔗糖酶纤维二糖 , 葡萄

糖甘油 纤维素酶

（二）组成型酶突变株的筛选1 、诱导型酶在生产上的缺点诱导物往往价格昂贵受诱导物种类，浓度及分解产物的影响2 、筛选原理 通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。

3 、筛选方法 创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势或者适当的识别两类菌落的方法，从而把组成型突变株选择出来。

恒化器法 以诱导物作底物，浓度低于起诱导作用浓度，诱导型菌株生长极弱，而变异株由于能产分解底物的酶，则能分解底物而得以生长，通过连续不断加入新鲜基质，使变异株数量逐渐增多，最后达到能分离的浓度。

循环培养法不含诱导物培养基 ↔ 含诱导物培养基(普通碳源或氮源） （诱导物作唯一碳源或氮源）

两菌都能生长，但组成型变异株已能合成特定的酶，亲株不能

变异株调整期短，亲株调整期长，短时间培养后，变异株所占比例增大

反复循环培养几次后，变异株所占比例逐渐提高，然后进行分离

（三）细胞膜透性突变型 1 、提高细胞膜透性的优点• 使胞内产物浓度维持较低的水平，有利于酶促反应的进行，提高产物的生成量

• 使胞内产物浓度维持低于发生反馈抑制或阻遏的程度，以积累过量的产物

2 、提高细胞膜透性 的措施

第四节 基因重组

遗传重组的一般概念遗传重组（基因重组）：遗传重组是指遗传物质从一个细胞向另一个细胞传递并导致 DNA 交换和重排的过程。

遗传改造的手段包括基因突变和基因重组微生物中基因重组的方式：• 真核微生物：有性生殖和准性生殖；• 原核微生物：接合、转化、转导

一、细菌的转化

定义：受体细胞直接吸收裸露的外源 DNA并与其自身遗传物质发生重组，从而使受体细胞获得共体细胞部分遗传性状的现象。1、转化过程• 感受态受体细胞• 转化因子的吸附和吸收• 转化因子的整合及转化子的形成

转化过程

转化因子的整合

二、 转导

Transduction

通过噬菌体作为媒介，而把一个细菌的基因导入另一个细菌的过程叫转导。

转导的组分： 供体细菌，受体细菌，转导噬菌体

（一）局限性转导 specialized transduction

只能传递供体染色体上原噬菌体整合位点附近的少数固定基因的转导。

1 、转导噬菌体的形成• Campbell模型（不正确切离）• 形成频率： 10-6

2 、转导子的形成• 稳定转导子的获得——双交换• 不稳定转导子的获得——溶原化

（二）普遍性转导 generalized transduction

• 能传递供体的任何基因的转导。1 、转导噬菌体的形成• 选择性包裹模型• 形成频率： 10-6

2 、转导子的形成• 完全转导与完全转导子Complete transduction

通过双交换而实现约占 1/10

• 流产转导与流产转导子Abortive transduction

进入受体的供体 DNA 片段既不复制，也不整合，但能正常表达。

3 、共转导 cotransduction

• 由一个转导噬菌体同时传递两个供体基因的转导。

• 共转导的频率

普遍性转导与局限性转导的区别

普遍性转导 局限性转导

能转导的基因 供体的任何基因 特定基因 , :gal,bio

噬菌体在供体菌中的位置

无特定的位置 有特定的位置 gal--bio

转导噬菌体的获得 自发裂解或诱导裂解 诱导裂解

转导子 非溶源性1/10 稳定的完全转导子9/10 不稳定流产转导子

缺陷溶源性1/3 稳定转导子2/3 不稳定转导子

三、 细菌的接合

• 供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。

Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two cells by plasmids.

1 、 F- 、 F+ 、 Hfr 菌株 F+ 菌株Hfr 菌株 F- 菌株

F+ Hfr

2 、细菌接合作用（ 1 ） F+×F-

结果： F-转变为 F+

（ 2 ） Hfr×F-

Hfr DNA 的转移

• 形成部分杂合子

• 通过双交换形成重组体

形成 lac+ade+重组体

形成 lac-ade+重组体

相同点 含有 F因子，都具有性纤毛，都具有接合作用

不同点 Hfr 细菌 F+

对于吖啶橙处理 稳定 F因子易失去

传递供体染色体基因

高频 (10-3 ~ 10-4) 低频 (10-6 ~ 10-

7)

F因子本身转移 基本不能 频率 70% 以上

F因子复制 随细菌染色体复制 独立复制

• F+ 与 Hfr 菌株的异同点

3 、 F因子转导• F’因子：带有细菌基因的 F因子。

例 F-lac ， F-gal ， F-pro…

• F’ 因子的形成： Hfr 菌株中 F 因子的异常切除（ aberrant excision)

• F因子转导（性因子转导、性导） 通过 F’因子的转移而使受体细菌改变其遗传性状的现象

四、 真菌的有性生殖

Sexual reproduction

一、真菌有性生殖过程二、粗糙脉孢菌 (Neurospora crassa) 的生活

史

五、 真菌的准性生殖

Parasexual reproduction• 能进行准性生殖的微生物：Aspergillus nidulans; Asp. niger; Asp. sojae Penicillium chrysogenum; Fusarium oxysporu

m（一）准性生殖的过程 异核体形成； （杂合）二倍体形成； 体细胞交换和单元化

1 、异核体的形成• 异核体细胞：并存有两个不同遗传性状

的核的细胞• 异核体菌丝体：由异核体细胞构成的菌丝体

• 异核体的无性繁殖：产生亲代类型的单倍体分生孢子

• 异核体的生物学意义：具有生长优势；可以储备隐性突变

2 、异核体的形成(1) 选择亲本 A. 亲缘关系近 B. 生活力、产生分生孢子的能力及数量相似

C. 带不同的遗传标记(2) 创造形成异核体的条件 A. 限制性培养基 B. 孢子混合数量： 106~108

（二）杂合二倍体的形成

1 、形成：将 106 ~ 107个异核体的分生孢子涂至MM上，长出的少数菌落即为二倍体

2 、检出：

避免异核体分生孢子重新形成异核体的措施

A. MM 要十分纯正

B. 采用具有分生孢子颜色突变型和营养缺陷型作遗传标记

（三）有丝分裂分离 二倍体在有丝分裂过程中发生基因重组，

使隐性基因得以表达，由此产生各种类型的分离子。

1 、体细胞交换与体细胞重组体（ 1 ）体细胞交换：在有丝分裂过程中同

源染色体发生的交换。由此导致部分基因的纯合化。

2 、单元化过程与非整倍体及单倍体分离子

单元化过程：是在一系列有丝分裂过程中发生的染色体不离开行为的结果。

有性生殖与准性生殖的区别

有性生殖 准性生殖 导致有性孢子的产生，其形态、生理均与营养体细胞不同，往往产生在特殊的囊器中

导致重组体细胞产生，其和一般营养体细胞相同，不产生在特殊的囊器中

减数分裂导致基因重组，减数分裂中染色体交换和减半是有规律的协调过程，是必然的

有丝分裂导致基因重组，有丝分裂中，染色体交换和减少是不规则且不协调的过程，是偶然的

六、 原生质体融合技术

1 、原生质体融合育种的优势：• 基因重组频率提高• 重组的亲本范围扩大• 融合子集中两亲本优良性状的机会增大

（一）原生质体融合技术的一般步骤

融合亲本的选择与标记；原生质体的制备；原生质体的融合；原生质体的再生；融合子的选择与鉴定；目标菌株的筛选。

七、基因工程育种

Genetic engineering 重组 DNA 技术： recombinant DNA technology

基因工程是将不同生物的基因在体外人工剪切组合并和载体（质粒、噬菌体、病毒）DNA连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使转入的基因在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。

目的基因 (DNA) 载体 DNA

重组 DNA

受体细胞

具表达目的基因功能的重组菌

DNA连接酶

转化、转导或转染

筛选（利用遗传标记或分子生物学方法等）

基因工程操作的主要过程

一、目的基因的获得主要方法• 化学合成• PCR扩增• 从 DNA文库中筛选

1 、 PCR体外扩增目的基因 Polymerase Chain Reaction —— 聚合酶链式反

应• 一种体外 DNA扩增技术，用于扩增位于两端已知序列之间的 DNA区段 (靶序列）

• 在 DNA聚合酶催化下，通过两条人工合成的单链引物的引导而扩增模板 DNA 片段的方法

(1) 基本 PCR 组成：• 含目标 DNA序列的模板 DNA (Template)

• 寡核苷酸引物 ( Primers) ： 界定复制范围两端的引物 • DNA聚合酶： (Taq. Polymearse)

• DNA合成底物及水： dNTPs

(2) PCR 反应——三个主要步骤• 变性 ( denaturation) ： 90℃以上• 退火 ( annealing) ： 50~65 ℃• 延伸 (extension) ： 72 ℃ 20~30 个循环

2. 基因文库法（ 1 ） 从共体菌基因组 DNA 获取目的基因

DNA文库： 生物染色体基因组各 DNA片段的克隆总体。

• 分离染色体 DNA

• 用限制性酶部分水解• 分离选出一定大小合适克隆的 DNA 片段

基因文库构建

步骤• 提取 DNA• 酶解• 电泳分离• 与载体连接• 导入宿主• 筛选阳性克隆

二、优良载体的选择• 优良载体应具备的特点• 对 E.coli 受体细胞，载体有质粒载体、

λ噬菌体载体、柯斯质粒载体三、目的基因与载体 DNA 的体外重组• 粘性末端连接• 平齐末端连接

四 . 重组载体导入宿主细胞• 转化或转染• 体外包装与感染• 电穿孔法 electroporation

五、重组受体细胞的筛选和鉴定

• 遗传学方法：检测选择性标记• 免疫化学方法：检测目的基因产物• 核酸杂交方法：检测目的基因• 直接检出法：检测基因产物

外源基因插入 tet

钝化 tetr

•受体细胞是 Amp 、 Tetd 的敏感型•在 Amp+Tet 培养基上生长的是野生型质粒•在 Amp 培养基上生长的带有重组质粒

选择性标记筛选例一

例例例 - 半乳糖苷酶显色反应（蓝白斑试验） 检出携带外源 DNA 的载体 - 半乳糖苷酶以四聚体形式存在能将无色底物 X-gal(5-bromo-4-chloro-3- indoly

l--D-galactoside)切割成半乳糖和深蓝色的 5-bromo-4-chloroindigo ，菌落呈蓝色

宿主 lacZM15 基因合成的是缺失 N-末端 11~41氨基酸的缺陷型酶，无活性

pUC18等质粒具有 lacZ’ 基因，所编码酶的 N-末端片段与 lacZM15 产物组成有活性的酶

pUC18上在 lacZ’ 中间具有 MCS ，外源 DNA片段的插入，使 lacZ’ 无完整产物，不能与 lacZM15 产物组成有活性的酶，菌落呈无色

八、基因定位诱变

定位突变 site-specific mutagensis

用合成的 DNA 和重组 DNA 技术在基因精确限定的残基上引入突变。包括删除、插入和置换特定的碱基序列。

第六节 菌种退化、复壮与保藏

一 . 菌种的退化1. 菌种退化 degeneration 的表现 生产性状的劣化 , 遗传标记的丢失 ,

原有的典型性状的不典型等 菌落及细胞形态的改变 生长速度缓慢 代谢产物生产能力下降，即负突变 致病菌对宿主侵染力下降 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱

2. 菌种退化的原因：基因自发突变 退化是发生在群体细胞中的一个从量变

到质变的逐步演变过程。 自发突变率 10-8~10-9 加速退化的因素

传代次数过多不适宜的培养条件

3. 防止退化的措施 控制传代次数 创造良好的培养条件 利用不易衰退的细胞传代 采用有效的菌种保藏方法

二 . 菌种的复壮 rejuvenation

狭义复壮狭义复壮 在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；

广义复壮广义复壮 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种

三 . 菌种的保藏（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退

化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。

（二）原理

挑选典型培养物（ typical culture ）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。

（二）常用的菌种保藏方法1 、斜面保藏法 方法：接种适宜斜面培养基 → 培养 → 4℃保藏 措施：低温： 4℃ 适用：各大类 保藏期： 1~6个月 用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间2 、石蜡油封藏法 方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液蜡高出培养

基 1cm→4~15℃保藏 措施：低温，隔氧 适用：不能利用石油的各大类 保藏期： 1~2年 优点：简便

3 、砂土管保藏法 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥

→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期： 1~10年4 、冷冻干燥保藏 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安醅管中→

低温冻结（ -25—-40℃）→抽真空（至 0.01mmHg ） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏

措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期： 5~15年或更长

5 、甘油悬液低温冷冻保藏法 方法：菌种培养 → 15~30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中 → 置 -70℃冰箱保藏

措施：低温（ -70℃）、保护剂（ 15~50%甘油）适用：细菌、酵母菌保藏期：约 10年 6 、液氮保藏法 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶中

措施：超低温（ -196℃）、保护剂 适用：各大类保藏期： >15年